JP2009502789A - 組み換えインフルエンザワクチン - Google Patents
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Abstract
本発明は、インフルエンザウイルスに対するワクチンとして使用される組成物、及び、そのような組成物を作製する迅速な方法を提供する。本発明の組成物は、i)組み換えカプシド融合ペプチドを形成する植物ウイルス由来のカプシドタンパク質に融合させる、インフルエンザウイルスに由来する少なくとも1つペプチドと、ii)ヒトインフルエンザウイルス又はトリインフルエンザウイルスに由来する少なくとも1つの単離された抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントとを含む。ヒトインフルエンザウイルス又はトリインフルエンザウイルスに由来する少なくとも1つの単離された抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントは組み換えカプシド融合ペプチドの表面にコンジュゲートすることができる。
Description
関連出願に対する相互参照
本出願は米国仮特許出願第60/700,601号(2005年7月19日出願)の優先権を主張する。
本出願は米国仮特許出願第60/700,601号(2005年7月19日出願)の優先権を主張する。
本発明は、ヒトインフルエンザウイルス及び/又はトリインフルエンザウイルスの抗原ペプチドに遺伝子融合した真核生物細胞又は原核生物細胞に由来するウイルスカプシドタンパク質を含有するキメラなウイルス様粒子キャリアを含む、アジュバントと一緒にされる、ヒトインフルエンザウイルス又はトリインフルエンザウイルスに由来する単離された抗原性のインフルエンザタンパク質又はインフルエンザタンパク質フラグメントを利用する多価インフルエンザウイルスワクチンの製造及び組み立てに関連する。本発明はまた、インフルエンザタンパク質に由来する新規な抗原ペプチド、及び、そのようなペプチドを含有する組成物に関連する。
連続したワクチン接種は、動物及びヒトを病原因子による感染症から保護するための最も効果的かつ効率的な方法の1つである。一般に、ワクチンは、ワクチンに含有される抗原性のタンパク質、ペプチド又は他の免疫原性構造体に対する宿主の免疫応答を誘発し、従って、宿主が病原因子にさらされたとき、感染の成功の可能性を低下させることによって、病原因子からの感染防護免疫を提供するように設計される。
インフルエンザウイルスは、オルソミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)に属するウイルスであり、そのコアタンパク質によって分類される3つのサブタイプを含む(これらは、A型インフルエンザ、B型インフルエンザ及びC型インフルエンザと呼ばれる)。A型インフルエンザウイルスは様々な哺乳動物種及び鳥類種に感染し、これに対して、B型及びC型は本質的にはヒト感染に限定される。A型インフルエンザウイルスは一般に、毎年の流行及び時々の世界的大流行の原因であり、これに対して、B型インフルエンザウイルスは2年〜4年毎に大流行を引き起こし、しかし、一般には世界的大流行には関連しない。ウイルス株は、起源の宿主生物種、地理的位置、単離年、通し番号に従って分類されるが、A型インフルエンザについては、赤血球凝集素及びノイラミニダーゼのサブタイプの血清学的性質によって分類される。
インフルエンザウイルスは、下記の9個のタンパク質から本質的には構成されるセグメント化されたマイナス鎖RNAウイルスである。マトリックス(M1);プロトンイオンチャネル(M2);赤血球凝集素(HA)、ノイラミニダーゼ(NA);核タンパク質(NP);ポリメラーゼ塩基性タンパク質1(PB1);ポリメラーゼ塩基性タンパク質2(PB2);ポリメラーゼ酸性タンパク質(PA);及び非構造タンパク質2(NP2)。HAタンパク質、NAタンパク質、M1タンパク質及びM2タンパク質は膜会合型タンパク質であり、HAタンパク質及びNAタンパク質は、ウイルスが宿主細胞に付着し、進入することにそれぞれ関わる糖タンパク質である。赤血球凝集素抗原の15のクラス(これらはH1〜H15として分類される)及びノイラミニダーゼ抗原の9のクラス(これらはN1〜N9として分類される)がA型インフルエンザウイルスにおいて分類されている。
HAタンパク質は、シアル酸を含有する宿主細胞表面の受容体に結合することによって細胞へのウイルス付着を初期化する。ヒトインフルエンザウイルスの赤血球凝集素は、α2,6-ガラクトース結合を含有するシアル酸受容体に優先的に結合し、これに対して、トリインフルエンザウイルスは、α2,3-ガラクトース結合を含有する細胞に優先的に結合する。これらの結合優先性は、シアル酸α2,6-ガラクトース結合がヒトの上皮細胞では優勢であり、α2,3-ガラクトース結合が鳥の腸上皮細胞では優勢であることと相関する。例えば、Rogers GN、Paulson JC、Daniels RS、Skehel JJ、Wilson IA、Wiley DC (1983) 「Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity」, Nature 304:76-78;Connor RJ, Kawaoka Y、Webster RG, Paulson JC (1994) 「Receptor specificity in human, avian and equine H2 and H3 influenza virus isolates」, Virology 205:17-23;Ito T、Suzuki Y、Mitnaul L, Vines A、Kida H、Kawaoka Y (1997) 「Receptor specificity of influenza A viruses correlate with agglutination of erythrocytes from different animal species」, Virology 227:492-99を参照のこと。受容体結合特異性に関わる分子的機構は十分には明らかにされていないが、鳥起源のインフルエンザの赤血球凝集素は、ヒトからヒトへの持続した伝播が可能であるインフルエンザ株を生じさせるために、ヒト受容体に結合する特異性を獲得するに違いないと考えられている。例えば、Stephenson I, KG Nicholson, JM Wood, MC Zambon and JM Katz (2004) 「Confronting the avian influenza threat: vaccine development for a potential pandemic」, The Lancet Infectious Diseases 4:499-509を参照のこと。部位特異的変異誘発による研究では、僅かに1つ又は2つのアミノ酸変異がこの変化のために要求されるにすぎないことが示されている。Matrosovich M, Tuzikov A, Bovin N et al. (2000) 「Early alterations of the receptor binding properties of the H1, H2 and H3 avian influenza virus hemagglutinins after their introduction into mammals」, J Virol 74:8502-12を参照のこと。
付着が起こると、NAタンパク質は受容体媒介によるエンドサイトーシス開始させ、その後、宿主細胞/ウイルスの膜融合を開始させる。その後、HAタンパク質はエンドソームの酸性環境での立体配座の変化を受け、M2タンパク質とともに、ヌクレオカプシドと会合したリボ核タンパク質(RNP)からのM1タンパク質の放出を媒介する。M1タンパク質は、その後、ウイルスRNA合成のために細胞の核に向かう。
M2タンパク質は、アミノ酸が97個の非グリコシル化膜貫通タンパク質である。Lamb RA、Lai C-J, Choppin PW (1981) 「Sequences of mRNAs derived from genome RNA segment 7 of influenza virus: collinear and interrupted mRNAs code for overlapping proteins」、PNAS 78:4170-4;Lamb RA, Zebedee SL, Richardson CD (1985) 「Influenza virus M2 protein is an integral membrane protein expressed on the infected-cell surface」, Cell 40:627-33。M2タンパク質はウイルス粒子のウイルス膜においてホモ四量体を形成し、しかし、HA及びNAと比較されたときには比較的少ない数である。しかしながら、このホモ四量体は感染細胞の原形質膜には高密度で存在する。Zebedee SL, Lamb RA (1988) 「Influenza A virus M2 protein: monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2 in virions」, J Virol 62:2762-72。
M2タンパク質は、融合後のウイルス膜からのRNP複合体の放出を容易にすると考えられる。M2タンパク質は、ウイルスの膜貫通タンパク質がERから原形質膜に送り出されているときに輸送小胞内のpHを低下させるプロトン輸送活性を示し、これにより、HAにおける早すぎる酸誘導による立体配座変化を防止する。Mozdzanowska K et al. (2003) 「Induction of influenza type A virus specific resistance by immunization of mice with a synthetic multiple antigenic peptide vaccine that contains ectodomains of matrix protein 2」, Vaccine 21:2616-2626;Steinhauer DA, Wharton SA, Skehel JJ, Wiley DC, Hay AJ (1991) 「Amantadine selection of a mutant influenza virus containing an acid-stable hemagglutinin glycoprotein: evidence for virus-specific regulation of the pH of glycoprotein transport vesicles」, Proc Natl Acad Sci 88:11525-9;Pinto LH, Holsinger LJ, Lamb RA (1992) 「Influenza virus M2 protein has ion channel activity」, Cell 69:517-28;Zhirnov OP (1990) 「Solubilization of matrix protein Ml/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses」, Virology 176:274-9を参照のこと。
M2タンパク質は、ヒトへの感染能を有するA型インフルエンザウイルスの間で高度に保存される長さが23アミノ酸の細胞外ドメイン(M2e)を含有する。実際、9個のN末端アミノ酸がウイルスの感染性ヒト株の間では完全に保存され、ほんの僅かな程度の構造的多様性が最初の15個のN末端アミノ酸において示されるだけである。Zebedee SL、Lamb RA (1988) 「Influenza A virus M2 protein: monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2 in virions」, J Virol 62:2762-72;Ito T, Gorman OT, Kawaoka Y, Bean WJ, Webster RG (1991) 「Evolutionary analysis of the influenza A virus M gene with comparison of the M l and M2 proteins」, J. Virol. 65:5481-8。
一般に、トリインフルエンザウイルスはヒトでの効率的な複製ができない。Beare AS, Webster RG (1991) 「Replication of avian influenza viruses in humans」, Arch Virol 119:37-42。しかしながら、トリインフルエンザウイルスのいくつかのサブタイプがヒトの気道内で複製し得ることが公知である。トリインフルエンザウイルスがヒトに伝播する事例が数多く確認されている。Stephenson I, KG Nicholson, JM Wood, MC Zambon及びJM Katz (2004) 「Confronting the avian influenza threat: vaccine development for a potential pandemic」, The Lancet Infectious Diseases 4:499-509;WHO disease alert (2004) "Confirmed human cases of avian influenza H5N1」, http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/en/;Hien TT、Liem NT、Dung NT他(2004) 「Avian influenza (H5N1) in 10 patients in Vietnam」, N Engl J Med 350:1179-88を参照のこと。いくつかのタイプのトリインフルエンザウイルスがヒトへの感染能を有することは、トリ/ヒトの再集合体ウイルスが出現するための環境をもたらし得る種のプールを増大させる。
一般に、2つのタイプのインフルエンザワクチンが存在する(不活化された完全インフルエンザウイルスワクチン及び不活化されたサブビリオンウイルスワクチン)。完全ウイルスワクチンは無傷の不活化されたビリオンを含有し、一方、サブビリオンワクチンは、ウイルスの構造タンパク質の大半と、ウイルスのエンベロープタンパク質の一部とを含有する。これらのウイルスワクチンは、特定のインフルエンザシーズンについてヒト集団の間で流行することが予測されるA型インフルエンザ株及びB型インフルエンザ株の三価混合物から毎年、構成される。WHOは、抗原性がよく一致したワクチンを提供するために、広く流行しているサブタイプに依存して、ワクチン組成を年に2回検討し、抗原性の中身を更新する。例えば、2004年〜2005年のインフルエンザシーズンについては、三価組成物は、A/New Caledonia/20/99(HINl)と、A/Wyoming/03/2003(H3N2)(これはA/Fujian/411/2002様ウイルスである)と、B/Shanghai/361/2002様ウイルス(すなわち、B/Jiangsu/10/2003又はB/Jilin/20/2003)とを含んでいた。そのようなワクチンの例には、Fluzone(Connaught)、Fluvirin(Chiron)及びFlu−Shield(Wyeth−Lederle)が含まれる。近年、MedImmuneが、合衆国における市販用途についてFDAから承認を受けている鼻腔内送達用の弱毒化された生インフルエンザワクチン(FluMist)を開発している。これらのワクチンは一般には、株に特異的な体液性応答を生じさせ、抗原性がずれたウイルスに対しては低下した効力を有し、関連性がない株に対しては効果がない。Stephenson I, Nicholson KG, Wood JM, Zambon MC and Katz JM (2004) 「Confronting the avian influenza threat: vaccine development for a potential pandemic」, The Lancet: Infectious Diseases 4:499-509を参照のこと。
上記で記載されたワクチン接種で利用される不活化ウイルス及び弱毒化ウイルスはニワトリ孵化卵の尿膜腔において製造される。この製造方法は時間がかかり、製造に6ヶ月までを要し、また、汚染を非常に受けやすい傾向がある。2004年には、Chironによるインフルエンザウイルスの製造における汚染が、インフルエンザワクチンの非常に知れわたった、また、議論を呼んだ不足をもたらした。汚染が2004年の8月に発見されたが、これは、製造者がそのシーズンのためのワクチンの新しいバッチを作製するためには遅すぎた。加えて、現行の製造方法では、インフルエンザシーズンの期間中に出現する可能性が最も高い特定の株を予想することが要求される。そのような要求は、現行の製造方法と併せて、予想外のウイルス株を標的とするためにインフルエンザワクチンの製造を変更し得ることを制限する。
従って、迅速に製造することができ、かつ、新しく出現したウイルスに対するワクチン接種を可能にするために容易に変更することができる改善されたワクチンが求められている。
本発明は、ウイルスに対するワクチンとして使用される組成物、具体的には、i)ウイルス粒子又はウイルス様粒子を形成するために会合することができる組み換えカプシド融合ペプチドを形成する植物ウイルス由来の少なくとも1つのカプシドタンパク質に融合したインフルエンザウイルス由来の少なくとも1つのペプチドと、ii)ヒトインフルエンザウイルス又はトリインフルエンザウイルスに由来する少なくとも1つの単離された抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントとを含む、インフルエンザウイルスに対するワクチンとして使用される組成物を提供する。そのような方策では、ヒトインフルエンザウイルス及び/又はトリインフルエンザウイルスに対してのより広い感染防護免疫を提供することができるワクチンを製造に、抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントとの組合せでのウイルス粒子又はウイルス様粒子の免疫原性の側面が利用される。
