BRPI0613625A2

BRPI0613625A2 - vacinas da gripe recombinantes

Info

Publication number: BRPI0613625A2
Application number: BRPI0613625-7A
Authority: BR
Inventors: Jason M Radam; Jamie P Phelps; Nghiep Dang; Lada Rasochova
Original assignee: Dow Global Technologies Inc
Priority date: 2005-07-19
Filing date: 2006-07-19
Publication date: 2011-01-18
Also published as: EP1909829A4; JP2009502789A; MX2008000890A; EP1909829A2; WO2007011904A3; US20090117144A1; WO2007011904A2; AU2006270065A1; CA2615658A1; KR20080028941A; CN101227920A

Abstract

VACINAS DA GRIPE RECOMBINANTES A presente invenção refere-se a composições para uso como vacinas contra o vírus influenza, e métodos rápidos de produzir tais composições. A composição inclui i) pelo menos um peptídeo derivado de um vírus influenza, em que o peptídeo é fundido a uma proteína de capsídeo derivada de um vírus de planta, formando um peptídeo de fusão de capsídeo recombinante e ii) pelo menos uma proteína ou fragmento de proteína isolada derivado de um vírus influenza humano ou de ave. A proteína ou o fragmento de proteína antigênica isolada derivado do vírus de influenza humano ou de ave pode ser conjugada à superfície do peptídeo de fusão de capsídeo recombinante.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VACINAS DAGRIPE RECOMBINANTES".

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

Esse pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório U.S. Nq60/700.601, depositado em 19 de julho de 2005.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se à produção e à montagem de va-cinas multivalentes de vírus influenza utilizando proteínas antigênicas deinfluenza isoladas ou fragmentos de proteína derivados de vírus influenzahumano e/ou de ave combinados com um adjuvante que compreende umveículo de partícula semelhante a vírus quimérico contendo uma proteína decapsídeo viral derivada de uma célula eucariótica ou procariótica fundidageneticamente a peptídeos antigênicos de vírus influenza humano e/ou deave. A presente invenção ainda refere-se a novos peptídeos antigênicos, e acomposições contendo tais peptídeos, derivados de proteínas de influenza.

Antecedentes da Invenção

Um curso de vacinações é uma das maneiras mais eficazes eeficientes de proteger animais e seres humanos de infecções por agentespatogênicos. Em geral, vacinas são projetadas para fornecer imunidade pro-tetora a partir de um agente patogênico por criar uma resposta imune dohospedeiro às proteínas antigênicas, peptídeos ou a outras estruturas imu-nogênicas contidas na vacina, reduzindo assim o potencial para infecçãobem-sucedida mediante exposição do hospedeiro ao agente patogênico.

O vírus influenza é um membro da família Orthomyxoviridae, einclui três subtipos classificados por suas proteínas internas, chamados in-fluenza A, influenza B, e influenza C. Os vírus influenza A infectam umagrande variedade de espécies de aves e mamíferos, enquanto os tipos BeCsão essencialmente restritos à infecção humana. Os vírus influenza A sãogeralmente responsáveis por epidemias anuais e pandemias ocasionais,enquanto os vírus influenza B causam surtos a cada 2-4 anos, mas não sãogeralmente associados com pandemias. Cepas de vírus são classificadas deacordo com a espécie do hospedeiro de origem, local geográfico, ano deisolamento, número de série, e, para influenza A, por propriedades sorológi-cas de subtipos de hemaglutinina e neuraminidase.

O vírus influenza é um vírus de RNA de sentido negativo seg-mentado composto essencialmente de nove proteínas: matriz (M1); canal depróton-íon (M2); hemaglutinina (HA), neuraminidase (NA); nucleoproteína(NP); proteína básica de polimerase 1 (PB1); proteína básica de polimerase2 (PB2); proteína ácida de polimerase (PA); e proteína não-estrutural 2(NP2). As proteínas HA, NA, M1, e M2 são proteínas associadas à membra-na, com as proteínas HA e NA sendo glicoproteínas responsáveis pelo aco-plamento viral e entrada na célula do hospedeiro, respectivamente. Quinzeclasses de antígenos de hemaglutinina, classificadas H1-H15, e 9 classes deantígenos de neuraminidase, classificados N1-N9, foram identificados emvírus influenza A.

A proteína HA inicia o acoplamento viral à célula pela ligação aum receptor de superfície da célula hospedeira que contém ácido siálico. Ahemaglutinina de vírus influenza humano se liga preferivelmente aos recep-tores de ácido siálico contendo ligações a2,6-galactose enquanto que vírusinfluenza de ave se liga preferivelmente a células contendo ligações cc2,3-galactose. Essas ligações se correlacionam de preferência com a predomi-nância de ligações de ácido siálico α 2,6 galactose em células epiteliais hu-manas, e ligações α 2,3-galactose em células epiteliais intestinais de ave.Veja, por exemplo, Rogers GN, Paulson JC, Daniels RS, Skehel JJ, WilsonIA, Wiley DC (1983) "Single amino acid substitutions in influenza haemagglu-tinin change receptor binding specificity," Nature 304: 76-78; Connor RJ,Kawaoka Y, Webster RG, Paulson JC (1994) "Receptor specificity in human,avian and equine H2 and H3 influenza virus isolates," Virology 205: 17-23;Ito T, Suzuki Y, Mitnaul L, Vines A1 Kida H, Kawaoka Y (1997) "Receptorspecificity of influenza A viruses correlate with agglutination of erythrocytesfrom different animal species," Virology 227:492-99. Embora os mecanismosmoleculares responsáveis pela especificidade de ligação ao receptor sejampouco definidos, acredita-se que hemaglutinina de influenza de origem deave deve adquirir, especificidade de ligação a receptor humano para gerarcepas de influenza capazes de transmissão humano-a-humano sustentada.Veja, por exemplo, Stephenson I, KG Nicholson, JM Wood, MC Zambon, &JM Katz (2004) "Confronting the avian influenza threat: vaccine developmentfor a potential pandemic," The Lancet Infectious Diseases 4:499-509. Estu-dos de mutagênese direcionada ao sítio mostraram que apenas uma ou du-as mutações de aminoácidos são necessárias para essa alteração. Veja Ma-trosovich M, Tuzikov A, Bovin N, et al. (2000) "Early alterations of the recep-tor binding properties of the H1, H2 and H3 avian influenza virus hemaggluti-nins aftertheir introduction into mammals," J Virol 74: 8502-12.

Uma vez que o acoplamento ocorre, a proteína. NA inicia a en-docitose mediada pelo receptor, e fusão de membrana da célula hospedei-ra/viral. A proteína HA então sofre uma alteração conformacional no meioácido do endossoma, e, junto com a proteína M2, medeia a liberação de pro-teínas M1 de ribonucleoproteínas (RNPs) associadas ao nucleocapsídeo,que são então direcionados para o núcleo da célula para síntese de RNA.

A proteína M2 é uma proteína transmembrana não-glicosilada de97 aminoácidos. Lamb RA, Lai C-J1 Choppin PW (1981)"Sequences of mR-NAs derived from genome RNA segment 7 of influenza virus: collinear andinterrupted mRNAs code for overlapping proteins," PNAS 78:4170-4; LambRA, Zebedee SL, Richardson CD (1985) "Influenza virus M2 protein is anintegral membrane protein expressed on the infected-cell surface," Cell40:627-33. Ela forma homotetrâmeros na membrana viral da partícula dovírus, mas em números comparativamente menores quando comparada comHA e NA. Entretanto, eles estão presentes em alta densidade na membranaplasmática da célula infectada. Zebedee SL, Lamb RA (1988) "Influenza Avirus M2 protein: monoclonal antibody restriction of virus growth and detecti-on of M2 in virions," J Virol 62:2762-72.

Acredita-se que a proteína M2 facilita a liberação dos complexosde RNP da membrana viral após fusão. Ela exibe atividade de transporte depróton que reduz o pH dentro de vesículas de transporte durante a saída dasproteínas transmembrana virais do ER para a membrana plasmática, impe-dindo uma alteração conformacional induzida por ácido prematura em HA.Veja Mozdzanowska K et al (2003) "Induction of influenza type A virus speci-fic resistance by immunization of mice with a synthetic multiple antigenic pep-tide vaccine that contains ectodomains of matrix protein 2," Vaccine 21:2616-2626; Steinhauer DA, Wharton SA, Skehel JJ, Wiley DC, Hay AJ (1991) "A-mantadine selection of a mutant influenza virus containing an acid-stablehemagglutinin glycoprotein: evidence for virus-specific regulation of the pH ofglycoprotein transport vesicles," Proc Natl Aead Sei 88:11525-9; Pinto LH,Holsinger LJ, Lamb RA (1992) "Influenza virus M2 protein has ion channelactivity," Cell 69:517-28; Zhirnov OP (1990) "Solubilization of matrix proteinM1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviru-ses," Virology 176:274-9.

A proteína M2 contém um ectodomínio de 23 aminoácidos deextensão (M2e) que é altamente conservado entre vírus influenza tipo A ca-pazes de infectar seres humanos. De fato, os 9 aminoácidos N-terminais sãototalmente conservados entre cepas humanas infecciosas do vírus, e apenasum grau pequeno de diversidade estrutural é mostrado nos primeiros 15 a-minoácidos N-terminais. Zebedee SL, Lamb RA (1988) "Influenza A virus M2protein: monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2in virions," J Virol 62:2762-72; ItO T, Gorman OT, Kawaoka Y, Bean WJ,Webster RG (1991) "Evolutionary analysis of the influenza A virus M genewith comparison of the M1 and M2 proteins," J. Virol'. 65:5481-8.

Geralmente, os vírus influenza de ave são incapazes de replica-ção eficaz em seres humanos. Beare AS, Webster RG (1991) "Replication ofavian influenza viruses in humans," Arch Virol 119: 37-42. Entretanto, sabe-se que alguns subtipos de vírus influenza de ave podem replicar dentro dotrato respiratório de seres humanos. Há vários casos confirmados de trans-missão de vírus influenza de ave para seres humanos. Veja Stephenson I,KG Nicholson, JM Wood, MC Zambon, & JM Katz (2004) "Confronting theavian influenza threat: vaccine development for a potential pandemic," TheLancet Infectious Diseases 4:499-509; alerta de doença da OMS (WHO)(2004) "Confirmed human cases of avian influenza H5N1,"http://www.who:int/csr/disease/avian_influenza/en/; Hien TT, Liem NT, DungNT, etal{2004) "Avian influenza (H5N1) in 10 patients in Vietnam," N EngIJMed 350: 1179-88. A habilidade de certos tipos de vírus influenza de aveinfectarem seres humanos aumenta o grupo de espécies que podem forne-cer um ambiente para emergência de vírus reagrupados ave/humano.

Em geral, existem dois tipos de vacinas de influenza, a vacinaviral influenza inteiro inativado e a vacina viral de subvírion inativado. A vaci-na viral inteira contém vírions intactos, inativados, enquanto que a vacina desubvírion contém a maioria das proteínas estruturais virais e algumas dasproteínas de envelope viral. Essas vacinas virais são compostas anualmentede uma mistura trivalente de cepas de influenza do tipo A e de influenza dotipo B previstas estar em circulação entre a população humana para umadada época de gripe. A OMS revisa a composição de vacina duas vezes aoano e atualiza o conteúdo antigênico dependendo de subtipos circulantesprevalentes para fornecer vacinas que combinem bem antigenicamente. Porexemplo, para a época de gripe de 2004-2005, a composição trivalentecompreendeu A/Nova Caledônia/20/99 (H1N1); A/Wyoming/03/2003 (H3N2),que é um vírus semelhante a A/Fujian/411/2002; e vírus semelhante aB/Shangai/361 /2002 (isto é, B/Jiangsu/10/2003 ou B/Jilin/20/2003). Exem-plos de tais vacinas incluem Fluzone (Connaught), Fluvirin (Chiron), e Flu-Shield (Wyeth-Lederle). Recentemente, Medlmmune desenvolveu uma vaci-na de influenza vivo atenuado para liberação intranasal, FIuMist, que rece-beu aprovação do FDA para uso comercial nos Estados Unidos. Essas vaci-nas geralmente produzem uma resposta humoral cepa-específica, têm eficá-cia reduzida contra vírus com variações antigênicas, e são ineficazes contracepas não relacionadas. Veja Stephenson I, Nicholson KG, Wood JM, Zam-bon MC, & Katz JM (2004) "Confronting the avian influenza threat: vaccinedevelopment for a potential pandemic," The Lancet: Infectious Diseases4:499-509.

Os vírus inativados e atenuados utilizados nas vacinações des-critas acima são produzidos na cavidade alantóide de ovos de pinto embrio-nados. Esse método de produção é demorado, levando até 6 meses paraproduzir e pode ser altamente vulnerável a contaminação. Em 2004, conta-minação na produção do vírus influenza por Chiron resultou em uma escas-sez altamente publicada e controvérsia da vacina da gripe. A contaminaçãofoi descoberta em agosto de 2004, tarde demais para os fabricantes geraremnovos lotes de vacina para aquela época. Além disso, os métodos de produ-ção atuais requerem antecipação da cepa ou cepas particulares que sãomais prováveis de emergir durante a época da gripe. Tal necessidade, emconjunto com os métodos de produção atuais, limita a habilidade de modifi-car a produção de uma vacina de vírus influenza para atingir uma cepa viralinesperada.

Dessa forma, há uma necessidade por vacinas melhoradas quepodem ser produzidas rapidamente e podem ser modificadas facilmente pa-ra permitir vacinação contra vírus recentemente emergentes.

Sumário da Invenção

A presente invenção fornece composições para uso como vaci-nas contra um vírus particularmente um vírus influenza compreendendo i)pelo menos um peptídeo derivado de um vírus influenza fundido a pelo me-nos uma proteína de capsídeo derivada de um vírus de planta que forma umpeptídeo de fusão de capsídeo recombinante, em que o peptídeo de fusãode capsídeo recombinante é capaz de montagem para formar um vírus ou apartícula semelhante a vírus, e ii) pelo menos uma proteína antigênica isola-da ou fragmento da proteína derivado de um vírus influenza humano ou deave. Tal estratégia utiliza o aspecto imunogênico de um vírus ou a partículasemelhante a vírus em combinação com proteínas ou fragmentos de proteí-nas antigênicas para produzir uma vacina que pode fornecer imunidade pro-tetora mais ampla contra vírus influenza humano e/ou de ave.

Em um aspecto da presente invenção, o peptídeo derivado deum vírus influenza fundido à proteína de capsídeo de planta é um epítopoviral de influenza conservado. Em uma modalidade, o epítopo conservado éum epítopo de vírus influenza humano conservado. Pela utilização de umepítopo de influenza conservado como um inserto antigênico para o vírus oua partícula semelhante a vírus, o componente interno da composição nãoprecisa ser re-manipulado anualmente. Ao invés disso, apenas a proteínaantigênica ou o fragmento da proteína precisa de alteração conforme novascepas de vírus influenza emergem. Pelo fato de que as proteínas antigênicasou fragmentos das proteínas podem ser produzidos recombinantemente, acomposição pode ser rapidamente produzida para uso como uma vacinapara criar uma resposta imune em um ser humano ou animal contra cepasde influenza recentemente emergentes.

Em uma modalidade específica, o peptídeo de influenza conser-vado é derivado da proteína M2. Em uma modalidade, o peptídeo derivadode M2 é selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID N-: 1-5 e22-24. Modalidades da presente invenção fornecem seqüências de peptídeoderivadas da proteína M2 selecionadas a partir do grupo que consiste emSEQ ID N-: 3, 22, 23, e 24. Adicionalmente, fragmentos, derivados e homó-logos de SEQ ID N-: 3, 22, 23, e 24 são fornecidos. Em outras modalidades,o epítopo conservado é derivado da proteína NP. Em uma modalidade, opeptídeo NP é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID N-: 8-10. Em outra modalidade, o epítopo é derivado da proteína HA. Em umamodalidade, o peptídeo HA é selecionado a partir do grupo que consiste emSEQ ID N25: 6 e 7.

Em outras modalidades, qualquer combinação de peptídeos deinfluenza conservados derivados de um vírus influenza selecionado a partirdo grupo que consiste em M2, NP, ou HA pode ser fundida a uma proteínade capsídeo. Em uma modalidade, o peptídeo de fusão de capsídeo contémum peptídeo M2, NP, e HA. Em outra modalidade, o peptídeo de fusão docapsídeo contém um peptídeo conservado M2 e um NP. Em ainda outramodalidade, o peptídeo de fusão de capsídeo contém um peptídeo M2 e umHA. Em outra modalidade, o peptídeo de fusão de capsídeo contém um pep-tídeo conservado HA e um NP.

A presente invenção utiliza proteínas de capsídeo derivadas devírus de planta para construir peptídeos de fusão de capsídeo. As proteínasde capsídeo com o peptídeo de influenza fundido pode automontar in vivo ouin vitro para formar um vírus ou uma partícula semelhante a vírus. Em umamodalidade, o vírus ou a partícula semelhante a vírus não inclui proteínas demembrana plasmática da célula hospedeira ou proteínas da parede da célulahospedeira. Em uma modalidade, o vírus de planta será selecionado a partirde vírus que são icosaédricos (incluindo icosaédricos propriamente ditos,isométricos, quase-isométricos e geminados ou combinados), poliédricos(incluindo esféricos, ovóides, e em forma de limão), baciliformes (incluindoem forma de bastão ou de bala, e fusiformes ou em forma de charuto), e he-Iicoidais (incluindo bastonetes, cilíndricos, e filamentosos). Em algumas mo-dalidades o vírus de planta pode ser uma espécie de vírus de planta icosaé-drico Em uma modalidade, o capsídeo viral pode ser derivado de um Vírusdo Mosqueado Clorótico do Caupi (CCMV) ou um Vírus do Mosaico do Cau-pi'(CPMV). Em modalidades adicionais, o vírus de planta é selecionado apartir de um vírus CCMV ou CPMV, e o capsídeo inclui pelo menos um in-serto selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID N-: 3, 22, 23 e 24.

Em um aspecto da presente invenção, a proteína antigênica iso-lada ou fragmento da proteína combinado com o vírus ou a partícula seme-lhante a vírus é uma proteína de influenza de uma cepa viral de influenzarecentemente emergente, incluindo um vírus influenza humano ou de ave.Em uma modalidade, a proteína ou fragmento de proteína é derivado de umvírus influenza de ave. Em uma modalidade da presente invenção, a proteí-na antigênica ou o fragmento de proteína é derivado de uma proteína-de ví-rus de influenza selecionada a partir do grupo que consiste em proteína dematriz (M1), canal de próton-íon (M2), hemaglutinina (HA), neuraminidase(NA), nucleoproteína (NP), proteína básica de polimerase (PB1), proteínabásica de polimerase 2 (PB2), proteína ácida de polimerase (PA), e proteínanão-estrutural 2 (NP2). Em uma modalidade da presente invenção, a proteí-na ou fragmento de proteína é derivado de HA ou NA de influenza de ave.

Em certas modalidades, o vírus ou a partícula semelhante a ví-rus é combinado com mais de uma proteína ou fragmento de proteína anti-gênica isolada. Em certas modalidades, esse peptídeo antigênico ou frag-mentos de peptídeo são derivados da mesma espécie. Em outras modalida-des, esse peptídeo antigênico isolado ou fragmentos de peptídeo são deri-vados de espécies diferentes. Em certas modalidades, o vírus ou a partículasemelhante a vírus é combinado com pelo menos uma proteína ou fragmen-to de proteína NA e pelo menos uma proteína ou fragmento de proteína HA.

Em certas modalidades, os fragmentos NA e/ou HA são derivados de umvírus influenza de ave. Em outras certas modalidades, os fragmentos de NAe/ou HA são derivados de um vírus influenza humano. Em uma modalidadeadicional, a partícula semelhante a vírus é combinada com pelo menos umaproteína ou fragmento de proteína NA, pelo menos uma proteína ou frag-mento de proteína HA, e qualquer combinação de proteínas ou fragmentosde proteínas virais de influenza de ave selecionadas a partir do grupo queconsiste em M1, M2, NP, PB1, PB2, PA, e NP2. Em certas modalidades, aproteína ou fragmento de proteína NA é derivada do grupo de proteínas NAde influenza selecionadas a partir do grupo que consiste em N1, N2, N3, N4,N5, N6, N7, N8, e N9. Em modalidades adicionais a proteína ou fragmentode proteína HA é derivada de H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10,H11, H12, H13, H14, e H15 de influenza.

Em certas modalidades, o peptídeo antigênico isolado está emuma mistura com o vírus ou a partícula semelhante a vírus, mas não é ligadocovalentemente ao vírus ou a partícula semelhante a vírus. A mistura podeincluir excipientes adicionais. Em uma modalidade, pelo menos um fragmen-to de proteína antigênica é menor do que a proteina.de extensão completa.

Em certas modalidades, o fragmento de proteína antigênica é derivado deum vírus de influenza humano ou de ave. Em certas modalidades, o frag-mento de proteína compreende pelo menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150,200 ou mais aminoácidos.

Em uma modalidade, o(s) peptídeo(s) derivado(s) de um vírusinfluenza, a(s) proteína(s) de capsídeo derivada(s) de um vírus de planta, ea(s) proteína(s) ou fragmento(s) de proteína(s) antigênica(s) derivada(s) deum vírus influenza pode(m) ser alterado(s) para fornecer características de-sejáveis aumentadas. Tais características incluem antigenicidade aumenta-da, expressão recombinante aumentada em uma célula hospedeira, monta-gem mais eficaz, ou propriedades de ligação covalente melhoradas. Em umamodalidade, o peptídeo de influenza inserido na proteína de capsídeo é mo-dificada pela alteração da sua seqüência de aminoácido, em que a alteraçãonão reduz a natureza antigênica do peptídeo. Em outra modalidade, o peptí-deo de influenza inserido na proteína de capsídeo é modificado por modifi-cações pós-traduzidas, tais como glicosilação, fosforilação, ou modificaçãode lipídeo. Em outra modalidade, a proteína antigênica isolada ou fragmentoderivado da proteína pode ser modificado pela alteração da sua seqüênciade aminoácido, em que a alteração não reduz a natureza antigênica do pep-tídeo. Em outra modalidade, a proteína antigênica ou o fragmento derivadoda proteína é modificado por modificação pós-traduzida.

Em outras modalidades da presente invenção, pelo menos umaproteína isolada ou fragmento de proteína pode ser ligado covalentemente àsuperfície do vírus ou a partícula semelhante a vírus que contém o peptídeo.

Em outra modalidade, pelo menos um fragmento de proteína de vírus deinfluenza de ave ou humano consistindo em menos do que a seqüência deaminoácido completa da proteína é ligada covalentemente à superfície dovírus ou a partícula semelhante a vírus que contém o peptídeo. Em uma mo-dalidade, o fragmento de proteína antigênica ligado covalentemente incluipelo menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200 ou mais aminoácidos.

Em outra modalidade da presente invenção, pelo menos umpeptídeo M2, NP, ou HA derivado de um vírus influenza é fundido a uma pro-teína de capsídeo derivada de um vírus de planta formando um primeiropeptídeo de fusão de capsídeo recombinante e o peptídeo de fusão de cap-sídeo recombinante é combinado com pelo menos um peptídeo derivado deum vírus influenza de ave e/ou humano fundido a uma proteína de capsídeoderivada de um vírus de planta formando um segundo peptídeo de fusão decapsídeo recombinante. Nessa modalidade, o primeiro peptídeo de fusão decapsídeo recombinante e o segundo peptídeo de fusão de peptídeo recom-binante são capazes de montagem, in vivo ou in vitro, para formar um vírusou a partícula semelhante a vírus. A partícula semelhante a vírus resultantepode então ser combinada com uma proteína antigênica isolada derivada deum vírus influenza. Em uma modalidade, o peptídeo contido no segundopeptídeo de fusão de capsídeo recombinante é derivado de uma proteína devírus influenza humano ou de ave selecionada a partir do grupo que consisteem M1, M2, hHA, NA, NP, PB1, PB2, PA, e NP2. Em uma modalidade dapresente invenção, o peptídeo contido no segundo peptídeo de fusão decapsídeo recombinante é derivado de proteínas de vírus influenza HA e NP.Em algumas modalidades o peptídeo contido no segundo peptídeo de fusãode capsídeo recombinante é HA. Em algumas modalidades o peptídeo HA éderivado de H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, Η10.Ή11, H12, H13, H14,ou H15.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, é fornecidauma composição que compreende um vírus ou a partícula semelhante a ví-rus, em que o vírus ou a partícula semelhante a vírus compreende uma pro-teína de capsídeo derivada de um vírus de planta fundido a i) pelo menosum peptídeo conservado de um vírus influenza, e ii) pelo menos um peptídeoviral de influenza isolado adicional, em que os peptídeos de fusão de capsí-deo são capazes de montagem, in vivo ou in vitro, em vírus ou a partículasemelhante a vírus, e iii) um peptídeo antigênico isolado derivado de um ví-rus influenza.

Em ainda outra modalidade, a invenção fornece uma composi-ção que compreende uma mistura de vírus ou as partículas semelhantes avírus, em que a mistura compreende i) um primeiro vírus ou a partícula se-melhante a vírus contendo pelo menos um peptídeo de um vírus influenza, eii) pelo menos um segundo vírus ou a partícula semelhante a vírus contendopelo menos um peptídeo viral de influenza diferente do que aquele contidono primeiro vírus ou a partícula semelhante a vírus, e iii) um peptídeo anti-gênico isolado derivado de um vírus influenza. Em uma modalidade, os pep-tídeos de influenza são fundidos a uma proteína de capsídeo derivada de umvírus de planta.

Em alguns aspectos da presente invenção, as composições po-dem ser utilizadas em uma estratégia de vacina para induzir uma respostaimune em um ser humano ou animal. As composições podem ser combina-das com um adjuvante e administradas em uma quantidade eficaz a um serhumano ou animal a fim de criar uma resposta imune. Em outras modalida-des, as composições são administradas sem um adjuvante a um ser humanoou animal. Em algumas modalidades a composição inclui ácido(s) nucléi-co(s) imunoestimulante(s), tais como seqüências CpG. Em certa modalida-de, o(s) ácido(s) nucléico(s) imunoestimulante(s) pode(m) ser encapsula-do(s) dentro das partículas semelhantes a vírus.

Modalidades da presente invenção incluem aquelas em que ascomposições podem ser administradas a um ser humano ou animal em umaforma substancialmente purificada, por exemplo, substancialmente livre deproteínas da célula hospedeira. Em outra modalidade, as composições po-dem ser administradas a um ser humano ou animal em uma forma parcial-mente purificada, por exemplo, em uma forma que inclui proteínas de célulahospedeira, que podem ser proteínas de célula de planta.

Em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um métodode produzir uma composição para uso em uma vacina de influenza em umser humano ou animal compreendendo:

i) fornecer um primeiro ácido nucléico que codifica uma seqüên-cia de proteína de capsídeo de vírus de planta ligada operativamente a umaseqüência de peptídeo viral de influenza, e expressar o primeiro ácido nu-cléico em uma célula hospedeira para produzir um peptídeo de fusão decapsídeo;

ii) montar o peptídeo de fusão de capsídeo para formar um vírusou a partícula semelhante a vírus;

iii) fornecer pelo menos um segundo ácido nucléico que codificapelo menos uma proteína ou fragmento de proteína antigênica derivado deuma cepa de vírus influenza, e expressar o segundo ácido nucléico em umacélula hospedeira para produzir a proteína ou fragmento de proteína antigê-nica;

iv) isolar e purificar a proteína ou fragmento de proteína antigê-nica; e

v) combinar o vírus ou a partícula semelhante a vírus e a proteí-na antigênica isolada ou fragmento da proteína para formar uma composiçãocapaz de ser administrada a um ser humano ou animal.

Em algumas modalidades o vírus ou a partícula semelhante avírus é produzido em um hospedeiro de planta, por exemplo, em plantas in-teiras ou culturas de célula de planta. Em outras modalidades, o vírus ou apartícula semelhante a vírus é produzido em uma célula hospedeira dePseudomonas fluorescens. Em outras modalidades, o peptídeo de fusão decapsídeo é expresso em uma célula hospedeira tal como uma célula deplanta ou de Pseudomonas fluorescens e o vírus ou a partícula semelhantea vírus é montado in vitro. Em uma modalidade, a proteína antigênica ou ofragmento de proteína pode ser produzido em uma célula eucariótica, talcomo em plantas inteiras ou culturas de célula de planta. Em modalidadesadicionais a proteína antigênica ou o fragmento de proteína pode ser produ-zido em qualquer célula procariótica, por exemplo, em E. coli ou Pseudomo-nas fluorescens. Em algumas modalidades, o peptídeo de fusão de capsídeoe a proteína antigênica monta in vivo para formar um vírus ou uma partículasemelhante a vírus. Em outras modalidades, o peptídeo de fusão de capsí-deo e a proteína antigênica ou o fragmento de proteína são co-expressos namesma célula procariótica, tal como uma célula de Pseudomonas fluores-cens, e o peptídeo de capsídeo de fusão monta in vivo para formar uma par-tícula semelhante a vírus.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1 mostra um desenho esquemático da vacina de influen-za que compreende o vírus ou as partículas de vírus apresentando epitoposde vírus influenza e antígenos de proteína ou fragmentos de proteína de ví-rus influenza ligados covalentemente a VLP. Encapsidação de seqüênciasde ácido nucléico imunoestimulantes (CpG) na partícula também é mostrada.

