CN1926238A - 植物细胞中的高效肽生产 - Google Patents

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Abstract

本发明为重组肽的生产提供了一种改进方法。特别是，本发明为病毒衣壳融合蛋白形式的重组肽的生产提供了一种改进方法，该蛋白可以在植物细胞悬浮培养物中进行体内组装。本发明还包括可以进行非传染性病毒衣壳融合肽生产的质粒、序列和植物细胞。

Description

植物细胞中的高效肽生产
相关申请的交叉引用
本申请要求美国临时专利申请序号No.60/548,744的优先权，该申请2004年2月27日提交，名称为“植物细胞中的高效肽生产”。
政府赞助的声明
本申请是在与国家健康研究院，国家变态反应和传染病研究院(NIAID)的美国政府合约下进行的，合作协议为No.1-U01-AI054641-01。
发明领域
本发明为重组肽的生产提供了一种改进的方法。特别是，本发明为病毒衣壳融合蛋白形式的重组肽的生产提供了一种改进的方法，其中该蛋白可以在植物细胞悬浮培养物中进行体内组装。本发明还包括可以用于非传染性病毒衣壳融合蛋白生产的质粒、序列和植物细胞。
发明背景
细菌、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达系统目前被用作生产重组多肽，取得了不同程度的成果。建立生产不同源多肽的表达系统中的一个目的是提供具有广泛的来源、灵活性、有效性、经济和实用的平台和方法，其可以被用于商业的、治疗的和疫苗的应用。例如，为了生产特定的多肽，其应该理想地具有一个表达系统，其可以以有效的和非昂贵的方式在体内生产大量的最终的所需产品从而消除或者减少以后的重组成本。
目前，由于具有可以用于生产大量的重组蛋白的潜力，所以细菌是进行重组多肽的生产中最广泛使用的表达载体。由于细菌通常不是糖基化，乙酰化，酰化，磷酸化或γ-羧基化的真核蛋白，因此限定了它们在体内生产特定类型异源真核多肽方面的应用，这些肽需要翻译后修饰。用于对细菌产生的真核多肽进行额外修饰的步骤有可能增加多肽产生的时间并减少其总产量，从而抵消了细菌宿主表达系统的许多优势。因此，可选择的非-细菌表达系统被应用来克服细菌表达系统固有的限制。
一个被分析了产生异外源多肽能力的特定的宿主表达系统是整个植物和植物细胞悬浮培养物。植物的安全性和廉价的培养为特定多肽的廉价生产提供了一种改进的可选择的宿主。当蛋白是复杂的、需要糖基化的，不应具有人类或动物传染性病毒的和细菌毒性的时候，这种可选择的方案特别具有吸引力。
完整植物提供了可以相对便宜地进行大量生长的优势，具有可以从收获的转基因或病毒感染植物的大量生物质中产生大量所需重组蛋白的潜力。因此，整个植物已经发展成为进行生物制药学蛋白质的商业生产的表达载体，这些蛋白通常用于人类或兽医的给药。
为了利用这些系统的固有能力，已经付出了大量的时间和资源以在非-细菌系统中改善异源蛋白的生产成本和产量。目前在这两个方面都取得了进展，用于在非-细菌表达系统中产生异源多肽的额外方法和平台将是有益的。
病毒和病毒样颗粒
在宿主细胞表达系统中改进多肽生产的一种手段是使用有传染力的重组病毒来产生目的重组多肽。植物宿主系统中有感染力的病毒的使用是公知的。参考，例如，Porta & Lomonossoff，(2002)在植物中以病毒作为载体来表达外源序列，生物工艺和遗传工程评论(″Viruses asvectors for the expression of foreign sequences in plants，″Biotechnologyand Genetic Enginering Reviews)19：245-291。
近来研究集中于在病毒样颗粒(VLP)结构中生产异源多肽。一般，壳体包裹的病毒包括一种蛋白外壳或“衣壳”，其被组装来含有病毒核酸。许多具有衣壳的病毒可以从独立表达的衣壳中来进行“自我组装”，衣壳表达在细胞内部(“体内组装”)、以及在分离和纯化后的细胞外进行(“体外组装”)。理想地，衣壳被修饰成含有目标重组多肽，产生一种重组病毒衣壳-肽融合体。融合多肽随后可以在细胞中被表达，并且，理想地，在体内进行组装来形成重组病毒或病毒样颗粒。
在植物中借助组装在VLPs中的衣壳融合蛋白进行异源蛋白的生产已经取得了大量的成功。参考，例如，C Marusic etal.，J Virol.75(18)：8434-39(2001年9月)(在完整Nicotiana benthamiana中使用传染性的螺旋马铃薯X病毒来表达病毒衣壳，其末尾融合到一种抗原性的，6个氨基酸的HIV多肽上，在体内形成重组病毒颗粒)；FR Brennan等人，Vaccine 17(15-16)：1846-57(1999年4月9日)(使用衣壳末尾融合到抗原性的金黄色葡萄球菌多肽上的具有传染性的豇豆花叶病毒或螺旋马铃薯病毒X在完整豇豆植物(vigna uniquiculata)内，在体内形成重组病毒颗粒表达)；C Porta等人，Intervirology 39(1-2)：79-84(1996)(介绍了在整个植物中表达嵌合外壳蛋白的有传染力的豇豆花叶病毒，该蛋白包括有抗原性的HIV序列)。
Lomonossoff & Johnson的美国专利NO.5,874,087介绍了在植物细胞或者整个植物中有传染性的植物病毒的生产，其中病毒衣壳被工程化地包含生物学活性多肽，例如激素、生长因子或抗原肽。一种选自豇豆花叶病毒属(Comovirus)，番茄丛矮病毒属(Tombusvirus)，南方菜豆花叶病毒属(Sobemovirus)和线虫传多面体病毒属(Nepovirus)的病毒被进行工程化以包含外源肽的编码序列，并使病毒完整工程化的基因组表达以产生重组病毒。需要特别强调的是修饰的病毒的增殖是本发明的中心。
Chapman等人的美国专利NO.6,232,099介绍了使用有传染力的、棒状的病毒以在整个植物中生产连接到病毒衣壳亚基的外源蛋白。棒状病毒，也被分类为螺旋病毒，例如马铃薯病毒X(PVX)，其具有插入到病毒基因组中的重组目标肽以产生重组病毒衣壳-肽融合体。这种重组的、有传染力的病毒随后被用来传染整个植物的植物细胞，其中，这种病毒在植物细胞中积极地复制并进一步传染其它细胞，最后传染了整个宿主植物。最后，重组的病毒衣壳-肽融合体被从植物中纯化。
Chapman等人还教导了二十面体病毒所能承受的有限的插入尺寸。Chapman等人引用了WO 92/18618，其限制了在二十面体病毒中用于在植物宿主中进行表达的重组肽的尺寸为26个氨基酸长度，来支持其论断。Chapman等人推理认为在二十面体病毒衣壳的内部插入位点存在更大的肽可能破坏蛋白的几何学和/或它成功地与其它衣壳结合的能力，从而导致嵌合型病毒组装的失败。
Koprowski等人的美国专利6,042,832中介绍了包括一种融合到抗原多肽上的植物病毒衣壳的融合衣壳蛋白。产生的颗粒在整个植物中进行生产。
但是，在衣壳融合蛋白中使用有传染力的重组病毒生产异源蛋白不是没有其缺陷。一个特别麻烦的就是这些病毒在体内进行突变的能力，产生本质上是野生型回复体的没有融合异源目标蛋白的衣壳蛋白，或者是突变的、非理想重组衣壳融合蛋白产品。参考，或者例如，Porta& Lomonossoff(1996)“病毒复制子在植物基因表达中的应用”(″Useof viral replicons for the expression of genes in plants，″)MolecularBiotechnology 5：209-221；Dolja等人(1993)“在插入一段外源基因后马铃薯Y病毒属(potyvirus)的自发突变”(″Spontaneous mutagenesisof a plant potyvirus genome after insertion of a foreign gene，″)J.Virol.67(10)：5968-5975；Dawson等人(2001)“TMV-为基础的瞬时表达载体应用中重组体的评价”(″Assessment of recombinants that arise from theuse of a TMV-based transient expression vector，″)Virol.284(2)：182-189(介绍了在接种的整个植物中异源插入基因的缺失)。这些病毒载体在整个植物中稳定性的缺乏潜在地减少了总蛋白产品的产量，并且可能导致衣壳-融合产品的不一致性和不规律性。这种无规律性可能是非常麻烦的，其中蛋白产品的完整性对所需的肽的物化特性是非常重要的。
由于在植物中有传染力的重组病毒的这种内在不稳定性，因此在商业化重组蛋白生产中需要一种有效的肽生产系统，其提供了植物-系统-型益处。
另外，在重组肽的生产中整个植物的使用也带来了潜在的问题。例如，长的发育时间、批与批之间产品产量的差异、牵制问题、在生产的早期阶段实行优良生产工艺的困难，农用化学品和化肥的污染的可能性，以及由于局部气候和土壤差异而带来的害虫、疾病和易变的培养条件的影响，所有这些都导致了用于生产重组肽的宿主系统的潜在的不一致性。
因此，本发明的一个目的是为含有衣壳融合蛋白的病毒样颗粒的生产提供稳定的和一致的植物细胞表达系统。
本发明的另一个目的是为含有衣壳融合蛋白的病毒样颗粒生产提供在稳定表达系统中用作宿主细胞的植物细胞。
本发明的又一个目的是为含有衣壳融合蛋白的病毒样颗粒在植物细胞中，包括植物细胞悬浮培养物中，生产的改进提供方法。
本发明的再一个目的是为含有衣壳融合蛋白的病毒样颗粒的生产提供在植物细胞表达系统中使用的新的构建体和核酸。
发明详述
本发明为重组肽的生产提供了方法，其中编码融合肽的无传染力质粒被稳定地插入到宿主植物细胞基因组中并在悬浮植物细胞培养物中进行表达，所述融合肽含有病毒衣壳和目的重组肽。这种病毒衣壳-异源肽融合产品可以如病毒样颗粒在体内进行表达。本发明不需要使用有传染力的病毒；而且，编码衣壳-异源肽融合产品的无传染力的核酸被稳定地插入到植物细胞基因组中，其在发酵过程中进行培养以生产目的肽。这种方法产生了很少的可变性，以及含有异源肽的衣壳融合蛋白的表达中更为稳定的宿主系统。
已经发现在整个植物中用来表达异源目标肽的含有衣壳-异源肽融合蛋白的有传染力的病毒在整个植物中表现了遗传的不稳定性，其导致在重组衣壳蛋白核酸中产生了突变，并且表达了突变的衣壳，其或者不能被组装到病毒颗粒中，或者含有一种突变的目标肽。本发明为得到的异源肽提供了增加的稳定性，并且在生长条件的精密控制、批与批之间的一致性、高水平的牵制和按照良好生产工艺来生产重组蛋白的能力等方面具有另外的益处。
衣壳-融合蛋白产品可以在细胞中形成病毒样颗粒。病毒样颗粒可以改善获得高纯度的回收肽的效率。在细胞中产生的病毒样颗粒典型地不能传染植物细胞。病毒衣壳序列可以来自于营养性的和非营养性的病毒，其中营养性是由被用作表达宿主的特定植物细胞来决定的。在一个实施方案中，病毒衣壳蛋白来自于对用来表达融合体产品的植物细胞表现出原始的或者天然的营养性的病毒。在一个实施方案中，病毒衣壳蛋白来自于对用来表达融合体产品的植物细胞不表现出原始的或天然的营养性的病毒。在一个实施方案中，除了用来生产融合体产品的所需衣壳蛋白序列外细胞中没有人工引入的病毒蛋白。在另一个实施方案中，除了用来生产融合体产品的所需衣壳蛋白序列外细胞中还包括人工引入的病毒蛋白或核酸，其中额外的病毒蛋白或核酸不为核酸序列提供传染性。在一个实施方案中，病毒衣壳来源于除植物细胞表达宿主外对不同有机体科取向的病毒。在另一个实施方案中，病毒衣壳来源于除了植物细胞表达宿主外，对不同有机体属取向的病毒。在另一个实施方案中，病毒衣壳来源于除了用来表达融合体产品的细胞外，对不同有机体种取向的病毒。在本发明的一个实施方案中，衣壳来源于棒状植物病毒。在一个特定的实施方案中，衣壳是一种来源于选自烟草花叶病毒和马铃薯病毒X(PVX)的棒状病毒衣壳。在本发明的一个实施方案中，衣壳蛋白来源于一种二十面体病毒。在一个特定的实施方案中，衣壳来源于一种植物二十面体病毒。在一个更为特定的实施方案中，二十面体衣壳来源于选自豇豆花叶病毒、豇豆退绿斑驳病毒和苜蓿花叶病毒。
本发明还提供了包括一种非-传染性核酸构建体的植物细胞，该核酸构建体含有一种编码病毒衣壳和重组肽的融合蛋白的表达盒。病毒衣壳和重组肽的融合肽可操作地连接到在植物细胞中起作用的启动子和终止子上。在一个特定的实施方案中，核酸是遗传地整合到植物细胞中的，其中这种整合产生了稳定的编码衣壳融合蛋白的核酸一代代地遗传和表达。在本发明的一个特定实施方案中，衣壳蛋白来源于二十面体病毒。在一个实施方案中细胞生产了病毒样颗粒或溶解框结构(Soluble Cage Structure)。在一个实施方案中，植物细胞是单子叶植物或双子叶植物。在一个特定的实施方案中，植物细胞是烟草。在一个可选择的实施方案中，植物细胞是稻米(Oryza Sativa)。在本发明的一个实施方案中，融合到病毒衣壳蛋白的重组肽是用于人类或动物治疗的治疗肽。在一个特定的实施方案中，重组肽是一种抗原肽。在一个特定的实施方案中，抗原肽是一种糖基化抗原肽。在一个实施方案中，植物细胞或提取物含有衣壳-重组肽病毒样颗粒，该病毒样颗粒含有抗原肽，该植物细胞或提取物可作为人类或动物疫苗给药。在一个可选择的实施方案中，纯化的衣壳-重组肽病毒样颗粒含有抗原肽，其可以用作人类或动物疫苗给药。在一个实施方案中，异源肽是一种抗菌肽。在另一个特定的实施方案中，重组肽是一种在游离单节形式时对植物细胞有毒性的肽。在一个实施方案中，融合到衣壳的重组肽长度是至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少12个，至少15个，至少20个，至少25个，至少30个，至少35个，至少40个，至少45个，至少50个，至少55个，至少60个，至少65个，至少75个，至少85个，至少95个，至少99个或至少100个氨基酸。
在本发明的一个实施方案中，融合到衣壳的重组肽含有至少一个所需目标肽的单体。在一个可选择的实施方式中，这种重组肽含有多于一个所需目标肽的单体。在特定的实施方案中，肽由至少2个、至少5个、至少10个，至少15个或至少20个分离的单体组成，其作为连体肽可操作地连接到衣壳上。在另一个实施方案中，连体肽中的独立单体被可切断的连接区域所连接。在另一个实施方案中，重组肽被插入到病毒衣壳的至少一个表面环上。在一个实施方案中，重组肽被插入到二十面体病毒衣壳的至少一个表面环上。在一个实施方案中，至少一个单体被插入到病毒衣壳蛋白的多于一个表面环上。在另外一个实施方案中，重组肽被插入到病毒衣壳的至少一个外表面环上。在一个可选择的实施方案中，重组肽被插入到病毒衣壳的至少一个内表面环上。
多于一个的病毒样颗粒的环可以被修饰。在一个特定的实施方案中，重组肽被表达在病毒样颗粒的至少两个表面环上。在另一个实施方案中，至少两个不同的肽被插入到病毒衣壳、框或病毒样颗粒的至少两个表面环上。在另一个实施方案中，至少三个重组肽被插入到病毒样颗粒的至少三个表面环上。表面环上的重组肽可以具有相同的氨基酸序列。在不同的实施方案中，表面环上的重组肽的氨基酸序列不同。
在又一个实施方案中，细胞包括至少一个编码野生型衣壳或不同的衣壳-重组肽的融合肽的额外核酸，其中多个衣壳可以在体内进行组装以生产嵌合的病毒样颗粒。
在本发明的一个实施方案中，提供的植物细胞包括病毒衣壳和重组肽的融合蛋白。在本发明的一个特定实施方案中，植物细胞是单子叶植物。在一个可选择的实施方案中，植物细胞是双子叶植物。在一个实施方案中，衣壳-重组肽融合蛋白在体内进行组装以形成病毒样颗粒。
在本发明的一个实施方案中，含有编码衣壳蛋白-重组肽融合肽的核酸构建体的植物细胞可以通过核酸转化得到。在一个实施方案中，植物细胞通过质体转化得到。在又另一个实施方案中，植物细胞通过叶绿体转化得到。
本发明进一步提供了含有编码病毒衣壳和重组肽的融合蛋白的表达盒的非传染性核酸构建体。在本发明的一个实施方案中，编码病毒衣壳和重组肽的融合蛋白的表达盒可操作地连接到启动子和终止子上。在本发明的一个实施方式中，衣壳来自于植物病毒。在本发明的一个实施方案中，衣壳来自于二十面体植物病毒。在一个特定的实施方案中，衣壳是来自于选自豇豆花叶病毒、豇豆退绿斑驳病毒和苜蓿花叶病毒的组的二十面体病毒衣壳。
在本发明的一个实施方案中，重组肽含有所需目标肽的至少一个单体。在一个可选择的实施方案中，重组肽含有所需目标肽的多于一个单体。在又一个实施方式中，重组肽被插入到二十面体病毒衣壳的至少一个表面环上。
在另一个实施方案中，核酸构建体包括额外的核酸序列，其包括在植物细胞中起作用的至少一个启动子。在另一个实施方案中，核酸构建体包括额外的核酸序列，其包括在植物细胞中起作用的至少一个启动子，以及在植物细胞中起作用的至少一个终止子。在一个实施方案中，可操作地连接到启动子和终止子序列上的编码选择标记的核酸序列包括在核酸构建体中。在一个可选择的实施方式中，可操作地连接到启动子和终止子序列上的选择标记存在于单独的核酸构建体上。在另一个实施方案中，核酸构建体包括来自于病毒RNA 3’端未翻译区域(3’UTR)的额外核酸序列。在另一个实施方案中，核酸构建体包括至少一个来自于病毒RNA的壳体包裹信号。在另外一个实施方案中，非传染性核酸构建体包括来自于病毒RNA的额外核酸序列，其中额外序列不为病毒核酸提供传染性。
一方面，本发明提供了生产重组肽的方法，其包括：
a)提供一种植物细胞；
b)提供编码融合肽的非传染性核酸，其中融合体为至少一个异源肽和至少一个病毒衣壳蛋白；
c)转化植物细胞，其中核酸随后被插入到植物细胞的基因组中；
d)在植物细胞中表达核酸，其中植物细胞于发酵工艺中在悬浮植物细胞培养物中生长；
e)其中植物细胞中的表达提供了在体内将融合肽组装成病毒样颗粒中；和
f)分离病毒样颗粒。
在一个实施方案中，方法进一步包括：e)切断融合体以从病毒衣壳蛋白中分离重组肽。在另一个实施方案中，方法进一步包括：f)在步骤e)后，分离重组肽。参考，例如，图1。在本发明的一个实施方案中，植物细胞选自稻米和烟草所组成的组。
编码重组肽和病毒衣壳蛋白的核酸可操作地连接到启动子和终止子序列上。
在一个实施方案中，方法包括联合表达的编码野生型衣壳或不同的衣壳-重组肽融合肽的另一个核酸，其中在体内组装衣壳以生产嵌合型病毒样颗粒。
本发明的另一个方面，提供了一种生产重组肽的表达系统，包括：
a)可以在植物细胞培养基中繁殖的植物细胞；
b)编码融合肽的非传染性核酸；其中融合肽包括至少一种重组肽和至少一种病毒衣壳，并且其中这种核酸可以在植物细胞中基因整合和表达；和
c)一种生长培养基。
编码融合肽的核酸可操作地连接到启动子序列和终止子序列上。表达的时候融合肽可以在细胞内组装成病毒样颗粒。在一个实施方案中，启动子是植物启动子。
附图的简要说明
图1举例说明了在植物细胞中病毒样颗粒(VLP)肽单体的生产流程图。编码所需目标肽(“I”)的序列插入到编码病毒外壳蛋白(“CP”)的序列中，构建了编码重组病毒外壳蛋白(“rCP”)的基因，其作为载体的一部分，被转化到植物细胞中并表达形成重组外壳蛋白(“rCP”)。优选的切割位点(“*”)也显示了。植物细胞被带有rCP基因的植物表达质粒转染或转化。rCP可以在植物细胞中组装成VLPs。肽插入在VLP表面进行。嵌合VLPs可以从植物细胞中进行纯化，所需目标肽可以任意从纯化的VLPs切割下来并且被纯化。
图2显示了在烟草NT1细胞中CCMV CP的表达，该细胞被传染性的CCMV RNA1，RNA2以及一种RNA3s所转染，其中RNA3被从pDOW2124(CCMV-RNA3-CP)，pDOW2125(CCMV-RNA3-CP63BamHI)，pDOW2126(CCMV-RNA3-CP102BamHI)，pDOW2127(CCMV-RNA3-CP114BamHI)，pDOW2128(CCMV-RNA3-CP129BamHI)和pDOW2129(CCMV-RNA3-CP160BamHI)所转录。植物细胞提取物在SDS-PAGE凝胶上电泳并用抗-CCMV多克隆抗体杂交。列1代表仅仅使用缓冲液，列2代表仅仅有RNA1和RNA2，列3代表RNA1和RNA2+从pDOW2124转录的wt RNA3，列4代表RNA1和RNA2+从pDOW2125转录的RNA3，列5代表RNA1和RNA2+从pDOW2126转录的RNA3，列6代表RNA1和RNA2+从pDOW2127转录的RNA3，列7代表RNA1和RNA2+从pDOW2128转录的RNA3，列8代表RNA1和RNA2+从pDOW2129转录的RNA3。