本発明の1つの態様において、植物カプシドタンパク質に融合させるインフルエンザウイルス由来のペプチドは、保存されたインフルエンザウイルスエピトープである。1つの実施形態において、保存されたエピトープは、保存されたヒトインフルエンザウイルスエピトープである。保存されたインフルエンザエピトープをウイルス粒子又はウイルス様粒子のための抗原性のインサートとして利用することによって、組成物のコア成分を年毎に再操作する必要がない。代わりに、単離された抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントのみを、インフルエンザウイルスの新しい株が出現するように変化させる必要がある。抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントは組み換えにより製造することができるので、組成物は、免疫応答を新しく出現したインフルエンザ株に対してヒト又は動物において誘発するためのワクチンとして使用するために迅速に製造することができる。
具体的な実施形態において、保存されたインフルエンザペプチドはM2タンパク質に由来する。1つの実施形態において、M2由来ペプチドは、配列番号1〜配列番号5及び配列番号22〜配列番号24からなる群より選択される。本発明の実施形態では、配列番号3、配列番号22、配列番号23及び配列番号24からなる群より選択される、M2インフルエンザタンパク質に由来するペプチド配列が提供される。加えて、配列番号3、配列番号22、配列番号23又は配列番号24のフラグメント、誘導体及び相同体が提供される。他の実施形態において、保存されたエピトープはNPタンパク質に由来する。1つの実施形態において、NPペプチドは、配列番号8〜配列番号10からなる群より選択される。別の実施形態において、保存されたエピトープはHAタンパク質に由来する。1つの実施形態において、HAペプチドは、配列番号6及び配列番号7からなる群より選択される。
他の実施形態において、M2、NP又はHAからなる群より選択されるインフルエンザウイルス由来の保存されたインフルエンザペプチドの任意の組合せを、カプシドタンパク質に融合することができる。1つの実施形態において、カプシド融合ペプチドは、M2ペプチド、NPペプチド及びHAペプチドを含有する。別の実施形態において、カプシド融合ペプチドはM2の保存されたペプチド及びNPの保存されたペプチドを含有する。さらに別の実施形態において、カプシド融合ペプチドはM2ペプチド及びHAペプチドを含有する。別の実施形態において、カプシド融合ペプチドはHAの保存されたペプチド及びNPの保存されたペプチドを含有する。
本発明では、植物ウイルスに由来するカプシドタンパク質が、カプシド融合ペプチドを構築するために利用される。融合したインフルエンザペプチドを有するカプシドタンパク質は、インビボ又はインビトロで自己会合して、ウイルス粒子又はウイルス様粒子を形成することができる。1つの実施形態において、ウイルス粒子又はウイルス様粒子は宿主細胞の原形質膜タンパク質又は宿主の細胞壁タンパク質を含まない。1つの実施形態において、植物ウイルスは、正二十面体であるウイルス(正二十面体の固有型(proper)、等方型(isometric)、準等方型(quasi-isometric)、及び、二重型(geminate)又は「双子」型(twinned)を含む)、多面体であるウイルス(球状型、卵型及びレモン形状型を含む)、桿状であるウイルス(桿状型又は銃弾形状型、及び、紡錘状又は葉巻状型を含む)、及び、らせん状であるウイルス(棒型、円筒状及び繊維状を含む)から選択される。いくつかの実施形態において、植物ウイルスは正二十面体の植物ウイルス種が可能である。1つの実施形態において、ウイルスカプシドはササゲクロロティックモットルウイルス(Cowpea Chlorotic Mottle Virus、CCMV)又はササゲモザイクウイルス(Cowpea Mosaic Virus、CPMV)に由来することができる。さらなる実施形態において、植物ウイルスはCCMVウイルス又はCPMVウイルスから選択され、カプシドは、配列番号3、配列番号22、配列番号23及び配列番号24からなる群より選択される少なくとも1つのインサートを含む。
本発明の1つの態様において、ウイルス粒子又はウイルス様粒子と組み合わされる単離された抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントは、ヒトインフルエンザウイルス又はトリインフルエンザウイルスを含めて、新しく出現したインフルエンザウイルス株に由来するインフルエンザタンパク質である。1つの実施形態において、タンパク質又はタンパク質フラグメントはトリインフルエンザウイルスに由来する。本発明の1つの実施形態において、抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントは、マトリックス(M1)、プロトンイオンチャネル(M2)、赤血球凝集素(HA)、ノイラミニダーゼ(NA)、核タンパク質(NP)、ポリメラーゼ塩基性タンパク質1(PB1)、ポリメラーゼ塩基性タンパク質2(PB2)、ポリメラーゼ酸性タンパク質(PA)及び非構造タンパク質2(NP2)からなる群より選択されるインフルエンザウイルスタンパク質に由来する。本発明の1つの実施形態において、タンパク質又はタンパク質フラグメントはトリインフルエンザのHA又はNAに由来する。
特定の実施形態において、ウイルス粒子又はウイルス様粒子は2又はそれ以上の単離された抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントと組み合わされる。特定の実施形態において、これらの単離された抗原性のペプチド又はペプチドフラグメントは同じ種に由来する。他の実施形態において、これらの単離された抗原性のペプチド又はペプチドフラグメントは異なる種に由来する。特定の実施形態において、ウイルス粒子又はウイルス様粒子は、少なくとも1つのNAタンパク質又はNAタンパク質フラグメント及び少なくとも1つのHAタンパク質又はHAタンパク質フラグメントと組み合わせられる。特定の実施形態において、NAフラグメント及び/又はHAフラグメントはトリインフルエンザウイルスに由来する。特定の他の実施形態において、NAフラグメント及び/又はHAフラグメントはヒトインフルエンザウイルスに由来する。さらなる実施形態において、ウイルス様粒子は、少なくとも1つのNAタンパク質又はNAタンパク質フラグメント、少なくとも1つのHAタンパク質又はHAタンパク質フラグメント、ならびに、M1、M2、NP、PB1、PB2、PA及びNP2からなる群より選択されるトリインフルエンザウイルスのタンパク質又はタンパク質フラグメントの任意の組合せと組み合わせられる。特定の実施形態において、NAタンパク質又はNAタンパク質フラグメントは、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8及びN9からなる群より選択されるインフルエンザNAタンパク質に由来する。さらなる実施形態において、HAタンパク質又はHAタンパク質フラグメントは、インフルエンザのH1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14及びH15に由来する。
特定の実施形態において、単離された抗原ペプチドは、ウイルス粒子又はウイルス様粒子との混合物の状態であり、しかし、ウイルス粒子又はウイルス様粒子に共有結合により連結されない。混合物はさらなる賦形剤を含むことができる。1つの実施形態において、少なくとも1つの抗原性のタンパク質フラグメントは全長のタンパク質よりも短い。特定の実施形態において、抗原性のタンパク質フラグメントはトリインフルエンザウイルス又はヒトインフルエンザウイルスに由来する。特定の実施形態において、タンパク質フラグメントは、少なくとも10個、15個、20個、25個、50個、75個、100個、150個、200個又はそれ以上のアミノ酸を含む。
1つの実施形態において、インフルエンザウイルスに由来するペプチド、植物ウイルスに由来するカプシドタンパク質、及び、インフルエンザウイルスに由来する抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントは、増大した望ましい特性を提供するために変化させることができる。そのような特性には、増大した抗原性、宿主細胞における増大した組み換え発現、より効率的な組み立て、又は、改善された共有結合性が含まれる。1つの実施形態において、カプシドタンパク質に挿入されるインフルエンザペプチドは、そのアミノ酸配列を変化させることによって改変され、ただし、この場合、そのような変化はペプチドの抗原的性質を低下させない。別の実施形態において、カプシドタンパク質に挿入されるインフルエンザペプチドは翻訳後修飾(例えば、グリコシル化、リン酸化又は脂質修飾など)によって改変される。別の実施形態において、単離された抗原性のタンパク質又はタンパク質由来フラグメントは、そのアミノ酸配列を変化させることによって改変することができ、ただし、この場合、そのような変化はペプチドの抗原的性質を低下させない。別の実施形態において、単離された抗原性のタンパク質又はタンパク質由来フラグメントは翻訳後修飾によって改変される。
本発明の他の実施形態において、少なくとも1つの単離されたタンパク質又はタンパク質フラグメントは、ペプチドを含有するウイルス粒子又はウイルス様粒子の表面に共有結合により結合することができる。別の実施形態において、タンパク質の全長未満のアミノ酸配列から成る少なくとも1つのトリインフルエンザウイルスタンパク質フラグメント又はヒトインフルエンザウイルスタンパク質フラグメントが、ペプチドを含有するウイルス粒子又はウイルス様粒子の表面に共有結合により結合される。1つの実施形態において、共有結合により連結された抗原タンパク質フラグメントは、少なくとも10個、15個、20個、25個、50個、75個、100個、150個、200個又はそれ以上のアミノ酸を含む。
本発明の別の実施形態において、インフルエンザウイルスに由来する少なくとも1つのM2ペプチド、NPペプチド又はHAペプチドは、第1の組み換えカプシド融合ペプチドを形成する植物ウイルス由来のカプシドタンパク質に融合させ、この組み換えカプシド融合ペプチドは、第2の組み換えカプシド融合ペプチドを形成する植物ウイルス由来のカプシドタンパク質に融合させる、トリインフルエンザウイルス及び/又はヒトインフルエンザウイルスに由来する少なくとも1つのペプチドと組み合わされる。この実施形態において、第1の組み換えカプシド融合ペプチド及び第2の組み換えカプシド融合ペプチドはインビボ又はインビトロで会合して、ウイルス粒子又はウイルス様粒子を形成することができる。得られたウイルス様粒子は、その後、インフルエンザウイルスに由来する単離された抗原タンパク質と組み合わせることができる。1つの実施形態において、第2の組み換えカプシド融合ペプチドに含有されるペプチドは、M1、M2、hHA、NA、NP、PB1、PB2、PA及びNP2からなる群より選択されるヒトインフルエンザウイルスタンパク質又はトリインフルエンザウイルスタンパク質に由来する。本発明の1つの実施形態において、第2の組み換えカプシド融合ペプチドに含有されるペプチドは、インフルエンザウイルスタンパク質のHA又はNPに由来する。いくつかの実施形態において、第2の組み換えカプシド融合ペプチドに含有されるペプチドはNPである。他の実施形態において、第2の組み換えカプシド融合ペプチドに含有されるペプチドはHAである。いくつかの実施形態において、HAペプチドは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14又はH15に由来する。
本発明のさらに別の実施形態において、ウイルス粒子又はウイルス様粒子を含む組成物が提供され、この場合、ウイルス粒子又はウイルス様粒子は、i)インフルエンザウイルスに由来する少なくとも1つの保存されたペプチドと、ii)少なくとも1つのさらなる単離されたインフルエンザウイルスペプチドとに融合した植物ウイルス由来のカプシドタンパク質(この場合、カプシド融合ペプチドはインビトロ又はインビトロでウイルス粒子又はウイルス様粒子に組み立てることができる)、及び、iii)インフルエンザウイルスに由来する単離された抗原ペプチドを含む。
さらに別の実施形態において、本発明は、ウイルス粒子又はウイルス様粒子の混合物を含む組成物を提供し、この場合、混合物は、i)インフルエンザウイルスに由来する少なくとも1つのペプチドを含有する第1のウイルス粒子又はウイルス様粒子、及び、ii)第1のウイルス粒子又はウイルス様粒子に含有されるインフルエンザウイルスペプチドとは異なる少なくとも1つのインフルエンザウイルスペプチドを含有する少なくとも1つの第2のウイルス粒子又はウイルス様粒子、及び、iii)インフルエンザウイルスに由来する少なくとも1つの単離された抗原ペプチドを含む。1つの実施形態において、インフルエンザペプチドは、植物ウイルスに由来するカプシドタンパク質に融合させる。
本発明のいくつかの態様において、本発明の組成物は、免疫応答をヒト又は動物において誘導するためのワクチン計画において利用することができる。本発明の組成物は、免疫応答を誘発するために、アジュバントと組合せ、効果的な量でヒト又は動物に投与することができる。他の実施形態において、本発明の組成物は、アジュバントを伴うことなくヒト又は動物に投与される。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は免疫刺激核酸(例えば、CpG配列など)を含む。特定の実施形態において、免疫刺激核酸はウイルス様粒子の中に包被することができる。
本発明の実施形態には、組成物が、実質的に精製された形態で、例えば、宿主細胞のタンパク質を実質的に含まない精製された形態でヒト又は動物に投与され得る実施形態が含まれる。他の実施形態において、組成物は、部分的に精製された形態で、例えば、宿主細胞のタンパク質(これは植物細胞のタンパク質が可能である)を含む形態でヒト又は動物に投与することができる。
本発明の別の態様において、ヒト又は動物におけるインフルエンザワクチンでの使用のための組成物を製造する方法が提供され、この場合、この方法は、
i)インフルエンザウイルスペプチド配列に機能的に連結された植物ウイルスカプシドタンパク質配列をコードする第1の核酸を提供し、カプシド融合ペプチドを産生させるために宿主細胞において第1の核酸を発現すること;
ii)ウイルス粒子又はウイルス様粒子を形成するためにカプシド融合ペプチドを会合させること;
iii)所定のインフルエンザウイルス株に由来する少なくとも1つの抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントをコードする少なくとも1つの第2の核酸を提供し、抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントを産生させるために宿主細胞において第2の核酸を発現すること;
iv)抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントを単離及び精製すること;及び
v)ヒト又は動物に投与することができる組成物を形成するために、ウイルス粒子又はウイルス様粒子及び単離された抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントを組み合わせることを含む。
i)インフルエンザウイルスペプチド配列に機能的に連結された植物ウイルスカプシドタンパク質配列をコードする第1の核酸を提供し、カプシド融合ペプチドを産生させるために宿主細胞において第1の核酸を発現すること;
ii)ウイルス粒子又はウイルス様粒子を形成するためにカプシド融合ペプチドを会合させること;
iii)所定のインフルエンザウイルス株に由来する少なくとも1つの抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントをコードする少なくとも1つの第2の核酸を提供し、抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントを産生させるために宿主細胞において第2の核酸を発現すること;
iv)抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントを単離及び精製すること;及び
v)ヒト又は動物に投与することができる組成物を形成するために、ウイルス粒子又はウイルス様粒子及び単離された抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントを組み合わせることを含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス粒子又はウイルス様粒子が、植物宿主において、例えば、植物体又は植物細胞培養物において産生される。他の実施形態において、ウイルス粒子又はウイルス様粒子が蛍光菌(Pseudomonas fluorescens)宿主細胞において産生される。他の実施形態において、カプシド融合ペプチドが宿主細胞(例えば、植物細胞又は蛍光菌細胞など)において発現され、ウイルス粒子又はウイルス様粒子がインビトロで組み立てられる。1つの実施形態において、抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントを、真核生物細胞において、例えば、植物体又は植物細胞培養物などにおいて産生させることができる。さらなる実施形態において、抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントを、任意の原核生物細胞において、例えば、大腸菌又は蛍光菌において産生させることができる。いくつかの実施形態において、カプシド融合ペプチド及び抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントが同じ真核生物細胞において同時発現させられ、カプシド融合ペプチドがインビボで会合して、ウイルス粒子又はウイルス様粒子を形成する。他の実施形態において、カプシド融合ペプチド及び抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントが同じ原核生物細胞(例えば、蛍光菌細胞など)において同時発現させられ、カプシド融合ペプチドがインビボで会合して、ウイルス粒子又はウイルス様粒子を形成する。
I.カプシド融合ペプチド
本発明では、組み換えカプシド融合ペプチドを形成する植物ウイルス由来のカプシドタンパク質に融合させるインフルエンザウイルス由来の少なくとも1つのペプチドが利用される。組み換えカプシド融合ペプチドは会合して、宿主細胞の原形質膜を含有さないウイルス粒子又はウイルス様粒子を形成することができる。