Figura 2 mostra desenho esquemático de ligação covalente deantígenos de proteína ou fragmento de proteína de vírus influenza ao vírusou a partícula semelhante a vírus.

Figura 3 mostra desenho esquemático de encapsidação de se-qüências de ácido nucléico imunoestimulantes (CpGs) na VLP durante mon-tagem de VLP.

Figura 4 mostra expressão de CP de CCMV129 fundido compeptídeo de vírus influenza M2e-1 em Pseudomonas fluorescens como de-tectado por SDS-PAGE corado por coloração Simply Blue Safe (Invitrogen).

Figura 5 mostra expressão de CP de CCMV129 fundido compeptídeo de vírus influenza M2e-2 em Pseudomonas fluorescens como de-tectado por SDS-PAGE corado por coloração Simply Blue Safe (Invitrogen).

Figura 6 mostra expressão de CP de CCMV129 fundido compeptídeo de vírus influenza NP55-69 em Pseudomonas fluorescens comodetectado por SDS-PAGE corado por coloração Simply Blue Safe (Invitro-gen).

Figura 7 mostra expressão de CP de CCMV129 fundido compeptídeo de vírus influenza NP147-158 em Pseudomonas fluorescens comodetectado por SDS-PAGE corado por coloração Simply Blue Safe (Invitro-gen).

Figura 8 mostra expressão de CP de CCMV129 fundido compeptídeo de vírus influenza HA91-108 em Pseudomonas fluorescens comodetectado por SDS-PAGE corado por coloração Simply Blue Safe (Invitro-gen).

Figura 9 mostra expressão e purificação de CP de CCMV129fundido com peptídeo de vírus influenza M2e-1 em Pseudomonas fluores-cens como detectado por SDS-PAGE corado por coloração Simply Blue Safe(Invitrogen).

Figura 10 mostra expressão de CP de CCMV129 fundido compeptídeo de vírus influenza M2e-1 em Pseudomonas fluorescens como de-tectado por western blotting com anticorpos 14B anti-CCMV e anti-M2. Opeptídeo M2e é reconhecido por anticorpos anti-M2.

Figura 11 mostra expressão de CPMV fundido com peptídeo devírus influenza M2e-1 em plantas como detectado SDS-PAGE e westernblotting com anticorpos 14B anti-CPMV e anti-M2. O peptídeo M2e é reco-nhecido por anticorpos anti-M2.

Figura 12 mostra a seqüência de uma proteína HA de um isola-do de H5N1 compreendendo peptídeo de sinal, HA1 e HA2, domínio trans-membrana, e cauda citoplasmática indicados.

Figura 13 mostra a estrutura de um monômero de HA de H5N1.

Figura 14 mostra desenho esquemático de vetores virais à basede PVX para expressão de proteínas ou fragmentos de proteína de influenzaem plantas.

Figura 15 mostra desenho esquemático de sistema à base devetor de vírus de planta para produção de proteínas de vírus influenza emplantas. O vetor de vírus de planta projetado para expressar proteínas oufragmentos de proteína de vírus influenza pode ser liberado nas plantas porinoculação mecânica como liberação mediada por DNA de plasmídeo, RNAviral ou por Agrobacterium.

Descrição Detalhada

I. Peptídeos de Fusão de Capsídeo

A presente invenção utiliza pelo menos um peptídeo derivado deum vírus influenza fundido a uma proteína de capsídeo derivada de um vírusde planta que forma um peptídeo de fusão de capsídeo recombinante. Opeptídeo de fusão de capsídeo recombinante é capaz de sofrer montagempara formar um vírus ou a partícula semelhante a vírus que não contémmembranas plasmáticas de célula hospedeira.

O peptídeo de fusão de capsídeo recombinante pode conterpeptídeos viralmente derivados de influenza. Em modalidades da presenteinvenção, o peptídeo de fusão de capsídeo recombinante contém um peptí-deo derivado de uma proteína de vírus de influenza. Em modalidades adi-cionais, o peptídeo é derivado de um peptídeo conservado, peptídeo deriva-do ou homólogo do mesmo. O peptídeo conservado pode ser derivado deuma proteína M2, HA, ou NP. Em algumas modalidades, um, mais do queum, ou combinações de peptídeos conservados, ou derivados ou homólogosdos mesmos, derivados de M2, HA, ou NP podem ser fundidos à proteína decapsídeo. Um derivado ou homólogo geralmente considerado ser uma se-qüência de aminoácido que é pelo menos cerca de pelo menos 75, 80, 85,90, 95, 98 ou 99% idêntica a uma seqüência de referência.a. Peptídeos Derivados de Influenza Humanos e/ou de Ave

Em uma modalidade da presente invenção, um peptídeo deriva-do de um vírus influenza humano e/ou de ave é fundido geneticamente auma proteína de capsídeo derivada de um vírus de planta. Seqüências deproteína de vírus humanas ou de ave são bem-conhecidas na técnica. Porexemplo, o Centro Nacional para Informação de Biotecnologia mantém umaInfluenza Resource Database, que contém seqüências de ácido nucléico quecodificam proteínas, e seqüências de aminoácido de cepas isoladas de vírusinfluenza humano e de ave. A base de dados está disponível emhttD://www.ncbi.nlm.nih.aov/Qenomes/FLU/FLU.html.

O peptídeo selecionado para inserção na proteína de capsídeoviral de planta pode ser derivado da seqüência de aminoácido de proteínasde vírus influenza de extensão completa. Em outras modalidades, o peptídeoselecionado para inserção compreende pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 ou mais aminoácidos de extensão. O pep-tídeo selecionado pode ser pelo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% homó-logo a um peptídeo antigênico que compreende pelo menos 4, 5, 6, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50,55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 ou mais aminoácidos da proteína deinfluenza a partir da qual ele é derivado.

Preferivelmente, o peptídeo de influenza selecionado para inser-ção compreende um epítopo capaz de criar uma resposta imune em um serhumano ou animal. A determinação de epitopos é bem-conhecida na técni-ca. Por exemplo um peptídeo selecionado para inserção na proteína de cap-sídeo viral de planta pode ser testado para determinar se ele é capaz de cri-ar uma resposta imune pela administração do peptídeo selecionado a umanimal tal como um camundongo, coelho, cabra, ou macaco e subseqüen-temente testar o soro do animal para a presença de anticorpos para o peptí-deo. Em outras modalidades, o peptídeo antigênico derivado de influenzapode ser alterado para melhorar as características do inserto, tais como,mas não limitadas a, expressão melhorada no hospedeiro, imunogenicidadeaumentada, e propriedades de ligação covalente melhoradas.

b. Peotídeo M2 de Influenza

A proteína M2 de influenza é uma proteína de membrana de 97aminoácidos. A proteína tem 24 aminoácidos que estão expostos extracelu-Iarmente na terminação-N, 19 aminoácidos que ocupam a bicamada lipídica,e 54 resíduos que estão localizados no lado citoplasmático da membrana.

Em uma modalidade, o peptídeo M2 utilizado na presente inven-ção é derivado de uma seqüência de 97 aminoácidos de um vírus influenzacapaz de infectar um ser humano ou pássaro. O peptídeo derivado podecompreender a seqüência de 97 aminoácidos inteira, ou ser um subgrupodessa compreendendo pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80,85, 90, 95, ou 97 aminoácidos escolhidos da seqüência de 97 aminoácidos.

O peptídeo selecionado pode ser pelo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou 99%homólogo à seqüência do peptídeo antigênico M2 compreendendo pelo me-nos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24,25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou 97 aminoácidos.

Modalidades adicionais da presente invenção incluem o peptí-deo M2 utilizado na presente invenção ser derivado do domínio extracelularde aminoácido. Modalidades da presente invenção incluem aquelas em queo peptídeo M2 utilizado na presente invenção é a seqüência do domínio ex-tracelular de 23 aminoácidos M2e-1 (SEQ ID N2: 1, Tabela 1) derivada daseqüência de M2 conservada universalmente. Em outra modalidade, o pep-tídeo M2 utilizado na presente invenção é compreendido de um subconjuntode aminoácidos do peptídeo M2e-1 que compreende pelo menos 4, 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, ou 23 escolhidos apartir do peptídeo M2e-1. O peptídeo selecionado pode ser pelo menos 75,80, 85, 90, 95, 98 ou 99% homólogo à seqüência do peptídeo M2e-1 com-preendendo pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20, 21, 22, ou 23 aminoácidos de SEQ ID Ne: 1.

Em outras modalidades, o peptídeo M2 utilizado na presenteinvenção é derivado da seqüência do domínio extracelular de 23 aminoáci-dos M2e-2 (SEQ ID N9: 2, Tabela 1). Em outra modalidade, o peptídeo M2utilizado na presente invenção é compreendido de um subconjunto do peptí-deo M2e-2 compreendendo pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, ou 23 aminoácidos escolhidos a partir do pep-tídeo M2e-2. O peptídeo selecionado pode ser pelo menos 75, 80, 85, 90,95, 98 ou 99% homólogo à seqüência do peptídeo M2e-2 compreendendopelo menos 4, 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22,ou 23 aminoácidos de SEQ ID N9: 2.

Em outra modalidade, o peptídeo M2 utilizado na presente in-venção é derivado da seqüência de domínio extracelular de 22 aminoácidosM2e-3 (SEQ ID Ne: 3, Tabela 1). Em outra modalidade, o peptídeo M2 utili-zado na presente invenção é compreendido de um subconjunto de aminoá-cidos do peptídeo M2e-3 que compreende pelo menos 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ou 22 aminoácidos escolhidos do pep-tídeo M2e-3. O peptídeo selecionado pode ser pelo menos 75, 80, 85, 90,95, 98 ou 99% homólogo à seqüência do peptídeo M2e-3 que compreendepelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ou22 aminoácidos de SEQ ID N2: 3.

Ainda em outra modalidade, o peptídeo M2 utilizado na presenteinvenção é derivado da seqüência de domínio extracelular de 23 aminoáci-dos da cepa de influenza A/PR/8/34 (H1N1) (SEQ ID N9: 4, Tabela 1). Emoutra modalidade, o peptídeo M2 utilizado na presente invenção é compre-endido de um subconjunto de aminoácidos do peptídeo M2 da cepa de influ-enza A/PR/8/34 (H1N1) compreendendo pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, ou 23 aminoácidos escolhidos a ®partir do peptídeo M2 da cepa de influenza A/PR/8/34 (H1N1). O peptídeoselecionado pode ser pelo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% homólogoao peptídeo M2 da cepa de influenza A/PR/8/34 (H1N1) que compreendepelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22,23 aminoácidos de SEQ ID N9: 4.

Ainda em outra modalidade, o peptídeo M2 utilizado na presenteinvenção é derivado da seqüência extracelular de 23 aminoácidos da cepade influenza A/Fort Monmouth/1/47 (H1N1) (SEQ ID Ne: 5, Tabela 1). Emoutra modalidade, o peptídeo M2 utilizado na presente invenção é compre-endido de um subconjunto de aminoácido do peptídeo M2 da cepa de influ-enza A/Fort Monmouth/1/47 (H1N1) que compreende pelo menos 4, 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, ou 23 aminoácidosescolhidos a partir do peptídeo M2 da cepa de influenza A/Fort Monmou-th/1/47 (H1N1). O peptídeo selecionado pode ser pelo menos 75, 80, 85, 90,95, 98 ou 99% homólogo ao peptídeo M2 da cepa de influenza A/Fort Mon-mouth/1/47 (H1N1) que compreende pelo menos 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 aminoácidos de SEQ ID NQ: 5.

Em outras modalidades, o peptídeo M2 utilizado na presenteinvenção é derivado da seqüência de 22 aminoácidos M2e-2(W-) (SEQ IDN?: 22, Tabela 1). Em outra modalidade o peptídeo M2 utilizado na presenteinvenção é compreendido de um subconjunto de aminoácidos do peptídeoM2e-2(W-) que compreende pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ou 22 aminoácidos escolhidos a partir do peptídeoM2e-2(W-). O peptídeo selecionado pode ser pelo menos 75, 80, 85, 90, 95,98 ou 99% homólogo à seqüência do peptídeo M2e-2(W-) que compreendepelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ou22 aminoácidos de SEQ ID Ne: 22.

Ainda em outra modalidade, o peptídeo M2 utilizado na presenteinvenção é derivado da seqüência de 22 aminoácidos de A/PR/8/34(H1N1)(W-) (SEQ ID N9: 23, Tabela 1). Em outra modalidade, o peptídeo M2utilizado na presente invenção é compreendido de um subconjunto de ami-noácidos de M2-A/PR/8/34 (H1N1)(W-) compreendendo pelo menos 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ou 22 aminoácidos es-colhidos a partir de A/PR/8/34 (H1N1)(W-). O peptídeo selecionado pode serpelo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% homólogo ao peptídeo A/PR/8/34(H1N1)(W-) que compreende pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15,16,17,18,19, 20, 21, 22, 23 aminoácidos de SEQ ID Ne: 23.

Ainda em outra modalidade, o peptídeo M2 utilizado na presenteinvenção é derivado da seqüência de 22 aminoácidos de A/Fort Monmou-th/1/47 (H1N1)(W-) (SEQ ID Ne: 24, Tabela 1). Em outra modalidade, o pep-tídeo M2 utilizado na presente invenção é compreendido de um subconjuntode aminoácidos de M2-A/Fort Monmouth/1/47 (H1N1)(W-) compreendendopelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ou22 aminoácidos escolhidos a partir de M2-A/Fort Monmouth/1/47 (H1N1 )(W-). O peptídeo selecionado pode ser pelo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou99% homólogo ao peptídeo M2-A/Fort Monmouth/1/47 (H1N1)(W-) compre-endendo pelo menos 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21, ou 22 aminoácidos de SEQ ID NQ: 24.

Em modalidades adicionais, o peptídeo M2 inserido na proteínade capsídeo de vírus de planta pode ser a seqüência de aminoácido inteiraselecionada a partir do grupo que consistem em SEQ ID N-: 1-5 e 22-24, ouum subconjunto dessas que tem pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou mais aminoácidos de extensão. O peptídeo selecionado para inserção pode ser pelo menos 75, 80, 85, 90,95, 98 ou 99% homólogo a um peptídeo de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11,12,13,14,15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou mais aminoácidos deextensão proveniente das seqüências de peptídeo selecionadas a partir dogrupo que consiste em SEQ ID N-: 1-5 e 22-24.

Em outras modalidades, qualquer combinação de peptídeos M2selecionados a partirxlo grupo que consiste em SEQ ID N9: 1-5 e 22-24, ouum subconjunto desses que tem pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou mais aminoácidos de extensãopode ser inserido na proteína de capsídeo de vírus de planta. As combina-ções de peptídeo selecionadas podem ser pelo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98ou 99% homólogas a pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou mais aminoácidos selecionados a partir dogrupo que consiste em SEQ ID Ne: 1-5 e 22-24.

Em modalidades adicionais, o peptídeo antigênico derivado deinfluenza M2 pode ser alterado para melhorar as características do inserto,tais como, mas não limitadas a, expressão melhorada no hospedeiro, imu-nogenicidadei aumentada, e propriedades de ligação covalente melhoradas.Modalidades da presente invenção incluem aquelas em que o aminoácidotriptofano em SEQ ID N9: 1, 2, 4, ou 5 é removido ou substituído por um a-minoácido que não é triptofano.

Tabela 1: Seqüências de Peptídeo M2

<table>table see original document page 22</column></row><table>

A presente invenção também fornece novos peptídeos derivadosde M2. Em uma modalidade, é fornecido o novo peptídeo M2, M2e-3, quecompreende SEQ ID Ne: 3. Em uma modalidade, são fornecidas seqüênciasde aminoácido pelo menos 70, 75, 80, 90, 95, 98 ou 99% homólogas a SEQID Ne: 3. Em outra modalidade, é fornecido um peptídeo que compreendepelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ou22 aminoácidos derivados de SEQ ID N9: 3. O peptídeo M2e-3 é derivado dopeptídeo M2e-1, em que o aminoácido triptofano foi removido. A remoção dotriptofano fornece montagem aumentada de certos peptídeos de fusão decapsídeo, enquanto não afeta adversamente a imunogenicidade do peptí-deo. Em uma modalidade, o peptídeo M2e-3 é inserido em uma proteína decapsídeo viral de planta. Modalidades da presente invenção incluem aquelasem que o peptídeo M2e-3 é inserido em uma proteína de capsídeo derivadade CCMV ou CPMV.

Em uma modalidade, é fornecido o novo peptídeo M2, M2e-2(W-), que compreende SEQ ID Ne: 22. Em uma modalidade, são fornecidas se-qüências de aminoácido pelo menos 70, 75, 80, 90, 95, 98 ou 99% homólo-gas a SEQ ID N2: 22. Em outra modalidade, é fornecido um peptídeo quecompreende pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, ou 22 aminoácidos derivados de SEQ ID N9: 22. O peptídeo M2e-2(W-) é derivado do peptídeo M2e-2, em que o aminoácido triptofano foi re-movido. Em uma modalidade, o peptídeo M2e-2(W-) é inserido em uma pro-teína de capsídeo derivada de um vírus de planta. Modalidades da presenteinvenção incluem aquelas em que o peptídeo M2e-2(W-) é inserido em umaproteína de capsídeo derivada de CCMV ou CPMV..

Em uma modalidade, é fornecido o novo peptídeo M2, M2e-A/PR/8/34 (H1N1)(W-) que compreende SEQ ID Ng: 23. Em uma modalida-de, são fornecidas seqüências de aminoácido pelo menos 70, 75, 80, 90, 95,98 ou 99% homólogas a SEQ ID Ne: 23. Em outra modalidade, é fornecidoum peptídeo que compreende pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ou 22 aminoácidos derivados de SEQ ID Ns: 23. Opeptídeo M2e-A/PR/8/34 (H1N1)(W-) é derivado do peptídeo M2e-A/PR/8/34(H1N1), em que o aminoácido triptofano foi removido. Em uma modalidade,o peptídeo M2e-A/PR/8/34 (H1N1)(W-) é inserido em uma proteína de cap-sídeo derivada de um vírus de planta. Modalidades da presente invençãoincluem aquelas em que o peptídeo M2e-A/PR/8/34 (H1N1)(W-) é inseridoem uma proteína de capsídeo derivada de CCMV ou CPMV.

Em uma modalidade, é fornecido o novo peptídeo M2, M2e-A/Fort Monmouth/1/47 (H1N1)(W-) que compreende SEQ ID N9: 24. Em umamodalidade, são fornecidas seqüências de aminoácido pelo menos 70, 75,80, 90, 95, 98 ou 99% homólogas a SEQ ID N2: 24. Em outra modalidade, éfornecido um peptídeo que compreende pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ou 22 aminoácidos derivados de SEQID N9: 24. O peptídeo é derivado do peptídeo M2e- A/Fort Monmouth/1/47(H1N1), em que o aminoácido triptofano foi removido. Em uma modalidade,o peptídeo M2e-A/Fort Monmouth/1/47 (H1N1)(W-) é inserido em uma prote-ína de capsídeo derivada de um vírus de planta. Modalidades da presenteinvenção incluem aquelas em que o peptídeo M2e-A/Fort Monmouth/1/47(H1N1)(W-) é inserido em uma proteína de capsídeo derivada de CCMV ouCPMV.

Novas composições compreendendo um peptídeo de fusão decapsídeo compreendendo uma proteína de capsídeo derivada de um vírus,incluindo um vírus de planta, fundida a um peptídeo selecionado do grupoque consiste em SEQ ID N-: 3, 22, 23, and 24 também são fornecidas,b. Proteína HA

Hemaglutinina (HA) de vírus influenza é uma glicoproteínatransmembrana tipo I que aparece em partículas de vírus influenza comohomotrímeros com múltiplos domínios de enovelamento. O monômero temseis pontes de dissulfeto intracadeia e sete glicanos N-Iigados no ectodomí-nio N-terminal, um domínio transmembrana e uma cauda citosólica. Wilsonet ai. (1981) "Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of in-fluenza virus at 3 A0 resolution," Nature 289:366-373; Wiley D.C. e JJ. Ske-hel (1987) "The structure and function of hemagglutinin membrane glycopro-tein of influenza virus," Annu. Rev. Biochem. 56:365-394. A estrutura cristali-na do ectodomínio nos trímeros ativados proteoliticamente revela uma longaproteína de espícula trimérica de 135 As na qual cada subunidade tem doisdomínios principais: um domínio NH2-terminal superior globular e um domí-nio COOH-terminal que forma a haste da proteína de espícula. A região dehaste contém os peptídeos de fusão conhecidos por estar envolvidos na ati-vidade de fusão de membrana da proteína. Wilson et ai (1981) "Structure ofthe haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A0 resolu-tion," Nature 289:366-373; Wiley D.C. e JJ. Skehel (1987) "The structure andfunction of hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus," Annu.Rev. Biochem. 56:365-394.

Em uma modalidade, o peptídeo HA utilizado na presente inven-ção é derivado de uma proteína HA contida em um vírus influenza selecio-nado a partir do grupo de quinze classes de antígenos de hemaglutinina H1-H15. O peptídeo derivado pode compreender a seqüência de aminoácido deHA inteira, ou ser um subconjunto desse que compreende pelo menos 4, 5,6,7,8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20,21,22,23,24,25,30,35,40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 135, 140, 150,160, 170, 180, 190, 200, 210, 225, 235, 250, 260, 275, 280, 290, 300, 310,320, 325, 330, 331, 332, ou 333 ou mais aminoácidos escolhidos a partir daseqüência de aminoácido de HA. O peptídeo selecionado pode ser pelo me-nos 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% homólogos à seqüência do peptídeo anti-gênico HA da proteína de influenza que compreende pelo menos 4, 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40,45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 135, 140, 150, 160,170, 180, 190, 200, 210, 225, 235, 250, 260, 275, 280, 290, 300, 310, 320,325, 330, 331, 332, 333 ou mais aminoácidos escolhidos a partir da seqüên-cia de aminoácido de HA a partir da qual ele é derivado.

Modalidades adicionais da presente invenção incluem o peptí-deo HA utilizado na presente invenção ser derivado de um vírus de influenzacapaz de infectar um ser humano ou pássaro. Modalidades da presente in-venção incluem aquelas em que o peptídeo HA inserido na proteína de cap-sídeo de vírus de planta utilizado na presente invenção é derivado de umsubtipo H3. Em modalidades adicionais, o peptídeo HA pode ser derivado daproteína HA de 333 aminoácidos da cepa de influenza A/Texas/1/77 (H3N2)(SEQ ID Ne: 6, Tabela 2). CB Smith et ai (2002) "Molecular epidemiology ofinfluenza A(H3N2) virus re-infec.tions," J. Infect. Dis. 185 (7): 980-985. Emoutra modalidade, o peptídeo HA utilizado para inserto na proteína de capsí-deo de planta pode compreender a seqüência de aminoácidos de HA inteirade SEQ ID N9: 6, ou ser um subconjunto desse compreendendo pelo menos4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 135, 140,150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 225, 235, 250, 260, 275, 280, 290, 300,310, 320, 325, 330, 331, 332, 333 ou mais aminoácidos escolhidos a partirda seqüência de aminoácido de HA de SEQ ID Ns: 6. O peptídeo seleciona-do pode ser pelo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% homólogo à seqüên-cia do peptídeo antigênico HA compreendendo pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13,=14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45,50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 135, 140, 150, 160, 170,180, 190, 200, 210, 225, 235, 250, 260, 275, 280, 290, 300, 310, 320, 325,330, 331, 332, 333 ou mais aminoácidos de SEQ ID N9: 6.

Modalidades adicionais da presente invenção incluem aquelasem que o peptídeo HA utilizado na presente invenção é derivado da seqüên-cia de 18 aminoácidos de HA91-108- A/Texas/1/77 (H3N2) (SEQ ID NQ: 7,Tabela 2) ou um subconjunto dessa que tem pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 aminoácidos de extensão derivada dos ami-noácidos 91-108 de HA da cepa de influenza A/Texas/1/77 (H3N2). O peptí-deo selecionado pode ser pelo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% homó-logo à seqüência de peptídeo antigênico de HA que compreende a seqüên-cia de 18 aminoácidos HA91-108- A/Texas/1/77 (H3N2) (SEQ ID N5: 7, Ta-bela 2) ou um subconjunto dessa que tem pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, ou 18 aminoácidos de extensão derivado dos aminoá-cidos 91 -108 de HA da cepa de influenza A/Texas/1/77 (H3N2).

Em modalidades adicionais, o peptídeo HA inserido na proteínade capsídeo de vírus de planta pode ser a seqüência de aminoácido inteiraselecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N-: 6 e 7, ou umsubconjunto dessas que tem pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70,75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, . 125, 135, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200,210, 225, 235, 250, 260, 275, 280, 290, 300, 310, 320, 325, 330, 331, 332,333 ou mais aminoácidos de extensão. Em outras modalidades, qualquercombinação de peptídeos HA selecionados a partir do grupo que consisteem SEQ ID N-: 6 e 7, ou um subconjunto desses que tem pelo menos 4, 5,6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35,40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 135, 140, 150,160, 170, 180, 190, 200, 210, 225, 235, 250, 260, 275, 280, 290, 300, 310,320, 325, 330, 331, 332, 333 ou mais aminoácidos de extensão pode serinserido na proteína de capsídeo de vírus de planta. O peptídeo selecionadopode ser pelo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% homólogo à seqüênciade peptídeo antigênico HA do peptídeo selecionado derivado do grupo queconsiste em SEQ ID N-: 6-7.

Em modalidades adicionais, o peptídeo antigênico HA derivadode influenza pode ser alterado para melhorar as características do inserto,tais como, mas não se limitando a, expressão melhorada no hospedeiro, i-munogenicidade aumentada, e propriedades de ligação covalente aumenta-das.

Tabela 2: Seqüências de peptídeo HA

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c. Proteína NP

Nucleoproteína de vírus influenza (NP) é uma nucleoproteínahelicoidal intimamente associada com o genoma de RNA de filamento sim-ples viral. A proteína NP de influenza é rica em resíduos de arginina, glicinae serina e tem uma carga líquida positiva em pH neutro. A proteína NP tipo Ade influenza é composta geralmente de um polipeptídeo de 498 aminoácidosde extensão, enquanto nos vírus B e C de influenza, a extensão do polipep-tídeo NP homólogo é geralmente 560 e 565 resíduos, respectivamente. VejaLondo et ai (1983) "Complete nucleotide sequence of the nucleoprotein ge-ne of influenza B virus," Journal of Virology 47:642-648; S. Nakada et al.(1984) "Complete nucleotide sequence of the influenza C/California/78 virusnucleoprotein gene," Virus Research 1: 433-441. Alinhamento das seqüên-cias de aminoácido previstas dos genes NP dos três tipos de vírus influenzarevela significante similaridade entre as três proteínas, com as NPs tipo A eB mostrando o maior grau de conservação. Veja Portela & Digard (2002)"The influenza virus nucleoprotein: a multifunctional RNA-binding protein pi-votal to virus replication 2002," JGV 83:723-734. Análise filogenética de ce-pas de vírus isoladas de hospedeiros diferentes revela que o gene NP é rela-tivamente bem conservado, com uma diferença de aminoácido máxima demenos do que 11%. Veja, Shu et al. (Ί993) "Analysis of the evolution andvariation of the human influenza A virus nucleoprotein gene from 1933 to1990," Journal of Virology 67: 2723-2729.

Em uma modalidade, o peptídeo NP utilizado na presente inven-ção é derivado de uma proteína NP contida em um vírus influenza tipo A, Bou C. O peptídeo derivado pode compreender a seqüência de aminoácido deNP inteira, ou um subconjunto dessa compreendendo pelo menos 4, 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 30, 35, 40,45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 135, 140, 150, 160,170, 180, 190, 200, 210, 225, 235, 250, 260, 275, 280, 290, 300, 310, 320,325, 330, 350, 360, 375, 380, 390, 400, 410, 425, 435, 445, 450, 460, 470,480, 490, 495, 498 ou mais aminoácidos escolhidos a partir da seqüência deaminoácido de NP. O peptídeo selecionado pode ser pelo menos 70, 75, 80,85, 90, 95, 98 ou 99% homólogo à seqüência de peptídeo antigênico NP daproteína de influenza compreendendo pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60,65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 135, 140, 150, 160, 170, 180, 190,200, 210, 225, 235, 250, 260, 275, 280, 290, 300, 310, 320, 325, 330, 320,325, 330, 350, 360, 375, 380, 390, 400, 410, 425, 435, 445, 450, 460, 470,480, 490, 495, 498 ou mais aminoácidos escolhidos da seqüência de amino-ácido NP.

