CN112725211A - 一种毕赤酵母重组菌、培养方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种毕赤酵母重组菌、培养方法及用途，制备培养得到的重组酵母可高效表达GLP‑1类似物，进而高效制备GLP‑1类似物。
Description
技术领域
本发明属于工程菌技术领域，具体涉及一种毕赤酵母重组菌、培养方法及用途。
背景技术
人胰高血糖素样肽-1（GLP-1）在治疗2型糖尿病中具有药用潜力。GLP-1的多方面生理作用包括刺激胰岛素表达、抑制胰高血糖素分泌和减少胃排空，有助于葡萄糖水平的正常化。随着2型糖尿病在世界范围内的流行率增加，开发了许多GLP-1衍生物以增强GLP-1的生物活性和药物稳定性。其日益增长的需求要求开发利用重组微生物进行GLP-1及其类似物大规模生产的生物工艺。
CN1225126A公开了一种通过基因重组技术，利用酿酒酵母发酵表达GLP-1（7-37）的方法。该方法技术难度大，生产成本高，不利于大规模生产。
CN110128552A，CN110498849A，CN107881187A，CN104592381A，CN108191981A，CN10724187A，CN107881187A公开了大肠杆菌表达GLP-1类似物的方法，这些方法均会产生包涵体，需要进行酶切且分离纯化复杂。
发明人通过筛选大量菌株后发现，选用毕赤酵母作为宿主有优势：不同的蛋白酶有不同的最佳pH作用范围，选择适当的发酵pH可以不影响细胞的生长，并且可降低蛋白酶活性，减少目的蛋白的降解。毕赤酵母的pH适应范围比较广，可以在pH 3-7的范围内生长。
CN103243118A公开了一种用毕赤酵母表达系统高效表达GLP-1人重组蛋白方法，包括载体构建和建立毕赤酵母表达GLP-1菌株，可得到99.9%纯度的产品GLP-1表达蛋白约30mg/ml。但是根据毕赤酵母表达手册，分泌蛋白占总蛋白的比例30%左右，如果发酵产量达到30g/L（30mg/ml），那么总蛋白表达量就要达到约100g/L，这都达到了高密度发酵细胞干重的重量了，而蛋白质只占细胞干重的一半左右。因此文中所述“最终产品GLP-1表达蛋白约30mg/ml”指的应该是分离纯化浓缩后的产量，而不可能是发酵产量。
发明人在实验研究中发现，虽然毕赤酵母的pH适应范围比较广，但毕赤酵母中的各种蛋白酶量会随着发酵过程中营养条件的改变发生变化，如发酵过程中的碳源改变、温度和pH变化及有害产物的形成等。在发酵过程中，由于高密度细胞的影响以及部分细胞的裂解，液泡中的蛋白酶常释放到培养基中，随着外源蛋白在培养基中的浓度不断提高，蛋白水解酶浓度也随着升高，导致目的蛋白的降解。因此，想要提高外源蛋白的产量，必须防止蛋白水解酶的水解作用，提高外源蛋白的稳定性，减少外源蛋白的损失。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明的第一目的是提供一种毕赤酵母重组菌，可高效表达GLP-1类似物，且能确保外源蛋白的稳定性。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种毕赤酵母重组菌，包含表达合成GLP-1类似物的表达系统，所述GLP-1类似物的形式包括：GLP-1截短和/或N-末端延伸的形式和/或部分氨基酸突变形式，如Arg34GLP-1（7-37）、Arg34GLP-1（9-37）。
作为本发明的进一步优选，所述表达系统包括合成所述GLP-1类似物的基因，所述基因至少包括：Arg34GLP-1（7-37）基因和/或Arg34GLP-1（9-37）基因，所述Arg34GLP-1（7-37）基因、Arg34GLP-1（9-37）基因的序列分别如SEQ ID NO：2，3所示，上述基因由Arg34GLP-1（7-37）、Arg34GLP-1（9-37）原始序列在不改变氨基酸序列的前提下进行密码子优化后得到。
作为本发明的进一步优选，所述毕赤酵母重组菌包含表达合成GLP-1类似物的重组构建物，所述重组构建物至少包括：所述Arg34GLP-1（7-37）基因和/或Arg34GLP-1（9-37）基因。
作为本发明的进一步优选，所述表达合成GLP-1类似物的重组构建物，由所述Arg34GLP-1（7-37）基因和/或Arg34GLP-1（9-37）基因，与载体pPinkα-HC（序列如SEQ ID NO：1所示）连接，以在毕赤酵母重组菌中表达合成GLP-1类似物。得到的重组载体pPinkα-HC序列如SEQ ID NO：4、5所示。
作为本发明的进一步优选，所述毕赤酵母重组菌宿主选自毕赤酵母菌属，如PichiaPink ™ Strain 1、PichiaPink ™ Strain 2、PichiaPink ™ Strain 3、PichiaPink ™ Strain 4。
本发明选用的PichiaPink表达系统是基于真核生物毕赤酵母的真核蛋白表达系统，可用于分泌型重组蛋白的高水平和大规模生产。与现有的基于毕赤酵母的蛋白质表达系统相比，PichiaPink表达系统具有以下优势：使用ADE2互补（即腺嘌呤营养缺陷型互补）而不是抗生素抗性，容易选择表达克隆。ADE2互补确保转化体在蛋白质表达放大过程中具有更高的稳定性。
本发明的第二目的是提供一种毕赤酵母重组菌的培养方法，该方法包括将所述毕赤酵母重组菌在液体培养基中进行高密度发酵培养。
作为本发明的进一步优选，所述毕赤酵母重组菌纳入了与启动子可操作地连接的所述基因，所述启动子由甲醇诱导。
作为本发明的进一步优选，所述液体培养基中pH值为4.0~5.0。
具体地，本发明的毕赤酵母重组菌的培养方法如下：