本発明では、組み換えカプシド融合ペプチドを形成する植物ウイルス由来のカプシドタンパク質に融合させるインフルエンザウイルス由来の少なくとも1つのペプチドが利用される。組み換えカプシド融合ペプチドは会合して、宿主細胞の原形質膜を含有さないウイルス粒子又はウイルス様粒子を形成することができる。
組み換えカプシド融合ペプチドはインフルエンザウイルス由来のペプチドを含有することができる。本発明の実施形態において、組み換えカプシド融合ペプチドは、インフルエンザウイルスタンパク質に由来するペプチドを含有する。さらなる実施形態において、ペプチドは、保存されたペプチド又はその誘導体もしくは相同的ペプチドに由来する。保存されたペプチドは、M2タンパク質、HAタンパク質又はNPタンパク質に由来することができる。いくつかの実施形態において、M2、HA又はNPに由来する保存されたペプチド又はその誘導体もしくは相同体の1、2又はそれ以上の組合せをカプシドタンパク質に融合することができる。誘導体又は相同体は一般には、基準配列との少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列であると見なされる。
a.ヒトインフルエンザ及び/又はトリインフルエンザに由来するペプチド
本発明の1つの実施形態において、ヒトインフルエンザウイルス及び/又はトリインフルエンザウイルスに由来するペプチドが、植物ウイルスに由来するカプシドタンパク質と遺伝子融合させる。ヒトインフルエンザウイル及びトリインフルエンザウイルスの様々なタンパク質配列が当分野では周知である。例えば、National Center for Biotechnology Informationは、ヒトインフルエンザウイル及びトリインフルエンザウイルスの様々な単離株に由来する、タンパク質をコードする核酸配列、及び、アミノ酸配列を含むInfluenza Resource Databaseを管理する。このデータベースはhttp://wwww.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Flu.htmlにおいて利用することができる。
本発明の1つの実施形態において、ヒトインフルエンザウイルス及び/又はトリインフルエンザウイルスに由来するペプチドが、植物ウイルスに由来するカプシドタンパク質と遺伝子融合させる。ヒトインフルエンザウイル及びトリインフルエンザウイルスの様々なタンパク質配列が当分野では周知である。例えば、National Center for Biotechnology Informationは、ヒトインフルエンザウイル及びトリインフルエンザウイルスの様々な単離株に由来する、タンパク質をコードする核酸配列、及び、アミノ酸配列を含むInfluenza Resource Databaseを管理する。このデータベースはhttp://wwww.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Flu.htmlにおいて利用することができる。
植物ウイルスのカプシドタンパク質への挿入のために選択されるペプチドは全長のインフルエンザウイルスタンパク質のアミノ酸配列に由来することができる。他の実施形態において、挿入のために選択されるペプチドは、長さが、少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個又はそれ以上のアミノ酸を含む。選択されたペプチドは、このペプチドが由来するインフルエンザタンパク質の内部からの少なくとも4個、5個、6個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個又はそれ以上のアミノ酸を含む抗原ペプチドに対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。
好ましくは、挿入のために選択されるインフルエンザペプチドは、免疫応答をヒト又は動物において誘発することができるエピトープを含む。エピトープの決定は当分野では周知である。例えば、植物ウイルスのカプシドタンパク質に挿入するために選択されるペプチドは、選択されたペプチドを動物(例えば、マウス、ウサギ、ヤギ又はサルなど)に投与し、その後、動物から得られた血清をペプチドに対する抗体の存在について試験することによって、そのペプチドが免疫応答を誘発することができるかどうかを明らかにするために試験することができる。他の実施形態において、インフルエンザ由来の抗原ペプチドは、インサートの特性(例えば、宿主における改善された発現、強化された免疫原性、及び、改善された共有結合性など、これらに限定されない)を改善するために変化させることができる。
b.インフルエンザM2ペプチド
インフルエンザM2ペプチドは、アミノ酸が97個の膜タンパク質である。このタンパク質は、N末端において細胞外に露出する24個のアミノ酸、脂質二重層にまたがる19個のアミノ酸、及び、膜の細胞質側に存在する54個の残基を有する。
インフルエンザM2ペプチドは、アミノ酸が97個の膜タンパク質である。このタンパク質は、N末端において細胞外に露出する24個のアミノ酸、脂質二重層にまたがる19個のアミノ酸、及び、膜の細胞質側に存在する54個の残基を有する。
1つの実施形態において、本発明で利用されるM2ペプチドは、ヒト又は鳥への感染能を有するインフルエンザウイルスの97アミノ酸の配列に由来する。得られるペプチドは完全な97アミノ酸の配列を含むことができるか、あるいは、97アミノ酸の配列の内部から選ばれる少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個又は97個のアミノ酸を含むそれらのサブセットが可能である。選択されたペプチドは、少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個又は97個のアミノ酸を含むM2抗原ペプチド配列に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。
本発明のさらなる実施形態には、本発明で利用されるM2ペプチドがアミノ酸細胞外ドメインに由来する実施形態が含まれる。本発明の実施形態には、本発明で利用されるM2ペプチドが、全般的に保存されたM2配列に由来する23アミノ酸の細胞外ドメイン配列M2e−1(配列番号1、表1)である実施形態が含まれる。別の実施形態において、本発明で利用されるM2ペプチドは、M2e−1ペプチドの内部から選ばれる少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個又は23個のアミノ酸を含む、M2e−1ペプチドのアミノ酸サブセットより構成される。選択されたペプチドは、配列番号1の少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個又は23個のアミノ酸を含むM2e−1ペプチド配列に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。
他の実施形態において、本発明で利用されるM2ペプチドは、アミノ酸が23個の細胞外ドメイン配列M2e−2(配列番号2、表1)に由来する。別の実施形態において、本発明で利用されるM2ペプチドは、M2e−2ペプチドの内部から選ばれる少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個又は23個のアミノ酸を含む、M2e−2ペプチドのアミノ酸サブセットより構成される。選択されたペプチドは、配列番号2の少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個又は23個のアミノ酸を含むM2e−2ペプチド配列に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。
別の実施形態において、本発明で利用されるM2ペプチドは、アミノ酸が22個の細胞外ドメイン配列M2e−3(配列番号3、表1)に由来する。別の実施形態において、本発明で利用されるM2ペプチドは、M2e−3ペプチドから選ばれる少なくとも4個、5個、6個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個又は22個のアミノ酸を含む、M2e−3ペプチドのアミノ酸サブセットより構成される。選択されたペプチドは、配列番号3の少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個又は22個のアミノ酸を含むM2e−3ペプチド配列に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。
さらに別の実施形態において、本発明で利用されるM2ペプチドはインフルエンザ株A/PR/8/34(H1N1)の23アミノ酸の細胞外ドメイン配列(配列番号4、表1)に由来する。別の実施形態において、本発明で利用されるM2ペプチドは、インフルエンザ株A/PR/8/34(H1N1)由来のM2ペプチドから選ばれる少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個又は23個のアミノ酸を含む、インフルエンザ株A/PR/8/34(H1N1)由来のM2ペプチドのアミノ酸サブセットより構成される。選択されたペプチドは、配列番号4の少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個のアミノ酸を含むインフルエンザ株A/PR/8/34(H1N1)由来のM2ペプチドに対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。
さらに別の実施形態において、本発明で利用されるM2ペプチドはインフルエンザ株A/Fort Monmouth/1/47(H1N1)の23アミノ酸の細胞外配列(配列番号5、表1)に由来する。別の実施形態において、本発明で利用されるM2ペプチドは、インフルエンザ株A/Fort Monmouth/1/47(H1N1)由来のM2ペプチドから選ばれる少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個又は23個のアミノ酸を含む、インフルエンザ株A/Fort Monmouth/1/47(H1N1)由来のM2ペプチドのアミノ酸サブセットより構成される。選択されたペプチドは、配列番号5の少なくとも4個、5個、6個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個又は23個のアミノ酸を含むインフルエンザ株A/Fort Monmouth/1/47(H1N1)由来のM2ペプチドに対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。
他の実施形態において、本発明で利用されるM2ペプチドは、アミノ酸が22個の配列M2e−2(W−)(配列番号22、表1)に由来する。別の実施形態において、本発明で利用されるM2ペプチドは、M2e−2(W−)の内部から選ばれる少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個又は22個のアミノ酸を含む、M2e−2(W−)ペプチドのアミノ酸サブセットより構成される。選択されたペプチドは、配列番号22の少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個又は22個のアミノ酸を含むM2e−2(W−)ペプチド配列に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。
さらに別の実施形態において、本発明で利用されるM2ペプチドはA/PR/8/34(H1N1)(W−)の22アミノ酸の配列(配列番号23、表1)に由来する。別の実施形態において、本発明で利用されるM2ペプチドは、A/PR/8/34(H1N1)(W−)から選ばれる少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個又は22個のアミノ酸を含む、M2−A/PR/8/34(H1N1)(W−)のアミノ酸サブセットより構成される。選択されたペプチドは、配列番号23の少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個のアミノ酸を含むA/PR/8/34(H1N1)(W−)ペプチドに対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。
さらに別の実施形態において、本発明で利用されるM2ペプチドはA/Fort Monmouth/1/47(H1N1)(W−)の22アミノ酸の配列(配列番号24、表1)に由来する。別の実施形態において、本発明で利用されるM2ペプチドは、M2−A/Fort Monmouth/1/47(H1N1)(W−)から選ばれる少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個又は22個のアミノ酸を含む、M2−A/Fort Monmouth/1/47(H1N1)(W−)のアミノ酸サブセットより構成される。選択されたペプチドは、配列番号24の少なくとも4個、5個、6個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個又は22個のアミノ酸を含むペプチドM2−A/Fort Monmouth/1/47(H1N1)(W−)に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。
さらなる実施形態において、植物ウイルスカプシドタンパク質に挿入されるM2ペプチドは、配列番号1〜配列番号5及び配列番号22〜配列番号24からなる群より選択される完全なアミノ酸配列、あるいは、長さが少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個又はそれ以上のアミノ酸であるそれらのサブセットが可能である。挿入のために選択されるペプチドは、配列番号1〜配列番号5及び配列番号22〜配列番号24からなる群より選択されるペプチド配列の内部からの長さが少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個又はそれ以上のアミノ酸であるペプチドに対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。
他の実施形態において、配列番号1〜配列番号5及び配列番号22〜配列番号24、あるいは、長さが少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個又はそれ以上のアミノ酸であるそれらのサブセットからなる群より選択されるM2ペプチドの任意の組合せを、植物ウイルスカプシドタンパク質に挿入することができる。選択されたペプチド組合せは、配列番号1〜配列番号5及び配列番号22〜配列番号24からなる群より選択される少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個又はそれ以上のアミノ酸に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。
さらなる実施形態において、M2のインフルエンザ由来抗原ペプチドは、インサートの特性(例えば、宿主における改善された発現、強化された免疫原性、及び、改善された共有結合性など、これらに限定されない)を改善するために変化させることができる。本発明の実施形態には、配列番号1、配列番号2、配列番号4又は配列番号5におけるアミノ酸のトリプトファンが除かれるか、又は、トリプトファンではない任意のアミノ酸により置換される実施形態が含まれる
本発明ではまた、新規なM2由来ペプチドが提供される。1つの実施形態において、配列番号3を含む新規なM2ペプチドM2e−3が提供される。1つの実施形態において、配列番号3に対して少なくとも70%、75%、80%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すアミノ酸配列が提供される。別の実施形態において、配列番号3に由来する少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個又は22個のアミノ酸を含むペプチドが提供される。M2e−3ペプチドはM2e−1ペプチドに由来するが、アミノ酸のトリプトファンが除かれている。トリプトファンの除去はいくつかのカプシド融合ペプチドの増大した会合をもたらすものの、ペプチドの免疫原性には悪影響を及ぼさない。1つの実施形態において、M2e−3ペプチドが植物ウイルスのカプシドタンパク質に挿入される。本発明の実施形態には、M2e−3ペプチドが、CCMV又はCPMVに由来するカプシドタンパク質に挿入される実施形態が含まれる。
1つの実施形態において、配列番号22を含む新規なM2ペプチドM2e−2(W−)が提供される。1つの実施形態において、配列番号22に対して少なくとも70%、75%、80%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すアミノ酸配列が提供される。別の実施形態において、配列番号22に由来する少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個又は22個のアミノ酸を含むペプチドが提供される。M2e−2(W−)ペプチドはM2e−2ペプチドに由来するが、アミノ酸のトリプトファンが除かれている。1つの実施形態において、M2e−2(W−)ペプチドが、植物ウイルスに由来するカプシドタンパク質に挿入される。本発明の実施形態には、M2e−2(W−)ペプチドが、CCMV又はCPMVに由来するカプシドタンパク質に挿入される実施形態が含まれる。
1つの実施形態において、配列番号23を含む新規なM2ペプチドM2e−A/PR/8/34(H1N1)(W−)が提供される。1つの実施形態において、配列番号23に対して少なくとも70%、75%、80%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すアミノ酸配列が提供される。別の実施形態において、配列番号23に由来する少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個又は22個のアミノ酸を含むペプチドが提供される。M2e−A/PR/8/34(H1N1)(W−)ペプチドはM2e−A/PR/8/34(H1N1)ペプチドに由来するが、アミノ酸のトリプトファンが除かれている。1つの実施形態において、M2e−A/PR/8/34(H1N1)(W−)ペプチドが、植物ウイルスに由来するカプシドタンパク質に挿入される。本発明の実施形態には、M2e−A/PR/8/34(H1N1)(W−)ペプチドが、CCMV又はCPMVに由来するカプシドタンパク質に挿入される実施形態が含まれる。