Modalidades adicionais da presente invenção incluem aquelasem que o peptídeo NP utilizado na presente invenção é derivado de um vírusinfluenza capaz de infectar um ser humano ou pássaro. Modalidades da pre-sente invenção incluem aquelas em que o peptídeo NP inserido na proteínade capsídeo de vírus de planta utilizada na presente invenção é derivada daproteína NP derivada de um vírus influenza Tipo A. a proteína NP é derivadada proteína NP de 498 aminoácidos da cepa de influenza A/Texas/1/77(H3N2) (SEQ ID Ne: 8, Tabela 3) ou é um subconjunto dessa que compreen-de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110,125, 135, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 225, 235, 250, 260, 275,280, 290, 300, 310, 320, 325, 330, 350, 360, 375, 380, 390, 400, 410, 425,435, 445, 450, 460, 470, 480, 490, 495, 498 ou mais aminoácidos escolhidosa partir da seqüência de aminoácido de NP de SEQ ID N9: 8. O peptídeoselecionado pode ser pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% homólo-go à seqüencia do peptídeo antigênico NP da proteína de influenza quecompreende pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90,95, 100, 110, 125, 135, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 225, 235,250, 260, 275, 280, 290, 300, 310, 320, 325, 330, 320, 325, 330, 350, 360,375, 380, 390, 400, 410, 425, 435, 445, 446, ou mais aminoácidos selecio-nados a partir da seqüência de aminoácido de NP de SEQ ID N5: 8.

Modalidades adicionais da presente invenção incluem aquelasem que o peptídeo NP utilizado na presente invenção é derivado da seqüên-cia de 15 aminoácidos NP55-69- A/Texas/1/77 (H3N2) (SEQ ID N9: 9, Tabe-la 3) ou um subconjunto dessa que tem pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, ou 15 aminoácidos de extensão ,derivados dos aminoácidos 55-69 da cepa de influenza A/Texas/1/77 (H3N2). O peptídeo selecionado podeser pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% homólogo à seqüência dopeptídeo antigênico NP ou um subconjunto dessa que tem pelo menos 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 aminoácidos de extensão derivados dos a-minoácidos 55-90 de NP da cepa de influenza A/Texas/1/77 (H3N2).

Em outras modalidades, o peptídeo NP utilizado na presenteinvenção é derivado da seqüência de 12 aminoácidos NP147-158-A/Texas/1/77 (H3N2) (SEQ ID N9: 10, Tabela 3) ou um subconjunto dessaque tem pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 aminoácidos de extensãoderivados dos aminoácidos 147-158 de NP da cepa de influenzaA/Texas/1/77 <(H3N2). O peptídeo selecionado pode ser pelo menos 70, 75,80, 85, 90, 95, 98 ou 99% homólogo à seqüência do peptídeo antigênico NPou um subconjunto dessa que tem pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12aminoácidos de extensão derivados dos aminoácidos 147-158 da cepa deinfluenza /VTexas/1/77 (H3N2).

Em modalidades adicionais, o peptídeo NP inserido na proteínade capsídeo de vírus de planta pode ser a seqüência de aminoácido inteiraselecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N-: 8-10, ou um sub-conjunto dessas que tem pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75,80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 135, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210,225, 235, 250, 260, 275, 280, 290, 300, 310, 320, 325, 330, 320, 325, 330,350, 360, 375, 380, 390, 400, 410, 425, 435, 445, 450, 460, 470, 480, 490,495, 498, ou mais aminoácidos de extensão. O peptídeo selecionado podeser pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% homólogo à seqüência dopeptídeo antigênico NP da proteína de influenza que compreende pelo me-nos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 135,140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 225, 235, 250, 260, 275, 280, 290,300, 310, 320, 325, 330, 320, 325, 330, 350, 360, 375, 380, 390, 400, 410,425, 435, 445, 450, 460, 470, 480, 490, 495, 498, ou mais aminoácidos es-colhidos a partir da seqüência de aminoácido de NP selecionada a partir dogrupo que consiste em SEQ ID N-: 8-10. Em outras modalidades, qualquercombinação de peptídeos NP selecionados a partir do grupo que consisteem SEQ ID N-: 8-10, ou um subconjunto dessas que é 70, 75, 80, 85, 90,95, 98 ou 99% homóloga à seqüência do peptídeo antigênico NP da proteínade influenza que compreende pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70,75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 135, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200,210, 225, 235, 250, 260, 275, 280, 290, 300, 310, 320, 325, 330, 320, 325,330, 350, 360, 375, 380, 390, 400, 410, 425, 435, 445, 450, 460, 470, 480,490, 495, 498 ou mais aminoácidos de extensão derivados do grupo queconsiste em SEQ ID N-: 8-10 pode ser inserido na proteína de capsídeo devírus de planta.

Em modalidades adicionais, o peptídeo antigênico derivado deNP de influenza pode ser alterado para melhorar as características do inser-to, tais como, mas não limitadas a, expressão melhorada no hospedeiro, i-munogenicidade aumentada, e propriedades de ligação covalente aumenta-das.

Tabela 3: Seqüências de aminoácido NP

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d. Proteína de Capsídeo

A presente invenção utiliza proteínas de capsídeo derivadas devírus de planta para construir peptídeos de fusão de capsídeo. Uma potenci-al vantagem para o uso de proteínas de capsídeo de um vírus de uma plantaé o potencial reduzido para reações adversas quando administrado a um serhumano ou animal enquanto mantém a vantajosa forma de uma partículaviral para apresentar o epítopo de influenza.

Em modalidades adicionais, a proteína de capsídeo será deriva-da de vírus de planta selecionados a partir de membros de qualquer um dostáxons que são específicos para pelo menos um hospedeiro de planta.

Taxonomias virais reconhecem os seguintes táxons de entida-des de partícula encapsidada: Vírus do grupo I, isto é, vírus de dsDNA, Vírusdo Grupo II, isto é, vírus de ssDNA; Vírus do grupo III, isto é, vírus de dsR-NA; Vírus do Grupo IV, isto é, os vírus de ssRNA de filamento-(+) sem está-gio de DNA; Vírus do Grupo V, isto é, os vírus de ssRNA filamento-(-); Vírusdo Grupo VI, isto é, vírus de retro RNA, que são vírus de ssRNA que fazemtranscrição reversa; Vírus do Grupo VII, isto é, vírus de retro DNA, que sãovírus de dsDNA que fazem transcrição reversa; Deltavírus; Viróides; e fagosSatélite e vírus Satélite, excluindo ácidos nucléicos Satélite e Príons.

Membros desses táxons são bem-conhecidos daqueles versa-dos na técnica e não são revisados em: H.V. Van Regenmortel et al. (eds.),Virus Taxonomy: Seventh Report of the International Committee on Taxo-nomy of Viruses (2000) (Academic Press/Elsevier, Burlington Mass., USA); apágina da internet de Taxonomia Viral da University of Leicester (UK) Micro-biology & Immunology Department emhttp://wwwmicro.msb.le.ac.uk/3035/Virusgroups.html; e as seções online "Vi-rus" e "Viroid" do Taxonomy Browser do National Center for BiotechnologyInformation (NCBI) da National Library of Medicine of the National Institutesof Health of the US Department of Health & Human Services (Washington,D.C.,.EUA) em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/tax.html.

A seqüência de aminoácido para o capsídeo pode ser selecio-nada a partir dos capsídeos de qualquer membro de qualquer um dessestáxons que são infecciosos para plantas. Seqüências de aminoácido paracapsídeos dos membros desses táxons podem ser obtidas de fontes, inclu-indo, mas não se limitando a, por exemplo, as seções "Nucleotide" (Gen-bank), "Protein," e "Structure" do instrumento de pesquisa PubMed oferecidopelo NCBI em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi.

Os vírus podem ser classificados naqueles com simetria helicoi-dal ou com simetria icosaédrica. Morfologias de capsídeo geralmente reco-nhecidas incluem: icosaédricos (incluindo incosaédrico propriamente dito,isométrico, quase-isométrico, e geminados ou combinados), poliédricos (in-cluindo esféricos, ovóides, e em forma de limão), baciliformes (incluindo emforma de bastão ou de bala e fusiforme ou em forma de charuto), e helicoi-dais (incluindo bastonete, cilíndrico, e filamentoso); qualquer um dos quaispode ser caudado e/ou pode conter projeções de superfície, tais como espí-cuias e nós. Em uma modalidade da invenção, a seqüência de aminoácidodo capsídeo é selecionada a partir dos capsídeos de vírus classificados co-mo tendo qualquer morfologia.

Em uma modalidade, o capsídeo é derivado de um vírus deplanta de formato de bastonete. Modalidades adicionais da presente inven-ção incluem aquelas em que o capsídeo é um capsídeo viral de formato debastonete derivado do grupo selecionado a partir de Vírus do Mosaico doTabaco (TMV) ou Vírus X da Batata (PVX). TMV consiste em um único RNAgenômico de sentido positivo (6,5 kb) encapsidados com uma única proteínade revestimento (17,5 kDa) o que resulta em partículas em formato de bas-tonete (300 nm). Uma grande variedade de hospedeiros do vírus do mosaicodo tabaco permite que se use uma variedade de espécies de planta comosistemas de produção e liberação. Foi mostrado anteriormente que genesestranhos inseridos nesse vetor podem produzir altos níveis de proteína.Yusibov et ai (1995) "High-affinity RNA-binding domains of alfalfa mosaicvirus coat protein are not required for coat protein-mediated resistance,"Proc. Natl. Acad. Sei. U.S. 92:8980-8984. Vírus V da batata são filamento-sos, não-envelopados; geralmente vírus flexuosos com um comprimentomodal desobstruído de 515 nm e largura de 13 nm. A estrutura do capsídeoforma uma hélice básica com uma altura de 3,4 nm. Varma A, Gibbs AJ,Woods RD, Finch JT (1968) "Some observations on the struçture of the fila-mentous partícles of several plant viruses," J Gen Virol. 2(1): 107-14. Em ou-tras modalidades, a proteína de capsídeo é derivada de um vírus de plantaque não é TMV.

Em uma modalidade, o capsídeo tem uma morfologia icosaédri-ca. Geralmente, capsídeos virais de vírus icosaédricos são compostos devárias subunidades de proteína dispostas em simetria icosaédrica (cúbica).Capsídeos icosaédricos nativos podem ser feitos, por exemplo, com 3 subu-nidades formando cada face triangular de um capsídeo, resultando em 60subunidades formando um capsídeo completo. Representante dessa peque-na estrutura viral é, por exemplo, o bacteriófago 0X174. Vários capsídeos devírus icosaédricos contêm mais do que 60 subunidades vários capsídeos devírus icosaédricos contêm um motivo de enovelamento de cilindro (beta-barrel) de oito fitas antiparelelos. O motivo tem um bloco em forma de cunhacom quatro filamentos beta (chamadas BIDG) de um lado e quatro (chama-das CHEF) do outro. Também há duas alfa-hélices conservadas (chamadasA e B), uma está entre betaC e betaD, a outra entre betaE e betaF.

Em uma modalidade, as espécies de vírus de planta icosaédri-cas serão uma espécie de vírus infecciosa para plantas que está ou é ummembro de qualquer um dos táxons Bunyaviridae, Reoviridae, Rhabdoviri-dae, Luteoviridae, Nanoviridae, Partitiviridae, Sequiviridae, Tymoviridàe,Ourmiavirus, Vírus Satélite da Necrose do Tabaco, Caulimoviridae, Geminivi-ridae, Comoviridae, Sobemovirus, Tombusviridae, ou Bromoviridae. Em umamodalidade, a espécie de vírus de planta icosaédrica é uma espécie de vírusinfecciosa para plantas que está ou é um membro de qualquer um dos tá-xons Luteoviridae, Nanoviridae, Partitiviridae, Sequiviridae, Tymoviridàe,Ourmiavirus, Vírus Satélite da Necrose do Tabaco, Caulimoviridae, Geminivi-ridae, Comoviridae, Sobemovirus, Tombusviridae, ou Bromoviridae. Em mo-dalidades específicas, a espécie de vírus de planta icosaédrica é uma espé-cie de vírus de planta infecciosa para plantas que é um membro de qualquerum de Caulimoviridae, Geminiviridae, Comoviridae, Sobemovirus, Tombusvi-ridae, ou Bromoviridae. Em outras modalidades a espécie de vírus de plantaicosaédrica será uma espécie de vírus infecciosa para plantas que é ummembro de qualquer um de Comoviridae, Sobemovirus, Tombusviridae, ouBromoviridae. Em modalidades adicionais, o capsídeo é derivado de um Ví-rus do Estriado do Tabaco, Vírus do Mosaico da Alfafa (AMV), ou Vírus doMosaico do Capim Bromo (BMV). Em outras modalidades, a espécie de ví-rus de planta icosaédrica pode ser uma espécie de vírus infecciosa paraplantas que é um membro da família Comoviridae ou Bromoviridae. Modali-dades da presente invenção incluem aquelas em que o capsídeo viral é deri-vado de um Vírus do Mosaico do Caupi (CPMV) ou Vírus do MosqueadoClorótico do Caupi (CCMV).

Modalidades da presente invenção incluem aquelas em que aproteína de capsídeo utilizada na presente invenção é derivada de uma pro-teína de capsídeo de CCMV. Mais especificamente, a proteína de capsídeoé derivada da seqüência de aminoácido de CCMV representada por SEQ IDN9: 11 (Tabela 4). Em outras modalidades, a proteína de capsídeo utilizadana presente invenção pode ser a seqüência de aminoácido inteira da grandeproteína de capsídeo de CCMV, ou um subconjunto dessa compreendendopelo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100,110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ou mais aminoácidos selecio-nados a partir de SEQ ID N5: 11. A proteína de capsídeo selecionada podeser pelo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98, ou 99% homóloga à seqüência deaminoácido da grande proteína de capsídeo de CCMV, ou um subconjuntodessa compreendendo pelo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70,75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ou maisaminoácidos selecionados a partir de SEQ ID N5: 11. Em outras modalida-des, a proteína de capsídeo pode ser alterada para melhorar as característi-cas do peptídeo de fusão de capsídeo, tais como, mas não limitadas a, ex-pressão melhorada no hospedeiro, imunogenicidade aumentada, proprieda-des de ligação covalente melhoradas, ou enovelamento ou remontagem me-lhorados.

Em outras modalidades, a proteína de capsídeo utilizada na pre-sente invenção é derivada da proteína menor de capsídeo de CPMV (Capsí-deo de CPMV S). Mais especificamente, a proteína de capsídeo é derivadada seqüência de aminoácido de CPMV S representada por SEQ ID Ne: 12(Tabela 4). Em outras modalidades, a proteína de capsídeo utilizada na pre-sente invenção pode ser a seqüência de aminoácido inteira da proteína me-nor de capsídeo de CPMV, ou um subconjunto dessa compreendendo pelomenos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110,120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 213 ou mais aminoácidosselecionados a partir de SEQ ID NQ: 12. A proteína de capsídeo selecionadapode ser pelo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98, ou 99% homóloga à seqüênciade aminoácido da proteína menor de capsídeo de CPMV, ou um subconjuntodessa compreendendo pelo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70,75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200,210, 213 ou mais aminoácidos selecionados a partir de SEQ ID Ns: 12. Emoutras modalidades, a proteína de capsídeo pode ser alterada para melhoraras características do peptídeo de fusão de capsídeo, tais como, mas nãolimitadas a, expressão melhorada no hospedeiro, imunogenicidade aumen-tada, propriedades de ligação covalente melhoradas, ou enovelamento ouremontagem melhoradas.

Em outra modalidade, a proteína de capsídeo utilizada na pre-sente invenção é derivada da grande proteína de capsídeo de CPMV (Cap-sídeo de CPMV L). Mais especificamente, a proteína de capsídeo é derivadada seqüência de aminoácido de capsídeo de CPMV L representada por SEQID Ne: 13 (Tabela 4). Em outras modalidades, a proteína de capsídeo utiliza-da na presente invenção pode ser a seqüência de aminoácido inteira dagrande proteína de capsídeo de CPMV, ou um subconjunto dessa compre-endendo pelo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85,90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 225, 240,250, 265, 275, 285, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 374 oumais aminoácidos selecionados a partir de SEQ ID N5: 12. A proteína decapsídeo selecionada pode ser pelo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98, ou 99%homóloga à seqüência de aminoácido da grande proteína de capsídeo deCPMV, ou um subconjunto dessa compreendendo pelo menos 20, 25, 30,35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140,150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 225, 240, 250, 265, 275, 285, 290, 300,310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 374 ou mais aminoácidos selecionados apartir de SEQ ID N2: 13. Em outras modalidades, a proteína de capsídeopode ser alterada para melhorar as características do peptídeo de fusão decapsídeo, tais como, mas não limitadas a, expressão melhorada no hospe-deiro, imunogenicidade aumentada, propriedades de ligação covalente me-lhoradas, ou enovelamento ou remontagem melhoradas.Tabela 4: Seqüências de Aminoácido e Nucleotídeo de Capsídeo Viral dePlanta

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e. Geração de Peptídeo de Fusão de Capsídeo

Um ácido nucléico que codifica um peptídeo derivado de um ví-rus influenza é geralmente fundido a um ácido nucléico que codifica umaproteína de capsídeo viral de planta para produzir um construto capaz de serexpresso como um peptídeo de fusão recombinante. Os peptídeos de capsí-deo recombinantes para uso na presente invenção podem ser produzidosem sistemas de expressão biológicos utilizando técnicas bem-conhecidas natécnica. Por exemplo, construtos de ácido nucléico que codificam um peptí-deo de fusão de uma proteína de capsídeo viral de planta operativamenteligados a pelo menos um peptídeo antigênico de influenza podem ser intro-duzidos em uma célula hospedeira e expressos. Elementos regulatóriostranscricionais e traduzidos, tais como seqüências intensificadoras transcri-cionais, seqüências intensificadoras traduzidas, promotores, sítios de entra-da ribossomal, incluindo sítios de entrada interna, ativadores, sinais de inícioe parada de tradução, terminadores de transcrição, reguladores cistrônicos,reguladores policistrônicos, seqüências marcadoras, tais como marcadoresde seqüência de nucleotídeo e seqüências codificantes de peptídeo marca-dor, que facilita a identificação, separação, purificação ou isolamento do pep-tídeo de fusão de proteína de capsídeo recombinante expresso, incluindomarcador His, marcador Flag, marcador T7, marcador S, marcador HSV,marcador B, marcador Strep, poliarginina, policisteína, polifenilalanina, ácidopoliaspártico, (Ala-Trp-Trp-Pro)n, tioredoxina, beta-galactosidase, cloramfe-nicol acetiItransferase, ciclomaltodextrina gluconotransferase, CTP:CMP-3-desóxi-D-mano-octulosonato citidiltransferase, trpE ou trpLE, avidina, estrep-tavidina, gene 10 de T7, T4 gp55, proteína A estafilocócica, proteína G es-treptocócica, GST, DHFR, CBP, MBP, domínio de ligação de galactose, do-mínio de ligação de Calmodulina1 KSI1 c-myc, ompT, ompA, pelB, NusA, ubi-quitina, hex-histidina, glutationa-S-transferase, GFP, YFP, ou análogos detais proteínas fluorescentes, moléculas de anticorpo, hemosilina A, ou umantígeno ou Iigante conhecido para um parceiro de ligação conhecido útilpara purificação pode ser incluído na seqüência de ácido nucléico para ex-pressão na célula hospedeira.

A seqüência codificante de ácido nucléico para o peptídeo oupeptídeos de influenza pode ser inserida na seqüência codificante de ácidonucléico para a proteína de capsídeo viral em um sítio predeterminado. Emuma modalidade, o peptídeo de influenza é inserido na seqüência codificantede capsídeo para que seja expresso como uma alça durante a formação deum vírus ou a partícula semelhante a vírus.

Peptídeos de influenza podem ser inseridos em mais de um sítiode inserção no capsídeo de planta. Dessa forma, peptídeos de influenza po-dem ser inseridos em mais de um motivo de alça de superfície de um capsí-deo quando os peptídeos de fusão de capsídeo remontarem para formar umvírus ou a partícula semelhante a vírus. Alternativamente, peptídeos de in-fluenza também podem ser inseridos em múltiplos sítios dentro de um dadomotivo de alça quando os peptídeos de fusão de capsídeo montarem paraformar um vírus ou a partícula semelhante a vírus.

Além disso, peptídeos de influenza podem ser inseridos dentrode alça(s) voltada(s) para o lado externo e/ou dentro de alça(s) voltada(s)para o lado interno, isto é, dentro de alças do capsídeo que estão voltadasrespectivamente para fora ou em direção ao centro do capsídeo. Qualquerligação de aminoácido ou peptídeo em uma alça de superfície de um capsí-deo pode servir como um sítio de inserção para o peptídeo de influenza. Ti-picamente, o sítio de inserção pode ser selecionado aproximadamente nocentro da alça, isto é, aproximadamente na posição localizada mais distai docentro da estrutura terciária do peptídeo de capsídeo enovelado. A seqüên-cia codificante do peptídeo de influenza pode ser inserida operativamentedentro da posição da seqüência codificante do capsídeo que corresponde aesse centro aproximado da(s) alça(s) selecionada(s) quando o peptídeo defusão de capsídeo montar para formar um vírus ou a partícula semelhante avírus. Isso inclui a retenção da fase de leitura para aquela porção da se-qüência de peptídeo do capsídeo que é sintetizado à jusante do sítio de in-serção do peptídeo.

Em outra modalidade, o peptídeo de influenza pode ser inseridona terminação amino do capsídeo. O peptídeo de influenza pode ser ligadoao capsídeo através de uma ou mais seqüências ligantes. Ainda em outramodalidade, o peptídeo de influenza pode ser inserido na terminação carbóxido capsídeo. O peptídeo de influenza também pode ser ligado à terminaçãocarbóxi do capsídeo. O peptídeo de influenza também pode ser ligado à ter-minação carbóxi através de um ou mais ligantes, que podem ser cliváveispor hidrólise química ou enzimática. Em uma modalidade, as seqüências depeptídeo de influenza são ligadas em uma localização interna, tal como umalocalização que é expressa na superfície do capsídeo na sua conformaçãotri-dimensional. Em uma modalidade, pelo menos um peptídeo antigênico deinfluenza é expresso dentro de pelo menos uma alça interna, ou em pelomenos uma alça de superfície externa, quando os peptídeos de fusão decapsídeo são montados para formar uma partícula semelhante a vírus.

Mais de uma alça do capsídeo viral pode ser modificada. Moda-lidades da presente invenção incluem aquelas em que o peptídeo antigênicode influenza é exposto em pelo menos duas alças de superfície quandomontadas como um vírus ou a partícula semelhante a vírus. Em outra moda-lidade, pelo menos dois peptídeos antigênicos de influenza são inseridos emuma proteína de capsídeo e expostos sobre pelo menos duas alças de su-perfície do capsídeo viral, confinamento, vírus ou a partícula semelhante avírus. Os peptídeos de influenza nas alças de superfície podem ter a mesmaseqüência de aminoácido. Em modalidades separadas, a seqüência de ami-noácido dos peptídeos de influenza nas alças de superfície pode diferir.

A seqüência de ácido nucléico que codifica a proteína de capsí-deo viral também pode ser modificada para alterar a formação de um vírusou a partícula semelhante a vírus (veja, por exemplo, Brumfield, etal. (2004)J. Gen. ViroL 85: 1049-1053). Por exemplo, três classes gerais de modifica-ção são as mais tipicamente geradas para modificar vírus ou a partícula se-melhante a vírus montada. Essas modificações são designadas alterar o in-terior, exterior ou a interface entre as subunidades adjacentes na confina-mento de proteína montada. Para realizar isso, iniciadores mutagênicos po-dem ser usados para: (i) alterar a carga de superfície interior da região deligação de ácido nucléico viral pela substituição de resíduos básicos (porexemplo, K, R) na terminação N com ácidos glutâmicos acídicos (Douglas etal., 2002b); (ii) deletar resíduos interiores na terminação N (por exemplo, emCCMV, geralmente resíduos 4-37); (iii) inserir um cDNA que codifica umaseqüência direcionadora de célula de peptídeo de 11 aminoácidos (Graf etal., 1987) em uma alça exposta na superfície; e (iv) modificar interações en-tre subunidades virais pela alteração de sítios de ligação de metal (por e-xemplo, em CCMV, resíduos 81/148 mutante).

Em uma modalidade, o peptídeo antigênico de influenza podeser inserido no capsídeo de um Vírus do Mosqueado Clorótico do Caupi(CCMV). Modalidades da presente invenção incluem aquelas em que o pep-tídeo de influenza pode ser inserido no aminoácido 129 da proteína do cap-sídeo de CCMV em Seq ID. Ne 11. Em outra modalidade, a seqüência depeptídeo de influenza pode ser inserida nos aminoácidos 60, 61, 62 ou 63 daproteína de capsídeo de CCMV em SEQ ID NQ: 11. Ainda em outra modali-dade, o peptídeo de influenza pode ser inserido nos aminoácidos 129 e ami-noácidos 60-63 da proteína de capsídeo de CCMV em SEQ ID Ne: 11. Emuma modalidade, um peptídeo M2 selecionado a partir do grupo que consis-te em SEQ ID N-: 3, 22, 23, e 24, ou derivado ou homólogo desses é inseri-do na proteína de capsídeo de CCMV.

Em uma modalidade, o peptídeo antigênico de influenza podeser inserido no capsídeo pequeno de um Vírus do Mosaico do Caupi(CPMV). Modalidades da presente invenção incluem aquelas em que o pep-tídeo de influenza pode ser inserido entre o aminoácido 22 e 23 da proteínamenor de capsídeo de CPMV (Capsídeo de CPMV S) em SEQ ID Ne: 12.Em uma modalidade, um peptídeo M2 selecionado do grupo que consisteem SEQ ID N-: 3, 22, 23, e 24, ou derivado ou homólogo desse é inseridona proteína menor de capsídeo de CPMV.

Em uma modalidade, o peptídeo antigênico de influenza podeser inserido no capsídeo maior de um Vírus do Mosaico do Caupi (CPMV).Modalidades da presente invenção incluem aquelas em que o peptídeo deinfluenza pode ser inserido na proteína maior de capsídeo de CPMV (CPMVL) em SEQ ID Ns: 13. Em uma modalidade, um peptídeo M2 selecionado apartir do grupo que consiste em SEQ ID N^: 3, 22, 23, e 24 ou derivado ouhomólogo desse é inserido na proteína maior de capsídeo de CPMV.

Em uma modalidade, uma seqüência marcadora adjacente aopeptídeo antigênico de influenza de interesse, ou ligada a uma porção daproteína de capsídeo viral, também pode ser incluída. Em uma modalidade,essa seqüência marcadora permite purificação do peptídeo de fusão de cap-sídeo recombinante. A seqüência marcadora pode ser um marcador de afi-nidade, tal como um marcador de afinidade de hexahistidina. Em outra mo-dalidade, o marcador de afinidade pode ser uma molécula de glutationa-S-transferase. O marcador também pode ser uma molécula fluorescente, talcomo YFP ou GFP1 ou análogos de tais proteínas flurorescentes. O marca-dor também pode ser uma porção de uma molécula de anticorpo, ou um an-tígeno ou Iigante conhecido para um parceiro de ligação útil para purificação.

A presente invenção contempla o uso de sistema de expressãosintético ou qualquer tipo de sistema de expressão biológico para produzir ospeptídeos de capsídeo recombinantes contendo o peptídeo de influenza.Métodos atuais de expressão de proteína de capsídeo incluem sistemas deexpressão em célula de inseto, sistemas de expressão em célula bacterianatais como E. coli, B. subtilus, e P. fluorescens, sistemas de expressão emplanta e em cultura de célula de planta, sistemas de expressão em leveduratais como S. cervisiae e P. Pastoris, e sistemas de expressão em mamífero.