步骤一：构建表达载体：将经密码子优化后的Arg34GLP-1（7-37）、Arg34GLP-1（9-37）基因序列，设计酶切位点Xhol和Swal，片段经酶切后与毕赤酵母载体pPinkα-HC连接；
步骤二：筛选阳性转化子：将步骤1所得重组表达载体pPinKα-HC- Arg34GLP-1（7-37）、PinKα-HC- Arg34GLP-1（9-37）转化至大肠杆菌再将菌液涂布LB平板培养至单菌落后培养并提取质粒，取1uL菌液作为模板进行PCR反应，比对电泳条带是否与与目的基因片段大小相符；且将重组质粒送测序，测序结果显示该质粒序列与基因序列一致，确认为表达正确的重组子；
步骤三：线性化酵母表达载体：将步骤二所得质粒用Mss1线性化单酶切、回收；
步骤四：制备新鲜的PichiaPink ™ Strain 1、PichiaPink ™ Strain 2、PichiaPink ™ Strain 3、PichiaPink ™ Strain 4感受态细胞，将单酶切线性化的酵母表达载体pPinKα-HC- Arg34GLP-1（7-37）、PinKα-HC- Arg34GLP-1（9-37）电转化至PichiaPink™ Strain 1、PichiaPink ™ Strain 2、PichiaPink ™ Strain 3、PichiaPink ™Strain 4感受态细胞中，电转条件为：1500V，电击5ms；电击完后，迅速加入1mL预冷的1M的无菌山梨醇溶液，混合后将菌液转移至1.5mL EP管中，放入30℃恒温摇床内孵育1h；取转化后菌液100～200μL涂布于YPD平板上，将平板放置于30℃恒温培养箱中避光培养3～5天至转化子长出。
步骤五：重组子的鉴定：将转化后长出的转化子经YPD液体培养基摇瓶培养，经酵母基因组提取试剂盒对该转化子菌液进行总DNA的抽提，取少量总DNA为模板，对转化子进行PCR反应，将PCR产物送测序后鉴定序列正确即得经鉴定的重组毕赤酵母菌株。
步骤六：毕赤酵母的表达：将转化后长出的转化子经YPD液体培养基摇瓶培养诱导后获得目标蛋白；
步骤七：目标蛋白鉴定：取步骤六所得重组子表达蛋白进行液相色谱-质谱检测，所得蛋白检测结果与目标一致。
上述表达方法实现了Arg34GLP-1（7-37）、Arg34GLP-1（9-37）基因在毕赤酵母表达系统中的高效表达，在不改变其氨基酸序列的情况下，根据毕赤酵母的密码子偏爱性优化密码子合成具有天然N-端的GLP-1基因，且构建真核表达载体pPinKα-HC-Arg34GLP-1（7-37）、pPinKα-HC-Arg34GLP-1（9-37），并将其转化至毕赤毕赤酵母PichiaPink ™ Strain 1、PichiaPink™ Strain 2、PichiaPink ™ Strain 3、PichiaPink ™ Strain 4菌株中，将筛选后的重组子摇瓶表达后，利用SDS-PAGE以及液相色谱-质谱检测其蛋白表达情况。结果显示，经过SDS-PAGE、液相色谱-质谱检测，在筛选得到的重组子摇瓶表达上清中检测到大小约为3kD的目的蛋白条带，氨基酸测序显示与目标蛋白序列一致，实现Arg34GLP-1（7-37）、Arg34GLP-1（9-37）在毕赤酵母菌株中的高效分泌表达。
本发明的第三目的是提供一种毕赤酵母重组菌的用途，所述毕赤酵母重组菌用于高效表达合成GLP-1类似物。
作为本发明的进一步优选，所述GLP-1类似物用于制备多肽药物。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1）本发明选用的毕赤酵母表达载体是诱导型启动子，是一种高效的表达系统；
2）本发明选用的毕赤酵母表达载体为分泌型表达载体，只分泌很少的自身蛋白，且毕赤酵母最小生长培养基中只有少量蛋白，因此分泌的外源蛋白是培养基中蛋白的主要成分，这样有利于后期蛋白纯化步骤；
3）本发明的毕赤酵母重组菌的培养方法中的高密度发酵过程选取抑制蛋白酶活性的发酵工艺，可以确保外源蛋白的稳定性；
4）本发明的毕赤酵母表达系统工艺简单、成本低，适用于工业化大生产。
附图说明
附图1为本发明实施例1 pPinKα-HC质粒插入位点图。
附图2为本发明实施例1菌落及其PCR鉴定电泳图。
附图3为本发明实施例2摇瓶表达SDS-PAGE电泳图。
附图4为本发明实施例3发酵罐表达SDS-PAGE电泳图。
附图5为本发明实施例2表达产物AKTA分离纯化图。
附图6为本发明实施例2 Arg34GLP-1（7-37）表达产物的质谱图。
附图7为本发明实施例2 Arg34GLP-1（9-37）表达产物的质谱图。
具体实施方式
本发明实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的质粒、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
一、材料准备
1.培养基
LB培养基：LB培养基（1L）：蛋白胨10g；酵母提取物5g；NaCl 10g；琼脂（固体培养基加）18g；调节pH到7.0，在121℃灭菌20min。
MD培养基：13.4gYNB；0.0004g生物素；20g葡萄糖。葡萄糖110℃灭菌15min，其它成分121℃灭菌20min，使用前混合。
固体MD培养基：13.4gYNB；0.0004g生物素；20g葡萄糖；15g琼脂粉。葡萄糖110℃灭菌15min，其它成分121℃灭菌20min，使用前混合。
YPD培养基（1L）：蛋白胨20g；酵母提取物10g；葡萄糖20g；琼脂18g。葡萄糖110℃灭菌15min，其它成分121℃灭菌20min，使用前混合。
BMGY培养基（1L）：蛋白胨20g；酵母提取物10g；YNB13.4g；生物素0.2g；甘油10ml；磷酸钾缓冲液（pH 5.5）100mM。121℃灭菌20min，使用前混合。