1つの実施形態において、配列番号24を含む新規なM2ペプチドM2e−A/Fort Monmouth/1/47(H1N1)(W−)が提供される。1つの実施形態において、配列番号24に対して少なくとも70%、75%、80%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すアミノ酸配列が提供される。別の実施形態において、配列番号24に由来する少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個又は22個のアミノ酸を含むペプチドが提供される。このペプチドはM2e−A/Fort Monmouth/1/47(H1N1)ペプチドに由来するが、アミノ酸のトリプトファンが除かれている。1つの実施形態において、M2e−A/Fort Monmouth/1/47(H1N1)(W−)ペプチドが、植物ウイルスに由来するカプシドタンパク質に挿入される。本発明の実施形態には、M2e−A/Fort Monmouth/1/47(H1N1)(W−)ペプチドが、CCMV又はCPMVに由来するカプシドタンパク質に挿入される実施形態が含まれる。
配列番号3、配列番号22、配列番号23及び配列番号24からなる群より選択されるペプチドに融合したウイルス(植物ウイルスを含む)由来のカプシドタンパク質を含むカプシド融合ペプチドを含む新規な組成物もまた提供される。
b.HAタンパク質
インフルエンザウイルスの赤血球凝集素(HA)は、多数の折り畳みドメインを有するホモ三量体としてインフルエンザウイルス粒子上に現れるI型膜貫通糖タンパク質である。モノマーは、N末端の細胞外ドメインにおける6つの鎖内ジスルフィド結合及び7つのN結合型グリカンと、膜貫通ドメインと、細胞質テールとを有する。Wilson et al. (1981) 「Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 Å resolution」、Nature 289:366-373;Wiley D.C. and JJ. Skehel (1987) 「The structure and function of hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus」, Annu. Rev. Biochem. 56:365-394。タンパク質分解により活性化された三量体の細胞外ドメインの結晶構造により、それぞれのサブユニットが2つの主要なドメイン(球状の最もNH2末端側のドメイン、及び、スパイクタンパク質の幹を形成するCOOH末端ドメイン)を有する長さが135Åの三量体スパイクタンパク質が解明される。幹領域は、タンパク質の膜融合活性に関与することが公知の融合ペプチドを含有する。Wilsonet et al. (1981) 「Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 Å resolution」, Nature 289:366-373;Wiley D.C. and JJ. Skehel (1987) 「The structure and function of hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus」, Annu. Rev. Biochem. 56:365-394。
インフルエンザウイルスの赤血球凝集素(HA)は、多数の折り畳みドメインを有するホモ三量体としてインフルエンザウイルス粒子上に現れるI型膜貫通糖タンパク質である。モノマーは、N末端の細胞外ドメインにおける6つの鎖内ジスルフィド結合及び7つのN結合型グリカンと、膜貫通ドメインと、細胞質テールとを有する。Wilson et al. (1981) 「Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 Å resolution」、Nature 289:366-373;Wiley D.C. and JJ. Skehel (1987) 「The structure and function of hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus」, Annu. Rev. Biochem. 56:365-394。タンパク質分解により活性化された三量体の細胞外ドメインの結晶構造により、それぞれのサブユニットが2つの主要なドメイン(球状の最もNH2末端側のドメイン、及び、スパイクタンパク質の幹を形成するCOOH末端ドメイン)を有する長さが135Åの三量体スパイクタンパク質が解明される。幹領域は、タンパク質の膜融合活性に関与することが公知の融合ペプチドを含有する。Wilsonet et al. (1981) 「Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 Å resolution」, Nature 289:366-373;Wiley D.C. and JJ. Skehel (1987) 「The structure and function of hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus」, Annu. Rev. Biochem. 56:365-394。
1つの実施形態において、本発明で利用されるHAペプチドは、H1〜H15の赤血球凝集素抗原の15のクラスのからなる群より選択される、インフルエンザウイルスに含まれるHAタンパク質に由来する。得られるペプチドは完全なHAアミノ酸配列を含むことができるか、あるいは、HAアミノ酸配列の内部から選ばれる少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、125個、135個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、210個、225個、235個、250個、260個、275個、280個、290個、300個、310個、320個、325個、330個、331個、332個、333個又はそれ以上のアミノ酸を含むそれらのサブセットが可能である。選択されたペプチドは、そのペプチドが由来するHAアミノ酸配列の内部から選ばれる少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、125個、135個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、210個、225個、235個、250個、260個、275個、280個、290個、300個、310個、320個、325個、330個、331個、332個、333個又はそれ以上のアミノ酸を含むインフルエンザタンパク質のHA抗原ペプチド配列に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。
本発明のさらなる実施形態には、本発明で利用されるHAペプチドが、ヒト又は鳥への感染能を有するインフルエンザウイルスに由来する実施形態が含まれる。本発明の実施形態には、本発明で利用される植物ウイルスカプシドタンパク質に挿入されるHAペプチドがH3サブタイプに由来する実施形態が含まれる。さらなる実施形態において、HAペプチドはインフルエンザ株A/Texas/1/77(H3N2)の333アミノ酸のHAタンパク質(配列番号6、表2)に由来することができる。CB Smith et al. (2002) 「Molecular epidemiology of influenza A(H3N2) virus re-infections」, J. Infect. Dis. 185(7):980-985。別の実施形態において、植物カプシドタンパク質における挿入のために利用されるHAペプチドは、配列番号6の完全なHAアミノ酸配列を含むことができるか、あるいは、配列番号6のHAアミノ酸配列の内部から選ばれる少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、125個、135個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、210個、225個、235個、250個、260個、275個、280個、290個、300個、310個、320個、325個、330個、331個、332個、333個又はそれ以上のアミノ酸を含むそれらのサブセットが可能である。選択されたペプチドは、配列番号6の少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、125個、135個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、210個、225個、235個、250個、260個、275個、280個、290個、300個、310個、320個、325個、330個、331個、332個、333個又はそれ以上のアミノ酸を含むHA抗原ペプチド配列に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。
本発明のさらなる実施形態には、本発明で利用されるHAペプチドが、アミノ酸が18個の配列HA91−108−A/Texas/1/77(H3N2)(配列番号7、表2)に由来するか、あるいは、インフルエンザA/Texas/1/77(H3N2)株のHAアミノ酸91〜108に由来する長さが少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個又は18個のアミノ酸であるそれらのサブセットに由来する実施形態が含まれる。選択されたペプチドは、アミノ酸が18個の配列HA91−108−A/Texas/1/77(H3N2)(配列番号7、表2)、あるいは、インフルエンザA/Texas/1/77(H3N2)株のHAアミノ酸91〜108に由来する長さが少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個又は18個のアミノ酸であるそれらのサブセットを含むHA抗原ペプチド配列に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。
さらなる実施形態において、植物ウイルスカプシドタンパク質に挿入されるHAペプチドは、配列番号6及び配列番号7からなる群より選択される完全なアミノ酸配列、あるいは、長さが少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、125個、135個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、210個、225個、235個、250個、260個、275個、280個、290個、300個、310個、320個、325個、330個、331個、332個、333個又はそれ以上のアミノ酸であるそれらのサブセットが可能である。他の実施形態において、配列番号6及び配列番号7からなる群より選択されるHAペプチド、あるいは、長さが少なくとも4個、5個、6個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、125個、135個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、210個、225個、235個、250個、260個、275個、280個、290個、300個、310個、320個、325個、330個、331個、332個、333個又はそれ以上のアミノ酸であるそれらのサブセットの任意の組合せを植物ウイルスカプシドタンパク質に挿入することができる。選択されたペプチドは、配列番号6〜配列番号7から成る群に由来する選択されたペプチドに由来するHA抗原ペプチド配列に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。
さらなる実施形態において、インフルエンザ由来のHA抗原ペプチドは、インサートの特性(例えば、宿主における改善された発現、強化された免疫原性、及び、改善された共有結合性など、これらに限定されない)を改善するために変化させることができる。
c.NPタンパク質
インフルエンザウイルスの核タンパク質(NP)は、ウイルスの一本鎖RNAゲノムと緊密に結合するらせん状の核タンパク質である。インフルエンザのNPタンパク質は、アルギニン残基、グリシン残基及びセリン残基が多く、中性pHにおいて正味の正荷電を有する。A型インフルエンザのNPタンパク質は一般に、長さが498アミノ酸のポリペプチドより構成され、一方、B型インフルエンザウイルス及びC型インフルエンザウイルスでは、相同的なNPポリペプチドの長さが一般に、それぞれ、560残基及び565残基である。Londo et al. (1983) 「Complete nucleotide sequence of the nucleoprotein gene of influenza B virus」, Journal of Virology 47:642-645;S. Nakada et al. (1984) 「Complete nucleotide sequence of the influenza C/California/78 virus nucleoprotein gene」, Virus Research 1:433-441を参照のこと。これら3つのインフルエンザウイルスタイプのNP遺伝子の予測されるアミノ酸配列のアラインメントにより、著しい類似性がこれら3つのタンパク質の間に明らかにされ、A型及びB型のNPが最も保存の程度が高い。Portela and Digard (2002) 「The influenza virus nucleoprotein: a multifunctional RNA-binding protein pivotal to virus replication 2002」, JGV 83:723-734を参照のこと。種々の宿主から単離されたウイルス株の系統発生解析により、NP遺伝子は比較的よく保存され、最大のアミノ酸差は11%未満であることが明らかにされる。Shu et al. (1993) 「Analysis of the evolution and variation of the human influenza A virus nucleoprotein gene from 1993 to 1990」, Journal of Virology 67:2723-2729を参照のこと。
インフルエンザウイルスの核タンパク質(NP)は、ウイルスの一本鎖RNAゲノムと緊密に結合するらせん状の核タンパク質である。インフルエンザのNPタンパク質は、アルギニン残基、グリシン残基及びセリン残基が多く、中性pHにおいて正味の正荷電を有する。A型インフルエンザのNPタンパク質は一般に、長さが498アミノ酸のポリペプチドより構成され、一方、B型インフルエンザウイルス及びC型インフルエンザウイルスでは、相同的なNPポリペプチドの長さが一般に、それぞれ、560残基及び565残基である。Londo et al. (1983) 「Complete nucleotide sequence of the nucleoprotein gene of influenza B virus」, Journal of Virology 47:642-645;S. Nakada et al. (1984) 「Complete nucleotide sequence of the influenza C/California/78 virus nucleoprotein gene」, Virus Research 1:433-441を参照のこと。これら3つのインフルエンザウイルスタイプのNP遺伝子の予測されるアミノ酸配列のアラインメントにより、著しい類似性がこれら3つのタンパク質の間に明らかにされ、A型及びB型のNPが最も保存の程度が高い。Portela and Digard (2002) 「The influenza virus nucleoprotein: a multifunctional RNA-binding protein pivotal to virus replication 2002」, JGV 83:723-734を参照のこと。種々の宿主から単離されたウイルス株の系統発生解析により、NP遺伝子は比較的よく保存され、最大のアミノ酸差は11%未満であることが明らかにされる。Shu et al. (1993) 「Analysis of the evolution and variation of the human influenza A virus nucleoprotein gene from 1993 to 1990」, Journal of Virology 67:2723-2729を参照のこと。
1つの実施形態において、本発明で利用されるNPペプチドは、A型、B型又はC型のインフルエンザウイルスに含まれるNPタンパク質に由来する。得られるペプチドは完全なNPアミノ酸配列を含むことができるか、あるいは、NPアミノ酸配列の内部から選ばれる少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、125個、135個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、210個、225個、235個、250個、260個、275個、280個、290個、300個、310個、320個、325個、330個、350個、360個、375個、380個、390個、400個、410個、425個、435個、445個、450個、460個、470個、480個、490個、495個、498個又はそれ以上のアミノ酸を含むそれらのサブセットが可能である。選択されたペプチドは、NPアミノ酸配列の内部から選ばれる少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、125個、135個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、210個、225個、235個、250個、260個、275個、280個、290個、300個、310個、320個、325個、330個、320個、325個、330個、350個、360個、375個、380個、390個、400個、410個、425個、435個、445個、450個、460個、470個、480個、490個、495個、498個又はそれ以上のアミノ酸を含むインフルエンザタンパク質のNP抗原ペプチド配列に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。