图3显示了在烟草NT1细胞中CCMV CP的表达，该细胞被传染性的CCMV RNA1，RNA2以及一种工程化的RNA3所转染，其中RNA3在位置63、102或114处含有带有抗原肽PA1、PA2、PA3或PA4的CCMV CP融合体。植物细胞提取物在SDS-PAGE凝胶上电泳并被抗-CCMV多克隆抗体杂交。列1代表尺寸标记，列2代表仅仅使用缓冲液，列3代表RNA1+RNA2+在位置63处在CP中带有PA1的嵌合型RNA3，列4代表RNA1+RNA2+在位置63处在CP中带有PA2的嵌合型RNA3，列5代表RNA1+RNA2+在位置63处在CP中带有PA3的嵌合型RNA3，列6代表RNA1+RNA2+在位置63处在CP中带有PA4的嵌合型RNA3，列7代表RNA1+RNA2+在位置102处带有PA1的嵌合型RNA3，列8代表RNA1+RNA2+在位置102处在CP中带有PA2的嵌合型RNA3，列9代表RNA1+RNA2+在位置102处在CP中带有PA3的嵌合型RNA3，列10代表RNA1+RNA2+在位置102处在CP中带有PA4的嵌合型RNA3，列11代表RNA1+RNA2+在位置114处在CP中带有PA1的嵌合型RNA3，列12代表RNA1+RNA2+在位置114处在CP中带有PA2的嵌合型RNA3，列13代表RNA1+RNA2+在位置114处在CP中带有PA3的嵌合型RNA3，和列14代表RNA1+RNA2+在位置114处在CP中带有PA4的嵌合型RNA3。
图4显示了在烟草NT1细胞中CCMV CP的表达，该细胞被传染性的CCMV RNA1，RNA2以及一种工程化的RNA3所转染，其中RNA3在位置129或160处含有带有抗原肽PA1、PA2、PA3或PA4的CCMVCP融合体。植物细胞提取物在SDS-PAGE凝胶上电泳并被抗-CCMV多克隆抗体所杂交。列1代表尺寸标记，列2代表RNA1+RNA2+在位置129处在CP中带有PA1的嵌合型RNA3，列3代表RNA1+RNA2+在位置129处在CP中带有PA2的嵌合型RNA3，列4代表RNA1+RNA2+在位置129处在CP中带有PA3的嵌合型RNA3，列5代表RNA1+RNA2+在位置129处在CP中带有PA4的嵌合型RNA3，列6代表RNA1+RNA2+在位置160处带有PA1的嵌合型RNA3，列7代表RNA1+RNA2+在位置160处在CP中带有PA2的嵌合型RNA3，列8代表RNA1+RNA2+在位置160处在CP中带有PA3的嵌合型RNA3，列9代表RNA1+RNA2+在位置160处在CP中带有PA4的嵌合型RNA3，列10代表RNA1+RNA2+wt RNA3，以及列11代表仅仅使用缓冲液。
图5显示了pDOW2160的质粒图。
图6显示了pDOW2161的质粒图。
图7显示了pDOW2162的质粒图。
图8显示了pDOW2163的质粒图。
图9显示了在被非传染性质粒pDOW2160、pDOW2161、pDOW2162和pDOW2163转染的烟草NT1细胞中嵌合型CCMV CP的表达。植物细胞提取物在SDS-PAGE凝胶上电泳并被抗-CCMV多克隆抗体杂交。列1代表仅仅使用缓冲液，列2-6代表RNA1+RNA2+wtRNA3(对照)，列7代表pDOW2160，列8代表pDOW2161，列9代表pDOW2162，以及列10代表pDOW2163。
图10显示了在被非传染性质粒pDOW2169、pDOW2170、pDOW2171和pDOW2172转染的烟草NT1细胞中嵌合型CCMV CP的表达。植物细胞提取物在SDS-PAGE凝胶上电泳并被抗-CCMV多克隆抗体所杂交。列1代表RNA1+RNA2+RNA3(对照)，列2代表缓冲液，列3代表pDOW2169，列4代表pDOW2170，列5代表pDOW2171，以及列6代表pDOW2172。
图11显示了被非传染性质粒pDOW2160、pDOW2161、pDOW2162和pDOW2163稳定转化的烟草NT1细胞中嵌合型CCMV CP的表达。在选择21天后，具有白色绒状细胞生长的愈伤组织(calli)被选择以通过蛋白印迹进行CP表达测试的分析。植物细胞提取物在SDS-PAGE凝胶上电泳并用抗-CCMV多克隆抗体进行杂交。列1代表未转化的烟草细胞(阴性对照)，列2代表用pDOW2160转化的转基因烟草细胞，列3代表用pDOW2161转化的转基因烟草细胞，列4代表用pDOW2162转化的转基因烟草细胞，以及列5代表用pDOW2163转化的转基因烟草细胞。
图12显示了被非传染性质粒pDOW2160、pDOW2161、pDOW2162和pDOW2163稳定转化的水稻细胞中嵌合型CCMV CP的表达。在选择21天后，具有白色绒状细胞生长的愈伤组织被选择以通过蛋白印迹进行CP表达测试的分析。植物细胞提取物在SDS-PAGE凝胶上电泳并用抗-CCMV多克隆抗体进行杂交。列1代表wt CCMV CP(阳性对照)，列2代表尺寸阶梯，列3代表非转基因稻米细胞(阴性对照)，列4代表用pDOW2160转化的转基因水稻细胞，列5代表wt CCMV CP(阳性对照)，列6代表尺寸阶梯，列7代表非转基因水稻细胞，列8代表用pDOW2161转化的转基因水稻细胞，列9代表wt CCMV CP(阳性对照)，列10代表尺寸阶梯，列11代表非转基因水稻细胞(阴性对照)，列12代表用pDOW2162转化的转基因水稻细胞，列13代表wtCCMV CP(阳性对照)，列14代表尺寸阶梯，，列15代表非转基因水稻细胞(阴性对照)，以及列16代表用pDOW2162转化的转基因烟草细胞。
图13显示了从所选的被非传染性质粒pDOW2160、pDOW2161、pDOW2162和pDOW2163转化的单独水稻愈伤组织中扩大的PCR产品的检测。用EtBr染色的1.2％的琼脂糖胶显示了从所选的单独水稻愈伤组织中扩大化的PCR产物。在选择21天后，具有白色绒状细胞生长的愈伤组织被选择通过PCR进行分析以测试在植物基因组中启动子-CP融合基因-终止子盒的整合。列1代表水稻愈伤组织46-5，列2代表水稻愈伤组织46-11，列3代表水稻愈伤组织46-17，列4代表尺寸梯度，列5代表水稻愈伤组织47-6，列6代表水稻愈伤组织48-12，列7代表水稻愈伤组织48-18，列8代表水稻愈伤组织48-20，列9代表水稻愈伤组织49-11，列10代表水稻愈伤组织49-18，以及列11代表阴性对照(非转基因水稻细胞)。
图14显示了从用非传染性质粒pDOW2160稳定转化的水稻细胞中利用PEG沉淀和超声波进行纯化的嵌合型CCMV VLPs的蛋白印迹分析，以及纯化的VLP样品中嵌合型CP-PA1融合蛋白的检测。样品在SDS-PAGE凝胶上电泳，并通过抗CCMV多克隆抗体检测。列1代表尺寸阶梯，列2代表从CCMV CP-PA1融合体的转基因水稻悬浮细胞中得到的总细胞溶解产物，列3代表第一PEG上清，列4代表第一PEG沉淀，列5代表第二PEG沉淀，以及列6代表第二PEG上清。
图15显示了在植物悬浮细胞中通过发酵产生嵌合型VLPs的生产方法流程图。
详细描述
本发明提供了生产重组肽的方法，其中编码包括一种病毒衣壳和目标重组肽的融合肽的非传染性质粒稳定地插入到宿主植物细胞的基因组中并在悬浮植物细胞培养物中进行表达。病毒衣壳-异源肽融合产品可以在体内作为病毒样颗粒进行表达。本发明进一步提供了这种方法中所用的植物细胞和核酸构建体。特别是，本发明提供了植物细胞，该植物细胞可以在悬浮植物细胞培养物中进行繁殖，其具有一种含有表达盒的核酸构建体，该表达盒编码病毒衣壳和重组肽组成的融合肽。融合肽可操作地连接到启动子序列和终止子序列上。在一个实施方案中，融合肽在植物细胞中的表达产生了病毒样颗粒或者溶解框结构。本发明也提供了可以结合到植物细胞基因组中并编码病毒衣壳和重组肽组成的融合肽的核酸构建体，其在一个实施方案中，可以是一种人类和动物治疗中使用的治疗肽。
本发明还提供了在悬浮植物细胞培养中生产重组肽的方法，通过提供：可以基因整合到含有表达盒的植物细胞中的核酸可操作地连接到启动子序列和终止子序列中，其中所述表达盒编码由重组肽和病毒衣壳组成的融合肽；在悬浮植物细胞培养中在植物细胞中表达核酸，其中植物细胞中的表达提供了融合肽在体内组装成病毒样颗粒；以及分离病毒样颗粒。
如这里所使用的术语“传染性”意味着病毒样颗粒转移其核酸到宿主中或者将病毒核酸引入到宿主中的能力，其中病毒核酸被复制，病毒蛋白被翻译，以及可以进一步转移核酸到宿主中的新的病毒颗粒被组装。如这里所使用的术语“非传染性”意味着病毒来源的核酸在引入到宿主中后不能在宿主中复制，其中病毒蛋白被翻译，组装的新病毒样颗粒不能在宿主中起始病毒传染过程。如这里所使用的术语“肽”不限于任何特定的分子量，并且还可以包括蛋白和多肽。
I.重组植物细胞
本发明提供了包括非传染性核酸构建体的植物细胞，其中构建体可以基因整合并编码一种由病毒衣壳和重组肽组成的融合肽，所述构建体可操作地连接到启动子序列和终止子序列上。该细胞可以被用于生产重组肽的方法中。
植物细胞可以来自于用含有一种表达盒的核酸构建体转化的天然植物细胞，其中表达盒编码由病毒衣壳和重组肽组成的融合肽，并可操作地连接到启动子序列和终止子序列上，其中核酸构建体稳定地整合到宿主细胞基因组中。稳定的转化依赖于外源DNA在基因组中的整合。外源DNA可以整合到植物的核或质粒基因组中。这种核酸构建体可以随意地插入到植物基因组中，或者可以通过同源重组被导入基因组的特定区域中。植物细胞可以通过本领域中公知的任意方法获得，包括核酸转化，质体转化和叶绿体转化。参考，例如，US 6,218,145；EP 012345149；WO 0121782；US 6,515,206；WO 99/10513；US 5,693,507；WO 02055651；WO 0170939；6,472,586；WO 02057466；US 5,057,422；WO 0120974 Staub，J.M.和Maliga，P，(1992)“通过转化同源DNA的长区域被结合到烟草质体基因组中”(″Long regionsof homologous DNA are incorporated into the tobacco plastid genome bytransformation，″)Plant Cell 4：39-45。
病毒衣壳
在一个实施方案中，本发明提供了肽的生产方法中所使用的植物细胞，改方法通过稳定整合到宿主基因组中的非传染质粒表达融合到病毒衣壳的肽，。表达可以在细胞中形成至少一种病毒样颗粒(VLP)。
病毒可以被分类为具有螺旋状对称或二十面体对称的那些病毒。通常认证的衣壳形态学包括：二十面体(包括正二十面体，等大的，类似-等大的，和成双的或“孪晶”)，多面体(包括球形，卵形，和柠檬形)，杆状的(包括杆状的或弹形的，以及纺锭状的或雪茄形的)，以及螺旋状的(包括棒状的，圆柱的，和细丝状的)；上面的任意一种可以是具有尾巴的和/或可以包含表面突起，例如长刺或突起。
形态学
在发明的一个实施方案中，衣壳的氨基酸序列可以选自分类为任意形态的病毒的衣壳。在一个实施方案中，衣壳来自于一种棒状病毒。在一个特定的实施方案中，衣壳来自于一种棒状植物病毒。在一个更为特定的实施方案中，衣壳是来自于选自烟草花叶病毒(TMV)和马铃薯病毒X(PVX)的组的棒状病毒衣壳。TMV包括特定包裹蛋白(17.5kDa)包裹的单一正向性质(single plus-sense)的基因组RNA(6.5kb)，其形成棒状颗粒(300nm)。马铃薯病毒X是细丝状的，没有包裹的；通常弯曲的病毒具有清楚的515nm的模型长度和13nm宽度(Brandes，1964)。衣壳结构形成了3.4nm的斜度的碱基螺旋(Varma等人，1968)。
在一个实施方案中，衣壳具有二十面体的形态。在一个实施方案中，衣壳氨基酸序列选自正二十面体的衣壳实体。在另一个实施方案中，衣壳氨基酸序列将选自二十面体病毒的衣壳。在一个特定的实施方案中，衣壳氨基酸序列将可以选自二十面体植物病毒的衣壳。但是，在另一个实施方案中，病毒衣壳可以来自一种对植物没有传染性的二十面体病毒。例如，在一个实施方案中，病毒是对哺乳动物有传染性的病毒。
通常，二十面体病毒的病毒衣壳由大量安排在二十面体(立方)对称体中的蛋白亚基组成。例如，天然的二十面体衣壳被构建成由3个亚基形成衣壳的一个三角形表面，60个亚基形成完整的衣壳。这种小的病毒结构的代表性例子是例如抗菌素ΦX174。许多二十面体病毒衣壳包含多于60个亚基。许多二十面体病毒的衣壳包含一种反平行的、8-链β-桶状折叠基序。这种基序具有楔形块，在一侧有四个β链(指定的BIDG)，在另一侧具有四个(指定的CHEF)。这里还有两个保守的α-螺旋(指定的A和B)，其中一个在βC和βD之间，另一个在βE和βF之间。
包装的病毒可以通过颗粒从细胞膜中的挤出(出芽)而从感染的细胞中退出，其整体不被破坏，在这个过程中颗粒被包装在来自于细胞膜的脂质封装中(参考，例如：AJ Cann(ed.)(2001)Principles ofMolecular Virology(Academic Press)；A Granoff和RG Webster(eds.)(1999)Encyclopedia of Virology(Academic Press)；DLD Caspar(1980)Biophys.J.32：103；DLD Caspar和A Klug(1962)Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.27：1；J Grimes等人(1988)Nature 395：470；JEJohnson(1996)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 93：27；以及J Johnson和JSpeir(1997)J.Mol.Biol.269：665)。
病毒
病毒分类学识别下面的包裹-颗粒实体分类：
·组I病毒，也就是，dsDNA病毒；
·组II病毒，也就是，ssDNA病毒；
·组III病毒，也就是，dsRNA病毒；
·组IV病毒，也就是，没有DNA阶段的ssRNA(+)-链病毒；
·组V病毒，也就是，ssRNA(-)-链病毒；
·组VI病毒，也就是，RNA逆转染病毒，其是ssRNA反转录的病毒；
·组VII病毒，也就是，DNA逆转染病毒，其是dsDNA反转录的病毒；
·δ病毒；
·类病毒；和
·卫星噬菌体和卫星病毒，不包括卫星核酸和朊病毒。
这些分类中的成员是本领域中普通技术人员所公知的并且被评论于：H.V.Van Regenmortel等人(eds.)，病毒分类学：病毒分类学国际会议的第七报道(2000)(学院出版社/Elsevier，Burlington Mass.，USA)；来切斯特大学(UK)微生物和免疫学院的病毒分类学网页位于 http://wwwmicro.msb.le.ac.uk/3035/Virusgroups，html；以及美国健康和人类服务部(华盛顿，D.C.，USA)的国家健康协会的美国国家医学图书馆的国家生物技术信息中心(NCBI)的分类浏览器的在线“病毒”和“类病毒”部分位于 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/tax.html。
衣壳的氨基酸序列可以选自这些分类中的任意一个分类的任意成员的衣壳。这些分类成员的衣壳的氨基酸序列可以选自来源于，包括，但是不限于，例如：NCBI提供的在线Pubmed检索工具“核酸”(Genbank)，“蛋白”，和“结构”部分位于http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi。
在一个实施方案中，衣壳氨基酸序列将选自分类成员，其对于下列宿主中的至少一个是特异的：细菌，包括酵母的真菌，植物，包括藻类的原生生物，无脊椎动物，脊椎动物和人类。在一个实施方案中，衣壳氨基酸序列将选自下述分类的任意一个成员：组I，组II，组III，组IV，组V，组VII，类病毒和卫星病毒。在一个实施方案中，衣壳氨基酸序列将可以选自这七个组中的任意一个的成员，其对于六个上述宿主类型中的至少一个是特异的。在一个特定的实施方案中，衣壳氨基酸序列将可以选自组II，组III，组IV，组VII和卫星病毒中的任意一个的成员；或者来自于组II，组IV，组VII和卫星病毒中的任意一个。在另一个实施方案中，病毒衣壳选自组IV或组VII。
病毒衣壳序列可以来自于一种对细胞没有取向(tropic)的病毒。在一个实施方案中，细胞除了所需的二十面体衣壳外不包括来自于所选特定病毒的其它病毒蛋白。在一是实施方案中，病毒衣壳来自于一种病毒，其对于除细胞外的不同有机体科具有取向。在另一个实施方案中，病毒衣壳来自于一种病毒，其对于细胞外的不同有机体属具有取向。在另一个实施方案中，病毒衣壳来自于一种病毒，其对于细胞外的不同有机体种具有取向。
在一个特定的实施方案中，病毒衣壳选自组IV中的病毒。
在一个实施方案中，病毒衣壳选自棒状植物病毒。在另一个特定实施方案中，病毒衣壳选自包括烟草花叶病毒和马铃薯病毒X的组。
在一个实施方案中，病毒衣壳选自二十面体病毒。二十面体病毒可以选自乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)，整体病毒科(Totiviridae全病毒科)，二順反子病毒科(Dicistroviridae)，嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)，披盖病毒科(Togaviridae)，多瘤病毒科(Polyomaviridae)，矮化病毒科(Nodaviridae)，复层噬菌体科(Tectiviridae)，光滑病毒科(Leviviridae)，微小噬菌体科(Microviridae)，Sipoviridae，矮化病毒科(Nodaviridae)，Picornoviridae，细小病毒(Parvoviridae)，Calciviridae，T四病毒科(Tetraviridae)，和卫星病毒中的任意一个中的一员。
在一个特定的实施方案中，序列可以选自任意一个分类的成员，其对至少一种植物宿主是特异的。在一个实施方案中二十面体植物病毒种将是植物-传染性病毒种，其是或者是布尼亚病毒科(bunyaviridae)，呼肠孤病毒科(Reoviridae)，弹状病毒科(Rhabdoviridae)，黄症病毒科(Luteoviridae)，矮化病毒科(Nanoviridae)，分体病毒科(Partitiviridae)，随伴病毒科(Sequiviridae)，芜菁发黄镶嵌病毒科(Tymoviridae)，欧尔密病毒属(Ourmiavirus)，烟草颓坏(黑斑症)卫星病毒(Tobacco NecrosisVirus Satellite)，花椰菜病毒科(Caulimoviridae)，联体病毒科(Geminiviridae)，豇豆镶嵌病毒科(Comoviridae)，南方菜豆花叶病毒属(Sobemovirus)，番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)，或者雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)分类中的任意一员。在一个实施方案中，二十面体植物病毒种是一种植物-传染性病毒种，其是或者是黄症病毒科，矮化病毒科，分体病毒科，随伴病毒科，芜菁发黄镶嵌病毒科，欧尔密病毒属，烟草颓坏(黑斑症)卫星病毒，花椰菜病毒科，联体病毒科，豇豆镶嵌病毒科，南方菜豆花叶病毒属，番茄丛矮病毒科，或雀麦花叶病毒科分类中的任意一员。在特定的实施方案中，二十面体植物病毒种是一种植物传染性病毒种，其是或者是花椰菜病毒科，联体病毒科，豇豆镶嵌病毒科，南方菜豆花叶病毒属，番茄丛矮病毒科，或雀麦花叶病毒科分类中的任意一员。在一个特定的实施方案中，二十面体植物病毒种将是一种植物-传染性病毒种，其是豇豆镶嵌病毒科，南方菜豆花叶病毒属，番茄丛矮病毒科，或雀麦花叶病毒科中的一员。在一个特定的实施方案中，二十面体植物病毒种将是一种植物-传染性病毒种，其是豇豆镶嵌病毒科或雀麦花叶病毒科中的一员。在一个特定的实施方案中病毒衣壳来自于豇豆花叶病毒(Cowpea Mosaic Virus)或豇豆退绿斑驳病毒(Cowpea Chlorotic Mottle Virus)。在另一个实施方案中，病毒衣壳来自于雀麦花叶病毒科分类的种。在一个特定的实施方案中，衣壳来自于等变环点病毒(Ilarvirus)或紫花苜蓿镶嵌病毒属(Alfamovirus)。在一个特定的实施方案中，衣壳来自于烟草条纹病毒或者苜蓿花叶病毒(AMV)(包括AMV1或AMV2)。