Em uma modalidade, um construto de ácido nucléico que codifi-ca um peptídeo de fusão de capsídeo é expresso em uma célula hospedeiraselecionada a partir de uma célula de planta, incluindo plantas inteiras e cul-turas de célula de planta, ou uma célula de Pseudomonas fluorescens. Emuma modalidade, um construto de ácido nucléico que codifica o peptídeo defusão de capsídeo é expresso em um hospedeiro de planta inteira. Em ou-tras modalidades, um construto de ácido nucléico que codifica o peptídeo defusão de capsídeo é expresso em uma cultura de célula de planta. Ainda emoutra modalidade, um construto de ácido nucléico que codifica o peptídeo defusão de capsídeo é expresso em Pseudomonas fluorescens. Técnicas paraexpressar peptídeos de fusão de capsídeo nas células hospedeiras acimasão descritas em, por exemplo, Pat. U.S. 5.874.087, Pat. U.S. 5.958.422,Pat. U.S. 6.110.466, Pedido U.S. 11/001.626, e Pedido U.S. 11/069.601 as-sim como nos Exemplos abaixo.

d. Montagem de Vírus ou as partículas Semelhantes a Vírus

Os peptídeos de fusão de capsídeo da presente invenção po-dem ser purificados a partir de uma célula hospedeira e montados in vitropara formar partículas semelhantes a vírus ou estruturas de confinamento,em que as partículas semelhantes a vírus não contêm membrana plasmáticade célula hospedeira. Uma vez que o peptídeo de fusão de capsídeo recom-binante é expresso em uma célula hospedeira, ele pode ser isolado e purifi-cado para pureza substancial por técnicas padrão bem-conhecidas na técni-ca. As técnicas de isolamento e purificação podem depender da célula hos-pedeira utilizada para produzir os peptídeos de fusão de capsídeo. Tais téc-nicas podem incluir, mas não são limitadas a, PEG1 precipitação com sulfatode amônio ou etanol, extração ácida, cromatografia de troca de ânion ou cá-tion, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica,cromatografia de afinidade, cromatografia de níquel, cromatografia de hidro-xilapatita, cromatografia de fase reversa, cromatografia de lectina, eletrofo-rese preparativa, solubilização com detergente, precipitação seletiva comtais substâncias como cromatografia de coluna, métodos de imunopurifica-ção, cromatografia de exclusão de tamanho, métodos de imunopurificação,centrífugação, ultracentrífugação, centrífugação de gradiente de densidade(por exemplo, em gradiente de cloreto de sacarose ou de césio (CsCI)), ul-tracentrífugação através de filtro de exclusão de tamanho, e quaisquer ou-tros métodos de isolamento de proteína conhecidos na técnica. Por exemplo,peptídeo de fusão de proteína de capsídeo tendo as propriedades de adesãomolecular estabelecidas pode ser reversivelmente fundido a um ligante. Como ligante apropriado, o peptídeo de fusão de proteína de capsídeo pode seradsorvido seletivamente a uma coluna de purificação e então liberado dacoluna em uma forma relativamente pura, A proteína de capsídeo é entãoremovida por atividade enzimática. Além disso, o peptídeo de fusão de pro-teína de capsídeo pode ser purificado usando colunas de imunoafinidade oucolunas de Ni-NTA. Técnicas gerais são ainda descritas em, por exemplo, R.Scopes, Peptide Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag: N.Y.(1982); Deutscher, Guide to Peptide Purification, Academic Press (1990);Pat. U.S. Ns 4.511.503; S. Roe, Peptide Purification Techniques: A PracticalApproach (Practical Approach Series), Oxford Press (2001); D. Bollag, et ai,Peptide Methods, Wiley-Lisa, Inc. (1996); AK Patra et ai, Peptide Expr Purif,18(2): p/182-92 (2000); e R. Mukhija, et ai, Gene 165(2): p. 303-6 (1995).Veja ainda, por exemplo, Ausubel1 et ai (1987 e suplementos periódicos);Deutscher (1990) "Guide to Peptide Purification," Methods in Enzymologyvol. 182, e outros volumes nessa série; Coligan1 et ai (1996 e suplementosperiódicos) Current Protocols in Peptide Science Wiley/Greene, NY; e litera-tura do fabricante sobre uso de produtos de purificação de peptídeo, por e-xemplo, Pharmacia, Piscataway, N.J., ou Bio-Rad, Richmond, Calif. Combi-nação com técnicas recombinantes permitem fusão a segmentos apropria-dos, por exemplo, a uma seqüência FLAG ou uma equivalente que pode serfundida através de uma seqüência removível por protease. Veja ainda, porexemplo, Hochuli (1989) Chemische Industrie 12:69-70; Hochuli (1990) "Pu-rification of Recombinant Peptides with Metal Chelate Absorbent" in Setlow(ed.) Genetic Engineering, Principie and Methods 12:87-98, Plenum Press,NY; e Crowe, et ai (1992) QIAexpress: The High Levei Expression & PeptidePurification System QIAGEN, Inc., Chatsworth, Calif.

Em outras modalidades, os peptídeos de fusão de capsídeo ex-pressos nas células hospedeiras, especialmente células hospedeiras bacte-rianas, podem formar agregados insolúveis ("corpos de inclusão"). Váriosprotocolos são adequados para purificação de peptídeos a partir de corposde inclusão. Por exemplo, purificação de corpos de inclusão envolve tipica-mente a extração, separação e/ou purificação de corpos de inclusão pelorompimento das células hospedeiras, por exemplo, por incubação em umtampão de TRIS/HCL 50 mM pH 7,5, NaCI 50 mM, MgCI2 5 mM, DTT 1 mM,ATP 0,1 mM, e PMSF 1 mM. A suspensão celular é Iisada tipicamente usan-do 2-3 passagens através de prensa francesa. A suspensão celular tambémpode ser homogeneizada usando um Polytron (Brinknan Instruments) ousonicada em gelo. Métodos alternativos de Iisar bactérias são claros paraaqueles versados na técnica (veja, por exemplo, Sambrook et ai, supra; Au-subel et ai, supra).

Se necessário, os corpos de inclusão podem ser solubilizados, ea suspensão celular Iisada pode tipicamente ser centrifugada para removermatéria insolúvel indesejada. Peptídeos de fusão de capsídeo que formaramos corpos de inclusão podem ser renaturados por diluição ou diálise com umtampão compatível. Solventes adequados incluem, mas não são limitados auréia (de cerca de 4M a cerca de 8M), formamida (pelo menos cerca de80%, base volume/volume), e cloridrato de guanidina (de cerca de 4M a cer-ca de 8M). Embora cloridrato de guanidina e agentes similares sejam desna-turantes, essa desnaturação não é irreversível e a renaturação pode ocorrerpela remoção dos desnaturantes (por diálise, por exemplo) ou diluição dodesnaturante. Outros tampões adequados são conhecidos dos versados natécnica.

Alternativamente, é possível purificar os peptídeos de fusão decapsídeo recombinantes, partículas semelhantes a vírus, ou estruturas deconfinamento a partir do periplasma do hospedeiro. Após Iise da célula hos-pedeira, quando o peptídeo recombinante é exportado para dentro do peri-plasma da célula hospedeira, a fração periplasmática da bactéria pode serisolada por choque osmótico gelado além de outros métodos conhecidosdaqueles versados na técnica. Para isolar peptídeos recombinantes do peri-plasma, por exemplo, as células bacterianas podem ser centrifugadas paraformar um pélete. O pélete pode ser ressuspenso em um tampão contendo20% de sacarose. Para Iisar as células, a bactéria pode ser centrifugada e opélete pode ser ressuspenso em MgSO4 a 5 mM gelado, e mantido em ba-nho de gelo por aproximadamente 10 minutos. A suspensão celular pode sercentrifugada e o sobrenadante decantado e guardado. Os peptídeos recom-binantes presentes no sobrenadante podem ser separados dos peptídeos dohospedeiro por técnicas de separação padrão bem-conhecidas dos versadosna técnica.

Um fracionamento de sal inicial pode separar vários dos peptí-deos indesejados da célula hospedeira (ou peptídeos derivados do meio decultura da célula) dos peptídeos de fusão de capsídeo recombinante de inte-resse. Um exemplo pode ser sulfato de amônio. Sulfato de amônio precipitapeptídeos por reduzir efetivamente a quantidade de água na mistura de pep-tídeo. Peptídeos então precipitam com base na sua solubilidade. Quantomais hidrofóbico for um peptídeo, mais provavelmente ele precipitará emconcentrações de sulfato de amônio menores. Um protocolo típico inclui adi-cionar sulfato de amônio saturado a uma solução de peptídeo para que aconcentração de sulfato de amônio resultante seja entre 20-30%. Essa con-centração precipitará a maioria dos peptídeos hidrofóbicos. O pélete é entãodescartado (a menos que o peptídeo de interesse seja hidrofóbico) e sulfatode amônio é adicionado ao sobrenadante para uma concentração conhecidapara precipitar o peptídeo de proteína de fusão de capsídeo de interesse. Opélete é então solubilizado em tampão e o excesso de sal removido, se ne-cessário, tanto através de diálise como por diafiltração. Outros métodos queutilizam solubilidade de peptídeos, tal como precipitação com etanol gelado,são bem-conhecidos daqueles versados na técnica e podem ser usados pa-ra fracionar misturas de peptídeo de fusão de proteína de capsídeo complexas.

O peso molecular de um peptídeo de fusão de proteína de cap-sídeo recombinante pode ser usado para isolá-lo de peptídeos de peso mo-lecular maior ou menos usando ultrafiltração através de membranas de ta-manhos de poro diferentes (por exemplo, membranas Amicon ou Millipore).Como uma primeira etapa, a mistura de peptídeo de fusão de proteína decapsídeo pode ser ultrafiltrada através de uma membrana com um tamanhode poro que tem um ponto de corte de peso molecular menor do que o pesomolecular do peptídeo de fusão de capsídeo recombinante de interesse. Oretentado da ultrafiltração pode então ser ultrafiltrado contra uma membranacom um ponto de corte de peso molecular maior do que o peso molecular dopeptídeo de fusão de proteína de capsídeo de interesse. O peptídeo de fu-são de proteína de capsídeo recombinante passará através da membranapara dentro do filtrado. O filtrado pode então ser cromatografado como des-crito abaixo. Peptídeos de fusão de capsídeo recombinantes também podemser separados de outros peptídeos com base no seu tamanho, carga líquidade superfície, hidrofobicidade, e afinidade por ligantes. Além disso, anticor-pos criados contra as proteínas de capsídeo podem ser conjugadas a matri-zes de coluna e as proteínas de capsídeo imunopurificadas. Todos essesmétodos são bem-conhecidos na técnica. Será claro para um versado natécnica que técnicas cromatográficas podem ser realizadas em qualquer es-cala e usando equipamento de vários fabricantes diferentes (por exemplo,Pharmacia Biotech).Montagem de partículas semelhantes a vírus requer proteínasde capsídeo enoveladas corretamente. Entretanto, fatores adicionais signifi-cativos para a formulação e estabilidade de VLP podem existir, incluindo pH,força iônica, ligações de dissulfeto, ligação de cátion divalente, entre outras.

Veja por exemplo, Brady et al, (1977) "Dissociation of polyoma virus by thechelation of calcium ions found associated with purified virions," J. Virol.23(3):717-724; Gajardo et al, (1997) "Two proline residues are essential inthe calcium binding activity of rotavirus VP7 outer capsid protein," J. Virol.,71:2211-2216; Walter et al, (1975) "Intermolecular disulfide bonds: an impor-tant structural feature of the polyoma virus capsid," Cold Spring Har. Symp.Quant. Biol., 39:255-257 (1975); Christansen et al, (1977) "Characterizationof components released by alkali disruption of simian virus 40," J Virol.,21:1079-1084; Salunke et al, (1986) "Self-assembly of purified polyomaviruscapsid protein VP1," Cell 46:895-904; Salunke et al, (1989) "Polymorphism inthe assembly of polyomavirus capsid protein VP," Biophys. J., 56:887-900;Garcea et al, (1983) "Host range transforming gene of polyoma virus plays arole in virus assembly," Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:3613-3617; Xi et al,(1991) "Baculovirus expression of the human papillomavirus type 16 capsidproteins: detection of L1-L2 protein complexes," J. Gen. Virol., 72:2981-2988.Técnicas que podem ser utilizadas para a remontagem são bem-conhecidasna técnica, e incluem, mas não são limitadas a, técnicas como descritas noExemplo 6.

Além disso, os peptídeos de fusão de capsídeo da presente in-venção podem ser expressos em uma célula hospedeira, e montados In vivocomo vírus, partículas semelhantes a vírus, ou estruturas de confinamento,em que o vírus ou a partícula semelhante a vírus não contém membranaplasmática de célula hospedeira. Em uma modalidade, um vírus, uma partí-cula semelhante a vírus (VLP), ou uma estrutura de confinamento é formadana célula hospedeira durante ou após expressão do peptídeo de fusão decapsídeo. Em uma modalidade, o vírus, a partícula semelhante a vírus, ou oconfinamento expõe o peptídeo de influenza na superfície do vírus ou a par-tícula semelhante a vírus.Em uma modalidade, o vírus, a partícula semelhante a vírus, oua estrutura de confinamento é montada como uma montagem multimérica depeptídeos de fusão de capsídeo recombinantes, incluindo de três a cerca200 peptídeos de fusão de capsídeo. Em uma modalidade, o vírus, a partícu-la semelhante a vírus, ou a estrutura de confinamento inclui pelo menos 30,pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 90, ou pelo menos 120 peptí-deos de fusão de capsídeo. Em outra modalidade, cada vírus, partícula se-melhante a vírus, ou estrutura de confinamento inclui pelo menos 150 peptí-deos de fusão de capsídeo, pelo menos 160, pelo menos 170, ou pelo me·nos 180 peptídeos de fusão de capsídeo.

Em uma modalidade, o vírus ou a partícula semelhante a vírus émontada como uma estrutura icosaédrica. Em outra modalidade, a partículasemelhante a vírus ou o vírus é montado na mesma geometria que o vírusnativo do qual o capsídeo é derivado. Em uma modalidade separada, entre-tanto, o vírus ou a partícula semelhante a vírus não tem a geometria idênticado vírus nativo. Em outras modalidades, por exemplo, a estrutura é montadaem uma partícula formada de múltiplos de peptídeos de fusão de capsídeo,mas não formando uma partícula de vírus nativa. Por exemplo, uma estrutu-ra de confinamento de apenas 3 capsídeos virais pode ser formada. Em mo-dalidades separadas, estruturas de confinamento de cerca de 6, 9, 12, 15,18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45,48, 51, 54, 57, ou 60 capsídeos podemser formadas.

Purificação de vírus de planta ou as partículas de vírus de plantamontadas in vivo foi descrita anteriormente. Por exemplo, veja Dijkstra, J. &De Jager, C. P., 1998; Matthews, R. E. F., 1991, Plant Virology, Terceira E-dição, Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich, Publishers, e osExemplos abaixo. A maioria dos vírus pode ser isolada por uma combinaçãode dois ou mais dos seguintes procedimentos: sedimentação em alta veloci-dade, fracionamento em gradiente de densidade, precipitação usando polieti-leno glicol, precipitação com sal, filtração em gel, cromatografia, e diálise.Uma vez que as células contendo o vírus ou a partícula semelhante a vírussão rompidas e os conteúdos celulares são liberados e misturados, os vírusou as partículas semelhantes a vírus se encontram em um ambiente que éanormal. Portanto, freqüentemente é necessário usar um meio artificial feitopara conservar o vírus ou as partículas semelhantes a vírus em um estadointacto e desagregado durante os vários estágios de isolamento. As condi-ções que favorecem a estabilidade de vírus ou as partículas semelhantes avírus purificadas podem ser diferentes daquelas necessárias em extratosbrutos ou preparações parcialmente purificadas. Além disso, fatores diferen-tes podem interagir fortemente na medida em que eles afetam a estabilidadedo vírus. Os principais fatores a ser considerados ao desenvolver um meioadequado são: pH e sistema tampão, íons de metal e força iônica, agentesredutores e substâncias que protegem contra compostos fenólicos, aditivosque removem proteínas de plantas e ribossomos, enzimas e detergentes.

Vários vírus são estáveis por uma faixa de pH muito estreita, e oextrato deve ser mantido dentro dessa faixa. A escolha de tampão pode serimportante. Tampões de fosfato têm sido empregados freqüentemente, maseles podem ter efeitos deletérios sobre alguns vírus ou as partículas seme-lhantes a vírus. Alguns vírus ou as partículas semelhantes a vírus requerema presença de íons de metal divalente para a conservação da integridadeestrutural. A força iônica também pode ser importante. Agentes redutoressão freqüentemente adicionados ao meio de extração. Esses materiais aju-dam na conservação de vírus ou as partículas semelhantes a vírus que per-dem facilmente infectividade através de oxidação. Eles também podem re-duzir adsorção de constituintes do hospedeiro ao vírus. Materiais fenólicospodem causar sérias dificuldades no isolamento e preservação do vírus ouas partículas semelhantes a vírus. Vários métodos foram usados com maisou menos sucesso para minimizar o efeito de fenóis sobre vírus de planta ouas partículas semelhantes a vírus durante o isolamento. EDTA como o sal desódio em 0,01 M em pH 7,4 causa a quebra da maioria dos ribossomos, im-pedindo sua co-sedimentação com as partículas de vírus. Essa substânciapode ser usada para vírus que não requerem íons de metal divalente paraestabilidade. Ribonucleases, ribossomos, proteína 19 S1 e material particula-do verde de cloroplastos fragmentados pode ser facilmente absorvido porbentonita sob determinada concentração de magnésio. Carvão pode ser u-sado para absorver e remover materiais do hospedeiro, particularmente pig-mentos. Enzimas podem ser adicionadas ao extrato inicial para várias finali-dades. Por exemplo, pectinase e celulase ajudam na liberação do vírus ouas partículas semelhantes a vírus que poderia permanecer de outra forma nafração de fibra. As enzimas também digerem materiais que poderiam de ou-tra maneira co-precipitar com o vírus ou as partículas semelhantes a vírus.Triton-X -100 ou Tween 80 pode algumas vezes ser usado no meio de extra-ção inicial para ajudar na liberação de vírus ou as partículas semelhantes avírus a partir de componentes celulares insolúveis. Detergentes também po-dem auxiliar na clarificação inicial do extrato de planta. Detergentes não-iônicos dissociam membranas celulares, que podem contaminar vírus ou aspartículas semelhantes a vírus.

Uma variedade de procedimentos pode ser usada para compri-mir ou homogeneizar o tecido de planta que contém o vírus ou a partículasemelhante a vírus. Esses incluem (i) um almofariz ou gral, (ii) vários mistu-radores de alimentos e extratores de suco tipo batelada, e (iii) moinhos decilindro, moinhos coloidais e moedores de carne, que podem suportar quilo-gramas de tecido. Se um meio de extração é usado, ele é freqüentementenecessário para garantir contato imediato de células rompidas com o meio.O tecido homogeneizado é geralmente prensado através de gaze para sepa-rar seiva de planta contendo o vírus e tecido de planta triturado. Ns extratobruto, o vírus ou as partículas semelhantes a vírus são misturados com umavariedade de constituintes celulares que são da mesma faixa ampla de ta-manho que o vírus ou a partícula semelhante a vírus e que pode ter proprie-dades que são similares em alguns aspectos. Essas partículas incluem ri-bossomos, proteína 19 S de cloroplastos, que têm uma tendência a se agre-gar, fitoferritina, fragmentos de membrana, e fragmentos de cloroplastosrompidos. Também estão presentes células não rompidas, todas as proteí-nas solúveis menores da célula, e solutos de baixo peso molecular. A primei-ra etapa no isolamento do vírus é geralmente projetada para remover tantomaterial macromolecular do hospedeiro quanto possível, deixando o vírus ouas partículas semelhantes a vírus em solução. O meio de extração pode serplanejado para precipitar ribossomos e outros materiais do hospedeiro dealto peso molecular ou desintegrá-los. O extrato pode ser submetido a taltratamento como aquecimento, solventes orgânicos tais como clorofórmio oun-butanol-clorofórmio. O extrato tratado é então submetido à centrífugaçãoem velocidade razoavelmente baixa. Esse tratamento sedimenta resíduoscelulares e material do hospedeiro coagulado. Centrífugação em alta veloci-dade por um tempo suficiente sedimentará o vírus ou as partículas seme-lhantes a vírus. Essa é uma etapa muito útil, já que ela serve para o duplopropósito de concentrar as partículas de vírus e remover materiais de baixopeso molecular. Certos vírus de planta são preferencialmente precipitadosem um sistema de polietileno glicol (PEG) de uma fase, embora algum DNAdo hospedeiro também possa ser pélete. Precipitação com PEG é um dosprocedimentos mais comuns usados em isolamento de vírus ou de partículassemelhantes a vírus. As condições exatas para precipitação dependem dopH, força iônica, e concentração de macromoléculas. Sua aplicação para oisolamento de qualquer vírus em particular é empírica. A principal vantagemda precipitação com PEG é que ultracentrífugas onerosas não são necessá-rias, embora centrífugação diferencial seja freqüentemente usada em proce-dimentos de purificação. Vários vírus podem formar precipitados que sãomuito difíceis de ressuspender. Centrífugação por gradiente de densidadeoferece a possibilidade de concentrar tais vírus ou as partículas semelhantesa vírus sem peletizar e é usada no procedimento de isolamento para váriosvírus. Um tubo de centrífuga é parcialmente preenchido com uma soluçãoque tem uma densidade decrescente do fundo para o topo do tubo. Paravírus de planta, sacarose é comumente usada para formar o gradiente, e asolução de vírus é disposta em camada sobre o topo do gradiente. Com gra-dientes formados com sais de césio, o vírus ou as partículas semelhantes avírus podem ser distribuídos através da solução no início da sedimentaçãoou eles podem ser dispostos em camada na superfície do gradiente de den-sidade. Gradientes de densidade podem ser usados de três maneiras: (i)centrífugação ppr gradiente isopícnico, (ii) sedimentação de taxa zonal, e (iii)sedimentação zonal por equilíbrio. Após a centrífugação, as bandas de víruspodem ser visualizadas devido às suas propriedades de dispersão de luz.Precipitação por sal também é comumente empregada. Sulfato de amônioem concentrações de até cerca de um terço da saturação é comumente u-sado, embora vários outros sais precipitarão vírus ou as partículas seme-lhantes a vírus. Após descansar por algumas horas ou dias o vírus ou aspartículas semelhantes a vírus são centrifugadas em baixa velocidade e re-dissolvidas em um pequeno volume de um meio adequado. Várias proteínastêm baixa solubilidade em ou próximo a seus pontos isoelétricos. Precipita-ção isoelétrica pode ser usada para vírus ou as partículas semelhantes avírus que são estáveis sob as condições envolvidas. O pélete é coletado porcentrífugação ou filtração e é redissolvido em um meio adequado. Diáliseatravés de membranas de celulose pode ser usada para remover materiaisde baixo peso molecular do um extrato inicial e alterar o meio. Isso é maiscomumente empregado para remover sal após precipitação de sal ou crista-lização, ou após fracionamento por gradiente densidade em soluções de salou sacarose.

Vírus ou as partículas semelhantes a vírus tidas através de puri-ficação e concentração de uma etapa ainda conterão alguns materiais dohospedeiro de alto e de baixo peso molecular. Mais desses podem ser re-movidos por etapas de purificação adicionais. -O procedimento depende daestabilidade do vírus ou as partículas semelhantes a vírus e da escala dapreparação. Algumas vezes preparações altamente purificadas podem serobtidas por aplicação repetida do mesmo procedimento. Por exemplo, umapreparação pode ser submetida a precipitações em PEG repetidas, ou po-dem ser dados vários ciclos de sedimentação em alta e baixa velocidade. Oúltimo procedimento leva à remoção preferencial de macromoléculas dohospedeiro porque elas permanecem insolúveis quando os precipitados deuma sedimentação em velocidade alta são ressuspensos. Falando de formageral, durante um isolamento é útil aplicar pelo menos dois procedimentosque dependem de propriedades diferentes do vírus ou as partículas seme-lhantes a vírus. Isso provavelmente é mais eficaz em remover constituintesdo hospedeiro do que a aplicação repetida do mesmo procedimento. Um dosprocedimentos mais úteis para purificação adicional, particularmente de vírusou as partículas semelhantes a vírus menos estáveis, é centrífugação porgradiente de densidade. Sacarose é o material mais comumente usado parafazer o gradiente. Centrifugação em gradiente de densidade de sacarose éfreqüentemente o método de escolha para purificação adicional. Soluçõesfortes de sais tais como cloreto de césio também são materiais eficazes paravírus que são suficientemente estáveis. Fracionamento bem-sucedido emdois gradientes diferentes pode algumas vezes dar resultados úteis. Filtra-ção através de gel de ágar ou Sephadex pode oferecer uma etapa útil parapurificação adicional de vírus ou as partículas semelhantes a vírus que sãoinstáveis à precipitação envolvida na centrífugação em alta velocidade. Anti-corpos monoclonais antivirais podem ser ligados a uma matriz de suporte tal .como agarose para formar uma coluna que se ligará especificamente ao ví-rus a partir de uma solução passada através da coluna. O vírus pode sereluído pela diminuição do pH. Procedimentos cromatográficos podem serusados para dar uma etapa de purificação eficaz pata preparações parcial-mente purificadas. Por exemplo, uma coluna de gel de fosfato de cálcio emtampão de fosfato, coluna de celulose, ou cromatografia líquida rápida deproteína podem ser usados para purificar vários vírus.

Em vários estágios no isolamento de um vírus, é necessárioconcentrar o vírus e remover sais e sacarose. Centrífugação em alta veloci-dade é comumente empregada para a concentração de vírus e a redução daquantidade de material de baixo peso molecular. Diálise é usada para remo-ção ou troca de sais.

II. Proteína Inteira ou Fragmentos de Proteína Antiqênicos de Influenza

A presente invenção utiliza, em combinação com os peptídeosde fusão de capsídeo descritos acima contendo um peptídeo de influenza,pelo menos uma proteína ou um fragmento de proteína antigênica isolada,derivado ou homólogo dessa, derivado de um vírus influenza, incluindo umvírus influenza humano e/ou de ave. Em uma modalidade, a proteína oufragmento der proteína antigênica isolada, derivado ou homólogo desse éderivado de uma cepa viral de influenza recentemente emergente.

A proteína ou fragmento de proteína de vírus de influenza utili-zado na presente invenção pode ser uma proteína ou fragmento de proteínaderivado das proteínas M1, M2, HA1 NA, NP1 PB1, PB2, PA ou NP2, deriva-dos ou homólogos dessas, de uma cepa viral de influenza identificada. Umgrande número de cepas de influenza, e seqüências de proteína correspon-dentes foi identificado e as seqüências estão disponíveis para o público atra-vés da página do National Center for Biotechnology Information (NCBI) Influ-enza Virus Resource, disponível emhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html.

Em uma modalidade da presente invenção, a proteína ou frag-mento de proteína derivado de um vírus influenza é selecionado a partir dogrupo que consiste em uma proteína ou fragmentos de proteína de HA e NA.Modalidades adicionais da presente invenção incluem a proteína ou frag-mento de proteína NA ser derivado do grupo de proteínas NA de influenzaselecionadas a partir do grupo que consiste nos subtipos N1, N2, N3, N4,N5, N6, N7, N8, e N9. Em uma modalidade, o peptídeo viral de influenza éuma proteína ou fragmento de proteína derivado de uma proteína NA huma-na e/ou de ave.

Em outras modalidades, a proteína ou o fragmento de proteínaantigênico vjral de influenza é derivado de uma proteína HA de influenza.Modalidades adicionais da presente invenção incluem a proteína ou o frag-mento de proteína HA ser derivado do grupo de proteínas HA de influenzaselecionadas a partir do grupo que consiste nos subtipos H1, H2, H3, H4,H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, e H15. Modalidades da pre-sente invenção incluem aquelas em que o peptídeo HA é derivado do grupode proteínas HA de influenza humano e/ou de ave. Em modalidades adicio-nais, o peptídeo HA pode ser derivado de uma proteína HA de influenza deave. Em uma modalidade, a proteína HA de ave é selecionada a partir dossubtipos H5, H7, e H9.

Em uma modalidade da presente invenção, a proteína ou ofragmento de proteína antigênica isolada é selecionado a partir de uma cepade influenza recentemente emergente. A Organização Mundial de Saúderevisa os dados epidemiológicos de influenza duas vezes ao ano, e atualizaperiodicamente a identificação de cepas de influenza recentemente emer-gentes. Informação genética útil em derivar proteínas ou fragmentos de pro-teínas antigênicas isoladas para uso na presente invenção é disponível paraaqueles versados na técnica. Por exemplo, o Los Alamos National Labora-tory mantém uma base de dados de seqüência de influenza, Influenza Se-quence Database, disponível em http://www-flu.lanl.gov/ que contém infor-mação genética sobre cepas recentemente emergentes de influenza.