本発明のさらなる実施形態には、本発明で利用されるNPペプチドが、ヒト又は鳥への感染能を有するインフルエンザウイルスに由来する実施形態が含まれる。本発明の実施形態には、本発明で利用される植物ウイルスカプシドタンパク質に挿入されるNPペプチドがA型インフルエンザウイルスのNPタンパク質に由来する実施形態が含まれる。NPタンパク質はインフルエンザ株A/Texas/1/77(H3N2)の498アミノ酸のNPタンパク質(配列番号8、表3)に由来するか、あるいは、配列番号8のNPアミノ酸配列の内部から選ばれる少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、125個、135個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、210個、225個、235個、250個、260個、275個、280個、290個、300個、310個、320個、325個、330個、350個、360個、375個、380個、390個、400個、410個、425個、435個、445個、450個、460個、470個、480個、490個、495個、498個又はそれ以上のアミノ酸を含むそれらのサブセットである。選択されたペプチドは、配列番号8のNPアミノ酸配列の内部から選ばれる少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、125個、135個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、210個、225個、235個、250個、260個、275個、280個、290個、300個、310個、320個、325個、330個、320個、325個、330個、350個、360個、375個、380個、390個、400個、410個、425個、435個、445個、446個又はそれ以上のアミノ酸を含むインフルエンザタンパク質のNP抗原ペプチド配列に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。
本発明のさらなる実施形態には、本発明で利用されるNPペプチドが、アミノ酸が15個の配列NP55−69−A/Texas/1/77(H3N2)(配列番号9、表3)、あるいは、インフルエンザA/Texas/1/77(H3N2)株のNPアミノ酸55〜69に由来する長さが少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個又は15個のアミノ酸であるそれらのサブセットに由来する実施形態が含まれる。選択されたペプチドは、NP抗原ペプチド配列、あるいは、インフルエンザA/Texas/1/77(H3N2)株のNPアミノ酸55〜69に由来する長さが少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個のアミノ酸であるそれらのサブセットに対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。
他の実施形態において、本発明で利用されるNPペプチドは、アミノ酸が12個の配列NP147−158−A/Texas/1/77(H3N2)(配列番号10、表3)、あるいは、インフルエンザA/Texas/1/77(H3N2)株のNPアミノ酸147〜158に由来する長さが少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個又は12個のアミノ酸であるそれらのサブセットに由来する。選択されたペプチドは、NP抗原ペプチド配列、あるいは、インフルエンザA/Texas/1/77(H3N2)株のNPアミノ酸147〜158に由来する長さが少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個又は12個のアミノ酸であるそれらのサブセットに対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。
さらなる実施形態において、植物ウイルスカプシドタンパク質に挿入されるNPペプチドは、配列番号8〜配列番号10からなる群より選択される完全なアミノ酸配列、あるいは、長さが少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、125個、135個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、210個、225個、235個、250個、260個、275個、280個、290個、300個、310個、320個、325個、330個、320個、325個、330個、350個、360個、375個、380個、390個、400個、410個、425個、435個、445個、450個、460個、470個、480個、490個、495個、498個又はそれ以上のアミノ酸であるそれらのサブセットが可能である。選択されたペプチドは、配列番号8〜配列番号10からなる群より選択されるNPアミノ酸配列の内部から選ばれる少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、125個、135個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、210個、225個、235個、250個、260個、275個、280個、290個、300個、310個、320個、325個、330個、320個、325個、330個、350個、360個、375個、380個、390個、400個、410個、425個、435個、445個、450個、460個、470個、480個、490個、495個、498個又はそれ以上のアミノ酸を含むインフルエンザタンパク質のNP抗原ペプチド配列に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。他の実施形態において、配列番号8〜配列番号10からなる群より選択されるNPペプチド、あるいは、配列番号8〜配列番号10から成る群に由来する長さが少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、125個、135個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、210個、225個、235個、250個、260個、275個、280個、290個、300個、310個、320個、325個、330個、320個、325個、330個、350個、360個、375個、380個、390個、400個、410個、425個、435個、445個、450個、460個、470個、480個、490個、495個、498個又はそれ以上のアミノ酸を含むインフルエンザタンパク質のNP抗原ペプチド配列に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すそれらのサブセットの任意の組合せを、植物ウイルスカプシドタンパク質に挿入することができる。
さらなる実施形態において、インフルエンザのNP由来の抗原ペプチドは、インサートの特性(例えば、宿主における改善された発現、強化された免疫原性、及び、改善された共有結合性など、これらに限定されない)を改善するために変化させることができる。
d.カプシドタンパク質
本発明では、植物ウイルスに由来するカプシドタンパク質が、カプシド融合ペプチドを構築するために利用される。植物ウイルス由来のカプシドタンパク質を使用することに対する1つの潜在的な利点は、インフルエンザのエピトープを提示するためにウイルス粒子の好都合な形態を維持しながら、ヒト又は動物に投与したときの有害な反応について可能性は低下している。
本発明では、植物ウイルスに由来するカプシドタンパク質が、カプシド融合ペプチドを構築するために利用される。植物ウイルス由来のカプシドタンパク質を使用することに対する1つの潜在的な利点は、インフルエンザのエピトープを提示するためにウイルス粒子の好都合な形態を維持しながら、ヒト又は動物に投与したときの有害な反応について可能性は低下している。
さらなる実施形態において、カプシドタンパク質は、少なくとも1つの植物宿主について特異的である分類群のいずれか1つのメンバーから選択された植物ウイルスに由来する。
ウイルス分類学では、サテライト核酸及びプリオンを除いて、カプシドにより包まれた粒子実体の下記の分類群が認められている。第I群ウイルス、すなわち、dsDNAウイルス;第II群ウイルス、すなわち、ssDNAウイルス;第III群ウイルス、すなわち、dsRNAウイルス;第IV群ウイルス、すなわち、DNA段階を伴わないssRNAの(+)鎖ウイルス;第V群ウイルス、すなわち、ssRNAの(-)鎖ウイルス;第VI群ウイルス、すなわち、RNAレトロイドウイルス(これはssRNA逆転写ウイルスである);第VII群ウイルス、すなわち、DNAレトロイドウイルス(これはdsDNA逆転写ウイルスである);デルタウイルス;ウイロイド;ならびにサテライトファージ及びサテライトウイルス。
これらの分類群の様々なメンバーが当業者には周知であり、H.V. Van Regenmortel et al (eds), Virus Taxonomy: Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (2000) (Academic Press/Elsevier, Burlington, Mass., USA);Leicester大学(英国)Microbiology & Immunology Departmentのウイルス分類学ウエブページ(http://wwwmicro.msb.le.ac.uk/3035/Virusgroups.html);ならびに国立医学図書館(国立衛生研究所、米国保健社会福祉省(Washington, D.C.、米国))のNational Center for Biotechnology Information(NCBI)のTaxonomy Browserの「Virus」及び「Viroid」の各オンラインセクション(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/tax.html)において総説される。
カプシドのアミノ酸配列を、植物に対する感染性を有するこれらの分類群のいずれかの任意のメンバーのカプシドから選択することができる。これらの分類群のメンバーのカプシドについてのアミノ酸配列を、例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgiにおいてNCBIによって提供されるPubMed検索サービスの「Nucleotide」(Genbank)、「Protein」及び「Structure」の各オンラインセクション(これらに限定されない)をはじめとする様々な提供元から得ることができる。
ウイルスは、らせんの対称性又は正二十面体の対称性を有するウイルスに分類することができる。一般に認められているカプシド形態には、下記が含まれる。正二十面体型(正二十面体の固有型、等方型、準等方型、及び、二重型又は「双子」型を含む)、多面体型(球状型、卵型及びレモン形状型を含む)、桿状型(桿状型又は銃弾形状型、及び、紡錘状又は葉巻状型を含む)、及び、らせん型(棒型、円筒状及び繊維状を含む);これらはいずれも、尾部を有する場合があり、及び/又は、表面の突出部(例えば、スパイク又はノブなど)を含む場合がある。本発明の1つの実施形態において、カプシドのアミノ酸配列は、いずれかの形態を有するとして分類されるウイルスのカプシドから選択される。
1つの実施形態において、カプシドは棒状の植物ウイルスに由来する。本発明のさらなる実施形態には、カプシドが、タバコモザイクウイルス(TMV)及びジャガイモウイルスX(PVX)から選択される群に由来する棒状ウイルスのカプシドである実施形態が含まれる。TMVは、棒状の粒子(300nm)をもたらす特異なコートタンパク質(17.5kDa)により包まれる一本のプラスセンスゲノムRNA(6.5kb)から成る。タバコモザイクウイルスの幅広い宿主範囲により、様々な植物種を製造システム及び送達システムとして使用することが可能である。このベクターに挿入された外来遺伝子は高レベルのタンパク質を産生し得ることが以前に示されている。Yusibov et al. (1995) 「High-affinity RNA-binding domains of alfalfa mosaic virus coat protein are not required for coat protein-mediated resistance」, Proc. Natl. Acsd. Sci. U.S. 92:8980-8984。ジャガイモウイルスXは繊維状で、エンベロープを有さず、通常、515nm及び13nmの幅の明瞭な典型的(modal)長さを有する曲がりくねったウイルスである。カプシド構造は、3.4nmのピッチを有する基本的ならせんを有する。Varma A, Gibbs AJ, Woods RD, Finch JT (1968) 「Some observations on the structure of the filamentous particles of several plant viruses」, J Gen Virol. 2(1):107-14。他の実施形態において、カプシドタンパク質は、TMVでない植物ウイルスに由来する。
1つの実施形態において、カプシドは正二十面体の形態を有する。一般に、正二十面体ウイルスのウイルスカプシドは、正二十面体(立方体)の対称性で配置される数多くのタンパク質サブユニットより構成される。生来的な正二十面体カプシドは、例えば、カプシドのそれぞれの三角形の面を形成する3つのサブユニットにより構成され得る(その結果、60個のサブユニットにより、完全なカプシドが形成される)。この小さいウイルス構造の代表例が、例えば、バクテリオファージΦX174である。多くの正二十面体ウイルスカプシドは、60個を超えるサブユニットを含有する。正二十面体ウイルスの多くのカプシドは、逆平行の、8本の鎖のβ−バレル折り畳みモチーフを含む。このモチーフは、4つのβ鎖(これらはBIDGと呼ばれる)によるくさび形状のブロックを一方の側に有し、4つのβ鎖(これらはCHEFと呼ばれる)によるくさび形状のブロックを反対側に有する。2つの保存されたα−らせん(これらはA及びBと呼ばれる)もまた存在し、1つがβC及びβDの間に存在し、もう一方がβE及びβFの間に存在する。
1つの実施形態において、正二十面体の植物ウイルス種は、ブニヤウイルス科(Bunyaviridae)、レオウイルス科(Reoviridae)、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)、ルテオウイルス科(Luteoviridae)、ナノウイルス科(Nanoviridae)、パルチチウイルス科(Partitiviridae)、セキウイルス科(Sequiviridae)、チモウイルス科(Tymoviridae)、オウルミアウイルス(Ourmiavirus)、タバコ壊死ウイルスサテライト(Tobacco Necrosis Virus Satellite)、カリモウイルス科(Caulimoviridae)、ジェミニウイルス科(Geminiviridae)、コモウイルス科(Comoviridae)、ソベモウイルス科(Sobemoviridae)、トンブスウイルス科(Tombusviridae)又はブロモウイルス科(Bromoviridae)の分類群のいずれかに属する植物感染性のウイルス種であるか、あるいは、そのような分類群のいずれかのメンバーである植物感染性のウイルス種である。1つの実施形態において、正二十面体の植物ウイルス種は、ルテオウイルス科、ナノウイルス科、パルチチウイルス科、セキウイルス科、チモウイルス科、オウルミアウイルス、タバコ壊死ウイルスサテライト、カリモウイルス科、ジェミニウイルス科、コモウイルス科、ソベモウイルス科、トンブスウイルス科又はブロモウイルス科の分類群のいずれかに属する植物感染性のウイルス種であるか、あるいは、そのような分類群のいずれかのメンバーである植物感染性のウイルス種である。具体的な実施形態において、正二十面体の植物ウイルス種は、カリモウイルス科、ジェミニウイルス科、コモウイルス科、ソベモウイルス科、トンブスウイルス科又はブロモウイルス科のいずれかに属する植物感染性のウイルス種であるか、あるいは、それらのいずれかのメンバーである植物感染性のウイルス種である。他の実施形態において、正二十面体の植物ウイルス種は、コモウイルス科、ソベモウイルス科、トンブスウイルス科又はブロモウイルス科のいずれかに属する植物感染性のウイルス種であるか、あるいは、それらのいずれかのメンバーである植物感染性のウイルス種である。さらなる実施形態において、カプシドはイラルウイルス(Ilarvirus)又はアルファモウイルス(Alfamovirus)に由来する。さらなる実施形態において、カプシドは、タバコ条斑病ウイルス(Tobacco streak virus)、アルファルファモザイクウイルス(Alfalfa mosaic virus、AMV)又はブロモモザイクウイルス(Bromo Mosaic Virus、BMV)に由来する。他の実施形態において、正二十面体の植物ウイルス種は、コモウイルス科又はブロモウイルス科のメンバーである植物感染性のウイルス種が可能である。本発明の実施形態には、ウイルスカプシドがササゲモザイクウイルス(CPMV)又はササゲクロロティックモットルウイルス(CCMV)に由来する実施形態が含まれる。
本発明の実施形態には、本発明で利用されるカプシドタンパク質がCCMVカプシドタンパク質に由来する実施形態が含まれる。より具体的には、カプシドタンパク質は、配列番号11(表4)によって表されるCCMVカプシドのアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、本発明で利用されるカプシドタンパク質は、CCMVのラージカプシドタンパク質の完全なアミノ酸配列、あるいは、配列番号11から選択される少なくとも20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個又はそれ以上のアミノ酸を含むそれらのサブセットが可能である。選択されたカプシドタンパク質は、CCMVのラージカプシドタンパク質のアミノ酸配列、あるいは、配列番号11から選択される少なくとも20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個又はそれ以上のアミノ酸を含むそれらのサブセットに対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。他の実施形態において、カプシドタンパク質は、カプシド融合ペプチドの特性(例えば、宿主における改善された発現、強化された免疫原性、改善された共有結合性、あるいは、改善された折り畳み又は再会合など、これらに限定されない)を改善するために変化させることができる。