VLP
发明的病毒衣壳在所述的宿主细胞中是非传染性的。在一个实施方案中，病毒样颗粒(VLP)或者框结构是在病毒衣壳的表达中或者之后在宿主细胞中形成的。在一个实施方案中，VLP或框结构还包括目标肽，以及在一个特定的实施方案中，目标肽在VLP的表面进行表达。表达系统特征性地不包含允许病毒进行传染的额外病毒蛋白。在一个代表性的实施方案中，表达系统包括宿主细胞和载体，所述载体编码一种或多种病毒衣壳及可操作地连接的目标肽。载体特征性地不包括额外病毒蛋白。本发明来自于一种发现，其中病毒衣壳在特定的宿主细胞中形成了更大的范围并且允许重组肽的更有效地回收。
在一个实施方案中，VLP或框结构是衣壳的多重组装，包括从3个到大约1000个衣壳。在一个实施方案中，VLP或框结构包括至少30，至少50，至少60，至少90或至少120个衣壳。在另一个实施方案中，每一个VLP或框结构包括至少150个，至少160个，至少170个或至少180个衣壳。
在一个实施方案中，VLP被表达为一种二十面体结构。在另一个实施方案中，VLP被表达为与衣壳蛋白序列来自的天然病毒相同的几何形状。可是，在另一个实施方案中，与天然病毒的几何形状不同。在特定的实施方案中，例如，这种结构是在多重衣壳形成的颗粒中产生的但是不形成一种天然-型VLP。例如，可以形成3个病毒衣壳的框结构。在一个单独的实施方案中，可以形成大约6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，51，54，57，或60个衣壳的框结构。
在一个实施方案中，至少一个衣壳包括至少一个目的肽。在一个实施方案中，肽被在至少一个内部环中进行表达，或者在至少一个VLP的外部环中进行表达。
多于一个的病毒衣壳的环可以是被修饰的。在一个特定的实施方案中，重组肽被表达在病毒样颗粒的至少两个表面环上。在另一个实施方案中，至少两个不同的肽被插入到病毒衣壳、框或病毒样颗粒的至少两个表面环中。在另一个实施方案中，至少三个重组肽被插入到病毒样颗粒的至少三个表面环中。表面环中的重组肽可以具有相同的氨基酸序列。在单独的实施方案中，表面环中的重组肽的氨基酸序列是不同的。
在特定的实施方案中，宿主细胞可以进行修饰以改进VLP的组装。例如，宿主细胞可以被修饰以包括伴侣蛋白，其促进来自于表达的病毒衣壳的VLPs的形成。在另一个实施方案中，宿主细胞被修饰以包括一种抑制蛋白，其更为有效地调控衣壳的表达以促进VLPs形成的调控。
编码病毒衣壳或蛋白的核酸序列也可以额外进行修饰以调整VLPs的形成(参考，例如，Brumfield，等人(2004)J.Gen.Virol.85：1049-1053)。例如，这些修饰被设计以改变组装蛋白框的邻近亚基之间的内部，外部或界面。为了实现这种修饰，诱变的引物可以被用于：(i)通过用酸性谷氨酸替换N末端的碱基残基(例如K，R)来调整病毒核酸结合区域的内表面电荷(Douglas等人，2002b)；(ii)从N末端删除内部残基(在CCMV中，通常是残基4-37)；(iii)将编码11个氨基酸肽的细胞-目标序列的cDNA(Graf等人，1987)插入到暴露环的表面；和(iv)通过改变金属结合位点修饰病毒亚基之间的相互作用(在CCMV中，残基81/148突变)。
重组肽位点
在一个实施方案中，可操作地连接到病毒衣壳序列的肽含有至少两个氨基酸。在另一个实施方案中，肽是至少3个，至少4个，至少5个或至少6个氨基酸长度。在单独的实施方案中，肽是至少7个氨基酸长度。肽也可以是至少8个，至少9个，至少10个，至少11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，30，45，50，60，65，75，85，95，96，99或更多的氨基酸长度。在一个实施方案中，肽编码至少25kD。
在一个实施方案中，肽将含有从2至大约300个氨基酸，或大约5至大约250个氨基酸，或大约5至大约200个氨基酸，或大约5至大约150个氨基酸，或大约5至大约100个氨基酸。在另一个实施方案中，肽含有或大约10至大约140个氨基酸，或大约10至大约120个氨基酸，或大约10至大约100个氨基酸。
在一个实施方案中，可操作地连接到病毒衣壳序列的肽或蛋白将含有大约500个氨基酸。在一个实施方案中，肽将含有少于500个氨基酸。在另一个实施方案中，肽将含有多至大约300个氨基酸，或多至大约250个，或多至大约200个，或多至大约180个，或多至大约160个，或多至大约150个，或多至大约140个，或多至大约120个，或多至大约110个，或多至大约100个，或多至大约90个，或多至大约80个，或多至大约70个，或多至大约60个，或多至大约50个，或多至大约40个或多至大约30个氨基酸。
在一个实施方案中，融合到衣壳的重组肽是至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少12个，至少15个，至少20个，至少25个，至少30个，至少35个，至少40个，至少45个，至少50个，至少55个，至少60个，至少65个，至少75个，至少85个，至少95个，至少99个或至少100个氨基酸。
在本发明的一个实施方案中，重组肽含有至少一个所需目标肽的单体。在一个可选择的实施方案中，重组肽含有多于一个的所需目标肽的单体。在特定的实施方案中，肽是由至少2个，至少5个，至少10个，至少15个或至少20个分离的单体组成，其可以作为一种连体肽可操作地连接到衣壳上。在另一个实施方案中，在连体肽中的单独的单体是通过可切割连接区域来连接的。在又一个实施方案中，重组肽被插入到二十面体病毒样颗粒的至少一个表面环中。在一个实施方案中，至少一个单体被插入到病毒样颗粒的表面环中。
分类
融合到病毒衣壳的目标肽可以是异源肽，其不来自于病毒，以及任意地其不来自于与细胞相同的种。
融合到病毒衣壳的目标肽可以是功能肽；结构肽；抗原肽，毒性肽，抗菌肽，以及它们的片段；它们的前体；前述任意一个的结合；和/或前述任意一个的连体。本发明的一个实施方案中，重组肽是用于人类和动物治疗的治疗肽，包括用于疫苗目的的抗原肽。在一个特定的实施方案中，抗原肽是体内糖基化的。
功能肽包括，但是不限于，例如：生物活性肽(也就是，施加，诱发或导致在生物活性实体内或生物活性实体的生物功能或活性的起始、增加、延伸、衰减、终止或防止的发生的肽，其中生物活性实体例如有机体，细胞，培养物，组织，器官或细胞器官)；催化肽；微结构和纳米结构-活性肽(也就是，形成工程化微米-或纳米-结构部分的肽，或者它们的结合，其中它们表现出活性，例如，运动，能量转换)；以及刺激肽(例如，肽调味剂，着色剂，气味，信息素，引诱剂，威慑剂和排斥剂)。
生物活性肽包括，但是不限于，例如：免疫活性肽(例如，抗原肽，引起过敏的肽，免疫调整肽，免疫调节肽)；信号和信号传导肽(例如，肽激素，细胞因子和神经递质；受体；激动剂和拮抗剂肽；目标肽和信号分泌肽)；以及生物-抑制肽(例如，毒性的，杀灭的或生物静态肽，例如毒性肽或抗菌肽)。
结构肽包括，但是不限于，例如：肽适配子(aptamer)；折叠肽(例如，在另一个分子中促进或诱导物理构向的形成或保持)；粘附-促进肽(例如，粘附肽，细胞-粘附-促进肽)；界面肽(例如，肽表面活性剂和乳化剂)；微结构和纳米结构建筑肽(也就是，形成工程化微米-或纳米-结构部分的结构肽)；以及预活化肽(例如，前体-，成熟和前体成熟蛋白和肽的前导肽；inteins)。
催化肽包括，例如，apo B RNA-编辑胞啶脱氨酶肽；谷氨酰tRNA合成酶的催化肽；天冬氨酸转氨甲酰酶的催化肽；植物1型核糖体-失活肽；病毒催化肽例如，如，口蹄疫疾病病毒[FMDV-2A]催化肽；基质金属蛋白酶肽和催化金属-寡肽。
肽也可以是肽抗原决定基，半抗原或相关肽(例如，抗原病毒肽；病毒相关肽，例如，HIV-相关肽，肝炎-相关肽；抗体独特型区域；细胞表面肽；抗原的人类，动物，原生生物，植物，真菌，细菌和/或古菌肽；引起过敏的肽和减少过敏原过敏性的肽)。
肽也可以是免疫调控或免疫调节肽(例如，干扰素，白细胞介素，免疫抑制肽和免疫增强肽)；抗体肽(例如，单链抗体；单链抗体片段和构造，例如，单链Fv分子；抗体轻链分子，抗体重链分子，区域-删除抗体轻链或重链分子；单链抗体区域和分子，例如，CH1，CH1-3，CH3，CH1-4，VHCH1，CL，CDR1或FR1-CDR1-FR2区域；paratopic肽；微抗体)；其他个结合肽(例如，适配子肽，细胞内和细胞表面受体蛋白，受体片段；抗-肿瘤坏死因子肽)。
肽也可以是酶底物肽或酶抑制肽(例如，caspase底物和抑制剂，蛋白激酶底物和抑制剂，荧光-反应-能量-转移肽酶底物)
肽也可以是细胞表面受体肽配体，激动剂和拮抗剂(例如，蛙皮素，脑啡肽，食欲素，垂体腺苷酸环化活性肽，肿瘤坏死因子肽；合成肽配体，激动剂和拮抗剂)；肽激素(例如，内分泌，旁分泌和自分泌激素，包括，例如：amylins，血管紧缩素，缓激肽，降血钙素，心肌兴奋神经肽，酪啡肽，肠促胰酶肽，亲皮质素和亲皮质素-相关肽，分化因子，内啡肽，内皮素，脑啡肽，红细胞生成素，exendins，囊泡-刺激激素，甘丙肽，胃泌激素，胰高血糖素和胰高血糖素类蛋白，促性腺激素，生长激素和生长因子，胰岛素，胰激肽，激肽，血清瘦素，抗脂肪肝激素，黄体生成素，黑细胞刺激激素，褪黑激素，尿钠排泄肽，神经激肽，神经降压素(neuromedins)，孤啡肽(nociceptins)，骨钙素，oxytocins(也就是ocytocins)，甲状旁腺激素，多向生长因子(pleiotrophins)，泌乳刺激素，松弛肽，分泌素，复合胺(serotonins)，睡眠-诱导肽，生长调节素，促胸腺生成素，甲状腺刺激激素，促甲状腺素，尾加压素(urotensin)，血管活性肠肽，抗利尿激素)；肽细胞因子，趋化因子，virokine，以及病毒编码受体激素释放的和释放抑制肽(例如，亲皮质素释放激素，cortistatins，囊泡-刺激激素-释放因子，胃抑制肽，胃泌激素释放肽，促性腺激素-释放肽，生长激素释放激素，黄体生成素-释放激素，促黑细胞激素释放激素，促黑细胞-释放抑制因子，nocistatins，胰抑素(pancreastatins)，催乳素释放肽，泌乳释放-抑制因子，生长抑素；促甲状腺释放激素)；肽神经递质或通道阻断剂(例如，bombesins，神经肽Y，神经降压素，P物质)一种肽毒素，毒性前体肽，或毒性肽部分。在特定的实施方案中，肽毒素不含有D-氨基酸。毒素前体肽可以是那些不含有D-氨基酸和/或那些没有通过翻译后修饰变成天然毒性结构的，例如，举例来说，通过D构型诱导剂的作用(举例来说，肽异构酶或差向异构酶或消旋酶或转氨酶)，其可以在氨基酸中诱导D构型化，和/或乙酰化剂(举例来说，肽硫酯酶，或肽连接酶例如跨越-结合蛋白或intein)，其可以形成一种环肽结构。
毒素肽部分可以是含毒素肽的线性的或者预-环化的寡-和聚肽部分。肽毒素的例子包括，举例来说，植株毒素(agatoxins)，鹅膏毒肽(amatoxins)，卡律蝎毒素(charybdotoxins)，氯毒素(chlorotoxins)，芋螺毒素(conotoxins)，曼巴蛇神经毒素(dendrotoxins)，insectotoxins，玛格蝎毒素(margatoxins)，巨大细胞去粒化肽，皂草毒素(saporins)，蛇毒(sarafotoxins)；和细菌外毒素例如，举例来说，炭疽毒素(anthraxtoxins)，波特淋菌毒素(botulism toxins)，白喉毒素(diphtheria toxins)和破伤风毒素(tetanus toxins)。
肽也可以是代谢-和消化-相关肽(举例来说，肠促胰酶肽-肠素胰酶素肽，肽yy，胰腺肽，胃动素)；细胞结合调整或调节肽，细胞外基质肽(举例来说，粘附素，选择素，黏连蛋白)；神经保护或髓鞘形成-促进肽；集合抑制肽(举例来说，细胞或血小板集合抑制肽，淀粉形成或沉积抑制肽)；连接肽(举例来说，心脏血管连接神经肽，iga连接肽)；或混杂肽(举例来说，刺豚鼠-相关肽，淀粉肽，骨骼-相关肽，细胞-渗透肽，芋螺毒素，contryphans，contulakins，髓磷脂碱型蛋白，和其它的)。
肽也可以是在体内翻译后修饰的。在特定的实施方案中，肽可以是，不常见的或结合的，糖基化，乙酰化，酰化，磷酸化或γ-羧化。
在特定的实施方案中，目标肽对于所选择的病毒衣壳是外源的。肽在序列上可以是天然的或者合成的(并且它们的编码序列可以是天然的或者合成的核酸序列)。因此，举例来说，包含天然的，修饰的天然的，和完全人造的氨基酸序列。类似的，编码这些氨基酸序列的核酸分子序列可以是天然的，修饰的天然的或完全人工的核酸序列，并且举例来说可以是用来获得核酸分子的一种或多种合理的或随机的突变和/或重组和/或合成和/或选择方法的结果(也就是，人类应用的)。
如果可得到，编码序列可以是目标肽的天然编码序列，但是更为代表性地是一种编码序列，其在选择表达宿主细胞中的应用中被选择，改进或优化：例如，通过基因合成以反映宿主种偏好使用的密码子。在本发明的一个实施方案中，宿主种是烟草，以及烟草的偏好密码子是在设计信号序列和肽序列中考虑的。在本发明的一个可选择的实施方案中，宿主种是稻米，以及稻米的偏好密码子是在信号序列和肽序列的设计中考虑的。
抗原肽(肽抗原决定基)
在一个实施方案中，抗原肽是利用病毒衣壳的表达来生产的。抗原肽可以选自那些人类或动物致病物的抗原肽，包括传染物，寄生虫，癌细胞，和其他病原物。这种致病物也包括这些物质的毒力因子和致病因子，举例来说，这些物质的外毒素，内毒素等。病原物可以表现任意水平的毒力，也就是，它们可以是，举例来说，剧毒的，无毒的，假毒性的，半-毒性的等。在一个实施方案中，抗原肽可以含有一种来自病原物的抗原决定基氨基酸序列。在一个实施方案中，抗原决定基氨基酸序列包括至少一个这种物质的表面肽的至少一部分。在一个实施方案中，衣壳-重组肽病毒样颗粒可以被用作人类或动物应用中的疫苗。
可以选择多于一种抗原肽，其中得到的病毒样颗粒可以提供多个不同的抗原肽。在多抗原肽形式的特定的实施方案中，多个的抗原肽将全部选自来源于相同病原物的大量抗原决定基。在多抗原-肽形式的特定实施方案中，不同的抗原肽将全部选自大量紧密相关的病原基，例如，相同属中的相同种或者不同种的不同的株，亚种，生物变型，致病变种，血清变型或基因变型。
在一个实施方案中，病原物可以属于至少一种下面的组：细菌和支原体物包括，但是不限于，致病的：杆菌属，举例来说，炭疽杆菌；巴尔通氏体属菌，举例来说，巴尔通体；布鲁氏菌；伯克霍尔德菌属；例如类鼻疽杆菌属；幽门螺杆菌属；羧菌属，举例来说，破伤风羧菌，肉毒羧菌；柯克斯体属，举例来说，贝氏柯克斯体；爱德华菌属，举例来说，迟钝爱德华菌；肠杆菌属，举例来说，阴沟肠杆菌；肠球菌属，举例来说，粪肠球菌，屎肠球菌；埃希氏菌属，举例来说，大肠杆菌；弗兰西氏菌属，举例来说，土拉伦菌；嗜血杆菌属，举例来说，流感嗜血杆菌；克雷伯氏杆菌属，举例来说，肺炎克氏杆菌；军团菌属；李斯特菌属，举例来说，单核细胞增生性李斯特氏菌；流脑和淋球菌，举例来说，奈瑟氏球菌属；莫拉氏菌属；分枝杆菌属，举例来说，麻疯分枝杆菌，结核分枝杆菌；肺炎双球菌，举例来说，肺炎双球菌；假单胞菌属，举例来说，铜绿假单胞菌；病原体属，举例来说，普氏立克次体，立氏立克次体，伤寒立克次体；沙门氏菌属，举例来所，伤寒沙门氏菌；葡萄状球菌属，举例来说，金黄色葡萄球菌；链球菌属，包括A组链球菌和乙型链球菌，举例来说，肺炎链球菌，酿脓链球菌；链霉菌属；志贺菌属；弧菌属，举例来说，霍乱弧菌；以及耶尔森氏菌属，举例来说，鼠疫耶尔森氏菌，小肠结肠炎菌；芽生菌属，举例来说，皮炎芽生菌；念珠菌属，举例来说，白色念珠菌；枝孢属；球孢子菌属，举例来说，粗球孢子菌；隐球酵母属，举例来说，新型隐球酵母；组织胞浆菌属，举例来说，组织胞浆菌；以及簇孢霉菌属，举例来说，申克孢子丝菌。
在一个实施方案中，病原物来自于原生生物包括，但是不限于，致病的：变形虫，包括棘阿米巴属，变形虫属，纳归阿米巴属(Naegleriaspp.)，内阿米巴属，举例来说，即溶组织内阿米巴；隐孢子虫属，举例来说，微小隐孢子虫；环孢子虫属；脑炎微孢子虫属，举例来说，肠道脑胞内原虫；腹泻原虫属；贾第虫属，举例来说，贾第鞭毛虫；等孢属；微孢子虫属；疟原虫，举例来说，恶性疟原虫，三日疟原虫，卵圆疟原虫，间日疟原虫；弓形虫属，举例来说，龚地弓形虫；以及锥形虫属，举例来说，布氏锥形虫。
在一个实施方案中，病原物来自寄生基(举例来说，肠寄生虫)包括，但是不限于，病原的：蛔虫属，举例来说，似蚓蛔线虫；龙线属，举例来说，麦地那龙线虫；尾丝虫属，举例来说，微丝蚴；血吸虫属；旋毛虫属，举例来说，旋毛形线虫；和毛尾属线虫，举例来说，毛首鞭形线虫。
在另一个实施方案中，病原物来自病毒基包括，但是不限于，病原的：腺病毒；沙粒病毒，举例来说，拉沙热病毒；星形病毒；布尼病毒，举例来说，hanta病毒，裂谷热病毒；冠状病毒，δ病毒；细胞巨化病毒，埃巴二氏病毒，疱疹病毒，水痘病毒；细丝病毒，举例来说，埃博拉病毒，马尔堡病毒；黄病毒，举例来说，登革热病毒，西尼罗热病毒，黄热病毒；肝炎病毒；流感病毒；慢病毒，T-细胞淋巴病毒，其它的白血病病毒；诺沃克因子病毒；刺瘤病毒，其它的肿瘤病毒；副粘病毒，举例来说，麻疹病毒，腮腺炎病毒，副流感病毒，肺炎病毒，仙台病毒；细小病毒；微小核糖核酸病毒，举例来说，心脏病毒，柯萨奇病毒，埃柯病毒，小儿麻痹病毒，鼻病毒，其它的肠道病毒；痘病毒，举例来说，天花病毒，牛痘病毒，副痘病毒；呼肠道病毒，举例来说，colti病毒，环状病毒，轮状病毒；棒状病毒，举例来说，狂犬病毒，小泡口腔炎病毒；和外衣病毒，举例来说，风疹病毒，辛德毕斯样病毒，西脑炎病毒。
在一个特定的实施方案中，抗原肽选自的由犬细小病毒肽(Canineparvovirus peptide)，炭疽杆菌保护抗原(PA)抗原肽和东马脑炎病毒(Eastern Equine Encephalitis virus)抗原肽组成。在一个特定的实施方案中，抗原肽是具有选自PA1(SEQ.ID.NO.1)，PA2(SEQ.ID.NO.2)，PA3(SEQ.ID.NO.3)或PA4(SEQ.ID.NO.4)氨基酸序列的炭疽杆菌来源的肽。
宿主-细胞毒性肽
在另一个特定的实施方案中，重组肽在游离的单体形式的时候对宿主细胞是有毒性的肽。在特定的实施方案中，与病毒衣壳结合表达的目标肽是宿主细胞毒性肽。宿主细胞毒性肽显示是一个生物抑制肽，其对在其中表达的宿主细胞、或者对细胞培养物中的其它细胞或者宿主细胞是其中之一的有机体、或者提供宿主细胞的有机体或种的细胞是生态静力学的，杀灭的或有毒性的。在一个实施方案中，宿主细胞毒性肽是生物抑制肽，其对在其中表达的宿主细胞是生物静态的，杀灭的或有毒性的。宿主-细胞-毒性肽的例子包括，但是不限于，肽毒素，抗菌肽，和其它抗生素肽。
抗菌肽
在另一个特定的实施方案中，重组肽是一种抗菌肽的肽。抗菌肽包括，举例来说，抗细菌肽例如，举例来说，蛙皮素，β防御素，一些α-防御素；蛋白酶抑制素(cathelicidin)；histatin；抗真菌肽；抗原生动物肽；合成的AMPs；肽抗生素或者它们的线性或预-环化寡-或聚-肽部分；其它的抗生素肽(举例来说，驱虫肽，溶血肽，杀肿瘤肽)；和抗病毒肽(举例来说，一些α-防御素；杀病毒肽；抑制病毒传染的肽)。在一个实施方案中，抗菌肽选择组由D2A21抗菌肽组成。
表达VLP所用的细胞
用作表达本发明的病毒衣壳或病毒衣壳融合肽的宿主的细胞(也指“宿主细胞”)是这样一个细胞，在其中病毒衣壳的表达不允许细胞进行复制或传染。在一个实施方案中，病毒衣壳来自的病毒其对宿主细胞来自的特定种的细胞不具有传染性。例如，在一个实施方案中，病毒衣壳来自一种二十面体植物病毒并且在植物种宿主细胞中进行表达，其中植物种不是病毒的天然营养宿主。在另一个实施方案中，病毒种传染哺乳动物和包括一个植物宿主细胞的表达系统。在一个可选择的实施方案中，病毒是用作表达衣壳-重组肽融合体的宿主细胞所属于的特定植物种的营养病毒。
植物宿主细胞可以是来自维管束植物(Tracheophyta)，真叶柄植物(Euphyllophyta)，种子植物(Sperinatoplzyta)或被子植物(Angiospermopliyta)的任意植物细胞。在一个特定的实施方案中，植物细胞是单子叶植物，包括，但是不限于，成员为：棕榈科，举例来说，椰子属，油棕属；薯蓣科，举例来说，薯蓣属；禾本科(Poaceae)，举例来说，燕麦属，大麦属，稻米属，黍属，小麦属，玉米属；以及芭蕉科，举例来说，芭蕉属。