BMMY培养基（1L）：蛋白胨20g；酵母提取物10g；YNB 13.4g；生物素0.2g；甲醇按设定浓度添加；磷酸钾缓冲液（pH5.5）100mM。121℃灭菌20min，使用前混合。
2.缓冲液
Buffer A: 25mM Tris-HCl，pH=7.5 。
Buffer B: 25mM Tris-HCl，1M NaCl，pH=7.5。
二、具体实施例
实施例1
构建毕赤酵母重组菌的过程如下：
（1）合成Arg34GLP-1（7-37）、Arg34GLP-1（9-37）基因序列：根据毕赤酵母密码子偏爱性，对Arg34GLP-1（7-37）、Arg34GLP-1（9-37）原始序列在不改变氨基酸序列的前提下进行密码子优化后得到基因核苷酸序列SEQ ID NO.2、3。
（2）构建重组质粒：根据上述Arg34GLP-1（7-37）、Arg34GLP-1（9-37）基因全序列以及毕赤酵母表达载体pPinKα-HC（SEQ ID NO.1）上的多克隆位点序列插入表达载体后的质粒插入位点图如图1所示：基因片段Arg34GLP-1（7-37）、Arg34GLP-1（9-37）与载体pPinKα-HC片段连接，获得重组质粒pPinKα-HC- Arg34GLP-1（7-37）、PinKα-HC- Arg34GLP-1（9-37）；将重组质粒测序，测序结果显示该质粒序列与基因序列SEQ ID NO.4、5一致，确认为表达正确。
上述操作由苏州金唯智生物科技有限公司合成，以实现在目的片段两端分别添加XhoI和SwaI酶切位点。
（3）重组质粒酵母菌株转化：将所得重组质粒pPinKα-HC- Arg34GLP-1（7-37）、PinKα-HC- Arg34GLP-1（9-37）导入大肠杆菌DH5α进行大量扩增后，提取质粒。取适量的重组质粒pPinKα-HC- Arg34GLP-1（7-37）、PinKα-HC- Arg34GLP-1（9-37），利用限制性内切酶Mss1对其进行线性化单酶切，琼脂糖凝胶电泳检测酶切线性化完全后，对酶切载体进行溶液回收。制备新鲜的PichiaPink ™ Strain 1、PichiaPink ™ Strain 2、PichiaPink ™ Strain 3、PichiaPink ™ Strain 4感受态细胞，将线性化的载体电转化至PichiaPink ™ Strain1、PichiaPink ™ Strain 2、PichiaPink ™ Strain 3、PichiaPink ™ Strain 4感受态细胞中，电转条件为：1500V，电击5ms。电击后迅速加入1mL预冷的1M山梨醇溶液，混合后将菌液转移至1.5mLEP管中，放入30℃恒温摇床内培养1h。分别取目的基因以及空载转化后菌液100-200μL涂布于PAD平板上，将平板放置于30℃恒温培养箱中培养3-5d至单菌落长出。
（4）筛选重组毕赤酵母菌株：挑取转化后PAD平板上长出的转化子于YPD液体培养基中，30℃摇瓶培养，用酵母基因组提取试剂盒抽提转化子菌液总DNA，取少量DNA为模板，对转化子进行PCR反应。(反应体系：22uL水、25uL PCR mix、1.5uL 5’AOX、1.5uL 3’CYC、0.2uL总DNA)，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物中是否有目的条带。结果如图2所示。将PCR产物测序，确认正确重组子。
通过上述实验结果可知：重组表达质粒测序验证正确，构建成功。
实施例2
重组毕赤酵母的表达与分离纯化的过程如下：
（1）重组毕赤酵母菌的表达：将鉴定后的重组毕赤酵母菌株接种于YPD平板划线，30℃条件下培养箱培养至单菌落长出。取单菌落接种至新鲜的BMGY液体培养基中，30℃、200rpm条件下摇瓶培养至OD600＝2-4无菌条件下离心收集菌体，用BMMY培养基将菌体重悬接种到新鲜BMMY液体培养基至OD600为1添加1％甲醇诱导，每间隔24h添加一次。诱导后定时取培养基上清样品，利用SDS-PAGE以及液相色谱-质谱检测蛋白表达情况。
（2）重组毕赤酵母菌表达后分离纯化：将含有重组表达质粒重组菌单菌落，在试管培养8h后按照1:10转入500mL三角瓶中30℃震荡培养，当OD值达到2-4时，转接到5L发酵罐发酵培养，30℃诱导96h后离心取上清液。
对离心得到的上清液利用离子交换层析，以5mL/min的流速穿过Buffer A平衡过的阴离子交换柱，用5个柱体积的Buffer A洗涤柱子，再使用Buffer B线性梯度洗脱。通过离子交换层析分离纯化可得到GLP-1类似物，GLP-1类似物可达200mg/ml。经液相色谱-质谱检测分离纯化的样品，纯度99.8%。
通过上述实验结果可知：发酵后的产物经过液相色谱-质谱检测，鉴定的重组毕赤酵母表达蛋白与预期一致，正确且稳定表达。
实施例3
重组工程菌的高密度发酵的过程如下：
（1）菌种活化：PAD平板所得单克隆接种到50 m YPD无菌液体培养基中，30℃、200rpm培养48 h，获得一级种子；一级种子接种到5瓶100 ml的YPD液体培养基中（500mL摇瓶），30℃，200 rpm过夜培养，获得二级种子；二级种子按10%接种比例转移至含5 L发酵培养基的10L发酵罐中，30℃高密度发酵。