他の実施形態において、本発明で利用されるカプシドタンパク質はCPMVのスモールカプシドタンパク質(S CPMVカプシド)に由来する。より具体的には、カプシドタンパク質は、配列番号12(表4)によって表されるS CPMVカプシドのアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、本発明で利用されるカプシドタンパク質は、CPMVのスモールカプシドタンパク質の完全なアミノ酸配列、あるいは、配列番号12から選択される少なくとも20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、210個、213個又はそれ以上のアミノ酸を含むそれらのサブセットが可能である。選択されたカプシドタンパク質は、CPMVのスモールカプシドタンパク質のアミノ酸配列、あるいは、配列番号12から選択される少なくとも20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、210個、213個又はそれ以上のアミノ酸を含むそれらのサブセットに対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。他の実施形態において、カプシドタンパク質は、カプシド融合ペプチドの特性(例えば、宿主における改善された発現、強化された免疫原性、改善された共有結合性、あるいは、改善された折り畳み又は再会合など、これらに限定されない)を改善するために変化させることができる。
別の実施形態において、本発明で利用されるカプシドタンパク質はCPMVのラージカプシドタンパク質(L CPMVカプシド)に由来する。より具体的には、カプシドタンパク質は、配列番号13(表4)によって表されるL CPMVカプシドのアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、本発明で利用されるカプシドタンパク質は、CPMVのラージカプシドタンパク質の完全なアミノ酸配列、あるいは、配列番号12から選択される少なくとも20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、210個、225個、240個、250個、265個、275個、285個、290個、300個、310個、320個、330個、340個、350個、360個、370個、374個又はそれ以上のアミノ酸を含むそれらのサブセットが可能である。選択されたカプシドタンパク質は、CPMVのラージカプシドタンパク質のアミノ酸配列、あるいは、配列番号13から選択される少なくとも20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、210個、225個、240個、250個、265個、275個、285個、290個、300個、310個、320個、330個、340個、350個、360個、370個、374個又はそれ以上のアミノ酸を含むそれらのサブセットに対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。他の実施形態において、カプシドタンパク質は、カプシド融合ペプチドの特性(例えば、宿主における改善された発現、強化された免疫原性、改善された共有結合性、あるいは、改善された折り畳み又は再会合など、これらに限定されない)を改善するために変化させることができる。
e.カプシド融合ペプチドの作製
インフルエンザウイルスに由来するペプチドをコードする核酸が、組み換え融合ペプチドとして発現させることができる構築物を作製するために、植物ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸に遺伝子融合させる。本発明において使用される組み換えカプシドペプチドは、当分野における周知である技術を利用して生物学的発現システムにおいて産生させることができる。例えば、少なくとも1つの抗原性のインフルエンザペプチドに機能的に連結された植物ウイルスカプシドタンパク質の融合ペプチドをコードする核酸構築物を宿主細胞に導入し、発現させることができる。様々な転写調節エレメント及び翻訳調節エレメント、例えば、転写エンハンサー配列、翻訳エンハンサー配列、プロモーター、リボソーム進入部位(内部リボソーム進入部位を含む)、アクチベーター、翻訳開始シグナル及び翻訳停止シグナル、転写ターミネーター、シストロン調節因子、ポリシストロン調節因子など、発現した組み換えカプシドタンパク質融合ペプチドの同定、分離、精製又は単離を容易にするタグ配列、例えば、ヌクレオチド配列"tag"及び"tag"ペプチドコード配列など(これには、His-tag、Flag-tag、T7-tag、S-tag、HSV-tag、B-tag、Strep-tag、ポリアルギニン、ポリシステイン、ポリフェニルアラニン、ポリアスパラギン酸、(Ala-Trp-Trp-Pro)n、チオレドキシン、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、シクロマルトデキストリン、グルコノトランスフェラーゼ、CTP:CMP-3-デオキシ-D-マンノオクツロソン酸シチジルトランスフェラーゼ、trpE又はtrpLE、アビジン、T7遺伝子10、T4 gp55、ブドウ球菌プロテインA、連鎖球菌プロテインG、GST、DHFR、CBP、MBP、ガラクトース結合ドメイン、カルモジュリン結合ドメイン、KSI、c−myc、ompT、ompA、pelB、NusA、ユビキチン、hex-ヒスチジン、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、GFP、YFP、又は、そのような蛍光性タンパク質のアナログ、抗体分子、ヘモシリンA、又は、精製のために有用な公知の結合性パートナーに対する公知の抗原もしくはリガンドを含む)を、宿主細胞における発現のための核酸配列に含めることができる。
インフルエンザウイルスに由来するペプチドをコードする核酸が、組み換え融合ペプチドとして発現させることができる構築物を作製するために、植物ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸に遺伝子融合させる。本発明において使用される組み換えカプシドペプチドは、当分野における周知である技術を利用して生物学的発現システムにおいて産生させることができる。例えば、少なくとも1つの抗原性のインフルエンザペプチドに機能的に連結された植物ウイルスカプシドタンパク質の融合ペプチドをコードする核酸構築物を宿主細胞に導入し、発現させることができる。様々な転写調節エレメント及び翻訳調節エレメント、例えば、転写エンハンサー配列、翻訳エンハンサー配列、プロモーター、リボソーム進入部位(内部リボソーム進入部位を含む)、アクチベーター、翻訳開始シグナル及び翻訳停止シグナル、転写ターミネーター、シストロン調節因子、ポリシストロン調節因子など、発現した組み換えカプシドタンパク質融合ペプチドの同定、分離、精製又は単離を容易にするタグ配列、例えば、ヌクレオチド配列"tag"及び"tag"ペプチドコード配列など(これには、His-tag、Flag-tag、T7-tag、S-tag、HSV-tag、B-tag、Strep-tag、ポリアルギニン、ポリシステイン、ポリフェニルアラニン、ポリアスパラギン酸、(Ala-Trp-Trp-Pro)n、チオレドキシン、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、シクロマルトデキストリン、グルコノトランスフェラーゼ、CTP:CMP-3-デオキシ-D-マンノオクツロソン酸シチジルトランスフェラーゼ、trpE又はtrpLE、アビジン、T7遺伝子10、T4 gp55、ブドウ球菌プロテインA、連鎖球菌プロテインG、GST、DHFR、CBP、MBP、ガラクトース結合ドメイン、カルモジュリン結合ドメイン、KSI、c−myc、ompT、ompA、pelB、NusA、ユビキチン、hex-ヒスチジン、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、GFP、YFP、又は、そのような蛍光性タンパク質のアナログ、抗体分子、ヘモシリンA、又は、精製のために有用な公知の結合性パートナーに対する公知の抗原もしくはリガンドを含む)を、宿主細胞における発現のための核酸配列に含めることができる。
インフルエンザペプチドのための核酸コード配列を所定の部位でウイルスカプシドタンパク質のための核酸コード配列の中に挿入することができる。1つの実施形態において、インフルエンザペプチドが、ウイルス粒子又はウイルス様粒子の形成時にループとして発現されるように、カプシドコード配列の中に挿入される。
インフルエンザペプチドは植物カプシドにおいて2カ所又はそれ以上の挿入部位で挿入することができる。従って、インフルエンザペプチドは、カプシド融合ペプチドが再会合して、ウイルス粒子又はウイルス様粒子を形成するとき、カプシドの2又はそれ以上の表面ループモチーフに挿入することができる。代替として、インフルエンザペプチドはまた、カプシド融合ペプチドが再会合して、ウイルス粒子又はウイルス様粒子を形成するとき、所与のループモチーフの内部において多数の部位で挿入することができる。
加えて、インフルエンザペプチドは、外向きのループ及び/又は内向きのループの内部に、すなわち、それぞれ、カプシドの中心から外に向かって向くカプシドループ、又は、カプシドの中心に向かって向くカプシドループの内部に挿入することができる。カプシドの表面ループにおけるアミノ酸結合又はペプチド結合はいずれも、インフルエンザペプチドのための挿入部位として役立ち得る。典型的には、挿入部位は、ループの中心付近において、すなわち、折り畳まれたカプシドペプチドの三次構造の中心から最も遠くに位置する位置の近くで選択することができる。インフルエンザペプチドをコードする配列は、カプシド融合ペプチドが会合して、ウイルス粒子又はウイルス様粒子を形成するとき、選択されたループのこの中心近くに対応するカプシドコード配列の位置において機能的に挿入することができる。これは、合成されるカプシドのペプチド配列のその部分についての読み枠をペプチド挿入部位の下流側に保持することを含む。
別の実施形態において、インフルエンザペプチドをカプシドのアミノ末端において挿入することができる。インフルエンザペプチドを、1つ又は複数のリンカー配列を介してカプシドに連結することができる。さらに別の実施形態において、インフルエンザペプチドをカプシドのカルボキシ末端において挿入することができる。インフルエンザペプチドはまた、化学的加水分解又は酵素的加水分解によって切断可能であり得る1つ又は複数のリンカーを介してカルボキシ末端に連結することができる。1つの実施形態において、インフルエンザペプチド配列が、アミノ末端及びカルボキシ末端の両方において、又は、一方の末端及び少なくとも1つの内部の場所(例えば、その三次元立体配座においてカプシドの表面に発現される場所など)において連結される。1つの実施形態において、少なくとも1つのインフルエンザ抗原ペプチドが、カプシド融合ペプチドが会合して、ウイルス様粒子を形成するとき、少なくとも1つの内部ループの内部において、又は、少なくとも1つの外側表面ループにおいて発現される。
ウイルスカプシドの2又はそれ以上のループを改変することができる。本発明の実施形態には、インフルエンザ抗原ペプチドが、ウイルス粒子又はウイルス様粒子として組み立てられたとき、少なくとも2つの表面ループの表面に露出する実施形態が含まれる。別の実施形態において、少なくとも2つのインフルエンザ抗原ペプチドがカプシドタンパク質の中に挿入され、ウイルスカプシド、ケージ、ウイルス粒子又はウイルス様粒子の少なくとも2つの表面ループの表面に露出する。別の実施形態において、少なくとも3つのインフルエンザ抗原ペプチドがカプシドタンパク質の中に挿入され、ウイルス粒子又はウイルス様粒子の少なくとも3つの表面ループの表面に露出する。表面ループにおけるインフルエンザペプチドは同じアミノ酸配列を有することができる。別個の実施形態において、表面ループにおけるインフルエンザペプチドのアミノ酸配列は異なることができる。
ウイルスカプシドタンパク質をコードする核酸配列はまた、ウイルス粒子又はウイルス様粒子の形成を変化させるために改変することができる(例えば、Brumfield et al. (2004) J. Gen.Virol. 85:1049-1053を参照のこと)。例えば、3つの一般的な種類の改変が、最も典型的には、ウイルス粒子又はウイルス様粒子の組み立てを変化させるためになされる。これらの改変は、組み立てられたタンパク質ケージにおける内部、外部、又は、隣接サブユニット間の境界を変化させるために設計される。これを達成するために、変異誘発プライマーを使用して、(i)N末端内の塩基性残基(例えば、K、R)を酸性のグルタミン酸で置換することによってウイルス核酸結合領域の内部表面電荷を変化させることができ(Douglas他、2002b);(ii)内部の残基をN末端から除くことができ(例えば、CCMVでは、通常、残基4〜37を除くことができ);(iii)11アミノ酸ペプチドの細胞標的化配列(Graf他、1987)をコードするcDNAを表面露出ループに挿入することができ;また、(iv)金属結合部位を変化させることによってウイルスサブユニット間の相互作用を変化させることができる(例えば、CCMVでは、残基81/148の変異体)。
1つの実施形態において、インフルエンザ抗原ペプチドをササゲクロロティックモットルウイルス(CCMV)由来のカプシドに挿入することができる。本発明の実施形態には、インフルエンザペプチドが配列番号11でのCCMVカプシドタンパク質のアミノ酸129において挿入され得る実施形態が含まれる。別の実施形態において、インフルエンザペプチド配列を、配列番号11でのCCMVカプシドタンパク質のアミノ酸60、アミノ酸61、アミノ酸62又はアミノ酸63において挿入することができる。さらに別の実施形態において、インフルエンザペプチドを配列番号11でのCCMVカプシドタンパク質のアミノ酸129及びアミノ酸60〜63において挿入することができる。1つの実施形態において、配列番号3、配列番号22、配列番号23及び配列番号24からなる群より選択されるM2ペプチド又はその誘導体もしくは相同体がCCMVカプシドタンパク質の中に挿入される。
1つの実施形態において、インフルエンザ抗原ペプチドをササゲモザイクウイルス(CPMV)由来のスモールカプシドに挿入することができる。本発明の実施形態には、インフルエンザペプチドが配列番号12でのCPMVスモールカプシドタンパク質(S CPMVカプシド)のアミノ酸22とアミノ酸23との間に挿入され得る実施形態が含まれる。1つの実施形態において、配列番号3、配列番号22、配列番号23及び配列番号24からなる群より選択されるM2ペプチド又はその誘導体もしくは相同体がCPMVスモールカプシドタンパク質の中に挿入される。
1つの実施形態において、インフルエンザ抗原ペプチドをササゲモザイクウイルス(CPMV)由来のラージカプシドに挿入することができる。本発明の実施形態には、インフルエンザペプチドが配列番号13でのCPMVラージカプシドタンパク質(L CPMV)の中に挿入され得る実施形態が含まれる。1つの実施形態において、配列番号3、配列番号22、配列番号23及び配列番号24からなる群より選択されるM2ペプチド又はその誘導体もしくは相同体がCPMVラージカプシドタンパク質の中に挿入される。
1つの実施形態において、目的とするインフルエンザ抗原ペプチドに隣接するタグ配列、又は、ウイルスカプシドタンパク質の一部に連結されたタグ配列もまた含むことができる。1つの実施形態において、このタグ配列は組み換えカプシド融合ペプチドの精製を可能にする。タグ配列は親和性タグ(例えば、ヘキサヒスチジンの親和性タグなど)が可能である。別の実施形態において、親和性タグはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ分子が可能である。タグはまた、蛍光性分子(例えば、YEP又はGFPなど)、又は、そのような蛍光性タンパク質のアナログが可能である。タグはまた、抗体分子の一部分、あるいは、精製のために有用である公知の結合性パートナーのための公知の抗原又はリガンドが可能である。
本発明では、インフルエンザペプチドを含有する組み換えカプシドペプチドを製造するための合成的システム又は任意のタイプの生物学的発現システムの使用が意図される。カプシドタンパク質発現の現在の方法には、昆虫細胞発現システム、細菌細胞発現システム(例えば、E.coli、B.subtilus及びP.fluorescensなど)、植物発現システム及び植物細胞培養発現システム、酵母発現システム(例えば、S cerevisiae及びP.Pastorisなど)、ならびに、哺乳動物発現システムが含まれる。
1つの実施形態において、カプシド融合ペプチドをコードする核酸構築物が、植物細胞(植物体及び植物細胞培養物を含む)又は蛍光菌細胞から選択される宿主細胞において発現させられる。1つの実施形態において、カプシド融合ペプチドをコードする核酸構築物が植物体宿主において発現させられる。他の実施形態において、カプシド融合ペプチドをコードする核酸構築物が植物細胞培養物において発現させられる。さらに別の実施形態において、カプシド融合ペプチドをコードする核酸構築物が蛍光菌において発現させられる。カプシド融合ペプチドを上記の宿主細胞において発現させるための様々な技術が、例えば、米国特許第5,874,087号、米国特許第5,958,422号、米国特許第6,110,466号、米国特許出願第11/001,626号及び米国特許出願第11/069,601号、ならびに、下記の実施例において記載される。
d.ウイルス粒子又はウイルス様粒子の組み立て