在一个可选择的实施方案中，植物细胞的成员是双子叶植物，包括，但是不限于，举例来说：苋科，举例来说，苋属，Beta属，苋色黎属；伞形科(伞形科)，举例来说，胡萝卜属，防风属；十字花科(十字花科)，举例来说，拟南芥属，芸苔属；菊科，举例来说，向日葵属；旋花科，举例来说，番薯属；葫芦科，举例来说，西瓜属，甜瓜属，南瓜属；大戟科；豆科(豆科)，举例来说，大豆属，扁豆属，苜蓿属，菜豆属，豌豆属，三叶草属，蚕豆属，豇豆属；亚麻科，举例来说，亚麻属；以及茄科，举例来说，辣椒属，番茄属，烟草属，茄属。
在一个特定的实施方案中，宿主细胞选自的组由拟兰芥，东北红豆杉，长春花，烟草，稻米，番茄和大豆组成。
II核酸构建体
本发明进一步提供了非传染性核酸构建体，其可以稳定地结合到宿主细胞基因组中并编码衣壳和重组肽组成的融合肽的。融合肽可以可操作地连接到启动子序列和终止子序列上。在一个实施方案中，用于转化植物细胞的核酸构建体包括a)编码重组肽的核酸序列，和b)提供编码病毒衣壳的核酸序列，其中a)的核酸和b)的核酸被可操作地连接以形成稳定地插入到植物宿主细胞基因组中的融合蛋白，其中它在植物细胞中进行表达。
在特定的实施方案中，载体包括多衣壳、或多个目标肽的序列。在一个实施方案中，载体可以包括至少两个不同的衣壳-肽编码序列。在一个实施方案中，编码序列被连接到相同的启动子上。在特定的实施方案中，编码序列被内部核糖体结合位点分开。在另一个实施方案中，编码序列被连接序列所连接，以允许在细胞中形成病毒样颗粒。在另一个实施方案中，编码序列被连接到不同的启动子上。这些启动子可以被相同或不同的诱导条件所构建或启动。在另一个实施方案中，提供了可以插入到基因组中并编码不同衣壳-肽结合体的多个载体。多个载体可以包括启动子，启动子是被相同的诱导条件或和不同的诱导条件所构建或启动的。在一个实施方案中，病毒衣壳来自于二十面体病毒衣壳。
目标肽的编码序列可以被插入到病毒衣壳或预定位点衣壳的编码序列中。肽也可以被插入到非预定位点和筛选用于VLPs生产的细胞。在一个实施方案中，肽被插入到衣壳编码序列中以在VLP的形成过程中表达为环状。在一个实施方案中，一个肽编码序列包括在载体中，但是在另一个实施方案中，包括了多个序列。多序列可以是连体的形式，例如通过可切割连接序列连接的连体。
肽在衣壳中可以在多个位点被插入。因此，肽在衣壳中可以被插入到多个表面环基序中；肽也可以被插入到给定环基序的多个位点处。插入的单独的功能和/或结构肽，和/或完整的肽插入体，可以被切割位点分开，也就是，切割或水解蛋白的基团所处的位点其将肽与衣壳结构或组装体的其余部分分隔开。
肽可以被插入到外表面环中和/或内表面环中，也就是，在衣壳的环中其分别背向或朝向衣壳的中心。衣壳表面环中的任何任何氨基酸或肽键可在肽的插入中起作用。典型地，插入位点将选择在大约环的中心，也就是，大约的位置位于折叠衣壳-肽三级结构中心的最远端。肽编码序列可以被可操作地插入到对应于给定环的近似中心位置的衣壳编码序列。这包括保持衣壳肽序列部分的阅读框，其从肽插入位点的下游开始合成。
在另一个实施方案中，肽可以被插入到衣壳的氨基末端。肽可以通过一个或多个连接序列被连接到衣壳上，包括上面所述的可切割的连接。在又一个实施方案中，肽可以被插入到衣壳的羧基末端，肽也可以通过一个或多个连接子连接到羧基末端，其可以通过化学或酶水解进行切割。在一个实施方案中，肽序列既被连接到氨基末端又被连接到羧基末端，或者一个末端和至少一个内部位点，例如在衣壳的三维构型中被表达在衣壳表面上的位点。
在一个实施方案中，肽被插入到来自于豇豆退绿斑驳病毒的衣壳中。在一个特定的实施方案中，肽可以被插入到CCMV外壳蛋白的129氨基酸处。在一个实施方案中，肽序列可以被插入到CCMV外壳蛋白的63、102、114、129或160氨基酸处。在另一个实施方案中，肽序列可以被插入到CCMV外壳蛋白的60、6l、62或63氨基酸处。在又一个实施方案中，肽可以既被插入到CCMV蛋白的129氨基酸处，又被插入到60-63氨基酸处。
在一个特定的实施方案中，本发明提供了一种包括a)编码抗原肽核酸和b)编码病毒衣壳核酸的核酸构建体，其中在细胞中表达的时候a)的核酸和b)的核酸被可操作地连接以形成一种融合蛋白。其它在构建核酸构建体中所使用的衣壳和重组肽在上面已经进行了介绍。
启动子
在一个实施方案中，核酸构建体包括一个可操作地连接到编码衣壳-重组肽融合肽的核酸序列上的启动子序列。可操作地结合或连接是指任意的形式，其中转录和任意的翻译调控元件共价连接到所述的序列上，因此通过宿主细胞的作用，调控元件可以指导目标序列的表达。在可选择的实施方案中，使用基因诱捕技术可以将编码衣壳融合产品的核酸构建体插入到宿主细胞天然启动子的框中。
在一种发酵方法中，一旦发酵开始，理想的是具有高水平的生产从而将表达系统的功效最大化。启动子起始转录并且通常位于转录起始位点上游1-100个核苷的位置。理想地，启动子要足够强大以允许大量重组肽的聚集。
按照本发明所使用的启动子可以是构建启动子或者调控启动子。在本技术领域中所使用的有用的调控启动子的一般例子包括：乙醇-诱导启动子；缺铁性-诱导启动子；创伤-诱导启动子和激素诱导，举例来说，植物激素-诱导启动子。有用的构建启动子的一般例子包括泛素启动子，肌动蛋白启动子，微管蛋白启动子和木薯叶脉花叶病毒启动子。在本发明中所使用的其它类型的启动子包括组织-特异启动子，例如玉米蔗糖合成酶1(Yang等人，1990)，玉米乙醇脱氢酶1(Vogel等人，1989)，玉米光线收集复合体(Simpson，1986)，玉米热激蛋白(Odell等人，1985)，豌豆小亚基RuBP碳酸酶(Poulsen等人，1986；Cashmore等人，1983)，Ti质粒甘露碱合成酶(Langridge等人，1989)，Ti质粒胭脂碱合成酶(Langridge等人，1989)，矮牵牛花查耳酮异构酶(VanTunen等人，1988)，豆胶丰富蛋白1(keller等人，1989)，CaMV 35s转录(Odell等人，1985)和马铃薯patatin(Wenzler等人，1989)。优选的启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV 35s)启动子，富α-淀粉酶RAmy3D启动子和S-E9小亚基RuBP碳酸酶启动子。另外，大量由于环境、激素、化学品和/或发展信号而进行调控的植物基因启动子可以被用于在植物细胞中表达可操作连接基因，包括由下列因素调控的启动子(1)热(CAllis等人，Plant Physiol.88：965，1988)，(2)光(举例来说，豌豆rbcS-3A启动子，Kuhlemeier等人，Plant Cell 1：471，1989；玉米rbcS启动子，Schaffner和Sheen，Plant Cell 3：997，1991；或叶绿素a/b-结合蛋白启动子，Simpson等人，EMBO J.4：2723，1985)，(3)激素，例如脱落酸(Marcotte等人，Plant Cell 1：969，1989)，(4)创伤(举例来说，wunI，Siebertz等人，Plant Cell 1：961，1989)，或者(5)化学品例如茉莉甲酯，水杨酸，或安全剂。也可以使用(6)机体-特异启动子(举例来说，Roshal等人，EMBO J.6：1155，1987；Schernthaner等人，EMBO J.7：1249，1988；Bustos等人，Plant Cell 1：839，1989)。在本发明中所使用的其它启动子包括那些在WO 97/48819中所介绍的；在美国专利号5,591,605中所介绍的菜豆蛋白启动子；在美国专利号5,641,876中所介绍的稻米肌动蛋白启动子；在WO98/56921中所介绍的per5启动子；在WO00/12681中介绍的γ玉米蛋白启动子；以及其它的在美国专利号6,825,006；美国专利号6,660,911中所介绍的启动子，以及在植物启动子序列数据库PlantProm中所介绍的植物启动子，介绍于Shahmuradov等人，(2003)，“plantprom：植物启动子序列数据库，”Nucleic Acid Res.31(1)：114-117，并且位于http://mendel.cs.rhul.ac.uk/mendel.php？topic＝plantprom。另外的启动子也可以包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子或者它的增强版本，杂合(ocs)3mas启动子，以及来自于玉米或拟南芥的泛素启动子。
具有所选植物宿主细胞天然启动子核酸序列的启动子也可以被用于调控编码目标肽的转基因的表达。也可以使用一前一后的启动子，其中多于一个启动子被共价连接到另一个上，序列或者是相同的或者是不同的。
具有来自于病毒的核酸序列的启动子也可以被用于指导编码目标肽的转基因的表达。
调控启动子可以使用启动子调控蛋白，从而控制作为启动子其一部分的基因的转录。在这里使用了一种调控启动子后，按照本发明相应的启动子调控蛋白也是表达系统的一部分。大量调控-启动子/启动子-调控-蛋白对在本领域中是公知的。
其它元件
在核酸构建体中可以包括其它的调控元件。这种元件包括，但是不限于，例如，转录增强序列，翻译增强序列，其它启动子，活性剂，翻译开始和终止信号，转录终止子，顺反子调控子，多顺反子调控子，tag序列，例如核苷序列“tags”和“tag”肽编码序列，其有助于表达肽的确认、分开、纯化和分离，包括His-tag，Flag-tag，T7-tag，S-tag，HSV-tag，B-tag，Strep-tag，多聚精氨酸，多聚半胱氨酸，多聚苯丙氨酸，多聚天冬氨酸，(Ala-Trp-Trp-Pro)n，硫氧还蛋白，β-半乳糖苷酶，氯霉素酰基转移酶，环麦芽糊精糖苷转移酶，CTP：CMP-3-脱氧-D-manno-octulosonate cytidyltransferase，trpE或trpLE，抗生物素蛋白，链霉亲和素，T7基因10，T4gp55，葡萄球菌蛋白A，链球菌蛋白G，GST，DHFR，CBP，MBP，半乳糖结合区域，calmodulin结合区域，GFP，KSI，c-myc，ompT，ompA，pelB，NusA，泛素和hemosylin A。
在一个实施方案中，核酸构建体进一步包括一个tag序列，其接近于目标重组肽的编码序列，或者连接到病毒衣壳的编码序列。在一个实施方案中，这种tag序列允许蛋白的纯化。这种tag序列可以是亲和性的tag，例如六-组氨酸亲和性tag。在另一个实施方案中，亲和性tag可以是谷胱甘肽-S-转移酶分子。这种tag也可以是荧光分子，例如YFP或GFP，或者这种荧光蛋白的类似物。这种tag也可以是抗体分子的一部分，或者用于纯化的已知抗原或结合伴侣的配体。
除了衣壳-重组肽编码序列外，本发明可以包括下述可操作连接到其上的调控元件：启动子，转录终止子，翻译开始和终止信号。
本发明中所使用的翻译和转录元件以及其它元件的其它例子被描述于：JD Watson等人(eds.)，Recombinant DNA，pp.273-92(1992)(Scientific American Books，W.H.Freeman和Co.，New York，NY，USA)；以及I Mitsuhara等人，″在单子叶植物和双子叶植物中提高外源基因表达的有效启动子盒(Efficient promoter cassettes for enhanced expressionof foreign genes in dicotyledonous and monocotyledonous plants)，″PlantCellPhysiol.37(1)：49-59(1996)。
在一个特定的实施方案中，核酸构建体包括额外的来自于病毒基因组核酸序列3’未翻译端(3’UTR)的核酸序列，其中病毒基因组核酸序列用来获得病毒衣壳蛋白。在一个特定的实施方案中，3’UTR含有在野生型病毒中翻译调控或衣壳形成中起作用的序列。在一个实施方案中，3’UTR序列是上游假结(pseudoknot)区域(UPD)。参考，例如，Leathers等人，(1993)″A phylogenetically conserved sequence withinviral 3′untranslated RNA pseudoknots regulates translation，″Mol.Cell Biol.13(9)：5331-5347。在一个特定的实施方案中，3’UTR来自于病毒基因组的病毒衣壳编码区域的3’UTR。在一个更为特定的实施方案中，3’UTR来自于豇豆退绿斑驳病毒RNA33’未翻译区。在一个实施方案中，3’UTR序列包括一种包裹信号。
在一个可选择的实施方案中，核酸构建体包括至少一个来自于病毒核酸序列的包裹信号。包裹信号可以来自于病毒基因组序列的5’UTR，3’UTR或内部序列。在一个实施方案中，核酸构建体被包裹在VLP中。
在一个实施方案中，非-传染性核酸构建体除了病毒衣壳蛋白序列外也包括其它的来自于病毒或非病毒核酸序列的序列。
载体
在植物细胞中使用的可以稳定结合到宿主细胞基因组中并表达衣壳-重组肽融合肽的有用的表达载体是通过插入结构DNA序列来构建得到的，其中结构DNA序列与具有功能启动子的开放阅读框中的适当翻译起始和终止信号一起编码与衣壳肽融合到一起的所需目标肽。这种载体也可以包括一种或多种表型选择或筛选标记以允许宿主细胞的选择。另外地，这种选择或筛选标记可以提供在分开的质粒上。
与用于表达的重组衣壳-编码核酸一起用于转化目标植物宿主细胞的大量载体和/或运送体在本领域中是公知的，并且其中任意一个可以被用于表达本发明所述基因。参考，例如，IJ Goderis IJ等人，“一套可以允许多达6个表达单元轻易插入的植物转化载体套件(A set ofmodular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up tosix expression units)”，Plant Mol.Biol.50(1)：17-27(2002)；AHChristensen & PH Quail，″在单子叶植物中用于选择和/或筛选标记基因的高水平表达的泛素启动子基础的载体(Ubiquitin promoter-basedvectors for high-level expression of selectable and/or screenable markergenes in monocotyledonous plants)，″Transgenic Res.5(3)：213-18(1996)；JD Jones等人，″在转基因植物中用于转化、表达外源基因和测验转位子删除的有效载体(Effective vectors for transformation，expression ofheterologous genes.and assaying transposon excision in transgenicplants)，″Transgenic Res.1(6)：285-97(1992)；AP Gleave AP，″有利于将克隆DNA有效结合到植物基因组中的具有T-DNA组织结构的通用二元载体系统(A versatile binary vector system with a T-DNA organisationalstructure conducive to efficient integration of cloned DNA into the plantgenome)，″Plant Mol.Biol.20(6)：1203-07(1992)。
因此，质粒，转位子，基因组DNA，基因组RNA，植物人造染色体，以及其它的核酸载体可以被应用。一些可以被使用的载体的例子包括，但是不限于，pRT101，pRT101-MCS，pRT104，pRT104.24LS，pRT104.N-myc，pRT104.C-myc，pRT104.N-3HA，pRT104-N3HadAsp，pRT104.N-6HA，pRT104-N6HadAsp，pRT104.C-3HA，pRT104-GST，pRT104NES(A2)，pRT103-3HA，pRTd35S-Luci(-)，pRTd35S-Luci-NES，pRTd35S-GFP，pRTd35S-GFP.SacI，pRTdS GFP.Bg1II，pRTd35S-Ds-Red，pRTd35S-profillin，pBIGa14DBD，pRT-3HAxHsfA2DBD，pRT-3HAxGa14DBD，pUC，pIL-TAB，pET，pME，pBBR，和pROKII。当使用颗粒轰击引入载体到细胞中时，在本发明中可以使用任意的DNA质粒或DNA分子。
在一个特定的实施方案中，载体是pIL-Tab。在一个更为特定的实施方案中，载体是编码豇豆退绿斑驳病毒(CCMV)外壳蛋白的pIL-Tab。在一个特定的实施方案中，载体是pIL-Tab，并且异源肽选自的组由PA1，PA2，PA3或PA4组成。在又进一步的实施方案中，载体选自的组由pDOW2160(Seq.ID.No.5)，pDOW 2161(Seq.ID.No.6)，pDOW2162(Seq.ID.No.7)，pDOW2163(Seq.ID.No.8)，pDOW 2169(Seq.ID.No.9)，pDOW2170(Seq.ID.No.10)，pDOW2171(Seq.ID.No.11)和pDOW2172(Seq.ID.No.12)组成。
可选择的，或者另外，一些运载体可以被使用，例如，脂质体，树枝状聚合物，阳离子聚合体，和阳离子聚合体-脂质体复合物，所有这些都被公开在大量将核酸转移到到细胞或原生质体内的方法中。可选择的，裸的DNA或裸的RNA可以被转移到植物宿主中。
载体、运送体、或裸的核酸可以利用本领域中公知有效的方法直接转化到植物细胞或原生质体中。例如，任意的下述方法可以被用来利用重组衣壳-编码核酸转化植物目标宿主：农杆菌属；微颗粒轰击如描述于V.Vasil et al.，Bio/Technology 9,743(1991)；如描述的原生质体电穿孔，例如，MC C hupeau等人针对莴苣进行的，Bio/Technology 7,503(1989)；使用例如金刚砂丝，玻璃或碳化硅进行的表面磨损；例如，如A.Deshayes等人描述的原生质体的脂质体融合，EMBO J.4，p.2731-2737(1985)；细胞-细胞(原生质体-原生质体)融合；以及内生植物病毒感染，也就是，利用工程化病毒载体转化植物目标宿主，工程化病毒载体是一种所选择的目标宿主是其天然宿主的病毒类型，并且其中病毒已经被工程化含有重组衣壳-蛋白-编码核酸(其中来自被制造的重组体的衣壳-蛋白-编码核酸选自一种病毒，其中植物目标宿主不是其天然宿主)；聚乙二醇调节转化被描述于，例如，I.Potrykus等人，Mol.Gen.Genetics，197，183-188；以及显微注射被描述于，例如RGriesbach，Biotechnology 3，p.348-350和CKShewmaker Mol.Gen.Genetics，202p.179-185(1986)。
III.衣壳融合体在植物细胞中的表达
本发明还提供了生产重组肽的方法。这种方法包括：
a)提供植物细胞；
b)提供含有编码融合肽的表达盒的非传染性核酸；其中融合体是重组肽和二十面体衣壳；
c)在植物细胞中表达核酸，其中在细胞中的表达提供融合肽在体内组装成病毒样颗粒；和
d)分离病毒样颗粒。
融合肽被可操作地连接到启动子序列和终止子序列。在一个实施方案中，这种方法进一步包括：e)从病毒衣壳蛋白中切割重组肽。在又一个实施方案中，该方法进一步包括：f)从步骤e中分离重组肽。参见，例如，图1。
肽可以被表达为衣壳肽中的单-拷贝肽插入体(也就是，以单独插入体的形式从重组衣壳肽编码序列中进行表达，该序列是肽的单一-顺反子)或者以二-、三-、或多-拷贝肽插入体的形式进行表达(也就是，以连接插入体的形式从重组衣壳蛋白编码序列中表达，该序列是肽的多顺反子；连接插入体可以含有相同目的外源肽的多拷贝或者可以含有不同目的外源肽的拷贝)。连接体可以是同源-或异源-连接体。
在一个实施方案中，分离的病毒样颗粒可以被用于人类或动物的疫苗应用。
在另一个实施方案中，核酸构建体可以与另一种编码野生型衣壳的核酸进行联合表达。在一个特定的实施方案中，联合表达的衣壳/衣壳-重组肽融合体颗粒在体内进行组装以形成嵌合型病毒样颗粒。嵌合型VLP是包括衣壳或被至少两种核酸构件体编码的衣壳-肽融合体的病毒样颗粒。