（2）高密度发酵：a. 接种前使用氨水调节培养基pH至4.0，随后按4.35mL/L的量添加PTM1；上述活化的二级种子液按10%（v/v）接种到配制好的发酵培养基中。培养过程中发酵罐中的溶氧先降低后升高，当溶氧超过80%时，开始碳源（甘油）流加阶段；b. 碳源流加阶段：按20mL/h/L的流加量流加50%w/v）甘油，其中PTM1的浓度为12 mL/L；c. 待甘油完全消耗进入甲醇诱导阶段：补料培养基为100%的甲醇，其中含PTM1浓度为12 mL/L，蛋白胨浓度为15g/L。起始补料速率设定为3.6mL/h/L。当菌体适应甲醇后流加速率增加到7.3mL/h/L，以此速率流加2h后增大速率到10.9mL/h/L。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
序列表
<110> 奥锐特药业（天津）有限公司
<120> 一种毕赤酵母重组菌、培养方法及用途
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7898
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1184)..(1189)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1215)..(1222)
<400> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<220>
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<222> (1)..(24)
<220>
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<222> (115)..(122)
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ctcgagaaaa gagaggctga agctgaaggt accttcactt ccgacgtctc ttcctacttg 60
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<212> DNA
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aaggagaaaa taccgcatca ggcgccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg 7860
gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag 7920
gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag 7980
tgaattg 7987
<210> 5
<211> 7981
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60
gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120
tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180
agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240
acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300
tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360
agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420
gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480
ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt 540
cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600
ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660
ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720
gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780
atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 840
actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900
caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaacg atgagatttc cttcaatttt 960
tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct ccagtcaaca ctacaacaga 1020
agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt tactcagatt tagaagggga 1080
tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat aacgggttat tgtttataaa 1140
tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta tctctcgaga aaagagaggc 1200