本発明のカプシド融合ペプチドは、宿主細胞から精製し、インビトロで会合させて、ウイルス様粒子又はケージ構造を形成させることができ、ただし、この場合、ウイルス様粒子は宿主細胞の原形質膜を含有さない。組み換えカプシド融合ペプチドが宿主細胞において発現させられると、組み換えカプシド融合ペプチドを、当分野で周知である様々な標準的な技術によって実質的な純度に単離及び精製することができる。単離及び精製の技術は、カプシド融合ペプチドを産生させるために利用された宿主細胞に依存し得る。そのような技術には、PEG沈殿、硫酸アンモニウム沈殿又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィー又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ニッケルクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、調製用電気泳動、変性剤による可溶化、カラムクロマトグラフィーとしてのそのような物質による選択的沈殿法、免疫精製法、サイズ排除クロマトグラフィー、免疫精製法、遠心分離、超遠心分離、密度勾配遠心分離(例えば、スクロース勾配又は塩化セシウム(CsCl)勾配での密度勾配遠心分離)、サイズ排除フィルターによる限外ろ過、及び、当分野で公知の任意の他のタンパク質単離方法が含まれ得るが、これらに限定されない。例えば、明らかにされた分子接着特性を有するカプシドタンパク質融合ペプチドをリガンドに可逆的に融合することができる。適切なリガンドを用いて、カプシドタンパク質融合ペプチドを精製カラムに選択的に吸着させ、その後、比較的純粋な形態でカラムから遊離させることができる。その後、カプシドタンパク質が酵素活性によって除かれる。加えて、カプシドタンパク質融合ペプチドは、免疫アフィニティーカラム又はNi−NTAカラムを使用して精製することができる。一般的な技術がさらに、例えば、R. Scopes, Peptide Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag: N.Y. (1982);Deutscher, Guide to Peptide Purification, Academic Press (1990);米国特許第4,511,503号;S. Roe、Peptide Purification Techniques: A Practiccal Approach (Practiccal Approach Series), Oxford Press (2001);D. Bollaget al., Peptide Methods, Wiley-Lisa, Inc. (1996);AK Patra et al., Peptide Expr Purif, 18(2): p/ 182-92 (2000);及びR. Mukhija et al., Gene 165(2): p. 303-6 (1995)に記載される。また、例えば、Ausubel et al. (1987及び定期的増補物);Deutscher (1990) 「Guide to Peptide Purification」, Methods in Enzymology vol. 182、及び、このシリーズにおける他の巻;Coligan et al. (1996及び定期的増補物)Current Protocols in Peptide Science Wiley/Greene、NY;ならびに、ペプチド精製製品の使用についての製造者の文献、例えば、Pharmacia(Piscataway、N.J.)又はBio−Rad(Richmond、Calif.)を参照のこと。組み換え技術との組合せにより、適切なセグメントへの融合、例えば、FLAG配列、又は、プロテアーゼにより除去可能な配列を介して融合することができる同等物への融合が可能になる。また、例えば、Hochuli (1989) Chemische Industrie 12:69-70;Hochuli (1990) 「Purification of Recombinant Peptides with Metal Chelate Absorbent」, Setloe(eds) Genetic Engineering, Principle and Methods 12:87-98, Plenum Press, NY;及びCrowe et al. (1992) QIAexpress: The High Level Expression & Peptide Purification System, QIAGEN, Inc.(Chatsworth、Calif.)を参照のこと。
本発明のカプシド融合ペプチドは、宿主細胞から精製し、インビトロで会合させて、ウイルス様粒子又はケージ構造を形成させることができ、ただし、この場合、ウイルス様粒子は宿主細胞の原形質膜を含有さない。組み換えカプシド融合ペプチドが宿主細胞において発現させられると、組み換えカプシド融合ペプチドを、当分野で周知である様々な標準的な技術によって実質的な純度に単離及び精製することができる。単離及び精製の技術は、カプシド融合ペプチドを産生させるために利用された宿主細胞に依存し得る。そのような技術には、PEG沈殿、硫酸アンモニウム沈殿又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィー又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ニッケルクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、調製用電気泳動、変性剤による可溶化、カラムクロマトグラフィーとしてのそのような物質による選択的沈殿法、免疫精製法、サイズ排除クロマトグラフィー、免疫精製法、遠心分離、超遠心分離、密度勾配遠心分離(例えば、スクロース勾配又は塩化セシウム(CsCl)勾配での密度勾配遠心分離)、サイズ排除フィルターによる限外ろ過、及び、当分野で公知の任意の他のタンパク質単離方法が含まれ得るが、これらに限定されない。例えば、明らかにされた分子接着特性を有するカプシドタンパク質融合ペプチドをリガンドに可逆的に融合することができる。適切なリガンドを用いて、カプシドタンパク質融合ペプチドを精製カラムに選択的に吸着させ、その後、比較的純粋な形態でカラムから遊離させることができる。その後、カプシドタンパク質が酵素活性によって除かれる。加えて、カプシドタンパク質融合ペプチドは、免疫アフィニティーカラム又はNi−NTAカラムを使用して精製することができる。一般的な技術がさらに、例えば、R. Scopes, Peptide Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag: N.Y. (1982);Deutscher, Guide to Peptide Purification, Academic Press (1990);米国特許第4,511,503号;S. Roe、Peptide Purification Techniques: A Practiccal Approach (Practiccal Approach Series), Oxford Press (2001);D. Bollaget al., Peptide Methods, Wiley-Lisa, Inc. (1996);AK Patra et al., Peptide Expr Purif, 18(2): p/ 182-92 (2000);及びR. Mukhija et al., Gene 165(2): p. 303-6 (1995)に記載される。また、例えば、Ausubel et al. (1987及び定期的増補物);Deutscher (1990) 「Guide to Peptide Purification」, Methods in Enzymology vol. 182、及び、このシリーズにおける他の巻;Coligan et al. (1996及び定期的増補物)Current Protocols in Peptide Science Wiley/Greene、NY;ならびに、ペプチド精製製品の使用についての製造者の文献、例えば、Pharmacia(Piscataway、N.J.)又はBio−Rad(Richmond、Calif.)を参照のこと。組み換え技術との組合せにより、適切なセグメントへの融合、例えば、FLAG配列、又は、プロテアーゼにより除去可能な配列を介して融合することができる同等物への融合が可能になる。また、例えば、Hochuli (1989) Chemische Industrie 12:69-70;Hochuli (1990) 「Purification of Recombinant Peptides with Metal Chelate Absorbent」, Setloe(eds) Genetic Engineering, Principle and Methods 12:87-98, Plenum Press, NY;及びCrowe et al. (1992) QIAexpress: The High Level Expression & Peptide Purification System, QIAGEN, Inc.(Chatsworth、Calif.)を参照のこと。
1つの実施形態において、宿主細胞(特に、細菌宿主細胞)において発現したカプシド融合ペプチドは不溶性の凝集体(「封入体」)を形成する場合がある。いくつかのプロトコルが、ペプチドを封入体から精製するために好適である。例えば、封入体の精製では、典型的には、宿主細胞を、例えば、50mM TRIS/HCL(pH7.5)、50mM NaCl、5mM MgCl2、1mM DTT、0.1mM ATP及び1mM PMSFの緩衝液におけるインキュベーションにより破壊することによる封入体の抽出、分離及び/又は精製が伴う。細胞懸濁物が、典型的には、French Pressへの2回〜3回の通過を使用して溶解される。細胞懸濁物はまた、Polytron(Brinknan Instruments)を使用してホモジネートすることができ、又は、氷上で超音波処理することができる。細菌を溶解する様々な代替法が当業者には明らかである(例えば、Sambrook他(上掲);Ausubel他(上掲)を参照のこと)。
適宜、封入体を可溶化することができ、溶解された細胞懸濁物を典型的には遠心分離して、望ましくない不溶物を除くことができる。封入体を形成したカプシド融合ペプチドは、適合し得る緩衝液による希釈又は透析によって再生することができる。好適な溶媒には、尿素(約4M〜約8M)、ホルムアミド(少なくとも約80%、体積/体積比)及びグアニジン塩酸塩(約4M〜約8M)が含まれるが、これらに限定されない。グアニジン塩酸塩及び類似する薬剤は変性剤であるが、この変性は不可逆的ではなく、再生を、変性剤の除去(例えば、透析による除去)又は希釈を行ったときに生じさせることができる。様々な他の好適な緩衝液が当業者には公知である。
代替として、組み換えカプシド融合ペプチド、ウイルス様粒子又はケージ構造体を宿主のペリプラズムから精製することが可能である。組み換えペプチドが宿主細胞のペリプラズムの中に送られるとき、宿主細胞を溶解した後、細菌のペリプラズム画分を、当業者に公知の他の方法に加えて、低温での浸透圧ショックによって単離することができる。組み換えペプチドをペリプラズムから単離するために、例えば、細菌細胞を遠心分離して、ペレットを形成させることができる。ペレットは、20%のスクロースを含有する緩衝液に再懸濁することができる。細胞を溶解するために、細菌を遠心分離することができ、ペレットを氷冷の5mM MgSO4に再懸濁し、氷浴で約10分間保つことができる。細胞懸濁物を遠心分離することができ、その後、上清をデカンテーションし、保存することができる。上清に存在する組み換えペプチドを、当業者に周知である標準的な分離技術によって宿主ペプチドから分離することができる。
塩による最初の分画により、望まれない宿主細胞ペプチド(又は細胞培養培地に由来するペプチド)の多くを、目的とする組み換えカプシドタンパク質融合ペプチドから分離することができる。1つのそのような例が硫酸アンモニウムであり得る。硫酸アンモニウムは、ペプチド混合物における水の量を効果的に減少させることによってペプチドを沈殿させる。その場合、様々なペプチドがその溶解度に基づいて沈殿する。ペプチドが疎水性であるほど、そのペプチドは、より低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿する可能性が大きくなる。典型的なプロトコルでは、飽和硫酸アンモニウムをペプチド溶液に加え、その結果、得られた硫酸アンモニウム濃度が20%〜30%の間であるようにすることが含まれる。この濃度では、最も疎水性のペプチドが沈殿する。その後、沈殿物は、(目的とするペプチドが疎水性でない限り)捨てられ、硫酸アンモニウムが、目的とするカプシドタンパク質融合ペプチドを沈殿させるために公知の濃度に上清に加えられる。沈殿物は、その後、緩衝液に可溶化され、過剰な塩が、適宜、透析又は透析ろ過のいずれかにより除かれる。ペプチドの溶解度に依拠する様々な他の方法(例えば、低温でのエタノール沈殿など)が当業者には周知であり、これらを、複雑なカプシドタンパク質融合ペプチド混合物を分画するために使用することができる。
組み換えカプシドタンパク質融合ペプチドの分子量を、異なる細孔サイズのメンブラン(例えば、Amiconメンブラン又はMilliporeメンブラン)による限外ろ過を使用して、組み換えカプシドタンパク質融合ペプチドをそれよりも大きいサイズのペプチド及びそれよりも小さいサイズのペプチドから単離するために使用することができる。最初の工程として、カプシドタンパク質融合ペプチドの混合物を、目的とする組み換えカプシド融合ペプチドの分子量よりも低い分子量カットオフを有する細孔サイズのメンブランにより限外ろ過することができる。その後、限外ろ過の保持液を、目的とする組み換えカプシドタンパク質融合ペプチドの分子量よりも大きい分子量カットオフを有するメンブランに対して限外ろ過することができる。組み換えカプシドタンパク質融合ペプチドがメンブランを通過してろ液に入る。その後、ろ液を下記で記載されるようにクロマトグラフィー処理することができる。組み換えカプシド融合ペプチドはまた、そのサイズ、正味の表面電荷、疎水性、及び、リガンドに対する親和性に基づいて、他のペプチドから分離することができる。加えて、カプシドタンパク質に対して惹起された抗体をカラムマトリックスにコンジュゲートすることができ、カプシドタンパク質を免疫精製することができる。これらの方法のすべてが当分野では周知である。様々なクロマトグラフィー技術が、任意のスケールで、また、多くの異なる製造者(例えば、Pharmacia Biotech)からの装置を使用して行われ得ることが当業者には明らかである。
ウイルス様粒子の組み立てでは、正しく折り畳まれたカプシドタンパク質が要求される。しかしながら、VLPの配合及び安定性のために重要であるさらなる要因が存在する場合があり、そのような要因には、とりわけ、pH、イオン強度、ジスルフィド結合、二価カチオンの結合が含まれる。例えば、Brady et al. (1977) 「Dissociation of polyoma virus by the chelation of calcium ions found associated with purified virions」, J. Virol. 23(3):717-724;Gajardo et al. (1977) 「Two proline residues are essential in the calcium binding activity of rotavirus VP7 outer capsid protein」, J. Virol., 71:2211-2216;Walter et al. (1975) 「Intermolecular disulfide bonds: an important structural feature of the polyoma virus capsid」, Cold Spring Har. Symp. Quant. Biol., 39:255-257 (1975);Christansen et al. (1977) 「Characterization of components released by alkali disruption of simian virus 40」, J Viol.、21:1079-1084;Salunke et al. (1986) 「Self-assenmbly of purified polyomavirus capsid protein VP1」, Cell 46:895-904;Salunke et al. (1989) 「Polymorphism in the assembly of polyomavirus capsid protein VP」, Biophys. J., 56:887-900;Garcea et al. (1983) 「Host range transforming gene of polyoma virus plays a role in virus assembly」、Proc. Natl. Sci. USA、80:3613-3617;Xi et al. (1991) 「Baculovirus expression of the human papillomavirus type 16 capsid proteins: detection of L1-L2 protein complexes」, J. Gen. Virol., 72:2981-2988を参照のこと。再組み立てのために利用することができる様々な技術が当分野では周知であり、これらには、実施例6で記載されるような技術が含まれるが、これらに限定されない。
加えて、本発明のカプシド融合ペプチドは、宿主細胞において発現させ、ウイルス粒子、ウイルス様粒子又はケージ構造体としてインビボで組み立てることができ、ただし、この場合、ウイルス粒子又はウイルス様粒子は宿主細胞の原形質膜を含有さない。1つの実施形態において、ウイルス粒子、ウイルス様粒子(VLP)又はケージ構造体が、カプシド融合ペプチドの発現時又は発現後に宿主細胞において形成される。1つの実施形態において、ウイルス粒子、ウイルス様粒子又はケージは、インフルエンザペプチドをウイルス粒子又はウイルス様粒子の表面に露出させる。
1つの実施形態において、ウイルス粒子、ウイルス様粒子又はケージ構造体は、3個〜約200個のカプシド融合ペプチドを含む、組み換えカプシド融合ペプチドの多量体会合物として組み立てられる。1つの実施形態において、ウイルス粒子、ウイルス様粒子又はケージ構造体は、少なくとも30個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも90個又は少なくとも120個のカプシド融合ペプチドを含む。別の実施形態において、それぞれのウイルス粒子、ウイルス様粒子又はケージ構造体が、少なくとも150個のカプシド融合ペプチド、少なくとも160個のカプシド融合ペプチド、少なくとも170個のカプシド融合ペプチド、又は、少なくとも180個のカプシド融合ペプチドを含む。