在又一个实施方案中，核酸构建体可以与另一种编码不同衣壳-重组肽融合颗粒的核酸进行联合表达。在特定的实施方案中，联合表达的衣壳融合体颗粒将在体内进行组装以形成嵌合型病毒样颗粒。
在又一个实施方案中，被设计用来表达不同肽的第二个核酸，例如伴侣蛋白，可以伴随着编码融合肽的核酸被表达。
本发明所使用的植物细胞、衣壳和重组肽在上面进行了描述。
在一个实施方案中，表达的病毒衣壳-异源肽融合体产品在细胞中以可溶的形式进行表达。
在一个实施方案中，表达的病毒衣壳-重组异源融合体产品在细胞中组装成VLPs。
在一个单独的实施方案中，表达的目标病毒衣壳-异源肽融合体产品的一部分在细胞中形成了不可溶聚集体。在一个实施方案中，目标肽可以从不可溶聚集体的中还原。
目标肽的切割
在一个实施方案中，方法进一步包括：e)切割融合体产品以从衣壳中分离重组肽。
可切割连接序列可以包括在病毒蛋白和重组肽之间。可以切割这种序列的试剂的例子包括，但是不限于化学试剂例如酸(HCl，蚁酸)，CNBr，羟胺(例如，天冬氨酰-糖胶)，2-硝基-5-硫氰酸苯甲酸盐，O-亚碘酰苯甲酸盐，以及酶试剂，例如，内切肽酶，内切蛋白酶，胰蛋白酶，clostripain，以及葡萄球菌蛋白酶。
可切割连接序列在本领域中是公知的。在本发明中，任意可以被切割试剂确认的可切割连接序列也可以被使用，包括二肽切割序列例如Asp-Pro。
表达
本发明的方法优选在植物宿主细胞中导致以所需序列和构型形式存在的所需衣壳-融合产品产量的增加。增加的产量可选择地可以是每克蛋白产品、每克宿主蛋白中或者占总的重组肽产品的百分比的所需肽水平的增加。增加的产量也可以是每克重组体或每克宿主细胞蛋白中可重获肽的水平的增加，例如可溶解蛋白。增加的产量也可以是蛋白的总水平的增加和蛋白活性的增加或这蛋白溶解水平的增加的任意的结合。
重组蛋白的改进的表达可以通过蛋白表达来实现，其作为一个衣壳融合蛋白并随后插入到VLPs中。在特定的实施方案中，至少60个，至少70个，至少80个，至少90个，至少100个，至少110个，至少120个，至少130个，至少140个，至少150个，至少160个，至少170个或至少180个目标肽的拷贝被表达在每个VLP中。这种VLPs可以被生产并从宿主细胞的细胞质、外周胞质或细胞外培养基中重新获得。
在一个实施方案中，肽在细胞中可以是不溶的。在特定的实施方案中，在不形成天然型VLP的多个衣壳形成的颗粒中产生了可溶性或不溶性肽。例如，可以形成仅仅有3个病毒衣壳的框架结构。在特定的实施方案中，这种衣壳结构包括多个目标肽拷贝，并且在特定的实施方案中，包括至少10个，至少20个，或至少30个拷贝。在特定的实施方案中，这种肽是在植物细胞的液泡中形成的。
肽或病毒衣壳序列也可以包括一种或多种瞄定序列或辅助纯化的序列。这些也可以是亲和性tag。这些也可以是指导衣壳组装到VLP中的瞄定序列。
细胞生长
利用载体对植物宿主细胞进行的转化可以使用本领域中任意已知的转化方法进行，并且植物宿主细胞可以按照完整的细胞或者原型进行转化。转化方法的例子已经在上面进行了描述。
如这里所使用的，术语“发酵”包括所用的字面意义上的发酵含义，以及另一种含义是所用的另外的、非发酵培养模式。发酵可以按照任意的规模进行。本领域中一般公知的任意方法都可以用在发酵中。参考，例如，Hellwig等人，(2004)″用于生产重组蛋白的植物细胞培养Plant cell cultures for the production of recombinant proteins，″NatureBiotech 22(11)：1415-1422；Sajc等人，(2000)″植物工程化生物反应器：进一步研究的展望Bioreactors for plant engineering：an outlook forfurther research，″Biochem Engin.J.4：89-99。在一个实施方案中，发酵培养基可以选自任意可行的植物细胞培养基。任意地，培养基中可以包括添加剂，例如，PVP，BSA，NaCl，布雷菲尔德酶A(BrefeldinA)，还原锰，聚醚消泡剂，聚乙烯乙二醇，凝胶，蛋白酶抑制剂，氧化还原辅助因子和二甲亚砜。
按照本发明表达系统可以在任意的发酵模式中进行培养。例如，批式，流加培养，半连续和连续发酵模式可以应用在这里。
按照本发明表达系统对任意规模(也就是，体积)发酵的转基因表达都是有用的。因此，举例来说，微升-规模，厘升规模，和1/10公升规模发酵体积可以被使用；以及1升和更大发酵体积可以被使用。在一个实施方案中，发酵体积将是或大于1升。在另一个实施方案中，发酵体积将是或大于5升，10升，15升，20升，25升，50升，75升，100升，200升，500升，1,000升，2,000升，5,000升，10,000升或50,000升。
在本发明中，转化宿主细胞的生长、培养和/或发酵是在允许宿主细胞存活的温度范围内进行的，优选温度在大约4℃至大约55℃的范围内，包含该点。
细胞密度(充满的潮湿细胞)
按照本发明植物细胞表达系统可以提供的细胞密度或者相应的充满的潮湿细胞密度为从大约20g/L(2％充满的潮湿细胞)至多于550g/L(55％充满的潮湿细胞)。在一个实施方案中，充满的细胞体积在2％至大约60％之间。在另一个实施方案中，充满的细胞体积是2％，5％，10％，15％，20％，25％，35％，40％，50％，55％，60％，70％或85％。
VLP或目标肽的分离
在特定的实施方案中，本发明提供了回收目标肽的改进方法，其通过在与病毒衣壳的结合和共同表达中来保护目标肽。在特定的实施方案中，病毒衣壳融合体形成了VLP，其可以很容易地从细胞溶解产物中进行分离。
本发明的蛋白可以通过本领域中公知的标准技术进行分离和纯化以充分纯化，技术包括，但是不限于，PEG沉淀，硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换色谱，磷酸纤维素色谱，疏水交换色谱，亲和色谱，镍色谱，羟磷灰石色谱，反相色谱，血凝素色谱，预备电泳，清洁剂溶解，用这种底物作为柱色谱的选择性沉淀，免疫纯化方法，以及其它。例如，建立分子黏附性能的蛋白可以反向融合到配体上。利用适当的配体，蛋白可以选择性地吸附到纯化柱上并随后以相对纯化的形式从柱上解离。这种融合蛋白随后可以通过酶或其它行为除去。另外，蛋白可以利用免疫亲和柱或Ni-NTA柱进行纯化。一般的技术进一步描述于，例如，R.Scopes，蛋白纯化：原始和实践(ProteinPurification：Principles and Practice，)Springer-Verlag：N.Y(1982)；Deutscher，蛋白纯化指导(Guide to Protein Purification)，AcademicPress(1990)；美国专利No.4,511,503；S.Roe，蛋白纯化技术：一种实践方法(实践方法丛书)(Protein Purification Techniques：A PracticalApproach(Practical Approach Series))，Oxford Press(2001)；D.Bollag，等人，蛋白方法(Protein Methods，)Wiley-Lisa，Inc.(1996)；AK Patra等人，蛋白快速纯化(Protein Expr Purif，)18(2)：p/182-92(2000)；以及R.Mukhija，等人，Gene 165(2)：p.303-6(1995)。也可以参考，例如，Ausubel，等人，(1987和定期增刊)；Deutscher(1990)″蛋白纯化指导(Guide to Protein Purification，)″Methods in Enzymology vol.182，以及这一系列中的其它卷；Coligan，等人，(1996和定期增刊)蛋白科学中的通用技术(Current Protocols in Protein Science)Wiley/Greene，NY；以及厂商关于蛋白纯化产品的使用说明书，举例来说，Pharmacia，Piscataway，N.J.，或Bio-Rad，Richmond，Calif。重组技术的结合允许融合到适当的片段上，举例来说，对于一个FLAG序列或者一种等价物，其可以通过蛋白酶-可移动序列进行融合。参考例如，Hochuli(1989)Chemische Industrie 12：69-70；Hochuli(1990)″具有金属螯合吸收剂的重组蛋白的纯化(Purification of Recombinant Proteins with Metal ChelateAbsorbent)″在Setlow(ed.)Genetic Engineering，Principle and Methods12：87-98，Plenum Press，NY；和Crowe，等人，(1992)QIAexpress：高水平表达和蛋白纯化系统QUIAGEN(The High Level Expression &Protein Purification System QUIAGEN)，Inc.，Chatsworth，Calif。
相似地，病毒样颗粒或框状结构也可以通过本领域中公知的标准技术进行分离和纯化以充分纯化。除那些上面所介绍的以外，分离VLPs的技术包括沉淀技术例如聚乙烯乙二醇或盐沉淀。分离技术包括阴离子或阳离子交换色谱，尺寸排除色谱，磷酸纤维素色谱，疏水交换色谱，亲和色谱，镍色谱，羟磷灰石色谱，反相色谱，血凝素色谱，预备电泳，免疫纯化方法，离心法，超速离心法，密度梯度离心法(例如，在蔗糖或在氯化铯(CsCl)的梯度上)，利用尺寸排除过滤进行超滤，以及任意本领域中公知的其它蛋白分离方法。
本发明也改进了活性重组肽的回收。活性蛋白的水平可以被测量，例如，通过任意便利的体内或体外试验测试已知肽和父系肽、肽变体、片段取代肽和/或残基-取代肽之间的相互作用。因此，体外试验可以被用来检测任意可探测的已知肽和目标肽之间的相互作用，举例来说，在酶和底物之间，激素和激素受体之间，抗体和抗原之间等。这种检测可以包括色度改变的测量，放射活性改变的测量，溶解度的改变，通过凝胶电泳和/或凝胶排除方法测定的分子量的改变等。体内试验包括，但是不限于，检测生理学效果的试验，举例来说，重量的增加，电解液平衡的改变，血液凝固时间的改变，凝固分散中的改变以及抗原反应的诱导。通常，任意体内试验可以被使用，只要存在可变量从而可以探测已知肽和目标肽之间的结合作用的改变。参考例如，美国专利No.5,834,250。
表达蛋白的检测可以通过本领域中已知的方法来获得，该方法包括，例如，放射性免疫试验，蛋白印迹试验或免疫沉淀。
初始盐分馏可以从重组目标蛋白中分离出许多不需要的宿主细胞蛋白(或者来自于细胞培养基的蛋白)。一个这样的例子可以是硫酸铵。硫酸铵通过有效减少蛋白混合物中的水量来沉淀蛋白。蛋白随后在它们的可溶性基础上进行沉淀。蛋白越是疏水，则越是容易在更低的硫酸铵浓度时进行沉淀。典型的技术包括添加饱和的硫酸铵到蛋白溶液中从而产生20-30％之间的硫酸铵浓度。这一浓度将可以沉淀大部分的疏水蛋白。沉淀物随后被抛弃(除非目的蛋白是疏水的)并且向上清中加入硫酸铵以达到已知的沉淀目标蛋白的浓度。这种沉淀物随后溶解到缓冲液中，如果需要，或者通过透析或者通过透析(diafiltration)除去过量的盐。依赖于蛋白溶解度的其它的方法，例如冷乙醇沉淀，对于本领域技术人员是公知的并且可以被用于分馏复杂的蛋白混合物。
重组蛋白的分子量可以用来从更大或更小尺寸的蛋白中将其分离出来，使用不同孔径的膜超滤(例如，Amicon或Millipore膜)。作为第一步，蛋白混合物可以通过膜进行超滤，这种膜的孔径具有低于目标蛋白分子量的分子量分离点。这种超滤的截留物随后再进行超滤，这种膜具有高于目标蛋白分子量的分子量分离点。重组蛋白将通过膜进入分离物。分离物随后进行层析。
重组蛋白也可以在其尺寸、净表面电荷、疏水性和与配体的亲和性的基础上从其它的蛋白中进行分离。另外，蛋白的抗体可以结合到柱基质和免疫纯化的蛋白上。所有这些方法是本领域中所公知的。对于本领技术人员来说很明显色谱技术可以在任意规模进行并且使用多个不同厂家的设备(举例来说，Pharmacia Biotech)。
复性和再折叠
不溶解的蛋白可以进行复性或再折叠来产生二级和三级蛋白结构构型。如果需要，可以使用蛋白再折叠步骤，来完成重组产品的构型。再折叠和复性可以使用一种本领域中公知的试剂来完成，从而促进蛋白的分离/结合。例如，蛋白可以培养在二硫代苏糖醇(dithiothreitol)中，随后培养在氧化谷胱甘肽二钠盐中，随后培养在含有再折叠剂如尿素的缓冲液中。
重组蛋白也可以被复性，例如，通过在磷酸缓冲盐(PBS)或50mMNa-醋酸缓冲液，pH为6并加入200mM NaCl，对其进行透析。可选择地，固定到柱上的时候这种蛋白可以被再折叠，例如在Ni NTA柱上，在500mMNaCl，20％甘油，和20mM Tris/HCl pH 7.4，并含有蛋白酶抑制剂中使用6M-1M的线性尿素梯度。复性可以在1.5小时后更长的时间段内进行。复性后蛋白可以通过加入250mM的咪唑(immidazole)来进行洗脱。咪唑可以通过最后在PBS或50mM的醋酸钠缓冲液，pH为6，并加入200mMNaCl中进行的透析步骤除去。纯化的蛋白可以储存在室温下，4℃或冷冻在-20℃至-80℃。
其它的实施方式包括，例如，那些介绍于MH Lee等人，ProteinExpr.Purif.，25(1)：p.166-73(2002)，W.K.Cho等人，J.Biotechnology，77(2-3)：p.169-78(2000)，Ausubel，等人，(1987和定期增刊)，Deutscher(1990)″蛋白纯化指导(Guide to Protein Purification，)″Methodsin Enzymology vol.182，以及这一系列中的其它卷，Coligan，等人，(1996和定期增刊)蛋白科学中的通用技术(Current Protocols in ProteinScience)Wiley/Greene，NY，S.Roe，蛋白纯化技术：一种实践方法(Protein Purification Techniques：A Practical Approach)(PracticalApproach Series)，Oxford Press(2001)；D.Bollag，等人，Protein Methods，Wiley-Lisa，Inc.(1996)。
活性肽分析
活性蛋白具有其所选自的序列的天然肽的至少20％，30％或40％，以及优选至少50％，60％或70％，并且最优选至少80％，90％或95％的特定活性。进一步，底物特异性(Kcat/Km)任意的与天然肽基本上相似。代表性的是，Kcat/Km将是天然肽的至少30％，40％或50％；以及更优选为至少60％，70％，80％或90％。蛋白和肽活性和底物特异性(Kcat/Km)的测试和定量检测方法是本领域中所公知的。
按照本发明产生的重组肽的活性可以按照本领域中已知的任意蛋白特异传统或标准体内或体外检测方法进行测定。植物宿主细胞产生的重组肽的活性可以与相应的天然蛋白的活性进行比较，来测定在相同或相似的生理学条件下重组肽是否与天然肽中通常观察到的活性基本上相似或相等。
重组蛋白的活性可以与先前建立的天然肽标准活性进行比较。可选择地，重组肽的活性可以通过与同时发生的，或者基本同时发生的可比较的天然肽进行测试来确定。例如，一种体外测试可以用来检测任意可检测的重组肽和目标之间的相互作用，举例来说，在表达的酶和底物之间，表达的激素和激素受体之间，表达的抗体与抗原之间，等。这种检测可以包括的检测为色度改变、增殖改变、细胞死亡、细胞排斥、放射性改变、溶解度改变、由凝胶电泳和/或凝胶排除方法测量的分子量的改变，磷酸化能力，抗体特异性试验例如ELISA试验，等。另外，体内试验包括，但是不限于，与天然肽的生理学效果相比较检测植物宿主细胞产生的肽的生理学效果，举例来说，抗原反应。通常，任意体外或体内的检测可以被用来检测重组肽的活性本质，其允许与天然肽进行比较分析，只要这种活性是可检测的。可选择的，本发明中所产生的肽可以被检测刺激或抑制肽和通常与肽相结合的分子之间的相互作用，举例来说，通常与天然蛋白相互作用的信号途径中的基质或成分。这种检测代表性地可以包括将蛋白与一种基质分子进行结合的步骤，其中结合是在允许肽与目标分子相互作用的条件下进行的，并且检测蛋白与目标分子相互作用的生物化学结果。
用来检测肽活性的试验被介绍于，例如，Ralph，P.J.，等人，(1984)J.Immunol.132：1858或Saiki等人，(1981)J.Immunol.127：1044，.Steward，W.E.II(1980)干扰素系统(The InterferonSystems.)Springer-Verlag，Vienna and New York，Broxmeyer，H.E.，等人(1982)Blood 60：595，″分子克隆：试验室手册(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)″，2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis eds.，1989，以及″酶学中的方法：分子克隆技术指导(Methods in Enzymology：Guide to MolecularCloning Techniques)″，Academic Press，Berger，S.L.和A.R.Kimmeleds.，1987，AK Patra等人，Protein Expr Purif，18(2)：p/182-92(2000)，Kodama等人，J.Biochem.99：1465-1472(1986)；Stewart等人，Proc.Nat′l Acad.Sci USA 90：5209-5213(1993)；(Lombillo等人，J.CellBiol.128：107-115(1995)；(Vale等人，Cell 42：39-50(1985)。
实施例
外壳蛋白-编码核酸的病毒来源
在下面的实施例中，豇豆退绿斑驳病毒(CCMV)已经被用作表达所需重组肽的外壳蛋白的来源。CCMV是雀麦花叶病毒科(bromoviridae)中的雀麦花叶病毒组中的一员。雀麦花叶病毒是25-28nm直径的具有四个部分，正义、单链RNA基因组的二十面体病毒，。RNA1和RNA2为复制酶编码。RNA3编码在植物宿主中进行病毒移动所使用的蛋白。RNA4(一种来自RNA3的亚基因组RNA)，也就是，sgRNA4，编码20kD的外壳蛋白(CP)(SEQ ID NO：13)(表1)。每个CCMV颗粒含有180个CCMV CP拷贝。编码CCMV CP的DNA序列的例子显示在SEQ ID NO：14中(表2)。
表1：由sgRNA4编码的野生型CCMV外壳蛋白(SEQ ID NO：13)
Met Ser Thr Val Gly Thr Gly Lys Leu Thr Arg Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala Arg LysAsn Lys Arg Asn Thr Arg Val Val Gln Pro Val Ile Val Glu Pro Ile Ala Ser Gly GlnGly Lys Ala Ile Lys Ala Trp Thr Gly Tyr Ser Val Ser Lys Trp Thr Ala Ser Cys AlaAla Ala Glu Ala Lys Val Thr Ser Ala Ile Thr Ile Ser Leu Pro Asn Glu Leu Ser SerGlu Arg Asn Lys Gln Leu Lys Val Gly Arg Val Leu Leu Trp Leu Gly Leu Leu ProSer Val Ser Gly Thr Val Lys Ser Cys Val Thr Glu Thr Gln Thr Thr Ala Ala Ala SerPhe Gln Val Ala Leu Ala Val Ala Asp Asn Ser Lys Asp Val Val Ala Ala Met Tyr ProGlu Ala Phe Lys Gly Ile Thr Leu Glu Gln Leu Thr Ala Asp Leu Thr Ile Tyr Leu TyrSer Ser Ala Ala Leu Thr Glu Gly Asp Val Ile Val His Leu Glu Val Glu His Val ArgPro Thr Phe Asp Asp Ser Phe Thr Pro Val Tyr