Modalidades da presente invenção também incluem aquelas emque a proteína ou o fragmento de proteína HA combinado com o vírus ou apartícula semelhante a vírus é derivado da seqüência de 568 aminoácidosda cepa A/Thailand/3(SP-83)/2004(H5N1) em SEQ ID Ne: 15 (Tabela 5), de-rivado, ou homólogo desse, que é codificada pela seqüência de nucleotídeoSEQ ID Ne: 16 (Tabela 5). Em outras modalidades, a proteína de vírus influ-enza utilizada na presente invenção pode ser a seqüência de aminoácidointeira da proteína ou fragmento de proteína HA da cepa A/Thailand/3(SP-83)/2004(H5N1), ou um subconjunto dessa compreendendo pelo menos 20,25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130,140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360,380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 565, 568 ou mais aminoá-cidos selecionados a partir de SEQ ID NO: 15. A proteína de vírus influenzaselecionada pode ser pelo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98, ou 99% homóloga àseqüência de aminoácido da proteína ou fragmento de proteína HA da cepaA/Thailand/3(SP-83)/2004(H5N1), ou um subconjunto desse compreendendopelo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100,110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300,320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 565, 568 oumais aminoácidos selecionados a partir de SEQ ID N9: 15, ou um subconjun-to dessa compreendendo pelo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65,70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, OUmais aminoácidos selecionados a partir de SEQ ID NO: 15. Em outras moda-lidades, a proteína ou seqüência de ácido nucléico de influenza pode seralterada para melhorar as características da proteína, tais como, mas não selimitando a, expressão melhorada no hospedeiro, imunogenicidade aumen-tada, ou propriedades de ligação covalente aumentadas.

Alternativamente, a proteína ou o fragmento de proteína HAcombinado com a partícula semelhante a vírus é derivado de SEQ ID NO: 17(Tabela 5). Em outras modalidades, a proteína de vírus influenza utilizada napresente invenção pode ser a seqüência de aminoácido inteira da proteínaou fragmento de proteína HA de SEQ ID N9: 17, ou um subconjunto dessacompreendendo pelo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75,80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220,240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520,530, 537, ou mais aminoácidos selecionados a partir de SEQ ID N-: 17. Aproteína de vírus influenza selecionada pode ser pelo menos 75, 80, 85, 90,95, 98, ou 99% homóloga à seqüência de aminoácido de SEQ ID N5: 17, ouum subconjunto dessa compreendendo pelo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45,50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170,180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440,460, 480, 500, 520, 530, 537, ou mais aminoácidos selecionados a partir deSEQ ID Ne: 17. Em outras modalidades, a proteína ou seqüência de ácidonucléico de influenza pode ser alterada para melhorar as características daproteína, tais como, mas não limitadas a expressão melhorada no hospedei-ro, imunogenicidade aumentada ou propriedades de ligação covalente au-mentadas.

Em outras modalidades, o fragmento de proteína HA será ofragmento de HA1 de 36 kDa da cepa A/Thailand/3(SP-83)/2004(H5N1)(SEQ ID Ne: 18, Tabela 5) codificado pela seqüência de nucleotídeo SEQ IDNQ: 19 (Tabela 5). Em outras modalidades, a proteína de vírus influenza utili-zada na presente invenção pode ser a seqüência de aminoácido inteira daproteína ou fragmento de proteína HA de SEQ ID Ne: 18, ou um subconjuntodessa compreendendo pelo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70,75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200,220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 350, 352, ou mais aminoácidos selecio-nados a partir de SEQ ID Ne: 18. A proteína de vírus influenza selecionadapode ser pelo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98, ou 99% homóloga à seqüênciade aminoácido de SEQ ID N9: 18, ou um subconjunto dessa compreendendopelo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100,110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300,320, 340, 350, 352, ou mais aminoácidos selecionados partir de SEQ ID Ne:18. Em outras modalidades, a proteína ou seqüência de ácido nucléico deinfluenza pode ser alterada para melhorar as características da proteína, taiscomo, mas não limitadas a, expressão melhorada no hospedeiro, imunoge-nicidade aumentada, ou propriedades de ligação covalente melhoradas.

Em outra modalidade, o fragmento de proteína HA será o frag-mento de HA2 de 26 kDa da cepa A/Thailand/3(SP-83)/2004(H5N1) (SEQ IDN9: 20 , Tabela 5) codificada pela seqüência de nucleotídeo SEQ ID N9:21 (Tabela 5). Em outras modalidades, a proteína de vírus influenza utilizadana presente invenção pode ser a seqüência de aminoácido inteira da proteí-na ou fragmento de proteína HA de SEQ ID N9: 20, ou um subconjunto des-sa compreendendo pelo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75,80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, oumais aminoácidos selecionados a partir de SEQ ID N9: 20. A proteína de ví-rus influenza selecionada pode ser pelo menos 75, 80, 85, 90, 95, 98, ou99% homóloga à seqüência de aminoácido de SEQ ID N9: 20, ou um sub-conjunto dessa compreendendo pelo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180,190, 200, ou mais aminoácidos selecionados partir de SEQ ID N9: 20. Emoutras modalidades, a proteína ou seqüência de ácido nucléico de influenzapode ser alterada para melhorar as características da proteína, tais como,mas não limitadas a, expressão melhorada no hospedeiro, imunogenicidadeaumentada, ou propriedades de ligação covalente melhoradas.

Em modalidades da presente invenção, a proteína ou o fragmen-to de proteína HA combinado com a partícula semelhante a vírus é derivadada seqüência de. 565 aminoácidos da cepa A/Vietnam/CL20/2004(H5N1) emSEQ ID N9: 25 (Tabela 5) derivado, ou homólogo do mesmo, que é codifica-do pelas seqüências de nucleotídeo SEQ ID NO: 26-28 (Tabela 5). Em ou-tras modalidades, a proteína de vírus influenza utilizada na presente inven-ção pode ser a seqüência de aminoácido inteira da proteína ou fragmento deproteína HA da cepa A/Vietnam/CL20/2004(H5N1) ou um subconjunto dessacompreendendo pelo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75,80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220,240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520,540, 560, 565 ou mais aminoácidos selecionados a partir de SEQ ID N-: 25.

Em uma modalidade, a proteína de vírus influenza utilizada na presente in-venção pode ser o fragmento de proteína HA da cepaA/Vietnam/CL20/2004(H5N1) em SEQ ID N9: 29 (Tabela 5) que não tem osinal N-terminal nativo e o domínio transmembrana C-terminal e a caudacitoplasmática. A proteína de vírus influenza selecionada pode ser pelo me-nos 75, 80, 85, 90, 95, 98, ou 99% homóloga à seqüência de aminoácido daproteína ou fragmento de proteína HA da cepa A/Vietnam/CL20/2004(H5N1),ou um subconjunto dessa compreendendo pelo menos 20, 25, 30, 35, 40,45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160,170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420,440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 565 ou mais aminoácidos selecionadospartir de SEQ ID N9: 25 e SEQ ID N9: 29 ou um subconjunto dessa compre-endendo pelo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85,90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou mais aminoáci-dos selecionados partir de SEQ ID N9: 25 e SEQ ID N9: 29. Em outras moda-lidades, proteína ou seqüência de ácido nucléico de influenza pode ser alte-rada para melhorar as características da proteína, tais como, mas não limi-tadas a, expressão melhorada no hospedeiro, imunogenicidade aumentada,ou propriedades de ligação covalente melhoradas.

Tabela 5: Seqüência de Proteína e Ácido Nucleico de HA

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Em uma modalidade, a partícula semelhante a vírus contendo opeptídeo de influenza é combinado com pelo menos uma proteína ou umfragmento de proteína NA derivado de um vírus influenza incluindo um vírusinfluenza humano e/ou de ave, e pelo menos uma proteína ou um fragmentode proteína HA derivado de um vírus influenza, incluindo um vírus influenzahumano e/ou de ave. Em uma modalidade adicional, a partícula semelhantea vírus contendo o peptídeo de influenza é combinada com pelo menos umaproteína ou fragmento de proteína NA derivado de um vírus influenza, pelomenos uma proteína ou um fragmento de proteína HA derivado de um vírusde influenza, e qualquer combinação de proteínas ou fragmentos de proteí-nas virais de influenza incluindo proteínas ou fragmentos de proteínas deinfluenza humano e/ou de ave, selecionados a partir do grupo que consisteem M1, M2, NP, PB1, PB2, PA, e NP2, derivado ou homólogo do mesmo,a. Produção de Proteína ou Fragmentos de Proteína Antiaênicos

A presente invenção contempla o uso de sistema de expressãosintético ou qualquer tipo de sistema de expressão biológico para produzir asproteínas ou fragmentos de proteína antigênicos de influenza. Métodos atu-ais de expressão de proteína incluem sistemas de expressão em célula deinseto, sistemas de expressão em célula bacteriana tais como E. coli, B. sub-tilus, e P. fluorescens, sistemas de expressão em planta e em cultura de cé-lula de planta, sistemas de expressão em levedura tais como S. cervisiae eP. pastoris, e sistemas de expressão em mamífero.

Em uma modalidade, a proteína ou o fragmento de proteína éexpresso em uma célula hospedeira selecionada a partir de uma célula deplanta, incluindo plantas inteiras e culturas de célula de planta, ou uma célu-la de Pseudomonas fluorescens. Modalidades adicionais da presente inven-ção incluem a proteína ou o fragmento de proteína ser expresso em umacultura de célula de planta. Em uma modalidade adicional, a proteína oufragmento de proteína é expressa em uma cultura de célula de planta. Téc-nicas para expressar fragmentos de proteína ou proteína recombinante nascélulas hospedeiras acima são bem-conhecidos na técnica. Em uma modali-dade, vetores virais de planta são usados para expressar proteínas ou frag-mentos de proteína de influenza em plantas inteiras ou células de planta.Modalidades da presente invenção incluem aquelas em que o vetor PVX éusado para expressar proteínas ou fragmentos de proteína HA em plantasde Nicotiana benthamiana. Em outra modalidade o vetor PVX é usado paraexpressar proteínas ou fragmentos de proteína HA em células de planta NT1de tabaco. Técnicas para utilizar vetores virais são descritos em, por exem-pio, Pat. U.S. 4.885.248, Pat. U.S. 5.173.410, Pat. U.S. 5.500.360, Pat. U.S.5.602.242, Pat. U.S. 5.804.439, Pat. U.S. 5.627.060, Pat. U.S. 5.466.788,Pat. U.S. 5.670.353, Pat. U.S. 5.633.447 e U.S Pat. 5.846.795, assim comonos exemplos 14 e 15 abaixo. Em outras modalidades, plantas ou culturasde células de planta transgênicas são usadas para expressar proteínas oufragmentos de proteínas HA. Métodos utilizados para expressão de proteí-nas ou fragmentos de proteínas em plantas ou células de planta transgêni-cas são bem-conhecidos na técnica. Em outras modalidades e no exemplo18 e no exemplo 19 as proteínas ou os fragmentos de proteína HA são ex-pressos no citoplasma ou periplasma de Pseudomonas fluorescens.

Métodos que podem ser utilizados para o isolamento e a purifi-cação da proteína ou do fragmento de proteína de influenza expresso emuma célula hospedeira são similares a, ou os mesmos que, aqueles descri-tos anteriormente nos exemplos para isolamento e purificação de peptídeode fusão de capsídeo.

III. Combinação de VLPs Contendo Peptídeo de Influenza e Proteínas Anti-qênicas de Influenza

A presente invenção fornece composições para uso como vaci-nas contra o vírus influenza compreendendo i) pelo menos um peptídeo de-rivado de um vírus influenza, em que o peptídeo é fundido a uma proteína decapsídeo derivada de um vírus de planta que forma um peptídeo de fusão decapsídeo recombinante, e em que o peptídeo de fusão de capsídeo recom-binante é capaz de montagem para formar um vírus ou a partícula seme-lhante a vírus e ii) pelo menos uma proteína ou fragmento de proteína anti-gêniça derivada de um vírus influenza. Em uma modalidade da presente in-venção, a proteína ou os fragmentos de proteína antigênico não são ligadosou acoplados quimicamente ao vírus ou a partícula semelhante a vírus. Vejapor exemplo, as figuras 1 e 2.As proteínas ou os fragmentos de proteína antigênicos e as par-tículas semelhantes a vírus da presente invenção podem ser conjugadasusando qualquer método de conjugação na técnica. Veja por exemplo, Gillit-zer E1 Willits D, Young M, Douglas T. (2002) "Chemical modification of a viralcage for multivalent presentation," Chem Commun (Camb) 20:2390-1; WangQ, Kaltgrad E, Lin T, Johnson JE1 Finn MG (2002) "Natural supramolecularbuilding blocks. Wild-type cowpea mosaic virus," Chem Biol. 9(7):805-11;Wang Q, Lin T1 Tang L1 Johnson JE1 Finn MG. (2002) "Icosahedral virus par-ticles as addressable nanoscale building blocks," Angew Chem Int Ed Engl.41(3):459-62; Raja etal. (2003) "Hybrid virus-polymer materiais. 1. Synthesisand properties of Peg-decorated cowpea mosaic virus," Biomacromolecules4:472-476; Wang Q, Lin T, Johnson JE1 Finn MG. (2002) "Natural supramo-lecular building blocks. Cysteine-added mutants of cowpea mosaic virus,"Chem Biol. 9(7):813-9.

Outros métodos para conjugação podem incluir, por exemplo,usar 4-(N- maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de sulfossuccinimidila(sSMCC), éster de N-[e-maleimidocaproilóxi]-sulfossuccinimida (sEMCS),éster de N-maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida (MBS), glutaraldeído, 1-etil-3-(3 dimetilaminopropil)carbodiimida (EDCI), Bis-diazobenzidina (BDB),ou N-acetil homocisteína tiolactona (NAHT).

No método de ativação por maleimida de veículo, a conjugaçãoé obtida usando 4-(N-maleimidomethil)ciclohexano-1- carboxilato de sulfos-succinimidil (sSMCC), ou éster de N-maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida(MBS). O método usando sSMCC é amplamente usado e altamente especí-fico (veja, por exemplo, Meyer et aí. 2002, J. ,of Virol. 76, 2150-2158).sSMCC reticula o grupo-SH de um resíduo de císteína ao grupo amino deum resíduo de Iisina na proteína semelhante a vírus.

Na reação de conjugação usando sSMCC, a partícula semelhan-te a vírus é primeiro ativada pela ligação do reagente sSMCC aos resíduosde amina (por exemplo, lisina) do vírus ou a partícula semelhante a vírus.Após a separação dos vírus ou a partícula semelhante a vírus ativados doexcesso de reagente e o subproduto, o peptídeo contendo cisteína é adicio-nado e a ligação ocorre pela adição do grupo-SH à função de maleimida dovírus ou a partícula semelhante a vírus ativada. O método usando MSB con-juga o peptídeo e o vírus ou a partícula semelhante a vírus através de ummecanismo similar.

A conjugação usando sSMCC pode ser altamente específicapara grupos-SH. Dessa forma, resíduos de cisteína na proteína ou fragmen-to de proteína antigênico de influenza são essenciais para fácil conjugação.Se uma proteína ou fragmento de proteína não tiver um resíduo de cisteína,um resíduo de cisteína poderá ser adicionado ao peptídeo, preferivelmentena terminação-N ou terminação-C. Se o epítopo desejado na proteína oufragmento de proteína contiver uma cisteína, a conjugação deverá ser alcan-çada com um método que não usa um vírus ou a partícula semelhante a ví-rus ativada por sSMCC. Se a proteína ou fragmento de proteína contivermais de um resíduo de cisteína, a proteína ou fragmento de proteína nãodeverá ser conjugado ao vírus ou a partícula semelhante a vírus usandosSMCC a menos que o resíduo de cisteína em excesso possa ser substituí-do ou modificado.

A ligação não deve interferir com o epítopo desejado na proteínaou fragmento de proteína. A cisteína é preferivelmente separada da seqüên-cia de epítopo desejada com uma distância de pelo menos um aminoácidocomo um espaçador.

Outra conjugação útil na presente invenção é obtida usando N-acetil homocisteína tiolactona (NAHT). Por exemplo, tiolactonas podem serusadas para introduzir funcionalmente um tiol no vírus ou a partícula seme-lhante a vírus para permitir a conjugação com peptídeos-bromo-acètiladosou maleimidados (Tolman et ai Int. J. Peptide Protein Res. 41, 1993, 455-466; Conley etal. Vaccine 1994, 12, 445-451).

Em modalidades adicionais da invenção, reações de conjugaçãopara acoplar a proteína ou o fragmento de proteína ao vírus ou a partículasemelhante a vírus envolvem introduzir e/ou usar grupos nucleofílicos intrín-secos em um reagente e introduzir e/ou usar grupos eletrofílicos intrínsecosno outro reagente. Um esquema de ativação seria introduzir um grupo tiolnucleofílico ao vírus ou a partícula semelhante a vírus e adicionar gruposeletrofílicos (preferivelmente haletos de alquila ou maleimida) à proteína ou afragmento de proteína de influenza. O conjugado resultante terá ligações deéter de tiol ligando a proteína ou o fragmento e a proteína e o vírus ou a par-tícula semelhante a vírus. A reação direta do grupo eletrofílico (maleimida ouhaleto de alquila) da proteína ou fragmento de proteína de influenza e osgrupos nucleofílicos intrínsecos (preferivelmente aminas primárias ou tióis)do vírus ou a partícula semelhante a vírus, levando a ligações de amina se-cundária ou ligações de éter de tiol. Esquemas alternativos envolvem adicio-nar um grupo maleimida ou haleto de alquila ao vírus ou a partícula seme-lhante a vírus e introduzir uma cisteína terminal à proteína ou fragmento deproteína de influenza e/ou usar tiós de proteína de influenza intrínsecos re-sultando novamente em ligações de éter de tiol.

Um aminoácido contendo enxofre contém um grupo enxofre rea-tivo. Exemplos de aminoácidos contendo enxofre incluem cisteína e aminoá-cidos que não são de proteína tal como homocisteína. Adicionalmente, oenxofre reativo pode existir em uma forma de dissulfeto antes da ativação ereação com o vírus ou a partícula semelhante a vírus. Por exemplo, cisteínaspresentes nas proteínas ou fragmentos de proteína de influenza podem serusadas em reações de acoplamento a um vírus ou a partícula semelhante avírus ativada com grupos eletrofílicos tais como maleimida ou haletos de al-quila. Introdução de grupos maleimida usando reticuladores heterobifuncio-nais contendo maleimida reativa e ésteres ativados são comuns.

Um ligante covalente unindo uma proteína de influenza a umapartícula semelhante a vírus pode ser estável Sob condições fisiológicas.Exemplos de tais Iigantes'são agentes reticuladores inespecíficos, espaça-dores monogenéricos e espaçadores bigenéricos. Agentes reticuladores i-nespecíficos e seu uso são bem-conhecidos na técnica. Exemplos de taisreagentes e seu uso incluem reação com glutaraldeído; reação com N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida, com ou sem mistura de um vírus ou apartícula semelhante a vírus succinilada; oxidação de periodato de substitu-intes glicosilados seguido por acoplamento a grupos amino livres de um ví-rus ou a partícula semelhante a vírus na presença de boroidreto de sódio oucianoboroidreto de sódio; oxidação de periodato de resíduos de serina e detreonina terminais não-acilados pode criar aldeídos terminais que podementão ser reagidos com aminas ou hidrazidas criando uma base de Schiff ouhidrazonas que podem ser reduzidas com cianoboroidreto a aminas secun-dárias; diazotização de grupos amino aromáticos seguida por acoplamentoem resíduos de cadeia lateral de tirosina da proteína; reação com isociana-tos; ou reação de anidridos mistos. Veja, geralmente, Briand, et ai, 1985 J.Imm. Meth. 78:59.

Espaçadores monogenéricos e seu uso são bem-conhecidos natécnica. Espaçadores monogenéricos são bifuncionais e requerem funciona-lização de apenas um dos parceiros do par de reação antes da conjugaçãoocorrer. Espaçadores bigenéricos e seu uso são bem-conhecidos na técnica.Espaçadores bigenéricos são formados após cada parceiro do par de reaçãoser funcionalizado. A conjugação ocorre quando cada parceiro funcionaliza-do é reagido com seu parceiro oposto para formar uma ligação ou ligaçõescovalentes estáveis (Veja, por exemplo, Marburg, et ai, 1986 J. Am. Chem.Sot. 108:5282-5287, e Marburg, et ai, Patente U.S. N5 4.695.624).

Uma vantagem da presente invenção é que pode-se obter váriasrazões molares de proteína de influenza para vírus ou a partícula semelhan-te a vírus no conjugado. Essa "carga de acoplamento de peptídeo" em vírusou as partículas semelhantes a vírus pode ser variada pela alteração dosaspectos do procedimento de conjugação de uma maneira de teste e erropara alcançar um conjugado que tem as propriedades desejadas. Por exem-plo, se uma alta carga de acoplamento é desejada tal que cada sítio reativono vírusOu a partícula semelhante vírus é conjugado a uma proteína oufragmento de proteína de influenza, pode-se determinar os sítios reativos novírus ou a partícula semelhante a vírus e incluir um grande excesso molar deproteína ou fragmento de proteína de influenza na reação de acoplamento.Se uma baixa carga de acoplamento for desejada, pode-se incluir uma razãomolar de menos que 1 mol de proteína de influenza por mol de sítios reativosno vírus ou a partícula semelhante a vírus.As condições particulares que se escolhe serão guiadas em úl-tima análise pelos rendimentos alcançados, propriedades físicas do conju-gado, a potência do conjugado resultante, a população do paciente e a do-sagem desejada que se quer administrar. Se a proteína total na vacina nãofor uma consideração importante, seria possível formular doses de conjuga-dos de cargas de acoplamento diferentes e imunogenicidades diferentes pa-ra liberar a mesma dose eficaz. Entretanto, se a proteína ou volume total foruma consideração importante, por exemplo, se o conjugado for pretendidopara ser usado em uma vacina de combinação, deve-se estar atento ao vo-lume total ou à proteína contribuída pelo conjugado para a vacina de combi-nação final. Pode-se então determinar a imunogenicidade de vários conju-gados tendo diferentes cargas de acoplamento e após isso escolher usar umconjugado com imunogenicidade adequada e um nível de proteína total ouvolume aceitável para adicionar à vacina de combinação.

IV. Vacinas

A presente invenção fornece composições para uso como vacinacontra o vírus influenza. Em uma modalidade, composições farmacêuticasque compreendem composições da presente invenção podem ser prepara-das como sais ácidos ou básicos. Sais farmaceuticamente aceitáveis (naforma de produtos dispersáveis ou solúveis em água ou óleo) incluem saisnão-tóxicos convencionais ou os sais de amônio usuais que são formados,por exemplo, a partir de ácidos ou bases inorgânicas ou orgânicas. Exem-plos de tais sais incluem sais de adição de ácido tais como acetato, adipato,alginato, aspartato, benzoato, benzenossulfonato, butirato, citrato, canforato,canforsulfonaío, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecüsulfato, etanos-sulfonato, fumarato, glicoheptanoato, gIicerofosfato, hernissuIfato, heptahoa-to, hexanoato, cloridrato, bromidrato, iodidrato, 2-hidroxietanossulfonato, Iac-tatos, maleato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, oxalato,pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propiona-to, succinato tartarato, tioeianato, tosilato, e undecanoato; e sais de base taiscomo sais de amônio, sais de metal alcalino tais como sais de sódio e po-tássio, sais de metal alcalino-terroso tais como sais de cálcio e de magnésio,sais com bases orgânicas tais como sais de dicicloeilamina, N-metil-D-glucamina, e sais com aminoácidos tais como arginina e lisina.

Em uma modalidade da presente invenção, as composições dapresente invenção são administradas a um animal ou paciente sem um adju-vante. Em outras modalidades, as composições são administradas com umadjuvante.

Adjuvantes à base de alumínio são comumente usados na técni-ca e incluem fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, hidróxi-fosfato dealumínio e hidróxi-sulfato-fosfato de alumínio. Nomes comerciais de adjuvan-tes comuns incluem ADJUPHOS, MERCK ALUM e ALHYDROGEL. A com-posição pode ser ligada a ou co-precipitada com o adjuvante conforme dese-jado e apropriado para o adjuvante particular usado.

Adjuvantes não-alumínicos também podem ser usados. Adjuvan-tes não-alumínicos incluem QS21, Lipídeo-A e derivados ou variantes des-ses, adjuvante completo e incompleto de Freund, Iipossomos neutros, vaci-nas contendo Iipossomos e citocinas e quimiocinas. Adjuvantes adicionaisincluem ácidos nucléicos imunoestimulantes, incluindo seqüências CpG. Ve-ja por exemplo, a figura 3.

As composições da presente invenção podem ser administradasusando qualquer técnica usada atualmente na técnica, incluindo, por exem-plo, oralmente, pela mucosa, intravenosamente, intramuscularmente, intrate-calmente, epiduralmenete, intraperitonealmente ou subcutaneamente. Moda-lidades da presente invenção incluem aquelas em que a composição é libe-rada pela mucosa através do nariz, boca ou pele. Modalidades adicionais dapresente invenção incluem a composição ser liberada intranasalmente. Emoutras modalidades, a composição é administrada oralmente pela digestãode uma célula da planta hospedeira na qual a composição foi produzida. Emoutra modalidade, a composição é administrada transdermicamente atravésde um emplastro.

Regimes de dosagem adequados são determinados preferivel-mente levando em consideração fatores bem-conhecidos na técnica incluin-do idade, peso, sexo e condição médica do indivíduo; a via de administra-ção; o efeito desejado; e a composição particular empregada (por exemplo,a proteína de influenza, a carga de proteína no vírus ou a partícula seme-lhante a vírus, etc.). A vacina pode ser usada em formatos de vacinaçãomultidose.

Em uma modalidade, uma dose poderia consistir da faixa decerca de 1 μg a cerca de 1,0 mg de proteína total. Em outra modalidade dapresente invenção, a faixa é de cerca de 0,01 mg a 1,0 mg. Entretanto, es-sas faixas são orientações. Dosagens mais precisas podem ser determina-das pela avaliação da imunogenicidade do conjugado produzido para queuma dose imunologicamente eficaz seja liberada. Uma dose imunologica-mente eficaz é uma que estimula o sistema imune do paciente a estabeleceruma resposta imunológica. Preferivelmente, o nível de estimulação do sis-tema imune será suficiente para desenvolver uma memória imunológica sufi-ciente para fornecer proteção de longo prazo contra doença causada pelainfecção com um vírus influenza particular.

A determinação do tempo das doses depende de fatores bem-conhecidos na técnica. Após a administração inicial uma ou mais doses dereforço podem ser subseqüentemente administradas para manter títulos deanticorpo. Um exemplo de um regime de dosagem seria uma dose no dia 1,uma segunda dose em 1 ou 2 meses, uma terceira dose em 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, ou 12 meses ou mais do que 12 meses, e doses de reforço adicio-nais em tempos distantes conforme necessário.

A resposta imune assim gerada pode ser completamente ouparcialmente protetora contra a doença e sintomas debilitantes causadospela infecção com vírus influenza.

V. Métodos para Produzir uma Combinação de VLPs Contendo Peptídeo deInfluenza e Proteínas Antiaênicas de Influenza.

i) fornecer um primeiro ácido nucléico que codifica um peptídeode fusão de capsídeo recombinante compreendendo uma proteína de capsí-deo de vírus de planta geneticamente fundida a um peptídeo viral de influen-za selecionado a partir do grupo que consiste em M1, M2, HA, NA, NP, PB1,PB2, PA e NP2, e expressar o primeiro ácido nucléico em uma célula hos-pedeira, em que a célula hospedeira é selecionada a partir de uma célula deplanta ou célula de Pseudomonas fluorescens;

ii) montar os peptídeos de fusão de capsídeo para formar umvírus ou a partícula semelhante a vírus, em que o vírus ou a partícula seme-lhante a vírus não contém membrana plasmática ou proteínas de paredecelular da célula hospedeira;

iii) fornecer pelo menos um segundo ácido nucléico que codificapelo menos uma proteína ou fragmento de proteína antigênica derivado deuma cepa de vírus influenza recentemente emergente, e expressar o segun-do ácido nucléico em uma célula hospedeira, em que a célula hospedeira éuma célula de planta ou célula de Pseudomonas fluorescens, e opcional-mente em que a cepa de vírus de influenza recentemente emergente é iden-tificada pela Organização Mundial de Saúde; e

iv) isolar e purificar a proteína ou fragmento de proteína antigê-nico; e

v) combinar o vírus ou a partícula semelhante a vírus e a proteí-na ou fragmento de proteína antigênico para formar uma composição capazde administração a um ser humano ou a um animal.