tgaagctgaa ggtaccttca cttccgacgt ctcttcctac ttggagggtc aagctgctaa 1260
ggagttcatc gcttggttgg tcagaggtag aggttgaatt taaatacagg ccccttttcc 1320
tttgtcgata tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc tcccacatcc 1380
gctctaaccg aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt 1440
taatagttat gttagtatta agaacgttat ttatatttca aatttttctt ttttttctgt 1500
acaaacgcgt gtacgcatgt aacattatac tgaaaacctt gcttgagaag gttttgggac 1560
gctcgaaggc tttaatttgc aagctggatc cgcggccgcc ttccaaactc tcatggattc 1620
tcaggtaata ggtattctag gaggaggcca gctaggccga atgattgttg aggccgctag 1680
caggctcaat atcaagaccg tgattcttga tgatggtttt tcacctgcta agcacattaa 1740
tgctgcgcaa gaccacatcg acggatcatt caaagatgag gaggctatcg ccaagttagc 1800
tgccaaatgt gatgttctca ctgtagagat tgagcatgtc aacacagatg ctctaaagag 1860
agttcaagac agaactggaa tcaagatata tcctttacca gagacaatcg aactaatcaa 1920
ggataagtac ttgcaaaagg aacatttgat caagcacaac atttcggtga caaagtctca 1980
gggtatagaa tctaatgaaa aggcgctgct tttgtttgga gaagagaatg gatttccata 2040
tctgttgaag tcccggacta tggcttatga tggaagaggc aattttgtag tggagtctaa 2100
agaggacatc agtaaggcat tagagttctt gaaagatcgt ccattgtatg ccgagaagtt 2160
tgctcctttt gttaaagaat tagcggtaat ggttgtgaga tcactggaag gcgaagtatt 2220
ctcctaccca accgtagaaa ctgtgcacaa ggacaatatc tgtcatattg tgtatgctcc 2280
ggccagagtt aatgacacca tccaaaagaa agctcaaata ttagctgaaa acactgtgaa 2340
gactttccca ggcgctggaa tcttcggagt tgagatgttc ctattgtctg atggagaact 2400
tcttgtaaat gagattgctc caaggcccca caattctggt cactatacaa tcgatgcatg 2460
tgtaacatct cagttcgaag cacatgtaag agccataact ggtctgccaa tgccactaga 2520
tttcaccaaa ctatctactt ccaacaccaa cgctattatg ctcaatgttt tgggtgctga 2580
aaaatctcac ggggaattag agttttgtag aagagcctta gaaacacccg gtgcttctgt 2640
atatctgtac ggaaagacca cccgattggc tcgtaagatg ggtcatatca acataatagg 2700
atcttccatg ttggaagcag aacaaaagtt agagtacatt ctagaagaat caacccactt 2760
accatccagt actgtatcag ctgacactaa accgttggtt ggagttatca tgggttcaga 2820
ctctgatcta cctgtgattt cgaaaggttg cgatatttta aaacagtttg gtgttccatt 2880
cgaagttact attgtctctg ctcatagaac accacagaga atgaccagat atgcctttga 2940
agccgctagt agaggtatca aggctatcat tgcaggtgct ggtggtgctg ctcatcttcc 3000
aggaatggtt gctgccatga ctccgttgcc agtcattggt gttcctgtca agggctctac 3060
gttggatggt gtagactcgc tacactcgat tgtccaaatg cctagaggtg ttcctgtggc 3120
tacggttgct atcaacaacg ccaccaatgc cgctctgttg gccatcagga ttttaggtac 3180
aattgaccac aaatggcaaa aggaaatgtc caagtatatg aatgcaatgg agaccgaagt 3240