表2：编码CCMC CP(的DNA序列的例子SEQ ID NO：14)
  atg tct aca gtc gga aca ggg aag tta act cgt gca caa cga agg gct gcg gcc cgt aag aac aagcgg aac act cgt gtc caa cct gtt att gta gaa ccc atc gct tca ggc caa ggc aag gct att aaagca tgg acc ggt tac agc gta tcg aag tgg acc gcc tct tgc gcg gcc gcc gaa gct aaa gta acctcg gct ata act atc tct ctc cct aat gag cta tcg tcc gaa agg aac aag cag ctc aag gta ggt agagtt tta tta ctt ggg ttg ctt ccc agt gtt agt ggc aca gtg aaa tcc tgt gtt aca gag acg cagact act gct gct gcc tcc ttt cag gtg gca tta gct gtg gcc gac aac tcg aaa gat gtt gtc gct gctatg tac ccc gag gcg ttt sag ggt ata acc ctt gaa caa ctc acc gcg gat tta acg atc tac ttg tacagc agt gcg gct ctc act gag ggc gac gtc atc gtg cat ttg gag gtt gag cat gtc aga cct acg tttgac gac tct ttc act ccg gtg tat tag
CCMC的晶体结构已经被明确了。这种结构提供了外壳蛋白相互作用的清晰照片，其对于颗粒的稳定性和动力学是十分重要的，并且对指导插入位点的合理设计是有帮助的。先前的研究已经证明CCMV外壳蛋白可以被遗传修饰，在不干扰形成颗粒的能力的前提下，运载异源肽。大量合适的插入位点已经被确认。总数达到180个异源肽单元拷贝(作为单独肽的形式或者以连体单元的形式)可以在CCMV CP的单独的插入位点处被插入到CCMV颗粒中。迄今为止在CCMV CP中所确定的插入位点可以容纳不同长度的肽。
原料和方法
除非另外声明，否则分子生物学领域中所公知的标准技术、载体、控制序列元件、和其它表达系统元件被用于核酸的操纵、转化和表达。这种标准的技术、载体和元件可以被找到，例如，在：Ausubel等人(eds.)，分子生物学中的常用技术(Current Protocols in Molecular Biology)(1995)(John Wiley & Sons)；Sambrook，Fritsch，& Maniatis(eds.)，Molecular Cloning(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY)；Berger & Kimmel，酶学中的方法(Methods in Enzymology)152：分子克隆技术指导(Guide to Molecular Cloning Techniques)(1987)(Academic Press)；和Bukhari等人(eds.)，DNA插入元件，质粒和附加体(DNA Insertion Elements，Plasmids and Episomes)(1977)(ColdSpring Harbor Laboratory Press，NY)。
除非另外说明，PCR反应按照下面的方法使用PTC225热循环(MJResearch，South San Francisco，CA，USA)进行：
表3.PCR方法
  反映混合物(100μl总体积)              热循环步骤
  10μl 10X PT HIFI缓冲液*  步骤l   1个循环  2min   94℃
  4μl 50mM MgSO4*  步骤2   35个循环  30sec   94℃
  2μl 10mM dNTPs*  30sec   55℃
  0.25ng 每种引物  1min   68℃
  1-5ng DNA模板  步骤3   1个循环  10min   70℃
  1μl PT HIFI Taq DNA聚合酶*  步骤4   1个循环  保持   4℃
  其余物 蒸馏的去离子水(ddH2O)
*(来自于Invitrogen Corp，Carlsbad，CA，USA，此后成为“Invitrogen”)
实施例1-用CCMV RNA1，RNA2，和嵌合型RNA3接种的完整豇豆植物中的CCMV病毒颗粒中抗原肽的生产
炭疽杆菌抗原肽的表达在完整的植物中进行，使用具有外壳蛋白(CP)的进行工程化以含有四个不同抗原肽的豇豆退绿斑驳病毒(CCMV)。
具有CCMV RNA1核酸序列的DNA以及具有CCMV RNA2核酸序列的DNA分别在克隆载体pUC19中，在T7启动子控制的下游和特定Xba I位点的上游进行进一步克隆。这产生了质粒pDOW2122(CCMV RNA1)和pDOW2123(CCMV RNA2)。
具有CCMV RNA3核苷序列的DNA，被设计成包含5个BamHI限制酶切位点，进一步设计成生成重组衣壳蛋白编码的核酸。四个DNA分子，每一个编码不同的四个外源肽之一(来自于炭疽杆菌保护抗原PA的四个不同的抗原多肽)每个都由合成的寡核苷酸的SOE(通过交叠延伸的拼接)合成。所得到的核酸包含BamHI识别位点末端。每个PA DNA片断利用BamHI限制酶切并且独立的插入到一个外壳蛋白中，其中这种插入是在CCMV外壳蛋白编码序列的五个不同的限制酶切位点进行：密码子63的BamHI，密码子102的BamHI，密码子114的BamHI，密码子129的BamHI和密码子160的BamHI。
四个不同的多肽是PA1(SEQ ID NO：1由SEQ ID NO：15编码)，PA2(SEQ ID NO：2，由SEQ ID NO：16编码)，PA3(SEQID NO：3，由SEQ ID NO：17编码)，和PA4(SEQID NO：4，由SEQ ID NO：18编码)。
表4炭疽杆菌抗原核酸和氨基酸序列
PA1
  核酸序列(SEQ ID NO：15)   5′-agt aat tct cgt aag aaa cgt tctacc tct gct ggc cct acc gtg cct gatcgt gat aat gat ggc att cct gat-3′
  氨基酸序列(SEQ ID NO：1)   Ser Asn Ser Arg Lys Lys Arg SerThr Ser Ala Gly Pro Thr Val ProAsp Arg Asp Asn Asp Gly Ile ProAsp
PA2
  核酸序列(SEQ ID NO：16)   5′-agt cct gaa gct cgt cat cct ctcgtg gct gcg tat cct att gtg cat gttgat atg gaa aat att atc ctc tct-3′
  氨基酸序列(SEQ ID NO：2)   Ser Pro Glu Ala Arg His Pro LeuVal Ala Ala Tyr Pro Ile Val HisVal Asp Met Glu Asn Ile Ile LeuSer
PA3
  核酸序列(SEQ ID NO：17)  5′-cgt att att ttc aat ggc aaa gat ctcaat ctc gtg gaa cgt cgt att gct gctgtg aat cct tct gat cct ctc-3′
  氨基酸序列(SEQ ID NO：3)  Arg Ile Ile Phe Asn Gly Lys AspLeu Asn Leu Val Glu Arg Ile AlaAla Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu
PA4
  核酸序列(SEQ ID NO：18)   5′-cgt caa gat ggc aaa acc ttc attgat ttc aaa aag tat aat gat aaa ctccct ctc tat att tct aat cct aat-3′
  氨基酸序列(SEQ ID NO：4)   Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe IleAsp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp LysLeu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn ProAsn
这些中的每一个被插入到五个质粒之一中：pDOW2125(pUC-CCMV RNA3-CP63BamHI)，pDOW2126(pUC-CCMV-RNA3-102BamHI)，pDOW2127(pUC-CCMV-RNA3-CP114BamHI)，pDOW2128(pUC-CCMV-RNA3-CP129BamHI)，和pDOW2129(pUC-CCMV-RNA3-CP160BamHI)，它们已经被BamHI限制酶切和去磷酸化。
这样一共产生了20种不同的“嵌合型RNA3”DNA。质粒pDOW2135(pUC-CCMV-RNA3-CP63BamHI-PA1)，pDOW2139(pUC-CCMV-RNA3-CP102BarnHI-PA1)，pDOW2143(pUC-CCMV-RNA3-CP114BanaHI-PA1)，pDOW2147(pUC-CCMV-RNA3-CP129BamHI-PA1)，和pDOW2151(pUC-CCMV-RNA3-CP160BamHI-PA1)是在位点63，102，114，129和160插入具有PA1的嵌合型RNA3的例子。编码野生型CCMV外壳蛋白的RNA3和编码工程化CCMV外壳蛋白的含有BamHI限制酶位点但是不含有插入体的RNA3被用作对照。每个修饰的RNA3构建体被单独地在克隆载体pUC19中T7启动子控制的下游以及在特定Xba I位点的上游进行再次克隆。
三类质粒中的每一个被克隆到大肠杆菌中。质粒被分离，通过XbaI限制酶消化被线性化，并随后使用mMESSAGE mMACHINE T7 Kit(来自于Ambion，Inc.，Austin，TX，USA的RNA转录试剂盒)将其每2微克在体外转录成RNA。这产生了24个不同的RNA变体：一个为RNA1，一个为RNA2，20个为嵌合型RNA3，以及两个为RNA3对照。
RNA1，RNA2，RNA3或含有PA插入体的嵌合型RNA3的混合物被用来传染豇豆植物。豇豆植物是从Cowpea California Blackeye #5种子(Ferry-Morse Seed Co.KY)发芽得到的。萌芽被单独地移植到具有Miracle-Gropotting混合器的6英寸的罐中(Miracle-Gro LawnProducts OH)。豇豆植物在2-叶阶段进行传染(大约在萌芽后7天)。对每棵植物的一个叶子施加400grit金刚砂粉末(Fisher Scientific cat.409-21-2)。RNA混合物被施加到金刚砂的表层上。叶子利用戴手套的手指进行温和的打磨。传染在接种后7-14天建立。
出乎意料地，在每一个整个植物系统中，即使使用的是天然宿主系统，嵌合型外壳蛋白也返回到野生型或者在某些情况下，所需的外源抗原肽被部分地删除了。这通过测序病毒子代得到了证实。RNA被萃取并使用ThermoScript RT-PCR系统(Invitrogen cat.11146-024)和CCMVRNA4.R基因特异引物(SEQ ID NO：19)(5′-CTC GAG CTAATA CAC CGG AGT GAA AG-3′)反向转录成DNA。通过使用引物CCMVRNA4.F(SEQ ID NO：20)(5′-CTG CAG ATG TCT ACA GTCGGA ACA GG-3′)和CCMVRNA4.R的PCR技术对cDNAs进行进一步的扩增。反应物被纯化，并利用CCMV-CP-F1引物(SEQ ID NO：21)(5′-AAC CCA TCG CTT CAG GCC AA-3′)进行测序。序列利用Sequencher软件版本4.0.5(Gene Codes Corporation)进行分析。例如，在测序中来自含有PA1插入体的pDOW2128的RNA3子代的外壳蛋白中含有一段小的，没有确认的核苷插入体(5′-CGTATTTCTGATCCTCTC-3′)，其作为RISDPL代替PA1被插入并翻译到氨基酸序列中。插入的核苷酸序列在框架中保持了剩余的外壳蛋白。已经确定工程化的CCMV RNA3在整个植物中进行表达的时候是不稳定的，很容易进行重组，并且整个植物系统不能用来生产嵌合型CCMV病毒颗粒上的抗原决定基。
实施例2-在接种了CCMV RNA1，RNA2，和嵌合型RNA3的烟草悬浮培养基中在CCMV病毒颗粒中抗原肽的生产
相同CCMV-肽-编码构建体的表达在植物细胞悬浮培养基中进行。烟草NTI细胞通过使用编码嵌合型CCMV外壳蛋白的CCMV RNA3和编码复制酶的RNA1和2的电穿孔技术来进行转化。编码野生型CCMV外壳蛋白的RNA3和编码工程化CCMV的含有适当BamHI限制位点的但不含有插入体的RNA3被用作对照。
如实施例1所述通过体外RNA转录得到了24个不同的RNA变体：一个为RNA1，一个为RNA2，20个为嵌合型RNA3，以及两个为RNA3对照。在22个不同组中，每2微克得到的三个RNAs(RNA1，RNA2，以及RNA3s中的一个)通过电穿孔来转化烟草。
使用下面的方案来转染植物细胞：
1)培养基准备：
NTI培养基(1升)
4.33g Murashige & Skoog碱性盐(Phyto Technology Laboratories KScat.M524)，100mg肌醇(Sigma cat.I-3011)，1ml 1mg/ml的硫胺HCl溶液(Sigma cat.T-3902)，180mg单价碱磷酸钾KH2PO4(Sigma cat.P-8416)，30g蔗糖(Sigma cat.S-5390)，以及200μl 10mg/ml 2，4-D溶液(Sigma cat.D-7299)在少量的水中进行混合。向溶液中加入纯净水从而使体积达到1升。pH被调节到5.8，并且溶液进行高压锅灭菌。
0.4M的甘露醇冲洗溶液：
36.43甘露醇(Sigma cat.M-1902)被添加到少量的纯净水中。加入纯净水使体积达到500ml并调节pH到5.5。溶液放入高压锅中进行灭菌。
酶溶液：
0.4M的甘露醇和0.02M MES在少量的水中进行混合。加入纯净水使体积达到500ml并调节pH到5.5。溶液放入高压锅中进行灭菌，并且溶液被保存在4℃。使用前，向溶液中加入1％的纤维素酶(Calbiochem cat.219466)和0.3％Macerase Pectinase(Calbiochem cat.441201)，并且震荡溶液直到纤维素酶和Macerase Pectinase溶解。
电穿孔缓冲液：
0.8％的NaCl，0.02％的KCl，0.02％的KH2PO4以及0.11％的Na2HPO4被加入到少量的纯净水中。加入纯净水使体积达到100ml，并调节pH到6.5。这种缓冲液进行高压锅灭菌并保存在4℃。
2)烟草细胞部分消化方案：
烟草细胞系NT1在电穿孔前进行如下的部分消化。活性细胞系每周通过再次培养来维持，细胞在轻微振荡的条件下在24℃或28℃培养在NTI培养基中，并且在消化前3天，将5ml的细胞悬浮物再次培养在50ml NTI培养基中并在28℃下进行培养。细胞在50ml试管中在800rpm下振荡5分钟。制备酶溶液，并且细胞利用甘露醇清洗溶液进行冲洗(大约40ml)。细胞在800rpm下振荡5分钟，并向细胞中加入3体积的酶溶液。细胞通过倒置进行悬浮；通过倾注转移到10cm培养皿中，并且这种皿用铝箔包裹后在室温下缓慢振荡60-120分钟。细胞随后被转移回50ml塑料管中；并在800rpm下振荡5分钟。细胞利用40ml甘露醇清洗溶液进行冲洗并再次振荡，利用电穿孔溶液进行冲洗，并振荡。向细胞中加入三体积电穿孔溶液(总体积通常为20ml)；并且细胞包裹在铝箔中在4℃下进行保存。
3)部分消化细胞电穿孔方案：
将1ml的被消化的细胞被分配到电穿孔试管中(4mm gap)。2μg的每种RNA转录子-CCMV RNA1，RNA2，和嵌合型RNA3-被添加到试管中并放置在冰上5分钟。向每个培养皿中加入10ml NTI平板培养基(NTI+0.4M甘露醇)。细胞在500μF，250V下进行电穿孔，并且试管被放置回冰上。细胞随后被转移到培养皿中，并且在黑暗中不进行振荡的条件下在室温进行孵化。在转化后48小时收集细胞进行分析。
结果
嵌合型外壳蛋白的表达利用抗-CCMV外壳蛋白多克隆抗体通过蛋白印迹反应进行分析。而且，RNA是从每种培养物中提取出来的，并且嵌合型CCMV RNA4被反向转录成cDNA，其随后通过PCR进行扩增。PCR产品如实施例1中所述进行测序。在蛋白印迹反应中除了仅仅用RNA1和2转化的阴性对照外所有的样品是阳性的。
相比较于对照CCMV衣壳蛋白，嵌合型外壳蛋白具有更大的尺寸和在胶上更慢的活动性，显示嵌合型外壳蛋白含有PA插入体。这通过对病毒RNA子代的测序而得到了证实。结果证明了20个嵌合型构建体中的19个适当地表达了嵌合型CCMV外壳蛋白而没有在所需抗原肽中产生突变。结果显示CCMV RNA3s在悬浮细胞中的表达是稳定的。
图2显示了转录自pDOW2125(CCMV63BamHI)，pDOW2126(CCMV102BamHI)，pDOW2127(CCMV114BamHI)，pDOW2128(CCMV129BamHI)和pDOW2129(CCMV160BamHI)的CCMV RNA1，RNA2，和RNA3所转化的细胞中CCMV CP的表达。结果显示CCMV CP从所有在不同CP位点具有工程化的RNA3s中表达。
在烟草细胞中成功地产生了所有的4个在63，102，114，129和160BamHI位点处被融合到CCMV外壳蛋白上的PA肽(PA1，PA2，PA3，和PA4)。图3和图4显示了嵌合型CCMV CP在用CCMV RNA1，RNA2，和含有CP的嵌合型RNA3转染的细胞中的表达，其中CP在位点63，102，114，129和160处具有四个PA肽插入体。图3显示了具有被插入到63，102或114处的PA1，PA2，PA3或PA4肽的CCMVCP融合蛋白中，除了在CCMV CP的63位点处插入PA2肽外，均在融合蛋白在烟草植物细胞中被表达。图4证明了PA1，PA2，PA3或PA4肽插入到129或160位点处的CCMV CP融合蛋白在烟草植物细胞中进行了表达。
实施例3-用编码嵌合型CCMV CPs的植物表达质粒进行转化的烟草悬浮培养基中CCMV病毒样颗粒的4个抗原肽的生产
1)载体构建体：
质粒pIL-Tab358被用作植物表达载体。选自CCMV CP插入体的限制位点是XbaI和EcoRI。这种质粒在XbaI位点的上游含有木薯叶脉花叶病毒启动子以及在EcoRI位点的下游含有Nos终止子。这种载体是在插入体连接前通过XbaI和EcoRI消化以及去磷酸化来制备的。
2)插入体构建：
CCMV CP-PA融合体是通过从pDOW2147(pUC-CCMV-RNA3-CP129BamHI-PA1)，pDOW2148(pUC-CCMV-RNA3-CP129BamHI-PA2)，pDOW2149(pUC-CCMV-RNA3-CP129BamHI-PA3)，pDOW2150(pUC-CCMV-RNA3-CP129BamHI-PA4)使用引物CCMV-CP-XbaI(SEQ ID NO：22)和CCMV-CP-EcoRI(SEQ ID NO：23)进行PCR以产生pDOW2160(pIL-Tab-CCMV129BamHI-PA1)(SEQ IDNO：5)，pDOW2161(pIL-Tab-CCMV129BamHI-PA2)(SEQ ID NO：6)，pDOW2162(pIL-Tab-CCMV129BamHI-PA3)，(SEQID NO：7)，和pDOW2163(pIL-Tab-CCMV129BamHI-PA4)(SEQ ID NO：8)。pDOW2160，pDOW2161，pDOW2162，和pDOW2163的质粒图显示于图5，6，7和8中。