Em uma modalidade, o vírus ou a partícula semelhante a vírus éproduzido em um hospedeiro de planta, por exemplo, em plantas inteiras ouculturas de célula de planta. Em outras modalidades, a partícula semelhantea vírus é. produzida em uma célula hospedeira de Pseudomonas fluorescens.Em uma modalidade, a proteína ou fragmento de proteína antigênica é pro-duzido em um hospedeiro de planta, por exemplo, em plantas inteiras ouculturas de célula de planta. Em outras modalidades, a proteína ou fragmen-to de proteína antigênico é produzido em uma célula hospedeira de Pseu-domonas fluorescens. Em uma modalidade, o vírus ou a partícula semelhan-te a vírus e a proteína ou fragmento de proteína são co-produzidos na mes-ma planta ou célula hospedeira Pseudomonas fluorescens, e o peptídeo defusão de capsídeo monta in vivo para formar um vírus ou a partícula seme-lhante de vírus. Alternativamente, a proteína antigênica e partículas seme-lhantes a vírus são produzidas em uma planta e/ou célula hospedeira dePseudomonas fluorescens, isoladas, e purificadas, em que o peptídeo defusão de capsídeo é montado in vivo ou remontado in vitro para formar umapartícula semelhante a vírus e combinado com uma proteína ou fragmentode proteína antigênico de influenza para formar uma composição capaz deadministração a um ser humano ou a um animal.

Exemplos

Exemplo 1 Clonagem do Epítopo Universal M2-e de Vírus Influenza A emproteína de revestimento (CP) de vírus do mosqueado clorótico do caupi(CCMV)

Dois peptídeos de 23 AA derivados de uma proteína M2 de vírusInfluenza A: M2e-1 e M2e-2 foram clonados independentemente no gene deCP de CCMV para serem expressos em partículas semelhantes a vírus(VLPs) de CCMV.

Seqüência do Peptídeo M2e-1:

SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (Seq. ID. N9 1)Seqüência do Peptídeo M2e-2:

SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD (Seq. ID. N9 2)

Cada um dos insertos foi sintetizado por oligonucleotídeos deDNA com sobreposição com o programa de termociclagem detalhado abaixo:

<table>table see original document page 80</column></row><table>* (de Invitrogen Corp, Garlsbad, CA, EUA, daqui em diante "Invitrogen")Os oligonucleotídeos utilizados incluem:

M2e-1 F

5'CGG GGA TCC TGT CAC TCT TGA CAG AGG TAG AAA CAC CGA TACGTA ATG AAT GG3' (Seq. ID. Ns 14)

M2e-1 R

5'CGC AGG ATC CCA TCT GAA GAA TCA TTA CAA CGA CAG CCC CATTCA TTA CGT ATC3' (Seq. ID. N2 30)

M2e-2F

5'CGG GGA TCC TGT CAC TCT TGA CAG AGG TAG AAA CAC CGA TACGTA ATG AAT GG3' (Seq. ID. Ne 31)

M2e-2R

5' CGC AGG ATC CCA TCT GAA GAG CCA TTA CAA CGA CAT TCC CATTCA TTA CG 3' (Seq. ID. N9 32)

Os produtos de PCR resultantes foram digeridos com enzima derestrição BamHI e subclonados no vetor bidirecional pESC-CCMV129 corta-do com BamHI e então desfosforilado. As seqüências codificantes dos genesCCMV-CP quiméricos foram então seqüenciadas para garantir a orientaçãoda seqüência de peptídeo inserida e a integridade do gene CP modificado.Os genes da proteína de revestimento quimérica foram então retirados doplasmídeo bidirecional em Spel e Xho\ e subclonados no plasmídeo de ex-pressão de Pseudomonas fIuorescens pDOW1803 em Spel e Xho\. Osplasmídeos resultantes foram então transformados por eletroporação em P.fluorescens MB214 eIetrocompetente com 15 μg/ml de tetraciclina como oagente de seleção.

Exemplo 2 Clonagem de Epítopos de NP de vírus Influenza A em proteínade revestimento (CP) de vírus do mosqueado clorótico do caupi (CCMV)

Dois peptídeos derivados de uma proteína NP de vírus InfluenzaA: NP55-69 e NP147-158 foram clonados independentemente no gene CPde CCMV para serem expressos com partículas semelhantes a vírus (VLPs)de CCMV.

Seqüência do Peptídeo NP55-69:RLIQNSLTIERMVLS (Seq. ID. N9 9)

Seqüência do Peptídeo NP147-158:TYQRTRALVRTG (Seq. ID. N910)

Cada um dos insertos foi sintetizado por oligonucleotídeos deDNA com sobreposição com o programa de termociclagem detalhado noExemplo 1.

Os oligonucleotídeos incluem:

NP55-69F

5'GATCCTGCGCCTGATCCAGAACAGCCTGACCATCGAACGCATGGTGCTGAGCGG3' (Seq. ID. N9 33)

NP55-69R

5'GATCCCGCTCAGCACCATGCGTTCGATGGTCAGGCTGTTCTGGATCAGGCGCAG3' (Seq. ID. N9 34)

NP147-158F

5'GATCCTGACCTACCAGCGCACCCGCGCTCTGGTGCGCACCGGCGG3'(Seq. ID. N0: 35)

NP147-158R

5'GATCCCGCCGGTGCGCACCAGAGCGCGGGTGCGCTGGTAGGTCAG3' (Seq. ID. N9 36)

Os produtos de PCR resultantes foram digeridos com enzima derestrição SamHI e subclonados no vetor bidirecional pESC-CCMV129 corta-do com BamHI e então desfosforilado. As seqüências codificantes dos genesCCMV-CP quiméricos foram então seqüenciadas para garantir a orientaçãoda seqüência de peptídeo inserida e a integridade do gene CP modificado.Os genes da proteína de revestimento quimérica foram então retirados doplasmídeo bidirecional em SpeI e Xho\ e subclonados no plasmídeo de ex-pressão de Pseudomonas fluorescens pDOW1803 em Spel e Xhol Osplasmídeos resultantes foram então transformados por eletroporação em P.fluorescens MB214 eletrocompetenté com 15 ,^g/ml de tetraciclina como oagente de seleção.

Exemplo 3 Clonagem do Epítopo de HA de vírus Influenza A em proteína derevestimento (CP) de vírus do mosqueado clorótico do caupi (CCMV)

Um peptídeo derivado de uma proteína HA de vírus Influenza A,HA 91-108 foi clonado independentemente no gene CP de CCMV para serexpresso em partículas semelhantes a vírus (VLPs) de CCMV.Seqüência do Peptídeo HA91-108:SKAFSNCYPYDVPDYASL (Seq. ID. Ne 7)

Os insertos foram sintetizados por oligonucleotídeos de DNAcom sobreposição com o programa de termociclagem detalhado no Exemplo 1.

Os oligonucleotídeos incluíram:

HA91-108F

5'GATCCTGAGCAAGGCTTTCAGCAACTGCTACCCGTACGACGTGCCGGACTACGCTAGCCTGGG31 (Seq. ID. N9 37)

HA91-108R

5'GATCCCCAGGCTAGCGTAGTCCGGCACGTCGTACGGGTAGCAGTTGCTGAAAGCCTTGCTCAG3'(Seq. ID. Ns 38)

Produtos de PCR resultantes foram digeridos com enzima derestrição BamH\ e subclonados no vetor bidirecional pESC-CCMV129 corta-do com BamHIe então desfosforilado. As seqüências codificantes dos genesCCMV-CP quiméricos foram então seqüenciadas para garantir a orientaçãoda seqüência de peptídeo inserida e a integridade do gene CP modificado.Os genes da proteína de revestimento quimérica foram então retirados doplasmídeo bidirecional em Spel e Xho\ e subclonados no plasmídeo de ex-pressão de Pseudomonas fluorescens pDOW18C)3 em Spel e Xho\. Osplasmídeos resultantes foram então transformados por eletroporação em P.fluorescens MB214 eletrocompetente com 15 μg/ml de tetraciclina como oagente de seleção.

Exemplo 4 Expressão de peptídeos de fusão de capsídeo de CCMV recom-binantes

Os plasmídeos de expressão de peptídeo de fusão CCMV129foram transformados em células hospedeiras de Pseudomonas fluorescensMB214 de acordo com o seguinte protocolo. Células hospedeiras foram des-congeladas gradualmente em frascos mantidos sobre gelo. Para cada trans-formação, 1 μΙ de DNA de plasmídeo de expressão purificado foi adicionadoàs células hospedeiras e a mistura resultante foi agitada gentilmente comuma ponteira de pipeta para misturar, e então incubada em gelo por 30 min.

A mistura foi transferida para cubetas de eletroporação descartáveis (BioRadGene Pulser Cuvette, distância entre eletrodos de 0,2 cm, cat no. 165-2086).As cubetas foram colocadas em um Biorad Gene Pulser pré-ajustado em200 Ohms, 25pfarads, 2,25kV. As células foram pulsadas rapidamente (cer-ca de 1-2 seg). Meio LB gelado foi então adicionado imediatamente e a sus-pensão resultante foi incubada a 30 C por 2 horas. As células foram entãocolocadas em ágar LB tet15 (meio LB suplementado com tetraciclina) e culti-vadas a 30 C durante a noite.

Uma colônia foi retirada de cada placa e a amostra retirada foiinoculada em 50 ml de cultura de semeadura LB em um frasco de agitaçãodifusa. Culturas líquidas em suspensão foram cultivadas durante a noite a30 C com agitação a 250 rpm. 10 ml de cada cultura de semeadura resultan-te foram então usados para inocular 200 ml de meio do frasco de agitação(isto é, extratos de levedura e sal com elementos traço, citrato de sódio, eglicerol, pH 6,8) em um frasco de agitação difusa de 1 litro. Tetraciclina foiadicionada para seleção. Culturas inoculadas foram cultivadas durante anoite a 30°C com agitação a 250 rpm e induzidas com IPTG para expressãodas proteínas de revestimento quiméricas de peptídeo de fusão CCMV129.

Alíquotas de 1 ml de cada cultura de frasco de agitação foramentão centrifugadas para precipitar as células. Os precipitados celulares fo-ram ressuspensos em 0,75 mL de Tris-HCI 50 mM gelado pH 8,2, contendo2mM de EDTA. Volume de 0,1% de detergente TritonX-10 a 10% foi entãoadicionado, seguido por uma adição de Iisozima para uma concentração finalde 0,2 mg/ml. As células foram então incubadas em gelo por 2 horas, tempono qual um Iisado celular viscoso e claro pôde ser aparente.

Aos lisados, 1/200 volume de MgCI2 a 1M foi adicionado, segui-ndo por uma adição de 1/200 volume de DNAse I, e então incubação em gelopor 1 hora, tempo pelo qual o Iisado se tornou um líquido muito menos vis-coso. Os lisados tratados foram então centrifugados por 30 min a 4eC emvelocidade máxima em uma centrífuga Tabletop e os sobrenadantes foramdecantados para dentro de tubos limpos. Os sobrenadantes decantados sãoas frações de proteína "solúveis". Os precipitados restantes foram então res-suspensos em 0,75 ml de tampão TE (10 mM de Tris-CI, pH 7,5, 1 mM deEDTA). Os precipitados ressuspensos são as frações "insolúveis"Exemplo 5 Análise de peptídeos de fusão de capsídeo de CCMV recombinantes

As frações "solúvel" e "insolúvel" foram submetidas a eletrofore-se em géis de Bis-Tris 4-12% NuPAGE (de Invitrogen1 Cat. NP0323), tendocavidades de 1,0mm, de acordo com a especificação do fabricante. 5μΙde cada fração foram combinados com 5μΙ de tampão de aplicação de SDS-PAGE redutor 2X, e fervidos por 5 minutos antes decorrer no gel. Os géisforam corados com SimpIyBIue Safe Stain1 (de Invitrogen1 Cat. LC6060) edescorado durante a noite com água.

Figura 4 mostra expressão de CP de CCMV129 fundido compeptídeo de vírus influenza M2e-1 em Psedomonas fluorescens conformedetectado por SDS-PAGE corado por coloração Simply blue safe (Invitrogen).

Figura 5 mostra expressão de CP de CCMV129 fundido compeptídeo de vírus influenza M2e-2 em Psedomonas fluorescens conformedetectado por SDS-PAGE corado por coloração Simply blue safe (Invitrogen).

Figura 6 mostra expressão de CP de CCMV129 fundido compeptídeo de vírus influenza NP55-69 em Psedomonas fluorescens conformedetectado por SDS-PAGE corado por coloração Simply blue safe (Invitrogen).

Figura 7 mostra expressão de CP de CCMV129 fundido compeptídeo de vírus influenza NP147-158 em Psedomonas fluorescens con-forme detectado por SDS-PAGE corado por coloração Simply blue safe (Invi-trogen).

Figura 8 mostra expressão de CP de CCMV129 fundido compeptídeo de vírus influenza HA91-108 em Psedomonas fluorescens confor-me detectado por SDS-PAGE corado por coloração Simply blue safe (Invi-trogen).

Exemplo 6 Purificação de VLPs de CCMV recombinantes

O protocolo usado para purificar VLPs de CCMV quiméricascompreendeu as seguintes etapas:(1) Lise celular, (2) Lavagem e separação de corpo de inclusão(IB), (3) Solubilização de IB1 (4) Remoção de contaminante de proteína dechoque térmico (HSP), (5) Remoção de endotoxina, (6) Renaturação da pro-teína de revestimento, (7) Clarificação, (8) Montagem de VLP, (9) Troca detampão em PBS, pH 7,0, e (10) Filtração estéril.

Os seguintes tampões foram usados:

a. Tampão de Lise -NaCI a 100mM/EDTA a 5mM/PMSF a 0,1-0,2mM/Tris a 50mM, pH 7,5

b. Tampão AU - Baixa Força lônica - uréia a 8M/DTT a 1 mM/Trisa 20mM, pH 7,5

c. Tampão B w/uréia a 8M - NaCI a 1 M/uréia a 8M/DTT a1 mM/Tris 20mM, pH 7,5

d. Solução CIP - NaOH a 0,5N/NaCI a 2M

e. Solução de preparação de coluna -Tris a 100mM, pH 7,5

f. Solução de armazenamento-20% de EtOH

g. Tampão B - NaCI a 1M/DTT a 1 mM/Tris a 20mM, pH 7,5

h. Tampão de Montagem de Vírus Mustang E (Pall, cat. N9MSTG25E3)-Filtrado - 0,1 NaOAc, pH 4,8, NaCI a 0,1 M, PMSF a 0,0002 M

i. PBS Mustang Ε-Filtrado pH 7,0.

15-20 g de pasta de célula úmida de P. fluorescens foi medidaem um tubo cônico de 50 ml e o tampão de Lise foi adicionado para um vo-lume total de 40 ml. Solução de pasta de célula foi vortexada e agitada atéalguma homogeneidade. As células foram Iisadas com duas passagens poruma Prensa Francesa em 8,8 MPa (1280 psi) usando aceleração alta. O Ii-sado (-33 ml) foi centrifugado a 10OOOxG por. 10 minutos a 4C. O sobrena-dante foi descartado. O pélete era firme e de uma consistência pulverulenta,de cor clara e distinto da pasta de célula. 4-5 ml do Tampão de Lise foramadicionados ao pélete e a solução foi vortexada e agitada com uma espátulaaté que o pélete se dissolveu. O Tampão de Lise foi adicionado para um vo-lume total de 40 ml. A amostra foi vortexada até que pélete se dissolveu. Aamostra foi centrifugada a 10OOOxG por 10 minutos a 4C. A lavagem do IBfoi repetida pelo menos mais uma vez com o Tampão de Lise e um momentofinal usando água Dl. IBs foram dissolvidos em 4-5 ml de uréia a 8M/DTT aImM/Tris a 20 mM, pH 7,5 por vórtex. O volume da solução de IB foi ajusta-da para 40ml com uréia a 8M/DTT a 1mM/Tris a 20mM, pH 7,5. A solução foisonicada por 15 minutos em um sonicador de banho resfriado se necessárioe chacoalhada durante a noite a 4C seguido por clarificação (por rotação por10 minutos a 10OOOxG a 4C ou por filtração através de Whatman GD/X de0,45um, cat. N2 6976-2504). A coluna Q-Sepharose Fast Flow (GE Healthca-re) foi equilibrada usando 10 Volumes de Coluna (CV) de tampão AU-BaixaForça lônica - uréia a 8M/DTT a ΙγτίΜΛΓris a 20mM, pH 7,5 (AU-Baixa). 8 mlde solução de IB foram aplicados por ml de resina e 2 ml das frações de flu-xo direto (FT) de 2 ml foram coletadas. A coluna foi lavada com 6 CV deTampão AU - baixa e eluído com 5 CV de Tampão B com uréia a 8M. A co-luna foi limpa e regenerada pelo uso de 6 CV de solução CIP e armazenadoem 20% de ETOH. Proteína de revestimento de CCMV com contaminantede HSP removido foi encontrado nas frações FT que foram agrupadas.

Membrana de filtro Sartobind Q15X ou Q100X (Sartorius) foi equilibrada com10 ml de Tampão AU - Baixo. Solução de IB foi filtrada através do filtro e ofiltrado foi clarificado. A solução filtrada foi adicionada ao frasco com volumede 5x de Tampão B e misturado imediatamente. A solução diluída foi deixa-da misturar a 4C por vários minutos e então dialisada contra Tampão B u-sando uma membrana de 3.500 Da a 4C durante a noite enquanto ainda seagitava lentamente. O tampão foi trocado pelo menos uma vez. Após diálise,a solução foi clarificada se necessário. A solução de proteína renaturada foidialisada em Tampão de Montagem de Vírus por 12 horas e clarificada porcentrífugação ou filtração de.0,2 μηι. A solução de VLP remontada foi con-centrada em Tampão de Montagem dé Vírus por uma membrana de 300kDa e trocada em PBS, pH 7,0 usando 3 trocas de tampão. A filtração estérilfinal foi a através de um filtro de 0,2 pm.

Exemplo 7 Análise de VLPs de CCMV Recombinantes Purificados

As VLPs purificadas foram submetidas à eletroforese em géis deBis-Tris 4-12% de NuPAGE (de Invitrogen, Cat. NP0323), tendo 15 cavida-des de 1,0mm, de acordo com a especificação do fabricante. 5ul da amostraforam combinados com 5 ul de tampão de aplicação de SDS-PAGE redutor2X, e fervido por 5 minutos antes de correr no gel. Os géis foram coradoscom SimpIyBIue Safe Stain1 (de Invitrogen, Cat. LC6060) e descorados du-rante a noite com água. Detecção por Western blot empregou IgG anti-CCMV (N9 de Acesso AS0011 de DSMZ, Alemanha, a proteína M2 anti-Influenza A (lgG1 kappa monoclonal de camundongo, cat Ne: MA1-082) deABR (Affinity BioReagents) como anticorpos primários, e o kit WESTERNBREEZE (de Invitrogen, Cat. WB7105), seguindo os protocolos do fabricante.

Figura 9 mostra expressão e detecção de CP de CCMV 129 pu-rificado fundido com peptídeo de vírus influenza M2e-1 em Psedomonas flu-orescens conforme detectado por SDS-PAGE corado por coloração Simplyblue safe (Invitrogen).

Figura 10 mostra expressão CP de CCMV129 undido com peptí-deo de vírus influenza M2e-1 em Psedomonas fluorescens conforme detec-tado por western blotting com anticorpos 14B anti-CCMV e anti-M2. O peptí-deo M2e é reconhecido por anticorpos anti-M2.

Exemplo 8 Clonagem do Epítopo Universal M2-e de vírus Influenza A emproteína de revestimento (CP) de vírus do mosaico do caupi (CPMV)

Um peptídeo M2e-3 derivado de uma proteína M2 de vírus Influ-enza A foi clonado independentemente no gene CP menor de CPMV paraser expresso em partículas semelhantes a vírus CPMV.

Seqüência do peptídeo M2e-3:

SLLTEVETPIRNEGCRCNDSSD (Seq. ID. N6 3)

0 inserto foi sintetizado por oligónucleotídeos de DNA com so-breposição com o programa de termociclagem detalhado no Exemplo 1.

Os oligonucleotídeos eram:

M2e-3F

ATG GAT AGC TAG CAC TCC TCC TGC TAG TCT GCT GAC CGA AGTGGA AAC CCC GAT TCG CAA CGA AGG CTG3' (Seq. ID. N9 39)

M2e-3R

5'TGC CTG TGA CGT CTG AAA ATG GAT CGC TGC TAT CGT TGC AGCGGC AGC CTT CGT TGC GAA TCG G3' (Seq. ID. N5 40)Produtos de PCR resultantes foram digeridos com enzimas derestrição AatiI e NheI (NEB) e subclonados no vetor pDOW2604 cortadoscom Aatíl, NheI e desfosforilados. 2μΙ de produto de ligação foram transfor-mados em células de E. coli Top 10 Oneshot (Invitrogen). A mistura de célu-la/produto de ligação foi incubada em gelo por 30 minutos, submetida a cho-que térmico por 45 segundos antes da adição de 0,5ml de hidrolisado sojalivre de LB animal (Teknova). Os transformantes foram agitados a 37°C por1 hora antes de serem plaqueados em placa de ágar de hidrolisado de sojalivre de LB animal com 100pg/ml de ampicilina para seleção.

As seqüências codificantes de genes CPMV-CP quiméricos(pDOW-M2e-3) foram então seqüenciadas para garantir a orientação da se-qüência de peptídeo inserida e a integridade do gene CP modificado.

Exemplo 9 Produção de CPMV recombinante contendo o Epítopo UniversalM2-e de vírus Influenza A em plantas de caupiProdução de Partículas de CPMV Quiméricas em Plantas

Sementes de Caupi Califórnia N- 5 de Ferry Morse, número doproduto 1450, foram germinadas durante a noite em temperatura ambienteem toalhas de papel úmidas. As sementes germinadas foram transferidaspara o solo. Sete dias após a germinação, as mudas foram inoculadas comRNA1 de CPMV e RNA2 de CPMV quimérico na presença de abrasivo. OsRNAs de CPMV foram produzidos por transcrição in vitro a partir de plasmí-deos pDOW2605 cortado com Mlu\ e pDOW-M2e-3 cortado com Ecofll. ODNA de plasmídeo Iinearizado foi purificado em coluna pelo uso de uma co-luna limpa Qiagen ou um kit limpo equivalente. A reação de transcrição foirealizada pelo uso de kit T7 MEGAscript (Ambion, catálogo Ns 1334) conteR-do CAP (40mM) de acordo com as instruções do fabricante. A qualidade dostranscritos foi analisada por correr 1μΙ dos transcritos de RNA em um gel deagarose.

Após a inoculação, as plantas foram cultivadas a 25C com umfotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de escuro por duas a três semanas.

As folhas que mostraram sintomas foram colhidas e congeladas a -80C an-tes da purificação.Purificação de Partículas de CPMV Quiméricas

40g de tecido de folha infectado com CPMV foram congelados a-80°C. O tecido de folha congelado foi amassado manualmente e colocadoem um misturador de alta velocidade Waring1 número do produto 8011S.120ml de tampão de ligação AIEC gelado com PMSF (Tris Base a 30mM pH7,50, PMSF a 0,2mM) foram colocados sobre as folhas amassadas. As fo-lhas foram trituradas 2 vezes por 3 segundos em alta velocidade. A soluçãofoi decantada em um frasco de centrífuga de 500ml. O misturador foi lavadocom 30ml de tampão de ligação AIEC e a lavagem foi colocada em um fras-co de centrífuga de 500ml. A solução foi centrifugada a 15.000G por 30 mi-nutos para remover os resíduos de célula de planta. O sobrenadante foi de-cantado em um cilindro graduado. Para precipitar o vírus CPMV, solução dePEG 6000 gelada (PEG 6000 20% de, NaCI a 1M) foi adicionada ao sobre-nadante para levar a concentração final de PEG para 4% de PEG 6000 comNaCI a 0,2M, e a solução foi gentilmente misturada. A solução foi deixadaprecipitar por 1 hora em gelo. A solução de pélete de vírus foi então centrifu-gada a 15.000G por 30 minutos para coletar o pélete de vírus CPMV. O so-brenadante foi derramado e o pélete de vírus foi imediatamente ressuspensoem tampão de ligação de troca de ânion (Tris base 30mM pH 7,50). Parapurificar adicionalmente as partículas semelhantes a vírus, a mistura de pro-teína foi fracionada por cromatografia de troca de ânion usando resina detroca de ânion forte POROS 50 HQ de Applied Biosystems, número do pro-duto 1-2559-11. O gradiente de 20 volumes de coluna foi de tampão A, Trisbase a 30mM pH 6,75, até tampão B, Tris base a 30mM pH 6,75 com NaCI a1 Μ. A cromatografia foi corrida com um AKTAexpIorer de Amersham Biosci-ences, número do produto 18-1112-41. O primeiro pico no gradiente, quecontinha as partículas de vírus desejadas, foi trocado de tampão em PBSusando um concentrador de rotação Millipore de membrana de ponto de cor-te de 100 kDa, número do produto UFC910096. As amostras foram entãoarmazenadas a -80C.

Exemplo 10 Análise de CPMV recombinante contendo o Epítopo UniversalM2-e de vírus Influenza AA estabilidade das proteínas de revestimento menor e maior foitestada com SDS PAGE. A integridade das partículas de vírus CPMV quimé-ricas montadas foi testada usando cromatografia de exclusão de tamanho.

As partículas purificadas foram submetidas à eletroforese em géis de Bis-Tris 4-12% de NuPAGE (de Invitrogen, Cat. NP0323), tendo 15 cavidades de1 ,Omm1 de acordo com a especificação do fabricante. 5ul da amostra foramcombinados com 5 ul de tampão de aplicação de SDS-PAGE redutor 2X, efervidos por 5 minutos antes de correr no gel. Os géis foram corados comSimpIyBIue Safe Stain, (de Invitrogen, Cat. LC6060) e descorados durante anoite com água. Detecção por Western blot empregou IgG de coelho policlo-nal J16 anti-CPMV policlonal, a antiproteína M2 de Influenza A (IgGI kappamonoclonal de camundongo, cat Ne: MA1-082) de ABR (Affinity BioRea-gents) como anticorpos primários e o kit WESTERN BREEZE (de Invitrogen,Cat. WB7105), seguindo os protocolos do fabricante.

Figura 11 mostra expressão de CPMV fundido com peptídeo devírus influenza M2e-1 em plantas conforme detectado por SDS-PAGE e wes-tern blotting com anticorpos 14B anti-CPMV e anti-M2. O peptídeo M2e éreconhecido por anticorpos anti-M2.

Exemplo 11 Gene e fragmentos de gene HA usados para expressão emplantas e células de planta

Um gene que codifica HA de influenza, identificado a partir dacepa de vírus influenza A/Thailand/3(SP-83)/2004(H5N1) em SEQ ID N5: 15foi encomendada de DNA 2.0 (DNA 2.0, Menlo Park, CA 94025, USA) parasíntese. O gene HA sintetizado foi manipulado para favorecer um viés deuso de códon de planta e conter sítios de restrição fabricados flanqueando ogene nas ausências dos mesmos sítios de restrição dentro do gene parapropósitos de clonagem. O gene HA de extensão completa sintetizado nãotinha o domínio transmembrana C-terminal e a cauda citoplasmática. Vejafigura 12 e figura 13. A seqüência de nucleotídeo otimizada por códon daORF do gene HA completa que foi usada para clonagem e expressão emcélulas de planta é mostrada na Tabela 5, seqüência SEQ ID NQ: 16. A se-qüência de aminoácido da proteína HA de extensão completa traduzida apartir de SEQ ID Ns: 16 é mostrada na Tabela 5, SEQ ID Ne: 17. Ela não temo domínio transmembrana C-terminal e a cauda citoplasmática e contémmarcador His na terminação-C da proteína. As seqüências de nucleotídeootimizada por códons para fragmentos de proteína HA, HA1 e HA2 são mos-trados na Tabela 5, SEQ ID NQ: 19 e 21. Seqüência de aminoácido dosfragmentos de proteína HA1 e HA2 traduzidos a partir de SEQ ID N9: 19 e21 são mostrados na Tabela 5, SEQ ID N9: 18 e 20. Ambos os fragmentos deHA contêm o peptídeo de sinal nativo, têm domínio transmembrana C-terminal e causa citoplasmática removidos, e contêm His-tag na terminaçãoC dos fragmentos de proteína.

Exemplo 12 Clonagem de HA de extensão completa, HA1 e HA2 de Influen-za em vetor de expressão à base de PVX pDOW3451

O gene HA de extensão completa foi isolado usando enzimas derestrição EcoFN e £?spE1 que permitiram que ele fosse retirado do vetorG01129 (DNA 2.0). G01129 digerido foi corrido em gel de agarose para se-parar o esqueleto do vetor do gene HA. O gene HA foi purificado em gel eentão subclonado no vetor pDOW3451 que também foi cortado com EcoFN+ BspE-I e desfosforilado usando fosfatase alcalina bovina (CIP). Veja a figu-ra 14. Clonagem bem-sucedida do novo vetor pDOW3471 foi verificada pormapeamento de restrição e rastreamento por PCR de colônia para o gene HA.