gttggggaag gcatccaact tggaatctga agggtatgaa tcctatttga agaatcgtct 3300
ttgaatttag tattgttttt taatagatgt atatataata gtacacgtaa cttatctatt 3360
ccattcataa ttttatttta aaggttcggt agaaatttgt cctccaaaaa gttggttaga 3420
gcctggcagt tttgataggc attattatag attgggtaat atttaccctg cacctggagg 3480
aactttgcaa agagcctcat gtgcggcgcg ccaggccata atggccaaac ggtttctcaa 3540
ttactatata ctactaacca tttacctgta gcgtatttct tttccctctt cgcgaaagct 3600
caagggcatc ttcttgactc atgaaaaata tctggatttc ttctgacaga tcatcaccct 3660
tgagcccaac tctctagcct atgagtgtaa gtgatagtca tcttgcaaca gattattttg 3720
gaacgcaact aacaaagcag atacaccctt cagcagaatc ctttctggat attgtgaaga 3780
atgatcgcca aagtcacagt cctgagacag ttcctaatct ttaccccatt tacaagttca 3840
tccaatcaga cttcttaacg cctcatctgg cttatatcaa gcttaccaac agttcagaaa 3900
ctcccagtcc aagtttcttg cttgaaagtg cgaagaatgg tgacaccgtt gacaggtaca 3960
cctttatggg acattccccc agaaaaataa tcaagactgg gcctttagag ggtgctgaag 4020
ttgacccctt ggtgcttctg gaaaaagaac tgaagggcac cagacaagcg caacttcctg 4080
gtattcctcg tctaagtggt ggtgccatag gatacatctc gtacgattgt attaagtact 4140
ttgaaccaaa aactgaaaga aaactgaaag atgttttgca acttccggaa gcagctttga 4200
tgttgttcga cacgatcgtg gcttttgaca atgtttatca aagattccag gtaattggaa 4260
acgtttctct atccgttgat gactcggacg aagctattct tgagaaatat tataagacaa 4320
gagaagaagt ggaaaagatc agtaaagtgg tatttgacaa taaaactgtt ccctactatg 4380
aacagaaaga tattattcaa ggccaaacgt tcacctctaa tattggtcag gaagggtatg 4440
aaaaccatgt tcgcaagctg aaagaacata ttctgaaagg agacatcttc caagctgttc 4500
cctctcaaag ggtagccagg ccgacctcat tgcacccttt caacatctat cgtcatttga 4560
gaactgtcaa tccttctcca tacatgttct atattgacta tctagacttc caagttgttg 4620
gtgcttcacc tgaattacta gttaaatccg acaacaacaa caaaatcatc acacatccta 4680
ttgctggaac tcttcccaga ggtaaaacta tcgaagagga cgacaattat gctaagcaat 4740
tgaagtcgtc tttgaaagac agggccgagc acgtcatgct ggtagatttg gccagaaatg 4800
atattaaccg tgtgtgtgag cccaccagta ccacggttga tcgtttattg actgtggaga 4860
gattttctca tgtgatgcat cttgtgtcag aagtcagtgg aacattgaga ccaaacaaga 4920
ctcgcttcga tgctttcaga tccattttcc cagcaggaac cgtctccggt gctccgaagg 4980
taagagcaat gcaactcata ggagaattgg aaggagaaaa gagaggtgtt tatgcggggg 5040
ccgtaggaca ctggtcgtac gatggaaaat cgatggacac atgtattgcc ttaagaacaa 5100
tggtcgtcaa ggacggtgtc gcttaccttc aagccggagg tggaattgtc tacgattctg 5160
acccctatga cgagtacatc gaaaccatga acaaaatgag atccaacaat aacaccatct 5220
tggaggctga gaaaatctgg accgataggt tggccagaga cgagaatcaa agtgaatccg 5280