3)植物细胞转化：
植物细胞利用10μg的pDOW2160，pDOW2161，pDOW2162，和pDOW2163质粒进行转染。植物细胞利用实施例2中所述的方法进行转染。
结果
所有4个位于129BamHI位点的PA肽-CCMV CP融合体都成功地在烟草细胞中进行了表达。图9显示了用pDOW2160，pDOW2161，pDOW2162，和pDOW2163转染的细胞中嵌合型CCMV CP的表达。与对照(没有插入题的CCMV外壳蛋白)相比较，所有四个嵌合型外壳蛋白具有更小的活动性，说明具有PA插入体。
实施例4-使用编码嵌合型CCMV CPs和3’UTR(CCMV RNA33’未翻译区)的植物表达质粒进行转染的烟草悬浮培养物中病毒样颗粒内作为CCMV CP融合体的4个抗原肽的生产
1)载体构建体
质粒pIL-Tab358被用作植物表达载体。选自CCMV CP插入体的限制位点是XbaI和EcoRI。这种质粒在XbaI位点的上游含有木薯叶脉花叶病毒启动子以及在EcoRI位点的下游含有Nos终止子。这种载体是在litigation插入体前通过XbaI和EcoRI消化以及去磷酸化来制备的。
2)插入体构建
含有RNA3的3’UTR的CCMV CP-PA融合体通过从pDOW2147，pDOW2148，pDOW2149，和pDOW2150使用引物CCMV-CP-XbaI和CCMV-CP-EcoRI-3’UTR(SEQ ID NO：24)进行PCR以产生pDOW2169(pIL-Tab-CP129BamHI-PA1-3’UTR)(SEQ IDNO：9)，pDOW2170(pIL-Tab-CP129BamHI-PA2-3’UTR)(SEQ ID NO：10)，pDOW2171(pIL-Tab-CP129BamHI-PA3-3’UTR)，(SEQID NO：11)，和pDOW2172(pIL-Tab-CP129BamHI-PA-3’UTR 4)(SEQ ID NO：12)。
3)植物细胞转化
利用10μg的质粒pDOW2169，pDOW2170，pDOW2171，和pDOW2172转化植物细胞。植物细胞转化按照实施例2中的方法进行。
结论
所有四个在129BamHI位点含有3’UTR的PA肽-CCMV CP融合体成功地在烟草细胞中进行了表达。图10显示了在用pDOW2169，pDOW2170，pDOW2171，和pDOW2172转化的细胞中嵌合型CCMCCP的表达。相比于对照样(没有插入体的CCMV外壳)，所有四个嵌合型外壳蛋白显示了更低的活动性表明具有PA插入体。
实施例5-使用编码嵌合型CCMV CPs的植物表达质粒进行转化的转基因烟草悬浮培养物中病毒样颗粒内作为CCMV CP融合体的4个抗原肽的生产
烟草细胞系NT1每周都保持在再次培养中。细胞生长于NTI培养基中在24℃或28℃下，轻微振荡。转化前3天，5ml的细胞悬浮液在50ml的NTI培养基中再次培养，并在28℃下孵化。
1)通过颗粒轰击进行的植物细胞转化：
质粒pDOW2160，pDOW2161，pDOW2162，pDOW2163以及含有被木薯叶脉花叶病毒启动子(pBBV)启动的植物细胞选择标记Pat的植物表达质粒pBBV被用来通过微-颗粒轰击进行NT1烟草细胞转化。使用的质粒比率为1∶6的pBBV：pDOW2160，pBBV：pDOW2161，pBBV：pDOW2162，或pBBV：pDOW2163。总量为5μg的质粒DNAs足以进行6次轰击。介绍于Chen，L等人Plant Cell Reports(1998)18：25-31的Biorad轰击方案被用来进行转化。
2)铺板
在转移到含有25μg/ml草铵膦(Glufosinate-ammonium)(Sigmacat#45520)的NT1琼脂培养基平板之前4小时轰击细胞被转移到非选择性NT1琼脂培养基平板中。
3)选择转基因愈合组织(calli)
21天后，具有白色绒状细胞生长的愈合组织被选择通过蛋白印迹进行分析以测试CP融合体的表达并且进行PCR以测试植物细胞中启动子-CP融合基因-终止子盒的结合。表达嵌合型CCMV CPs的转基因愈合组织被转移到液体NT1培养基中。细胞在NT1培养基中在24℃或28℃和轻微振荡条件下生长，并且每周进行再次培养。
结果
图11显示了用pDOW2160，pDOW2161，pDOW2162，和pDOW2163稳定转化的细胞中嵌合型CCMV CP的表达。CP融合体利用CCMV的多克隆抗体进行检测。所有四个嵌合型外壳蛋白转基因的表达都是被检测。
实施例6-使用编码嵌合型CCMV CPs的植物表达质粒进行转化的转基因水稻悬浮培养物中CCMV病毒样颗粒内作为CCMV CP融合体的4个抗原肽的生产
稻米细胞系每周都进行再次培养，以维持。细胞在NB培养基中(Li，L等人，Plant Cell Reports.(1993)12：250-255)在28℃和轻微振荡条件下生长。转化前3天，5ml的细胞悬浮物再次培养到50ml NB培养基中并在28℃进行孵化。
1)利用颗粒轰击进行的植物细胞转化。
质粒pDOW2160，pDOW2161，pDOW2162，pDOW2163以及含有被木薯叶脉花叶病毒启动子启动的植物选择标记Pat的植物表达质粒pBBV被用来通过微颗粒轰击进行水稻细胞转化。使用的质粒比率为1∶6的pBBV：pDOW2160，pBBV：pDOW2161，pBBV：pDOW2162，或pBBV：pDOW2163。总量为5μg的质粒DNAs足以进行6次轰击。介绍于Chen，L等人Plant Cell Reports(1998)18：25-31的Biorad轰击方案被用来进行转化。
2)铺板
被轰炸的细胞被转移到含有25μg/ml草铵膦(Sigma cat#45520)的NB琼脂培养基平板以进行选择。
3)选择转基因愈合组织
21天后，具有白色绒状细胞生长的愈合组织被选择通过蛋白印迹进行分析以测试CP融合体的表达并且进行PCR以测试植物基因组中启动子-CP融合基因-终止子盒的整合。
结果
图12显示了用pDOW2160，pDOW2161，pDOW2162，和pDOW2163稳定转化的细胞中嵌合型CCMV CP的表达，其是利用CCMV的多克隆抗体检测的。所有四个嵌合型外壳蛋白转基因的表达都是被检测。
下面的方法用来提取基因组DNA并且通过PCR检测植物细胞中启动子-CP融合基因-终止子盒的整合。按照下面的厂商说明书利用Qiagen DNeasy Plant Mini来提取基因组DNA。
近似50-100ng的新鲜水稻愈合组织被放置到1.5ml试管中。组织被冷冻在液氮中以进行直接DNA提取或者放置到-80℃冰箱中进行冷藏。DNA提取前使用微杵进行研磨来手工磨碎组织。样品被放置到冰上并且利用Qiagen DNeasy Plant Mini Kit手册中所述的方法提取基因组DNA。Access Quick Master Mix 2x(Promega cat#A1720)被用来设置PCR反应如下：
主要混和物                                     25ul
CCMV-F(10mM)引物，SEQ ID NO：25                1ul
Nos-term-R(10mM)引物，SEQ ID NO：26            1ul
基因组DNA                                      1ul
水                                             22ul
总共                                           50ul
下面的PCR循环被用来从基因组DNA中扩增启动子-CP融合基因-终止子盒：
1个循环                95℃                    2min
35个循环               95℃                    30sec
                       55℃                    30sec
                       70℃                    2min
1个循环                70℃                    5min
                       4℃                     保持
10ul的PCR反应在1.2％的琼脂胶上进行电泳并有EtBr进行染色。图13显示了从选择的单独稻米愈合组织中扩增的PCR产品。含有预定尺寸的PCR产品的样品被评价为阳性，用来稳定转化并整合到植物基因组的嵌合型CP转基因中。
表达嵌合型CCMV CPs的转基因愈合组织被转移到液体NB培养基中来产生适合放大化发酵的细胞悬浮培养物。细胞在NB培养基中在28℃和轻微的震荡下生长，并每周进行再次培养。
VLP提取
通过摇瓶培养样品的裂解来沉淀嵌合型VLPs，随后用PEG(聚乙烯乙二醇)-处理得到的细胞溶解物并进行超滤，按照下面的方案：
每种摇瓶培养物的50ml体积被进行离心以将细胞沉淀化。沉淀化细胞再次悬浮在病毒缓冲液中(0.2M醋酸钠pH 5.2；10mM EDTA.0)以两体积缓冲液对一体积沉淀化细胞。细胞随后通过多次60sec的混合来进行破碎，并且在期间放在冰上两分钟。得到的均浆通过三层稀纱布被压挤，并随后在4℃ 15,000xG下离心15分钟。除去得到的上清并测定其体积。向每种上清中，加入PEG8000至最终浓度为10％，并且这种溶液在冰上孵化1小时或者在4℃过夜。随后，溶液在4℃ 15，000xG下离心10分钟。沉淀的小球随后悬浮到1/10初始上清体积的病毒缓冲液中，并保存在4℃，并通过使用多克隆抗-CCMV抗体进行蛋白印迹分析。
图14显示了从用pDOW2160稳定转化的细胞中回收的嵌合型CCMV VLPs。嵌合型CP-PA1融合蛋白在重新悬浮的PEC沉淀中被检测到，但是上清中没有，显示嵌合型CP组装到了VLPs中。
可以选择的，重新悬浮的样品在4℃ 15,000xG下离心10分钟，回收上清，并用于第二轮的PEG沉淀。加入PEG8000至最终浓度为15％，并在4℃下搅拌2小时。随后溶液在15,000xG下离心10分钟，并且沉淀重新悬浮在小体积的病毒缓冲液中。重新悬浮的VLP溶液被装入到具有300K分子量界值的Centricon Plus-20中并在4,000xG中旋转5分钟。浓缩的VLP样品随后通过使用多克隆抗-CCMV抗体进行蛋白印迹分析(参见图14)。嵌合型CP-PA1融合蛋白在重新悬浮的和尺寸过滤的第二PEG沉淀中被检测到，但是不存在于上清液中，显示嵌合型CP组装到VLPs中了。
                                 序列表
<110>陶氏化学公司
<120>植物细胞中的高效肽生产
<130>00588.105026
<140>未指定
<141>2005-02-28
<150>60/548,744
<151>2004-02-27
<160>26
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>25
<212>PRT
<213>炭疽芽孢杆菌
<400>1
Ser Asn Ser Arg Lys Lys Arg Ser Thr Ser Ala Gly Pro Thr Val Pro
1               5                   10                  15
Asp Arg Asp Asn Asp Gly Ile Pro Asp
            20                  25
<210>2
<211>25
<212>PRT
<213>炭疽芽孢杆菌
<400>2
Ser Pro Glu Ala Arg His Pro Leu Val Ala Ala Tyr Pro Ile Val His
1               5                   10                  15
Val Asp Met Glu Asn Ile Ile Leu Ser
            20                  25
<210>3
<211>25
<212>PRT
<213>炭疽芽孢杆菌
<400>3
Arg Ile Ile Phe Asn Gly Lys Asp Leu Asn Leu Val Glu Arg Arg Ile
1               5                   10                  15
Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu
            20                  25
<210>4
<211>25
<212>PRT
<210>4
<211>25
<212>PRT
<213>炭疽芽孢杆菌
<400>4
Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys
1               5                   10                  15
Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn Pro Asn
            20                  25
<210>5
<211>4136
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pDOW2160
<400>5
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca      60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg     120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc     180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaataccgc atcaggcgcc      240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat     300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt     360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gcttccagaa ggtaattatc     420
caagatgtag catcaagaat ccaatgttta cgggaaaaac tatggaagta ttatgtgagc     480
tcagcaagaa gcagatcaat atgcggcaca tatgcaacct atgttcaaaa atgaagaatg     540
tacagataca agatcctata ctgccagaat acgaagaaga atacgtagaa attgaaaaag     600
aagaaccagg cgaagaaaag aatcttgaag acgtaagcac tgacgacaac aatgaaaaga     660
agaagataag gtcggtgatt gtgaaagaga catagaggac acatgtaagg tggaaaatgt     720
aagggcggaa agtaacctta tcacaaagga atcttatccc ccactactta tccttttata     780
tttttccgtg tcatttttgc ccttgagttt tcctatataa ggaaccaagt tcggcatttg     840
tgaaaacaag aaaaaatttg gtgtaagcta ttttctttga agtactgagg atacaacttc     900
agagaaattt gtaagtttgt agatctcgat tctagaatgt ctacagtcgg aacagggaag     960
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caacctgtta ttgtagaacc catcgcttca ggccaaggca aggctattaa agcatggacc    1080
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gctataacta tctctctccc taatgagcta tcgtccgaaa ggaacaagca gctcaaggta    1200
ggtagagttt tattatggct tgggttgctt cccagtgtta gtggcacagt gaaatcctgt    1260
gttacagaga cgcagactac tgctgctgcc tcctttcagg tggcattagc tgtggccgac    1320
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gatcgtgata atgatggcat tcctgatggg atcctgtcga aagatgttgt cgctgctatg    1440
taccccgagg cgtttaaggg tataaccctt gaacaactca ccgcggattt aacgatctac    1500
ttgtacagca gtgcggctct cactgagggc gacgtcatcg tgcatttgga ggttgagcat    1560
gtcagaccta cgtttgacga ctctttcact ccgtattagt aagaattcga gctcggtacc    1620
ggatccaatt cccgatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt    1680
tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat    1740
taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt    1800
atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg    1860
cgcggtgtca tctatgttac tagatcgggg atcgatcccc aattcgtaat catggtcata    1920
gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag    1980
cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg cgtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg    2040
ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca    2100
acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc    2160
gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg    2220
gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa    2280
ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga    2340
cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag    2400
ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct    2460
taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg    2520
ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctggggtgtg tgcacgaacc    2580
ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt    2640
aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta    2700
tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac    2760
agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc    2820
ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat    2880
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tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt    3000
cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta    3060
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atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg    3180
cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga    3240
tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt    3300
atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt    3360
taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt    3420
tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat    3480
gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc    3540
cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc    3600
cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat    3660
gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag    3720
aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt    3780
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ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa    3900
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aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa    4020
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac    4080
cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtc        4136
<210>6
<211>4136
<212>DNA
<213>人工序列
<22>
<223>pDOW2161
<400>6
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gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag      3720
cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt      3780
actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt      3840
caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac      3900
gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taggcgtgtt gagatccagt tcgatgtaac      3960
ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag      4020
caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa      4080
tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga      4140
gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc      4200
cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa      4260
ataggcgtat cacgaggccc tttcgtc                                          4287
<210>13
<211>190
<212>PRT
<213>豇豆退绿斑驳病毒
<400>13
Met Ser Thr Val Gly Thr Gly Lys Leu Thr Arg Ala Gln Arg Arg Ala
1               5                   10                  15
Ala Ala Arg Lys Asn Lys Arg Lys Thr Arg Val Val Gln Pro Val Ile
            20                  25                  30
Val Glu Pro Ile Ala Ser Gly Gln Gly Lys Ala Ile Lys Ala Trp Thr
        35                  40                  45
Gly Tyr Ser Val Ser Lys Trp Thr Ala Ser Cys Ala Ala Ala Glu Ala
    50                  55                  60
Lys Val Thr Ser Ala Ile Thr Ile Ser Leu Pro Asn Glu Leu Ser Ser
65                  70                  75                  80
Glu Arg Asn Lys Gln Leu Lys Val Gly Arg Val Leu Leu Trp Leu Gly
                85                  90                  95
Leu Leu Pro Ser Val Ser Gly Thr Val Lys Ser Cys Val Thr Glu Thr
            100                 105                 110
Gln Thr Thr Ala Ala Ala Ser Phe Gln Val Ala Leu Ala Val Ala Asp
        115                 120                 125
Asn Ser Lys Asp Val Val Ala Ala Met Tyr Pro Glu Ala Phe Lys Gly
    130                 135                 140
Ile Thr Leu Glu Gln Leu Thr Ala Asp Leu Thr Ile Tyr Leu Tyr Ser
145                 150                 155                 160
Ser Ala Ala Leu Thr Glu Gly Asp Val Ile Val His Leu Glu Val Glu
                165                 170                 175
His Val Arg Pro Thr Phe Asp Asp Ser Phe Thr Pro Val Tyr
            180                 185                 190
<210>14
<211>573
<212>DNA
<213>豇豆退绿斑驳病毒
<400>14
atgtctacag tcggaacagg gaagttaact cgtgcacaac gaagggctgc ggcccgtaag      60
aacaagcgga agactcgtgt ggtccaacct gttattgtag aacccatcgc ttcaggccaa     120
ggcaaggcta ttaaagcatg gaccggttac agcgtatcga agtggaccgc ctcttgtgcg     180
gctgccgaag ctaaagtaac ctcggctata actatctctc tccctaatga gctatcgtcc     240
gaaaggaaca agcagctcaa ggtaggtaga gttttattat ggcttgggtt gcttcccagt     300
gttagtggca cagtgaaatc ctgtgttaca gagacgcaga ctactgctgc tgcctccttt     360
caggtggcat tagctgtggc cgacaactcg aaagatgttg tcgctgctat gtaccccgag     420
gcgtttaagg gtataaccct tgaacaactc accgcggatt taacgatcta cttgtacagc     480
agtgcggctc tcactgaggg cgacgtcatc gtgcatttgg aggttgagca tgtcagacct     540
acgtttgacg actctttcac tccggtgtat tag                                  573
<210>15
<211>75
<212>DNA
<213>炭疽芽孢杆菌
<400>15
agtaattctc gtaagaaacg ttctacctct gctggcccta ccgtgcctga tcgtgataat      60
gatggcattc ctgat                                                       75
<210>16
<211>75
<212>DNA
<213>炭疽芽孢杆菌
<400>16
agtcctgaag ctcgtcatcc tctcgtggct gcgtatccta ttgtgcatgt tgatatggaa      60
aatattatcc tctct                                                       75
<210>17
<211>75
<212>DNA
<213>炭疽芽孢杆菌
<400>17
cgtattattt tcaatggcaa agatctcaat ctcgtggaac gtcgtattgc tgctgtgaat      60
ccttctgatc ctctc                                                       75
<210>18
<211>75
<212>DNA
<213>炭疽芽孢杆菌
<400>18
cgtcaagatg gcaaaacctt cattgatttc aaaaagtata atgataaact ccctctctat      60
atttctaatc ctaat                                                       75
<210>19
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CCMVRNA4.引物
<400>19
ctcgagctaa tacaccggag tgaaag                                           26
<210>20
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CCMVRNA4.F引物
<400>20
ctgcagatgt ctacagtcgg aacagg                                           26
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CCMV-CP-F1引物
<400>21
aacccatcgc ttcaggccaa                                                  20
<210>22
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CCMV-CP-Xbar引物
<400>22
gctctagaat gtctacagtc ggaacaggg                                        29
<210>23
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CCMV-CP-EcoRI引物
<400>23
cggaattctt actaatacgg agtgaaagag                                       30
<210>24
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CCMV-CP-EcoRI-3′UTR
<400>24
cggaatcctg gtctccttag agatcacc                                         28
<210>25
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CCMV.F引物
<400>25
ccagaaggta attatccaag atgtag                                           26
<210>26
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>NOS TERM R引物
<400>26
cgatccccga tctagtaaca tagat                                            25

Claims (35)

1、一种生产异源肽的方法包括：
a)利用含有编码融合肽的核酸序列的非传染性核酸转化植物细胞，其中融合肽含有至少一个目标异源肽和至少一个病毒衣壳蛋白，其中核酸被整合到植物细胞基因组中；
b)在植物细胞中表达核酸，其中植物细胞在发酵过程中生长于悬浮植物细胞培养物中；
c)其中植物细胞中的表达提供了融合肽到病毒样颗粒的体内组装；和
d)分离病毒样颗粒。
2、如权利要求1中的方法，其中编码融合肽的核酸可操作地连接到启动子序列和终止子序列上。
3、如权利要求2中的方法，其中核酸进一步包含病毒3’UTR。
4、如权利要求3中的方法，其中3’UTR包含包裹信号。
5、如权利要求2中的方法，其中核酸进一步包含包裹信号。
6、如权利要求1中的方法，其中病毒衣壳蛋白来自于对植物细胞宿主不表现天然营养性的病毒。
7、如权利要求1中的方法，其中病毒衣壳蛋白来自于对植物细胞宿主表现天然营养型的病毒。
8、如权利要求1中的方法，其中病毒衣壳蛋白来自于二十面体植物病毒。
9、如权利要求8中的方法，其中二十面体病毒选自豇豆花叶病毒，豇豆退绿斑驳病毒或苜蓿花叶病毒。
10、如权利要求1中的方法，其中异源肽是一种抗原肽。
11、如权利要求10中的方法，其中抗原肽是炭疽杆菌肽。
12、如权利要求11中的方法，其中抗原肽选自Seq.ID.Nos.1-4。
13、如权利要求1中的方法，其中核酸选自Seq.ID.Nos.5-12。
14、如权利要求1中的方法，其中病毒样颗粒作为疫苗投药给动物。
15、如权利要求1中的方法，其中植物细胞是双子叶植物。
16、如权利要求15中的方法，其中植物细胞是烟草。
17、如权利要求1中的方法，其中植物细胞是单子叶植物。
18、如权利要求17中的方法，其中植物细胞是稻米。
19、如权利要求1中的方法，其中核酸中除了衣壳蛋白编码序列外不含有编码其它病毒蛋白的病毒序列。
20、一种含有非传染性核酸的植物细胞，该核酸含有编码融合肽的核酸序列，其中融合肽包含至少一种目标异源肽和至少一种病毒衣壳蛋白，并且其中核酸被整合到植物细胞的基因组中。
21、如权利要求20中的植物细胞，其中植物细胞表达融合肽。
22、如权利要求21中的植物细胞，其中融合肽在体内组装成病毒样颗粒。
23、如权利要求20中的植物细胞，其中抗原肽选自Seq.ID.Nos.1-4。
24、如权利要求20中的植物细胞，其中核酸选自Seq.ID.Nos.5-12。
25、如权利要求20中的植物细胞，其中植物细胞是烟草。
26、如权利要求20中的植物细胞，其中植物细胞是稻米。
27、如权利要求20中的植物细胞，其中核酸进一步包括3’UTR。
28、如权利要求20中的植物细胞，其中核酸进一步包括病毒3’UTR。
29、如权利要求28中的植物细胞，其中3’UTR包含包裹信号。
30、如权利要求20中的植物细胞，其中核酸进一步包含包裹信号。
31、如权利要求20中的植物细胞，其中病毒衣壳蛋白来自于对植物细胞宿主不表现天然营养性的病毒。
32、如权利要求20中的植物细胞，其中病毒衣壳蛋白来自于对植物细胞宿主表现天然营养性的病毒。
33、如权利要求20中的植物细胞，其中病毒衣壳蛋白来自于二十面体植物病毒。
34、如权利要求33中的植物细胞，其中二十面体病毒选自豇豆花叶病毒，豇豆退绿斑驳病毒或苜蓿花叶病毒。
35、一种核酸构建体，其包含选自Seq.ID.Nos.5-12的序列。
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CN108779152A (zh) * 2016-01-27 2018-11-09 建国大学校产学协力团 包含抗菌肽的不溶性融合蛋白以及利用上述不溶性融合蛋白的抗菌肽制造方法
CN108779152B (zh) * 2016-01-27 2022-08-26 建国大学校产学协力团 包含抗菌肽的不溶性融合蛋白以及利用上述不溶性融合蛋白的抗菌肽制造方法

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