Fragmentos de gene HA1 e HA2 foram isolados usando G01129como um molde em uma reação de PCR. A primeira reação de PCR serviupara amplificar o gene HA1 que incluía o sítio de restrição de EcoFN, peptí-deo de sinal, e o início da ORF. O iniciador de sentido reverso serviu paraadicionar um marcador 6xHis nã terminação-C e o sítio de restrição de Bs-pB. As reações de PCR foram realizadas usando SuperPCR Mix (Invitro-gen) de acordo com as instruções do fabricante.

Iniciadores usados para amplificar o fragmento de HA1 foram:Thai 1 FHA1

5' GCGCGATATCAACAATGGAGAAGATAGTTC 3' (Seq. ID. N9 41)Thai 3 HA1 BspEI5' GCGCTCCGGATTTAGTGGTGATGGTGATGATGTCTCTTCTTACGTC 3'(Seq. ID. N9 42)

A segunda reação serviu para amplificar o fragmento de HA2. osseguintes iniciadores foram usados:Thai 8 FHA2 EcoRV

GCGATATCAACAATGGAGAAGATAGTTCTCTTGTTTGCCATCGTCAGTTTGGTCAAATCAGGATTGTTCG 3' (Seq. ID. N9 43) .Thai 7 HA2 BspEI

5' GCGCTCCGGATTTAGTGGTGATGGTGATGATGTTGGTAGATACC 3'(Seq. ID. N9 44)

Os parâmetros do termociclador para a reação de PCR incluí-ram:

1. 959 C por 2 min

2. 949 C por 30 seg

3. 569 C por 30 seg

4. 689 C por 1:10 min

5. "Go to" etapa 2 34 vezes

6. 689 C por 10 min

7. 49C

Após o PCR1 produtos para fragmentos de HA1 e HA2 foramdigeridos com EcoFN e SspEI, corridos em um gel de DNA e as bandasforam cortadas para uso para clonagem em vetor pDOW3451. Clonagembem-sucedida foi verificada por mapeamento de digestão de restrição e ras-treamento por PCR de colônia para os fragmentos de HA.

Exemplo 13 Preparação de transcritos de RNA de pDOW3475 e pDOW3466pDOW3471 e pDOW3466 (um plasmídeo auxiliar contendo ogenoma de PVX com uma deleção na proteína de revestimento) foram am-bos Iinearizados usando enzima de restrição Spel, purificados em colunaQuickspin (Qiagen) e eluídos com água livre de nuclease (Ambion). Reaçõesde transcrição in vitro foram organizadas como segue usando componentesdo kit mMessage Machine T7 coberto (Ambion).<table>table see original document page 94</column></row><table>

As reações foram montadas sobre gelo, e então incubadas a 37g

C por 2 horas. Após transcrição de RNA in vitro, uma pequena amostra decada reação foi corrida para visualizar os produtos de RNA.Exemplo 14 Inoculação de plantas de Nicotiana benthamiana e produção deproteína HA em plantas

Plantas de Nicotiana benthamiana foram inoculadas usandoRNA transcrito in vitro de pDOW3475 e pDOW3466. Uma única folha deuma planta de 2-3 semanas de idade foi pulverizada com carborundo empequena quantidade. O inóculo de RNA foi aplicado à folha nova e sobre ocarborundo. Usando luvas limpas, o RNA foi esfregado no tecido da folha.Um inóculo (20 μΙ_ de RNA transcrito in vitro) de pDOW3475 combinado compDOW3466 foi usado por inoculação de planta. As plantas foram observadaspara formação de sintoma. Veja figura 15.

Exemplo 15 Inoculação de células de tabaco-NTI e produção de proteína HAem células de planta

Transfecção de células NT1 de Tabaco foi realizada através deeletroporação de RNA transcrito in vitro em protoplastos de NT1. Os proto-plastos de foram preparados para eletroporação pela remoção da paredecelular usando celulisina e macerase. Cinco minutos antes da eletroporaçãodo RNA de pDOW3475 nas células, 5ug de um plasmídeo contendo o geneHcPro foi incubado com as células. HcPro foi demonstrado anteriormenteevitando o silenciamento gênico e por isso aumentando a quantidade de re-plicação e atividade viral. Complementação não foi considerada necessáriapara culturas de célula de planta propagarem o RNA viral expressando ogene HA. RNA derivado de pDOW3466 foi usado como inóculo. Imediata-mente antes da eletroporação, 5 μΙ_ de RNA transcrito in vitro foi adicionadoa 1 mL de células de planta processadas em uma cubeta com distância de0,4 cm resfriada com gelo (Biorad), e misturada rapidamente. As células fo-ram pulsadas a 500mF e 250 V em uma constante de tempo de 11-13 se-gundos. As células foram plaqueadas em 5 mL de meio de plaqueamento deNT1 em uma placa de petri, selada com parafilme e então deixadas crescerpor 48 horas em temperatura ambiente.

As células foram testadas para transfecção bem-sucedida e pro-dução de HA. Culturas de células inteiras foram peletizadas, congeladas,amassadas com um gral, e Iisadas a fim de purificar a proteína HA sinalizadacom his sob condições normais e desnaturantes através de uma coluna derotação Ni-NTA (Qiagen). Amostras foram então detectadas através de wes-tern blot utilizando anticorpos primários anti-His (conjunto Qiagen 3), e anti-AP de camundongo secundário (Western Breeze, Invitrogen).

Exemplo 16 Expressão de HA ou fragmentos de HA em Pseudomonas fluo-rescens

Um gene que codifica HA de influenza, identificado a partir dacepa de vírus influenza A/Vietnam/2004(H5N1) em SEQ ID Ne: 25 foi enco-mendado de DNA 2.0 (DNA 2.0, Menlo Park, CA 94025, USA) para síntese.

O gene HA sintetizado foi manipulado para favorecer um viés de uso de có-don de P. fluorescens, e conter um sítio de ligação de ribossomo e sítios derestrição fabricados flanqueando o gene nas ausências dos mesmos sítiosde restrição dentro do gene para propósitos de clonagem. A seqüência denucleotídeos otimizada por códon da ORF completa do gene HA que foi u-sado para clonagem e expressão em células de- P. fluorescens é mostradana Tabela 5, seqüência SEQ ID N2: 26. O gene da proteína HA foi retiradodo plasmídeo em Spel e Xho\ e subclonado no plasmídeo de expressão dePseudomonas fluorescens pDOW1803 em SpeI e Xho\ no lugar do genebuibui.

Os plasmídeos resultantes foram transformados por eletropora-ção em P. fluorescens MB214 eletrocompetente. As células hospedeiras fo-ram descongeladas gradativamente em frascos mantidos sobre gelo. Paracada transformação, 1μΙ_ de DNA de plasmídeo de expressão purificado foiadicionado às células hospedeiras e a mistura resultante foi agitada gentil-mente com a ponta de uma pipeta para misturar e então incubada sobre gelopor 30 minutos. A mistura foi transferida para cubetas descartáveis de ele-troporação (BioRad Gene Pulser Cuvette, distância entre eletrodos de 0,2cm, cat no. 165-2086). As cubetas foram colocadas em um Biorad GenePulser pré-ajustado em 200 Ohms1 25pfarads, 2,25kV. As células foram pul-sadas brevemente (cerca de 1-2 seg). Meio LB gelado foi então imediata-mente adicionado e a suspensão resultante foi incubada a 30-C por 2 horas.

As células foram então plaqueadas em ágar LB tet15 (meio LB suplementa-do com 15ug/ml de tetraciclina) e cultivadas a 30°C durante a noite.

Uma colônia foi retirada de cada placa e a mostra retirada foiinoculada em 50mL de cultura de semeadura LB em um frasco de agitaçãodifusas. Culturas de suspensão líquida foram cultivadas durante a noite a30°C com agitação em 250rpm. 10mL de cada cultura de semeadura resul-tante foram então usados para inocular 200 mL de meio de frasco de agita-ção (isto é, extratos de Ievedo e sal com elementos traço, citrato de sódio eglicerol, pH 6,8) em um frasco de agitação difusas de 1 litro. Tetraciclina foiadicionada para seleção. As culturas inoculadas foram cultivadas durante anoite a 30QC com agitação a 250 rpm e induzidas com IPTG para expressãoda proteína HA.

Exemplo 17 Clonagem e expressão de pbp-HA no periplasma de P, fluores-cens DC454

Clonagem:

Um sinal de secreção de proteína de ligação de fosfato (pbp) de24 resíduos foi fundido na terminação N da cepa do vírus da influenzaA/Vietnam/2004(H5N1) modificada em SEQ ID N9: 29 sem o seu sinal desecreção nativo e domínio transmembrana C-terminal.

O sinal pbp foi amplificado de pDOW1113 com o seguinte par deiniciadores:

pbpF-Spel

5' - GGACTAGTAGGAGGTAACTTATGAAACTGAAACGTTTGATG - 3'(Seq. ID. Nq 45)pbp-HA-Rev

5' - GTGATAGCCGATGCAAATCTGGTCGGCCACCGCGTTGGC - 3' (Seq.ID. N9 46)

A proteína HA modificada foi amplificada a partir do plasmídeobidirecional contendo o gene HA em SEQ ID NQ: 26 por PCR com o seguintepar de iniciadores:

pbp-HA-For

5' - GCCAACGCGGTGGCCgaccagatttgcatcggctatcac - 3' (Seq. ID. Nq 47)HA-XhoI-Rev

5' - CCGCTCGAGTCATTACTGATAGATCCCGATGCTCTCC - 3' (Seq. ID.N5 48)

O gene de fusão pbp-HA foi então amplificado usando o par deiniciadores abaixo:

pbpF-Spel

5' - GGACTAGTAGGAGGTAACTTATGAAACTGAAACGTTTGATG - 3'(Seq. ID. 49)

HA-XhoI-Rev

5' - CCGCTCGAGTCATTACTGATAGATCCCGATGCTCTCC - 3' (Seq. ID.N9 48)

<table>table see original document page 97</column></row><table>

Etapa 1: Plasmídeo carregando o sinal pbp foi usado como molde de PCR.Iniciadores pbpF-Spel e pbp-HA-Rev foram usados na reação 1. Iniciadorespbp-HA-For e HA-XhoI-Rev foram usados na reação 2. PCRs foram realiza-dos de acordo com os protocolos de termociclagem descritos acima.Etapa 2: Produtos de PCR 1 e 2 foram usados como moldes de PCR paraessa reação. Iniciadores pbpF-Spel e HA-XhoI-Rev foram usados para am-plificar o produto final de PCR.

O produto final de PCR foi então digerido por SpeI e Xho\ e sub-clonado no vetor de expressão de P. fIuorescens pDow1169 restrito comSpel e Xho\ e desfosforilado. O produto de ligação foi transformado por ele-troporação na cepa DC454 de P. fluorecens após purificação com colúnasde cromatografia Micro Bio-spin 6 (Biorad). Os transformantes foram plaque-ados em placas de M9 Glicose (Teknova) após duas horas de agitação emmeio LB a 30oC. As placas foram incubadas a 30eC por 48 horas. A presen-ça do inserto foi confirmada por digestão de restrição e seqüenciamento.

Expressão de Proteína:

Transformantes únicos foram inoculados em 50 ml de meio M9Glicose e cultivados durante a noite. Culturas de P. fluorescens de 3,0-5,0OD6OO foram usadas para inocular culturas em frascos de agitação. Os fras-cos de agitação foram incubados a 309C com 300 rpm de agitação durante anoite. As culturas de 15,0-20,0 OD6OO foram induzidas com 300μΜ de iso-propil-p-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG). Culturas foram coletadas 24 horasapós a indução.

Exemplo 18 Conjugação de HA ou fragmentos de HA a vírus ou as partícu-las semelhantes a vírus CCMV in vitro

As partículas de VLP de CCMV quiméricas contendo o insertode influenza são produzidas como descrito nos Exemplos 1-7 e então pro-'cessadas adicionalmente para conjugar a proteína HA, ou fragmentos daproteína HA ou mutantes da proteína HA, ou mutantes de fragmentos de HAderivados como descrito nos Exemplos 11-17 à proteína de revestimento deCCMV. A proteína ou fragmentos de proteína HA são ligados aos resíduosde cisteína expostos na superfície em partícula de CCMV ou seus mutantes.Isso é obtido pelo acoplamento oxidativo de tióis de cisteína em CCMV agrupos de tiol livres sobre a proteína na presença de CuS04 1mM em aceta-to de sódio 50mM pH 4.8, com uma razão molar de 93 pM de proteína derevestimento de CCMV para 385 pM de HA. A reação é incubada por 1-4horas. Alternativamente, a proteína HA é ligada à superfície da VLP deCCMV através de um método como descrito em Gillitzer, et ai, Chemicalmodification of a viral cage for multivalent presentation, Chem. Commun.,2002, 2390-2391 e Chatterji et ai, Chemical conjugation of heterologous pro-teins on the surface of Cowpea Mosaic Virus. Bioconjugate Chem., 2004,Vol. 15, 807-813.

Partículas conjugadas são separadas de partículas não-conjugadas através de cromatografia de exclusão de tamanho usando umacoluna Superose 6 de 1cm χ 30cm de GE Bioscience com uma fase móvelde NaP04 a 0,1M, pH 7,00. Alternativamente, as partículas conjugadas sãoseparadas das proteínas ou fragmentos de proteína HA livres através deprecipitação com 4% de PEG NaCI a 0,2M seguida por ressuspensão emTris a 30mM, pH 7,50.

Exemplo 19 Conjugação de HA ou fragmentos de HA a vírus ou as partícu-las semelhantes a vírus CPMV in vitro

As partículas de VLP de CPMV quiméricas contendo o inserto deinfluenza são produzidas como descrito nos Exemplos 8-10 e então proces-sadas adicionalmente para conjugar a proteína HA, ou fragmentos da proteí-na HA ou mutantes da proteína HA, ou mutantes de fragmentos de HA pro-duzidos como descrito nos Exemplos 11-17 à proteína de revestimento deCPMV.

A proteína HA é ligada aos resíduos de cisteína expostos na su-perfície em CPMV ou seus mutantes. Isso é obtido pelo acoplamento oxida-tivo de tióis de cisteína em CPMV a grupos de tiol livres sobre a proteína napresença de CuSO4 a 1mM em acetato de sódio a 50mM, pH 4,8, com umarazão molar de 93 pM de proteína de revestimento de CPMV para 385 pMde HA. T A reação é incubada por 1-4 horas. Alternativamente, a proteínaHA é ligada à superfície da VLP de CPMV através de um método como des-crito em Gillitzer, et ai, Chemical modification of a viral cage for multivalentpresentation, Chem. Commun., 2002, 2390-2391 e Chatterji et ai, Chemicalconjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea Mosaic Virus.Bioconjugate Chem., 2004, Vol. 15, 807-813.

Partículas conjugadas são separadas de partículas não-conjugadas através de cromatografia de exclusão de tamanho usando umacoluna Superose 6 de 1 cm χ 30cm de GE Bioscience com uma fase móvelde NaPO4 a 0,1 M pH 7,00. Alternativamente, as partículas conjugadas sãoseparadas das proteínas ou fragmentos de proteína HA não-conjugadas a -través de precipitação com 4% de PEG NaCI a 0,2M seguida por ressuspen-são em Tris a 30mM, pH 7,50.

Exemplo 20 Imunização de camundongos com partículas de CCMV e CPMVquiméricas contendo o epítopo M2e

VLPs de CCMV contendo um inserto de peptídeo de influenza econjugadas a uma proteína HA são produzidas como descrito no Exemplo18 e administradas a camundongos Balb/c fêmeas. Camundongos Balb/c de7 semanas de idade são injetados intraperitonealmente com 100 μg purifica-dos da VLP de CCMV conjugado a HA uma vez a cada três semanas.

Para imunização intranasal, 100 μg da VLP de CCMV conjugadoa HA são administrados a camundongos anestesiados. Um volume total de100 μΙ é administrado em duas narinas (50 μΙ por cada narina). Aos camun-dongos de controle é dada uma VLP de CCMV com um inserto de peptídeonão relacionado, tal como antígeno protetor (PA) de antraz no mesmo es-quema de dosagem. Opcionalmente,aos camundongos de controle é dadoPBS, pH 7,0.

Amostras de soro, lavagens nasais e pulmonares, são obtidas 1dia antes da primeira administração e 2,semanas após cada uma das duasadministrações subseqüentes. Os camundongos imunizados são então es-timulados com 4000 PFU/camundongo de uma cepa de influenza vivo adap-tada para camundongo 2-3 semanas após a última imunização. Os camun-dongos são então observados quanto à sobrevivência. As amostras são en-tão processadas para títulos de Ac para determinar a resposta imune paraas proteínas de CCMV, HA, e M2e pelo ensaio de ELISA.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA<110> Dow Global Technologies, Inc.Rasochova, LadaDang, NghiepDao, PhilipPhelps, Jamie P.

Radam, Jason M.

<120> Vacina da Gripe Recombinantes Recombinant Flu Vaccine<130> 00588.105034 DOW 111<150> US 60/700,601<151> 2005-07-19<160> 49

<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 23<212> PRT

<213> Vírus Influenza<400> 1

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys1 5 10 15

Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp20

<210> 2<211> 23

<212> PRT '' ·"'

<213> Vírus Influenza<400> 2

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Glu Cys15 10 15

Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp20

<210> 3<211> 22<212> PRT

<213> Vírus Influenzá<400> 3

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Gly Cys Arg1 5 10 15

Cys Asn Asp Ser Ser Asp20

<210> 4<211> 23<212> PRT

<213> Vírus Influenza A<400> 4

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys1 5 10 15

Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp20

<210> 5<211> 23<212> PRT

<213> Vírus Influenza A<400> 5

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Lys Asn Glu Trp Glu Cys1 5 10 15

Arg <?ys Asn Asp -Ser Ser Asp20

<210> 6<211> .333<212> PRT

<213> Vírus Influenza A<400> 6

Gln Asn Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly1 5 10 15

His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp

20 25 30

Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser Ser Thr

35 40 45

Gly Arg Ile Cys Asp Ser Pro His Arg Ile Leu Asp Gly Lys Asn Cys

50 55 60

Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Gly Phe Gln65 70 75 80

Asn Glu Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Phe Ser Asn

85 90 95

Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val

100 105 110

Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Ile Asn Glu Gly Phe Asn Trp Thr

115 120 125

Gly Val Thr Gln Asn Gly Gly Ser Tyr Ala Cys Lys Arg Gly Pro Asp

130 135 140

Asn Gly Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Tyr Lys Ser Glu Ser Thr145 150 155 160

Tyr Pro Val Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Gly Asn Phe Asp Lys

165 170 175

Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Ser Thr Asp Lys Glu Gln Thr

180 185 190

Asn Leu Tyr Val Gln Ala Ser Gly Arg Val Thr Val Ser Thr Lys Arg

195 / ' 200 205

Ser Gln Gln Thr Ile Ile Pro Asn Val Gly Ser Arg Pro Trp Val Arg

210 215 220

Gly Leu Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly225 230 235 240

Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly

245 250 255

Tyr Phe Lys Ile Arg Thr Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala260 265 270

Pro Ile Gly Thr Cys Ser Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile

275 280 285

Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Lys Ile Thr Tyr Gly Ala

290 295 300

Cys Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met305 310 315 320

Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly325 330

<210> 7<211> 18<212> PRT

<213> Vírus Influenza A<400> 7

Ser Lys Ala Phe Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala1 5 10 15

Ser Leu

<210> 8<211> 498<212> PRT

<213> Vírus Influenza A<400> 8

Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr AspIr.' 5 10 15

Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Vai.Gly Lys Met

20 25 30

Ile Asp Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys

35 40 45

Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Leu Thr Ile Glu

50 55 60

Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu65 70 75 80

Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile

85 90 95

Tyr Lys Arg Val Asp Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu Val Leu Tyr Asp

100 105 HO

Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Asp Asp

115 120 125

Ala Thr Arg Gly Leu Thr His Met Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn

130 135 140

Asp Thr Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg.Thr Gly Met Asp145 150 155 160

Pro Arg Met Gys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser

165 170 175

Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Ile Gly Thr Met Val Met Glu

180 185 190

Leu Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg

195 200 205

Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ser Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn

210 215 220

Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Ala Met Met Asp225 230 235 240

Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp Leu

245 250 255

Ile Phe Ser Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His

260 2&5 270

Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Pro Ala Val Ala Ser Gly

275 280 285

Tyr Asp Phe Glu Lys Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe

290 295 300

Lys Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Tyr Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu305 310 315 320

Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala325 330 335

Ala Phe Glu Asp Leu Arg Leu Leu Ser Phe Ile Arg Gly Thr Lys Val

340 345 350

Ser Pro Arg Gly Lys Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn

355 360 365

Glu Asn Met Asp Thr Met Glu Ser Ser Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg

370 375 380

Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg385 390 395 400

Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg

405 410 415

Asn Leu Pro Phe Asp Lys Ser Thr Ile Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn

420 425 430

Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Ala Glu Ile Ile Arg Met Met

435 440 445

Glu Gly Ala Lys Pro Glu Glu Val Ser Phe Arg Gly Arg Gly Val Phe

450 455 460

Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Asn Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp465 470 475 480

Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr485 490 495

Asp Asn<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> Vírus Influenza A<400> 9

Arg Leu Ile Gln Asn Ser Leu Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser1 5 10 15

<210> 10<211> 12<212> PRT

<213> Vírus Influenza A<400> 10

Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly1 5 10

<210> 11<211> 190<212> PRT

<213> Vírus do Mosqueado Clorófico do Caupi (CCMV)<400> 11

Met Ser Thr Val Gly Thr Gly Lys Leu Thr Arg Ala Gln Arg Arg Ala1 5 10 15

Ala Ala Arg Lys Asn Lys Arg Asn Thr Arg Val Val Gln Pro Val Ile

20 25 30

Val Glu Pro Ile Ala Ser Gly Gln Gly Lys Ala Ile Lys Ala Trp Thr

35 40 45

Gly Tyr Ser Val Ser Lys Trp Thr Ala Ser Cys Ala Ala Ala Glu Ala

50 55 60

Lys Val Thr Ser Ala Ile Thr Ile Ser Leu Pro Asn Glu Leu Ser Ser65 70 75 80

Glu Arg Asn Lys Gln Leu Lys Val Gly Arg Val Leu Leu Trp Leu Gly

85 90 95

Leu Leu Pro Ser Val Ser Gly Thr Val Lys Ser Cys Val Thr Glu Thr

100 105 110

Gln Thr Thr Ala Ala Ala Ser Phe Gln Val Ala Leu Ala Val Ala Asp

115 120 125

Asn Ser Lys Asp Val Val Ala Ala Met Tyr Pro Glu Ala Phe Lys Gly

130 135 140

Ile Thr Leu Glu Gln Leu Thr Ala Asp Leu Thr Ile Tyr Leu Tyr Ser145 150 155 160

Ser Ala Ala Leu Thr Glu Gly Asp Val Ile Val His Leu Glu Val Glu165 170 175His Val Arg Pro Thr Phe Asp Asp Ser Phe Thr Pro Val Tyr180 185 190

<210> 12<211> 213<212> PRT

<213> Vírus do Mosaico do Caupi (CPMV)<400> 12

Gly Pro Val Cys Ala Glu Ala Ser Asp Val Tyr Ser Pro Cys Met Ile1 5 10 15

Ala Ser Thr Pro Pro Ala Pro Phe Ser Asp Val Thr Ala Val Thr Phe

20 25 30

Asp Leu Ile Asn Gly Lys Ile Thr Pro Val Gly Asp Asp Asn Trp Asn

35 40 45

Thr His Ile Tyr Asn Pro Pro Ile Met Asn Val Leu Arg Thr Ala Ala

50 55 60

Trp Lys Ser Gly Thr Ile His Val Gln Leu Asn Val Arg Gly Ala Gly65 70 75 80

Val Lys Arg Ala Asp Trp Asp Gly Gln Val Phe Val Tyr Leu Arg Gln

85 90 95

Ser Met Asn Pro Glu Ser Tyr Asp Ala Arg Thr Phe Val Ile Ser Gln

100 105 110

Pro Gly Ser Ala Met Leu Asn Phe Ser Phe Asp Ile Ile Gly Pro Asn

115 120 125

Ser Gly Phe Glu Phe Ala Glu Ser Pro Trp Ala Asn Gln Thr Thr Trp130 135 140

Tyr Leu Glu Cys Val Ala Thr Asn Pro Arg Gln Ile Gln Gln Phe Glu145 150 155 160

Val Asn Met Arg Phe Asp Pro Asn Phe Arg Val Ala Gly Asn Ile Leu

165 170 175

Met Pro Pro Phe Pro Leu Ser Thr Glu Thr Pro Pro Leu Leu Lys Phe

180 185 190

Arg Phe Arg Asp Ile Glu Arg Ser Lys Arg Ser Val Met Val Gly His195 200 205

Thr Ala Thr Ala Ala210<210> 13<211> 374<212> PRT

<213> Vírus do Mosqueado Clorófico do Caupi (CCMV)<400> 13

Met Glu Gln Asn Leu Phe Ala Leu Ser Leu Asp Asp Thr Ser Ser Val1 5 10 15

Arg Gly Ser Leu Leu Asp Thr Lys Phe Ala Gln Thr Arg Val Leu Leu

20 25 30

Ser Lys Ala Met Ala Gly Gly Asp Val Leu Leu Asp Glu Tyr Leu Tyr

35 40 45

Asp Val Val Asn Gly Gln Asp Phe Arg Ala Thr Val Ala Phe Leu Arg50 55 60

Thr His Val Ile Thr Gly Lys Ile Lys Val Thr Ala Thr Thr Asn Ile65 70 75 80

Ser Asp Asn Ser Gly Cys Cys Leu Met Leu Ala Ile Asn Ser Gly Val

85 90 95

Arg Gly Lys Tyr Ser Thr Asp Val Tyr Thr Ile Cys Ser Gln Asp Ser

100 105 110

Met Thr Trp Asn Pro Gly Cys Lys Lys Asn Phe Ser Phe Thr Phe Asn

115 120 125

Pro Asn Pro Cys Gly Asp Ser Trp Ser Ala Glu Met Ile Ser Arg Ser

130 135 140

Arg Val Arg Met Thr Val Ile Cys Val Ser Gly Trp Thr Leu Ser Pro145 150 155 160

Thr Thr Asp Val Ile Ala Lys Leu Asp Trp Ser Ile Val Asn Glu Lys

165 170 175

Cys Glu Pro Thr Ile Tyr His Leu Ala Asp Cys Gln Asn Trp Leu Pro180 185 190Leu Asn Arg Trp Met Gly Lys Leu Thr Phe Pro Gln Gly Val Thr Ser

195 200 205

Glu Val Arg Arg Met Pro Leu Ser Ile Gly Gly Gly Ala Gly Ala Thr

210 215 220

Gln Ala Phe Leu Ala Asn Met Pro Asn Ser Trp Ile Ser Met Trp Arg225 230 235 240

Tyr Phe Arg Gly Glu Leu His Phe Glu Val Thr Lys Met Ser Ser Pro

245 250 255

Tyr Ile Lys Ala Thr Val Thr Phe Leu Ile Ala Phe Gly Asn Leu Ser

260 265 270

Asp Ala Phe Gly Phe Tyr Glu Ser Phe Pro His Arg Ile Val Gln Phe

275 280 285

Ala Glu Val Glu Glu Lys Cys Thr Leu Val Phe Ser Gln Gln Glu Phe

290 295 300

Val Thr Ala Trp Ser Thr Gln Val Asn Pro Arg Thr Thr Leu Glu Ala305 310 315 320

Asp Gly Cys Pro Tyr Leu Tyr Ala Ile Ile His Asp Ser Thr Thr Gly

325 330 335

Thr Ile Ser Gly Asp Phe Asn Leu Gly Val Lys Leu Val Gly Ile Lys

340 345 350

Asp Phe Cys Gly Ile Gly Ser Asn Pro Gly Ile Asp Gly Ser Arg Leu

355 360 365

Leu Gly Ala Ile Ala Gln370

<210> 14 ,··

<211> 53<212> DNA

<213> Iniciador Sintético<400> 14

cggggatcct gtçactcttg acagaggtag aaacaccgat acgtaatgaa tgg<210> 15<211> 568<212> PRT

<213> Vírus Influenza A<400> 15

Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser1 5 10 15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val