aagaaaacga tcaatgaacg gaggacgtaa gtaggaattt atggtttggc cataatggcc 5340
tagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat 5400
tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag 5460
ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg 5520
ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc 5580
ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc 5640
agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa 5700
catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 5760
tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 5820
gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 5880
ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 5940
cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 6000
caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 6060
ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 6120
taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 6180
taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 6240
cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 6300
tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 6360
gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 6420
catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa 6480
atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga 6540
ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt 6600
gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg 6660
agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga 6720
gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga 6780
agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg 6840
catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc 6900
aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc 6960
gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca 7020
taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac 7080
caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg 7140
ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc 7200
ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg 7260
tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac 7320
aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat 7380
actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 7440
catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 7500
agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg 7560
tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat 7620
gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg 7680
tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga 7740
gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag 7800
aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc 7860
ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt 7920
aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt 7980
g 7981
Claims (10)
1.一种毕赤酵母重组菌，其特征在于，所述毕赤酵母重组菌包含表达合成GLP-1类似物的表达系统，所述GLP-1类似物的形式包括：GLP-1截短和/或N-末端延伸的形式和/或部分氨基酸突变形式。
2.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母重组菌，其特征在于，所述表达系统包括合成所述GLP-1类似物的基因，所述基因至少包括：Arg34GLP-1（7-37）基因和/或Arg34GLP-1（9-37）基因，所述Arg34GLP-1（7-37）基因、Arg34GLP-1（9-37）基因的序列分别如SEQ ID NO：2，3所示。
3.根据权利要求2所述的一种毕赤酵母重组菌，其特征在于，所述毕赤酵母重组菌包含表达合成GLP-1类似物的重组构建物，所述重组构建物至少包括：所述Arg34GLP-1（7-37）基因和/或Arg34GLP-1（9-37）基因。
4.根据权利要求3所述的一种毕赤酵母重组菌，其特征在于，所述表达合成GLP-1类似物的重组构建物，由所述Arg34GLP-1（7-37）基因和/或Arg34GLP-1（9-37）基因，与载体pPinkα-HC连接，以在毕赤酵母重组菌中表达合成GLP-1类似物。
5.一种用于培养权利要求1~4任一一种所述毕赤酵母重组菌的培养方法，将所述毕赤酵母重组菌在液体培养基中进行高密度发酵培养。
6.根据权利要求5所述的一种毕赤酵母重组菌的培养方法，其特征在于，所述毕赤酵母重组菌纳入了与启动子可操作地连接的所述基因，所述启动子由甲醇诱导。
7.根据权利要求5所述的一种毕赤酵母重组菌的培养方法，其特征在于，所述液体培养基中pH值为4.0~5.0。
8.根据权利要求1~4任一所述的一种毕赤酵母重组菌，其特征在于，所述毕赤酵母重组菌宿主为PichiaPink ™ Strain 1、PichiaPink ™ Strain 2、PichiaPink ™ Strain 3、PichiaPink ™ Strain 4中的一种。
9.根据权利要求1~4任一所述的一种毕赤酵母重组菌的用途，所述毕赤酵母重组菌用于高效表达合成GLP-1类似物。
10.根据权利要求9所述毕赤酵母重组菌的用途，所述GLP-1类似物用于制备多肽药物。
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|---|---|---|---|
| CN202011502087.4A CN112725211A (zh) | 2020-12-18 | 2020-12-18 | 一种毕赤酵母重组菌、培养方法及用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202011502087.4A CN112725211A (zh) | 2020-12-18 | 2020-12-18 | 一种毕赤酵母重组菌、培养方法及用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN112725211A true CN112725211A (zh) | 2021-04-30 |
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| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112725211A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113249288A (zh) * | 2021-07-13 | 2021-08-13 | 奥锐特药业(天津)有限公司 | 一种高效表达glp-1类似物的重组菌及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1865430A (zh) * | 2005-05-16 | 2006-11-22 | 南开大学 | 一种高产促胰岛素激素的毕赤酵母工程菌及其构建方法 |
-
2020
- 2020-12-18 CN CN202011502087.4A patent/CN112725211A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1865430A (zh) * | 2005-05-16 | 2006-11-22 | 南开大学 | 一种高产促胰岛素激素的毕赤酵母工程菌及其构建方法 |
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| CN113249288A (zh) * | 2021-07-13 | 2021-08-13 | 奥锐特药业(天津)有限公司 | 一种高效表达glp-1类似物的重组菌及其应用 |
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