20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

-35 40 45

Leu Glu.Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys

50 55 60

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn65 70 75 80

Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val

85 90 95

Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn

100 105 110

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu

115 120 125

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser

130 135 140

Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe145 150 155 160

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile

165 170 175

Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp

180 185 190

Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln

195 200 205

Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg

210 215 220

Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly225 230 235 240

Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn

245 250 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

260 265 270

Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly

275 280 285

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser

290 295 300

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys305 310 315 320

Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser

325 330 335

Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile

340 345 350

Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr

355 360 365

Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys

370 375 380

Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser385 390 395 400

Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe

405 410 415

Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp

420 425 430

Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met

435 440 445

Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe'His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu

450 455 460

Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly465 470 475 480

Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met GluSer Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala

Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly

Ile Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala

Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly

Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile

565

<210> 16<211> 1614<212> DNA<213> Vírus Influenza A<400> 16

àtggagaaga tagttctctt gtttgccatc gtcagtttgg tcaaatcaga tcagatttgt 60

ataggatacc atgcaaacaa cagtaccgaa caagttgaca caatcatgga gaagaatgta 120

acagtgactc acgcccagga cattcttgag aagacccaca atggcaagct ttgcgacttg 180

gatggtgtta agccactcat tcttcgtgat tgttctgtgg caggttggct tctcggaaac 240

ccaatgtgtg acgagttcat caacgttcca gagtggtctt acatcgtcga gaaggcaaac 300

cctgtgaatg atctttgcta cccaggagac ttcaacgact acgaggaatt gaaacatctc 360

ttgtctagga tcaaccactt tgagaagatt cagatcattc ctaagtcctc ttggtcttca 420

catgaggcaa gccttggtgt gtcatccgcc tgcccttatc aaggaaagtc atctttcttc 480

agaaatgttg tgtggcttat caagaagaac tctacatatc caaccatcaa -^aggagctac 540

aacaacacaa accaggaaga tctcttggtg ctctggggaa ttcatcatcc aaatgacgca 600

gcagagcaaa ctaagcttta ccagaaccct acaacttaca tctccgtggg cacttctaca 660

ctcaatcaga gacttgtgcc aaggattgct actaggtcaa aggttaacgg acaatcaggt 720

cgtatggagt tcttctggac aatcttgaag ccaaacgatg ccatcaactt cgagtcaaat 780

ggaaacttca tcgctccaga gtacgcttac aagattgtga agaaaggaga tagtaccatc 840

atgaagtctg aactcgagta cggaaactgc aacaccaagt gtcagactcc aatgggagct 900

atcaatagct ctatgccatt tcacaacatt caccctttga caataggaga atgccctaag 960tacgtgaaga gcaacaggct cgtcctcgca actggtttga gaaacagtcc acaaagagaa 1020cgtagacgta agaagagagg attgttcggt gcaattgccg ggttcatcga aggaggctgg 1080cagggtatgg tggatggttg gtatgggtat catcacagta atgagcaagg atcaggatat 1140gctgcagaca aagaaagcac ccagaaagca atagatggag tcactaacaa agtcaattcc 1200ataatcgaca agatgaacac acagttcgaa gctgttggac gtgagttcaa caaccttgag 1260aggaggattg agaatcttaa caagaagatg gaagatgggt tcttggacgt gtggacttac 1320aatgctgaat tgttagttct tatggagaac gaaagaactc tcgacttcca tgattctaacgtgaagaact tgtacgacaa ggtgcgtctt caacttcgtg ataacgctaa agagctcgggaacggttgct ttgagttcta tcacaagtgt gacaatgagt gcatggaatc tgttagaaat 1500ggaacttacg attaccctca gtattcagag gaggcaaggc tcaagagaga agagatctcc 1560ggcgtgaagt tggagagcat tggtatctac caacatcatc accatcacca ctaa 1614

<210> 17<211> 537<212> PRT<213> Vírus Xnfluenza A<400> 17

Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser1 5 10 15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln.Val

20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

35 40 45

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys50 55 60

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val'Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn65 70 75 80

Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val

85 90 95

Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn

100 105 110

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu115 120 125Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser

130 135 140

Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe145 150 155 160

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile

165 170 175

Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp

180 185 190

Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln

195 200 205

Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg

210 215 220

Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly225 230 235 240

Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn

245 250 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

260 265 270

Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly275 280 285

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser

290 295 300

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys305 310 315 320

Tyr Val Lys Ser Asn^Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser

325 330 335

Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Airg Gly Leu Phe Gly Ala Ile

340 345 350

Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr

355 360 365

Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys370 375 380Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser385 390 395 400

Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe

405 410 415

Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp

420 425 430

Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met

435 440 445

Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu

450 455 460

Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly465 470 475 480

Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu

485 490 495

Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala

500 505 510

Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly

515 520 525

Ile Tyr Gln His His His His His His

530 535

<210> 18<211> 352<212> PRT

<213> Vírus Influenza A<400> 18

Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser1 5 10 15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val

20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

35 40 45

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys50 55 60

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn65 70 75 80

Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val

85 90 95

Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn

100 105 HO

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu

115 120 125

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser

130 135 140

Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe145 150 155 160

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile

165 170 175

Lys Arg Ser Tyr Asn Ash Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp

180 185 190

Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln

195 200 205

Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg

210 215 220

Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly225 230 235 240

Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn

245 250 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

260 265 270

Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly

275 280 285

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser

290 295 300

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys305 310 315 320

Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser

325 330 335

Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg His His His His His His340 345 350

<210> 19<211> 1059<212> DNA

<213> Vírus Influenza A

<400> 19

atggagaaga tagttctctt gtttgccatc gtcagtttgg tcaaatcaga tcagatttgt 60ataggatacc atgcaaacaa cagtaccgaa caagttgaca caatcatgga gaagaatgta 120acagtgactc acgcccagga cattcttgag aagacccaca atggcaagct ttgcgacttg 180gatggtgtta agccactcat tcttcgtgat tgttctgtgg caggttggct tctcggaaac 240ccaatgtgtg acgagttcat caacgttcca gagtggtctt acatcgtcga gaaggcaaac 300cctgtgaatg atctttgcta cccaggagac ttcaacgact acgaggaatt gaaacatctc 360ttgtctagga tcaaccactt tgagaagatt cagatcattc ctaagtcctc ttggtcttca 420catgaggcaa gccttggtgt gtcatccgcc tgcccttatc aaggaaagtc atctttcttc 480agaaatgttg tgtggcttat caagaagaac tctacatatc caaccatcaa gaggagctac 540aacaacacaa accaggaaga tctcttggtg ctctggggaa ttcatcatcc aaatgacgca 600gcagagcaaa ctaagcttta ccagaaccct acaacttaca tctccgtggg cacttctaca 660ctcaatcaga gacttgtgcc aaggattgct actaggtcaa aggttaacgg acaatcaggt 720cgtatggagt tcttctggac aatcttgaag ccaaacgatg ccatcaactt cgagtcaaat 780ggaaacttca tcgctccaga gtacgcttac aagattgtga agaaaggaga tagtaccatc 840atgaagtctg aactcgagta cggaaactgc aacaccaagt gtcagactcc aatgggagct 900atcaatagct ctatgccatt tcacaacatt caccctttga caataggaga atgccctaag 960tacgtgaaga gcaacaggct cgtcctcgca actggtttga gaaacagtcc acaaagagaa 1020cgtagacgta agaagagaca tcatcaccat caccactaa 1059

<210> 20

<211> 207

<212> PRT

<213> Vírus Influenza A<400> 20

Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser1 5 10 15

Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly

20 25 30

Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser

35 40 45

Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val

50 55 60

Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu65 70 75 80

Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu

85 90 95

Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala

100 105 HO

Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp

115 120 125

Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp

130 135 140

Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys145 150 155 160

Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro

165 170 175

Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val

180 185 190

Lys Leu Glu Ser Ile Gly Ile Tyr Gln His His His His His His

195 200 205

<210> 21<211> 624<212> DNA

<213> Vírus Influenza A<400> 21atggagaaga tagttctctt gtttgccatc gtcagtttgg tcaaatcagg attgttcggt 60

gcaattgccg ggttcatcga aggaggctgg cagggtatgg tggatggttg gtatgggtat 120

catcacagta atgagcaagg atcaggatat gctgcagaca aagaaagcac ccagaaagca 180

atagatggag tcactaacaa agtcaattcc ataatcgaca agatgaacac acagttcgaa 240

gctgttggac gtgagttcaa caaccttgag aggaggattg agaatcttaa caagaagatg 300

gaagatgggt tcttggacgt gtggacttac aatgctgaat tgttagttct tatggagaac 360

gaaagaactc tcgacttçca tgattctaac gtgaagaact tgtacgacaa ggtgcgtctt 420

caacttcgtg ataacgctaa agagctcggg aacggttgct ttgagttcta tcacaagtgt 480

gacaatgagt gcatggaatc tgttagaaat ggaacttacg attaccctca gtattcagag 540

gaggcaaggc tcaagagaga agagatctcc ggcgtgaagt tggagagcat tggtatctac 600

caacatcatc accatcacca ctaa 624<210> 22<211> 22<212> PRT<213> Vírus Influenza<400> 22

<212> PRT

Cys Asn Gly Ser Ser Asp20<210> 23<211> 22<212> PRT

<213> Vírus Influenza A

<400> 23 ·

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Gly Cys Arg1 5 10 15

Cys Asn Gly Ser Ser Asp20

<210> 24<211> 22<213> Virus Influenza A<400> 24

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Lys Asn Glu Glu Cys Arg1 5 10 15

Cys Asn Asp Ser Ser Asp20

<210> 25<211> 565<212> PRT

<213> Vírus Influenza A<400> 25

Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Alá Ile Val Ser Leu Val Lys Ser1 5 10 15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val

20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

35 40 45

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys

50 55 60

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn65 70 75 80

Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val

85 90 95

Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asp

100 105 110

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu

115 120 125

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser

130 135 140

Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe145 150 155 160

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile165 170 175

Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Met Trp

180 185 190

Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln

195 200 205

Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg

210 215 220

Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly225 230 235 240

Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn

245 250 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

260 265 270

Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly

275 280 285

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser

290 295 300

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys305 310 315 320

Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser

325 330 335

Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile

340 345 350

Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr

355 360 365

Gly Tyr His His Ser Asn Glu.Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys

370 375 380

Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser385 390 395 400

Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe

405 410 415

Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp420 425 430

Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met

435 440 445

Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu450 455 460

Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly465 470 475 480

Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu485 490 495

Ser Vai Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala500 505 510

Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly

515 520 525

Ile Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala530 535 540

Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly545 550 555 560

Ser Leu Gln Cys Arg565

<210> 26

<211> 1732<212> DNA

<213> Vírus Influenza A<400> 26

ggactagtag gaggtaactt atggagaaaa tcgtcotgtt gtttgccatt gtctccctgg 60· tgaagagcga ccagatttgc atcggctatc acgcgaacaa ttccaccgaa caagtggata 120 cgatcatgga gaagaatgtg accgtcaccc acgctcagga tattctggag aagacgcata 180 acgggaaact ctgtgacttg gatggggtta agccgctgat tctgcgcgat tgttcggtgg 240 ccggctggct gctgggcaac ccaatgtgcg atgaatttat caacgtgccc gagtggagct 300 acattgtcga gaaggccaat cccgttaacg acttgtgcta ccctggtgat ttcgacgact 360 acgaagaact gaagcacctg ttgtcccgca ttaatcactt cgagaaaatc cagatcatcc 420 cgaaatcgag ctggagcagc catgaagcct cgctcggtgt gagttccgcc tgtccgtacc 480agggcaagtc gtccttcttc cgtaacgtgg tgtggctgat taagaagaac tccacttacc 540

600660

10201080

13801440

cgaccattaa gcggagctac aacaacacca accaagaaga cttgttggtg atgtggggtatccatcaccc caacgacgcc gccgagcaaa ccaaactgta ccagaatcct acgacttaçatctcggtcgg caccagcacc ctgaaccaac gcttggttcc gcgcatcgcg actcgcagca 720aagtcaacgg ccagagtggg cgtatggaat tcttttggac catcctgaag ccaaacgatg 780cgatcaactt cgaatcgaat ggcaacttca ttgccccgga atacgcctac aagatcgtga 840agaaagggga ctcgaccatc atgaagtcgg agctggaata cggcaactgc aacacgaaat 900gccagacgcc gatgggcgcc atcaactcca gcatgcçgtt tcataacatt cacccattga 960ctatcggcga atgcccgaaa tacgtcaagt ccaatcgtct ggtcctggcg accggtctgcgcaacagccc gcagcgcgaa cgtcgccgta agaaacgggg cctgttcggt gccatcgctg

gcttcatcga gggcggctgg cagggcatgg tcgacggctg gtatggctac catcacagca 1140acgagcaggg cagtggttac gccgctgaca aggaaagcac ccaaaaggcc atcgacggcg 1200tgacgaacaa ggtgaactcc attatcgaca agatgaacac gcagttcgaa gccgtcggcc 1260gtgagttcaa caacctggaa cgccgcatcg aaaacttgaa caagaagatg gaagacggtt 1320tcttggacgt ctggacctat aatgcggaat tgctggttct gatggaaaac gaacgcaccctggactttca tgactcgaac gtgaagaacc tgtatgataa agtccgtctg cagctgcgcgacaacgccaa ggaactgggt aacggctgct ttgaatttta ccataaatgt gacaatgagt 1500gcatggaaag tgtgcgcaac ggcacctatg attatccgca gtacagtgaa gaggcacgtc 1560tgaagcgtga ggaaattagc ggcgttaaat tggagagcat cgggatctat cagatcctca 1620gcatctacag caccgtggcc agcagcttgg ccctggccat catggtcgct ggcctctcgc 1680tgtggatgtg cagcaacggt tcçctgcagt gccgctgata atagctcgag tt 1732

<210> 27<211> 1732<212> DNA<213> Vírus Influenz-a A<400> 27

ggactagtag gaggtaactt atggaaaaga ttgtgctgtt gttcgccatc gtgagtctggtgaaatcgga ccaaatctgc atcggctacc acgctaataa cagcaccgaa caagtcgacaccatcatgga gaagaacgtc actgtgacgc atgcccaaga tatcttggaa aagacccata 180acggcaagct gtgcgacctg gacggtgtga agccgttgat cctgcgcgac tgctccgtcg 240cgggttggct gttgggcaac ccgatgtgcg atgagttcat taacgtcccg gaatggagct 300atatcgtcga gaaggcgaat cccgtcaacg acctgtgtta ccctggcgat ttcgatgatt 360

60120acgaagagct gaaacatctg ctgagccgcacgaagagcag ttggagcagc cacgaagcctaggggaagtc gtcctttttc cgcaacgtggctactatcaa gcgcagttac aacaacactattcatcatcc caacgacgcg gccgagcagatcagcgtggg gacgtccacc ctcaatcagcaggtgaacgg gcagtcgggc cggatggagtcaatcaactt cgagtcgaat ggtaacttcaaaaagggcga ctcgactatc atgaagagcggtcaaacccc gatgggcgca atcaacagctccattggtga gtgcccgaag tacgtcaaatgtaactcgcc gcagcgggaa cgtcgccgtaggttcatcga gggcggctgg cagggcatggacgaacaagg cagcggctac gcggcggatatcaccaacaa agtgaacagc atcatcgatagtgagttcaa caacctcgaa cggcgcatcgtcctggatgt ctggacctat aatgccgagctggactttca cgattcgaat gtgaagaatcacaacgcgaa agagctgggc aacggctgttgtatggagtc cgtgcgcaac ggcacgtatgtgaaacgtga agaaatcagc ggcgtgaagcgcatctatag caccgtggcg tcgtcgctggtgtggatgtg cagcaacggc tcgctgcaat<210> 28<211> 1732

<212> DNA

<213> Vírus Influenza A<400> 28

ggactagtag gaggtaactt atggagaaaatgaagagcga ccagatttgc atcggctatccgatcatgga gaagaatgtg accgtcacccacgggaaact ctgtgacttg gatggggtta

tcaaccactt cgagaagatc caaatcatcc 420ccctgggcgt ttcgtcggcc tgcccctatc 480tctggctgat caaaaagaac agtacctatc 540accaagaaga cctgttggtc atgtggggca 600ccaagttgta ccagaacccg accacgtata 660gtctggtgcc gcgcatcgcg acccgtagca 720tcttttggac tatcctgaag ccgaacgacg 780ttgccccaga gtatgcttac aagatcgtga 840aactggagta cgggaactgt aacaccaaat 900cgatgccctt ccataatatc catccgctga 960

cgaaccggtt ggtgctggcc actggcctcc 1020

agaaacgcgg tttgttcggc gccattgcag 1080

tcgatggttg gtacgggtac caccactcca 1140

aagaaagtaç ccagaaggct atcgacggcg 1200

agatgaacac gcagttcgaa gccgtgggcc 1260

agaacctgaa caaaaagatg gaagatggct 1320

tgctggtgct gatggaaaac gagcgtaccc 1380

tgtacgacaa agtccggttg cagctgcgcg 1440

tcgagttcta ccataagtgc gacaacgagt 1500

attatcctca gtattccgaa gaggcccgct 1560

tggagagcat cggcatctat caaatcttga 1620

ccctcgcgat catggttgcc ggcctgagcc 1680

gccgctgata atagctcgag tt 1732

tcgtcctgtt gtttgccatt gtctccctgg 60

acgcgaacaa ttccaccgaa caagtggata 120

acgctcagga tattctggag aagacgcata 180

agccgctgat tctgcgçgat tgttcggtgg 240ccggctggct gctgggcaac ccaatgtgcg atgaatttat caacgtgccc gagtggagct 300

acattgtcga gaaggccaat cccgttaacg acttgtgcta ccctggtgat ttcgacgact 360

acgaagaact gaagcacctg ttgtcccgca ttaatcactt cgagaaaatc cagatcatcc 420

cgaaatcgag ctggagcagc catgaagcct cgctcggtgt gagttccgcc tgtccgtacc 480

agggcaagtc gtccttcttc cgtaacgtgg tgtggctgat taagaagaac tccacttacc 540

cgaccattaa gcggagctac aacaacacca accaagaaga cttgttggtg atgtggggta 600

tccatcaccc caacgacgcc gccgagcaaa ccaaactgta ccagaatcct acgacttaca 660

tctcggtcgg caccagcacc ctgaaccaac gcttggttcc gcgcatcgcg actcgcagca 720

aagtcaacgg ccagagtggg cgtatggaat tcttttggac catcctgaag ccaaacgatg 780

cgatcaactt cgaatcgaat ggcaacttca ttgccccgga atacgcctac aagatcgtga 840

agaaagggga ctcgaccatc atgaagtcgg agctggaata cggcaactgc aacacgaaat 900

gccagacgcc gatgggcgcc atcaactcca gcatgccgtt tcataacatt cacccattga 960

ctatcggcga atgcccgaaa tacgtcaagt ccaatcgtct ggtcctggcg accggtctgc 1020

gcaacagccc gcagcgcgaa cgtcgccgta agaaacgggg cctgttcggt gccatcgctg 1080

gcttcatcga gggcggctgg cagggcatgg tcgacggctg gtatggctac catcacagca 1140

acgagcaggg cagtggttac gccgctgaca aggaaagcac ccaaaaggcc atcgacggcg 12 00

tgacgaacaa ggtgaactcc attatcgaca agatgaacac gcagttcgaa gccgtcggcc 1260

gtgagttcaa caacctggaa cgccgcatcg aaaacttgaa caagaagatg gaagacggtt 1320

tcttggacgt ctggacctat aatgcggaat tgctggttct gatggaaaac gaacgcaccc 1380

tggactttca tgactcgaac gtgaagaacc tgtatgataa agtccgtctg cagctgcgcg 1440

acaacgccaa ggaactgggt aacggctgct ttgaatttta ccataaatgt gacaatgagt 1500

gcatggaaag tgtgcgcaac ggcacctatg attatccgca gtacagtgaa gaggcacgtc 1560

tgaagcgtga ggaaattagc ggcgttaaat tggagagcat cgggatctat cagatcctca 1620

gcatctacag caccgtggcc agcagcttgg ccctggccat catggtcgct ggcctctcgc 1680

tgtggatgtg cagcaacggt tccctgcagt gccgctgata atagctcgag tt 1732<210> 29<211> 515<212> PRT

<213> Vírus Influenza A

<400> 29

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln ValAsp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

20 25 30

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys

35 40 45

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn

50 55 60

Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val65 70 75 80

Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asp

85 90 95

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu

100 105 110

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser

115 120 125

Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe

130 135 140

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile145 150 155 160

Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Met Trp

165 170 175

Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln

180 185 190

Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg

195 200 205

Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly

210 215 220

Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asri Asp Ala Ile Asn225 230 235 240

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

245 250 255

Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly260 265 270Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser

275 280 285

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys

290 295 300

Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser305 310 315 320

Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile

325 330 335

Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr

340 345 350

Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys

355 360 365

Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser

370 375 380

Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe385 390 395 400

Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp

405 410 415

Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met

420 425 430

Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu

435 440 445

Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly

450 455 460

Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His^Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu ·<"465 470 475 480

Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala

485 490 495

Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly500 505 510

Ile Tyr Gln515<210> 30

<211> 54

<212> DNA

<213> Iniciador Sintético

<400> 30

cgcaggatcc eatetgaaga atcattacaa cgacágcccc attcattacg tate

<210> 31

<211> 53

<212> DNA

<213> Iniciador Sintético

<400> 31

cggggatcct gtcactcttg acagaggtag aaacaccgat acgtaatgaa tgg<210><211><212>

<213><400>

cgcaggatcc eatetgaaga gccattacaa cgacattccc attcattacg 50

<210> 33<211> 54

<212> DNA

<213> Iniciador Sintético<400> 33

gatcctgcgc ctgatccaga acagcetgac catcgaacgc atggtgctga gcgg 54

<210> 34

<211> 54

<212> DNA

<213> Iniciador Sintético

<400> 34

gatcccgctc agcaccatgc gttcgatggt caggctgttc tggatcaggc geag 54

<210> 35

<211> 45

3250DNA

Iniciador Sintético32<212> DNA

<213> Iniciador Sintético<400> 35

gatcctgacc taccagcgca cccgcgctct ggtgcgcacc ggcgg 45

<210> 36

<211> 45

<212> DNA

<213> Iniciador Sintético

<400> 36

gatcccgccg gtgcgcacca gagcgcgggt gcgctggtag gtcag 45

<210> 37

<211> 63

<212> DNA

<213> Iniciador Sintético

<400> 37

gatcctgagc aaggctttca gcaactgcta cccgtacgac gtgccggact acgctagcct 60

ggg 63

<210> 38

<211> 63

<212> DNA

<213> Iniciador Sintético

<400> 38

gatccccagg ctagcgtagt ccggcacgtc gtacgggtag cagttgctga aagccttgct 60

cag 63

<210> 39

<211> 69<212> DNA

<213> Iniciador Sintético<400> 39

atggatagct agcactcctc ctgctagtct gctgaccgaa gtggaaaccc cgattcgcaa 60

cgaaggctg 69

<210> 40<211> 64<212> DNA

<213> Iniciador Sintético<400> 40

tgcctgtgac gtctgaaaat ggatcgctgc tatcgttgca gcggcagcct tcgttgcgaa 60tcgg 64

<210> 41<211> 30<212> DNA<213> Iniciador Sintético<400> 41

gcgcgatatc aacaatggag aagatagttc 30

<210> 42<211> 46<212> DNA

<213> Iniciador Sintético<400> 42

gcgctccgga tttagtggtg atggtgatga tgtctcttct tacgtc 46

<210> 43

<211> 70

<212> DNA

<213> Inieiador Sintético<400> 43

gcgatatcaa caatggagaa gatagttctc ttgtttgeea tegtcagttt ggtcaaatca 60

ggattgttcg 70

<210> 44<211> 44<212> DNA

<213> Inieiador Sintético<400> 44

gcgctccgga tttagtggtg atggtgatga tgttggtaga tacc 44

<210> 45<211> 41<212> DNA

<213> Iniciador Sintético<400> 45

ggactagtag gaggtaactt atgaaactga aacgtttgat g<210> 46<211> 39<212> DNA

<213> Iniciador Sintético<400> 46

gtgatagccg atgcaaatct ggtcggccac cgcgttggc<210> 47<211> 39<212> DNA

<213> Iniciador Sintético<400> 47

gccaacgcgg tggccgacca gatttgcatc ggctatcac<210> 48<211> 37<212> DNA

<213> Iniciador Sintético<400> 48

ccgctcgagt cattactgat agatcccgat gctctcc<210><211><212><213><400>

ggactagtag gaggtaactt atgaaactga aacgtttgat g

4941DNA

Iniciador Sintético49

Claims

1. Método de produzir uma composição para uso como uma va-cina de influenza em um ser humano ou em um animal compreendendo:i) fornecer um primeiro ácido nucléico que codifica um peptídeode fusão de capsídeo recombinante, o peptídeo de fusão de capsídeo com-preendendo uma proteína de capsídeo de vírus de plantai fundida a um pep-tídeo viral de influenza, e expressar o peptídeo de fusão de capsídeo emuma célula hospedeira;ii) montar o peptídeo de fusão de capsídeo para formar um vírusou uma partícula semelhante a vírus;iii) fornecer pelo menos um segundo ácido nucléico que codificapelo menos uma proteína ou um fragmento de proteína antigênica derivadade uma cepa de vírus influenza, e expressar a proteína ou fragmento de pro-teína antigênica em uma célula hospedeira;iv) isolar e purificar a proteína ou fragmento de proteína antigê-nica; ev) combinar o vírus ou a partícula semelhante a vírus e a proteí-na ou fragmento de proteína antigênica para formar uma composição capazde administração a um ser humano ou animal.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a proteínaouo fragmento de proteína antigênica é conjugado ao vírus ou a partículasemelhante a vírus.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a proteínaou o fragmento de proteína antigênica isolada é derivado de uma cepa deinfluenza recentemente emergente.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o peptídeode fusão de capsídeo compreende um peptídeo viral de influenza derivadode um peptídeo viral de influenza conservado.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o peptídeoviral de influenza conservado é derivado de um peptídeo M2 de influenza.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que o peptídeoM2 é selecionado a partir do grupo que consiste em Seq. ID. NO. 1-5 e 22-- 24.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o peptídeoM2 é selecionado a partir do grupo que consiste em Seq. ID. NO. 3, 22, 23, e 24.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a proteínade capsídeo de vírus de planta é derivada de um vírus de planta CCMV ouCPMV.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a proteínade capsídeo de vírus de planta é selecionada a partir do grupo que consisteem Seq. ID. NO. 11-13.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o vírus oua partícula semelhante a vírus não contém proteínas da membrana plasmá-tica ou parede celular da célula hospedeira.

11. Composição compreendendo:i) um peptídeo de fusão de capsídeo recombinante, o peptídeode fusão de capsídeo compreendendo uma proteína de capsídeo de vírus deplanta fundida a um peptídeo viral de influenza, em que o peptídeo de fusãode capsídeo monta para formar um vírus ou a partícula semelhante a vírus, eii) pelo menos uma proteína ou um fragmento de proteína anti-gênica isolada derivada de um vírus influenza.

12. Composição de acordo com a reivindicação 11, em que aproteína ou fragmento de proteína antigênica isolada é conjugado ao vírusou a partícula semelhante a vírus.

13. Composição de acordo com a reivindicação 11, em que aproteína ou fragmento de proteína antigênica isolada é derivado de uma ce-pa de influenza recentemente emergente.

14. Composição de acordo com a reivindicação 11, em que opeptídeo de fusão de capsídeo compreende um peptídeo viral de influenzaderivado de um peptídeo viral de influenza conservado.

15. Composição de acordo com a reivindicação 14, em que opeptídeo viral de influenza conservado é derivado de um peptídeo M2 deinfluenza.

16. Composição de acordo com a reivindicação 15, em que opeptídeo M2 é selecionado a partir do grupo que consiste em Seq. ID.NO. 1-5 e 22-24.

17. Composição de acordo com a reivindicação 16, em que opeptídeo M2 é selecionado a partir do grupo que consiste em Seq. ID. NO. 3, 22, 23, e 24.

18. Composição de acordo com a reivindicação 11, em que aproteína de capsídeo de vírus de planta é derivada de um vírus de plantaCCMV ou CPMV.

19. Composição de acordo com a reivindicação 18, em que aproteína de capsídeo de vírus de planta é selecionada a partir do grupo queconsiste em Seq. ID. NO. 11-13.

20. Composição de acordo com a reivindicação 11, em que ovírus ou a partícula semelhante a vírus não contém proteínas da membranaplasmática ou parede celular da célula hospedeira.

21. Composição de acordo com a reivindicação 11, em que acomposição ainda compreende uma molécula imunoestimulante.

22. Composição de acordo com a reivindicação 21, em que amolécula imunoestimulante compreende uma seqüência CpG.

23.

Seqüência de peptídeo selecionada a partir do grupo queconsiste em Seq. ID. NO. 3, 22, 23, e 24.