1つの実施形態において、ウイルス粒子又はウイルス様粒子は正二十面体の構造体として組み立てられる。別の実施形態において、ウイルス様粒子又はウイルスは、カプシド配列が由来する天然ウイルスと同じ幾何形状で組み立てられる。しかしながら、別個の実施形態において、ウイルス粒子又はウイルス様粒子は天然ウイルスの同一の幾何形状を有さない。他の実施形態において、例えば、構造体は、多数のカプシド融合ペプチドから形成される粒子で、しかし、天然型のウイルス粒子を形成しない粒子で組み立てられる。例えば、3個もの少ないウイルスカプシドのケージ構造体を形成させることができる。別個の実施形態において、約6個、9個、12個、15個、18個、21個、24個、27個、30個、33個、36個、39個、42個、45個、48個、51個、54個、57個又は60個のカプシドから成るケージ構造体を形成させることができる。
インビボで組み立てられた植物ウイルス又は植物ウイルス粒子の精製が以前に記載されている。例えば、Dijkstra, J. and De Jager, C.P., 1998;Mathews, R.E.F., 1991, Plant Virology, Third Edition, Academic Press Inc., Harcourt Brace Jovanovich, Publishers, ならびに、下記の実施例を参照のこと。大半のウイルスを下記手法の2つ又はそれ以上の組合せによって単離することができる。高速度沈降、密度勾配分画、ポリエチレングリコールを使用する沈殿形成、塩析、ゲルろ過、クロマトグラフィー及び透析。ウイルス粒子又はウイルス様粒子を含有する細胞が破壊され、細胞内容物が放出され、混合されると、ウイルス粒子又はウイルス様粒子は、異常である環境に見出される。従って、多くの場合、ウイルス粒子又はウイルス様粒子を単離の様々な段階の期間中において無傷かつ非凝集の状態で維持するために設計された人為的な媒体を使用することが必要である。精製されたウイルス調製物又はウイルス様粒子調製物の安定性に有利である条件は、粗抽出物、又は、部分精製された調製物において必要とされる条件と異なる場合がある。そのうえ、種々の要因が、それらがウイルスの安定性に影響を及ぼす程度で強く相互作用する場合がある。好適な媒体を開発する際に考慮される大きな要因には、pH及び緩衝液系、金属イオン及びイオン強度、フェノール系化合物に対して保護する還元剤及び物質、植物のタンパク質及びリボソームを除く添加剤、酵素、ならびに、界面活性剤がある。
多くのウイルスはかなり狭いpH範囲で安定であり、抽出物はこの範囲内で維持されなければならない。緩衝液の選択が重要となる場合がある。リン酸塩緩衝液が多くの場合には用いられ、しかし、リン酸塩緩衝液は、いくつかのウイルス粒子又はウイルス様粒子に対する有害な影響を有する場合がある。いくつかのウイルス粒子又はウイルス様粒子が二価金属イオンの存在を構造的一体性の維持のために要求する。イオン強度もまた重要である場合がある。様々な還元剤がしばしば、抽出媒体に加えられる。これらの物質は、感染性を酸化により容易に失うウイルス粒子又はウイルス様粒子の保存を助ける。それらはまた、宿主成分がウイルスに吸着することを減少させることができる。フェノール系物質は、ウイルス粒子又はウイルス様粒子の単離及び保存において重大な困難さを引き起こすことがある。いくつかの方法が、単離時における植物ウイルス粒子又はウイルス様粒子に対するフェノール系化合物の影響を最小限に抑えるために、程度の差はあるが、首尾よく使用されている。pH7.4の緩衝液における0.01Mでのナトリウム塩としてのEDTAは大半のリボソームの破壊を引き起こし、これにより、ウイルス粒子とのそれらの同時沈降を妨げる。この物質は、二価金属イオンを安定性のために要求しないウイルスについて使用することができる。リボヌクレアーゼ、リボソーム、19Sタンパク質、及び、フラグメント化された葉緑体に由来する緑色の粒状物を、特定のマグネシウム濃度のもとでベントナイトによって容易に吸収することができる。活性炭が、宿主の物質(特に、色素)を吸収及び除去するために使用される場合がある。酵素を様々な目的のために最初の抽出物に加えることができる。例えば、ペクチナーゼ及びセルラーゼは、そうでない場合には繊維画分に保持されるウイルス粒子又はウイルス様粒子の放出を助ける。酵素はまた、そうでない場合にはウイルス粒子又はウイルス様粒子と同時に沈殿する物質を消化する。Triton X−100又はTween 80を時には、不溶性の細胞成分からのウイルス粒子又はウイルス様粒子の放出を助けるために最初の抽出媒体において使用することができる。界面活性剤もまた、植物抽出の最初の清澄化を助けることができる。非イオン性界面活性剤は、ウイルス粒子又はウイルス様粒子に混入し得る細胞膜を解離させる。
様々な手順を、ウイルス粒子又はウイルス様粒子を含有する植物組織を破砕又はホモジネートするために使用することができる。これらには、(i)乳棒及び乳鉢、(ii)様々な回分式の食物ブレンダー及びジュース抽出器、及び(iii)ローラーミル、コロイドミル及び市販の肉ひき機(これらはキログラム単位の組織に対処することができる)が含まれる。抽出媒体が使用されるならば、多くの場合、壊れた細胞が媒体と直ちに接触することを確実にすることが必要である。ホモジネートされた組織は通常、ウイルスを含有する植物液汁と、破砕された植物組織とを分離するためにチーズクロスに通される。粗抽出物において、ウイルス粒子又はウイルス様粒子は、ウイルス粒子又はウイルス様粒子と同じ広いサイズ範囲にあり、かつ、いくつかの点で類似する性質を有し得る様々な細胞成分と混合している。これらの粒子には、リボソーム、葉緑体由来の19Sタンパク質(これは、凝集する傾向がある)、フィトフェリチン、膜フラグメント、及び、壊れた葉緑体のフラグメントが含まれる。壊れていない細胞、細胞のより小さい可溶性タンパク質のすべて、及び、低分子量の溶質もまた存在する。ウイルス単離における最初の工程は、通常、高分子の宿主物質をできる限り除き、ウイルス粒子又はウイルス様粒子を溶液中に残すために設計される。抽出媒体は、リボソーム及び他の高分子量の宿主物質を沈殿させるために、又は、それらを分解するために設計することができる。抽出物は、加熱、有機溶媒(例えば、クロロホルム又はn-ブタノール−クロロホルムなど)のような処理に供することができる。処理済みの抽出物は、その後、かなり低い速度での遠心分離に供される。この処理により、細胞破片及び凝集した宿主物質が沈降する。十分な時間にわたる高速度での遠心分離により、ウイルス粒子又はウイルス様粒子が沈降する。これは、ウイルス粒子を濃縮し、かつ、低分子量物質を除去するという二重の目的を果たすので、非常に有用な工程である。ある種の植物ウイルスは単相ポリエチレングリコール(PEG)系で優先的に沈殿し、しかしながら、いくらかの宿主DNAもまた沈殿する場合がある。PEGによる沈殿形成は、ウイルス粒子又はウイルス様粒子の単離において使用される最も一般的な手法の1つである。沈殿形成のための正確な条件は、pH、イオン強度、及び、高分子の濃度に依存する。いずれかの特定のウイルスを単離することへのその適用は経験的である。PEG沈殿の大きな利点は、費用のかかる超遠心分離が必要とされないことであり、しかしながら、示差的な遠心分離が、精製手順における第2の工程として使用されることが多い。多くのウイルスは、再懸濁することが非常に困難であるペレットを形成することがある。密度勾配遠心分離は、そのようなウイルス粒子又はウイルス様粒子を、ペレット化することなく濃縮するという可能性をもたらし、多くのウイルスについての単離手順において使用される。遠心分離チューブが、チューブの底から上部に向かって低下する密度を有する溶液で部分に満たされる。植物ウイルスについては、スクロースが、そのような勾配を形成するために一般に使用され、ウイルス溶液が勾配の上部に重層される。勾配がセシウム塩により形成される場合、ウイルス粒子又はウイルス様粒子を沈降開始時に溶液全体に分布させることができるか、又は、密度勾配の上部に重層することができる。密度勾配を3つの方法で使用することができる。(i)等密度勾配遠心分離、(ii)レートゾーン(rate zonal)沈降、及び(iii)平衡ゾーン沈降。遠心分離後、ウイルス帯をその光散乱性のために可視化することができる。塩析もまた一般に用いられる。約1/3飽和までの濃度での硫酸アンモニウムが最も一般に使用され、しかしながら、多くの他の塩により、ウイルス粒子又はウイルス様粒子が沈殿する。数時間又は数日間にわたって静置した後、ウイルス粒子又はウイルス様粒子が低速度で遠心分離され、少量の好適な媒体に再溶解される。多くのタンパク質は、その等電点又はその近くで低い溶解度を有する。等電点沈殿を、関与する条件の下で安定であるウイルス粒子又はウイルス様粒子については使用することができる。沈殿物が遠心分離又はろ過によって集められ、好適な媒体に再溶解される。セルロースメンブランによる透析を、低分子量の物質を最初の抽出物から除くために、また、媒体を交換するために使用することができる。透析は、より通常的には、塩析又は結晶化の後で、あるいは、塩溶液又はスクロース溶液における密度勾配分画の後で塩を除くために用いられる。
精製及び濃縮の1つの工程により得られたウイルス調製物又はウイルス様粒子調製物は依然として低分子量の宿主物質及び高分子量の宿主物質を少し含有する。これらのより多くをさらなる精製工程によって除くことができる。その手順は、ウイルス粒子又はウイルス様粒子の安定性及び調製の規模に依存する。時には、高度に精製された調製物を、同じ手順を繰り返し適用することによって得ることができる。例えば、調製物を、反復したPEG沈殿に供することができ、又は、高速度沈降及び低速度沈降の数サイクルに供することができる。後者の手順では、宿主高分子物質の優先的な除去がもたらされる。これは、宿主の高分子物質は、高速度沈降からのペレットが再懸濁されたときには不溶性のままであるからである。一般的に言えば、単離期間中、ウイルス粒子又はウイルス様粒子の異なる性質に依存する少なくとも2つの手順を適用することが有用である。これは、宿主成分を除くことにおいて、同じ手順を繰り返し適用することよりも効果的であると考えられる。特に、さらなる精製、特に、あまり安定でないウイルス粒子又はウイルス様粒子のさらなる精製のための最も有用な手順の1つが、密度勾配遠心分離である。スクロースが、勾配を作製するための最も一般的に使用される物質である。スクロース密度勾配遠心分離はしばしば、さらなる精製のために好まれる方法である。塩(塩化セシウムなど)の高濃度溶液もまた、十分に安定であるウイルスについては効果的な勾配物質である。2つの異なる勾配での連続した分画は時には、有用な結果をもたらす場合がある。アガロースゲル又はSephadexによるろ過は、高速度での遠心分離に伴うペレット化に対して不安定であるウイルス粒子又はウイルス様粒子のさらなる精製のための有用な工程を提供することができる。モノクローナル抗ウイルス抗体を、カラムを通過した溶液からウイルスを特異的に結合するカラムを形成するために担体マトリックス(例えば、アガロースなど)に結合することができる。ウイルスを、pHを低下させることによって溶出することができる。クロマトグラフィー手順を、部分精製された調製物のための効果的な精製工程を提供するために使用することができる。例えば、リン酸塩緩衝液におけるリン酸カルシウムゲルのカラム、セルロースカラム、又は、高速タンパク質液体クロマトグラフィーを、様々なウイルスを精製するために使用することができる。
ウイルスの単離における様々な段階において、ウイルスを濃縮し、また、塩又はスクロースを除くことが必要である。高速度での遠心分離が、ウイルスを濃縮するために、また、低分子量物質の量を減らすために一般に用いられる。透析が塩の除去又は交換のために使用される。
II.インフルエンザの抗原性の完全なタンパク質又はタンパク質フラグメント
本発明では、インフルエンザペプチドを含有する上記で記載されたカプシド融合ペプチドとの組合せで、インフルエンザウイルス(ヒトインフルエンザウイルス及び/又はトリインフルエンザウイルスを含む)に由来する少なくとも1つの単離された抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメント、その誘導体もしくは相同体が利用される。1つの実施形態において、単離された抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメント、その誘導体もしくは相同体は、新しく出現したインフルエンザウイルス株に由来する。
本発明では、インフルエンザペプチドを含有する上記で記載されたカプシド融合ペプチドとの組合せで、インフルエンザウイルス(ヒトインフルエンザウイルス及び/又はトリインフルエンザウイルスを含む)に由来する少なくとも1つの単離された抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメント、その誘導体もしくは相同体が利用される。1つの実施形態において、単離された抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメント、その誘導体もしくは相同体は、新しく出現したインフルエンザウイルス株に由来する。
本発明で利用されるインフルエンザウイルスのタンパク質又はタンパク質フラグメントは、特定されたインフルエンザウイルス株のM1タンパク質、M2タンパク質、HAタンパク質、NAタンパク質、NPタンパク質、PB1タンパク質、PB2タンパク質、PAタンパク質又はNP2タンパク質に由来するタンパク質又はタンパク質フラグメント、あるいは、その誘導体又は相同体が可能である。非常に多数のインフルエンザ株、及び、対応するタンパク質配列が特定され、それらの配列が、National Center for Biotechnology Information(NCBI)のInfluenza Virus Resourceサイト(これはhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.htmlにおいて利用可能である)を介して公開されている。
本発明の1つの実施形態において、インフルエンザウイルスに由来するタンパク質又はタンパク質フラグメントは、HA及びNAのタンパク質又はタンパク質フラグメントからなる群より選択される。本発明のさらなる実施形態には、NAタンパク質又はNAタンパク質フラグメントが、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8及びN9のサブタイプからなる群より選択されるインフルエンザNAタンパク質の群に由来する実施形態が含まれる。1つの実施形態において、インフルエンザウイルスペプチドは、ヒトインフルエンザのNAタンパク質及び/又はトリインフルエンザのNAタンパク質に由来するタンパク質又はタンパク質フラグメントである。
他の実施形態において、インフルエンザウイルスの抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントはインフルエンザのHAタンパク質に由来する。本発明のさらなる実施形態には、HAタンパク質又はHAタンパク質フラグメントが、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14及びH15のサブタイプからなる群より選択されるインフルエンザHAタンパク質の群に由来する実施形態が含まれる。本発明の実施形態には、HAペプチドが、ヒトインフルエンザのHAタンパク質及び/又はトリインフルエンザのHAタンパク質に由来する実施形態が含まれる。さらなる実施形態において、HAペプチドはトリインフルエンザのHAタンパク質に由来することができる。1つの実施形態において、トリHAタンパク質は、H5、H7及びH9のサブタイプから選択される。
本発明の1つの実施形態において、単離された抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントはインフルエンザの新しく出現した株から選択される。世界保健機関は世界中のインフルエンザの疫学的データを年に2回検討し、インフルエンザの新しく出現した株の特定を定期的に更新する。本発明において使用される単離された抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントを得ることにおいて有用である遺伝情報が当業者には利用可能である。例えば、Los Alamos National Laboratoryにより、インフルエンザの新しく出現した株についての遺伝情報を含む、http://www−flu.lanl.gov/において利用可能なInfluenza Srquence databaseが管理される。
本発明の実施形態にはまた、ウイルス様粒子と組み合わされるHAタンパク質又はHAタンパク質フラグメントが、配列番号16(表5)のヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号15(表5)でのA/Thailand/3(SP−83)/2004(H5N1)株の568アミノ酸の配列、その誘導体又は相同体に由来する実施形態が含まれる。他の実施形態において、本発明で利用されるインフルエンザウイルスタンパク質は、A/Thailand/3(SP−83)/2004(H5N1)株のHAタンパク質又はHAタンパク質フラグメントの完全なアミノ酸が可能であり、あるいは、配列番号15から選択される少なくとも20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、220個、240個、260個、280個、300個、320個、340個、360個、380個、400個、420個、440個、460個、480個、500個、520個、540個、560個、565個、568個又はそれ以上のアミノ酸を含むそれらのサブセットが可能である。選択されたインフルエンザウイルスタンパク質は、A/Thailand/3(SP−83)/2004(H5N1)株のHAタンパク質又はHAタンパク質フラグメントのアミノ酸配列、あるいは、配列番号15から選択される少なくとも20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、220個、240個、260個、280個、300個、320個、340個、360個、380個、400個、420個、440個、460個、480個、500個、520個、540個、560個、565個、568個又はそれ以上のアミノ酸を含むそれらのサブセット、あるいは、配列番号15から選択される少なくとも20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個又はそれ以上のアミノ酸を含むそれらのサブセットに対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。他の実施形態において、インフルエンザのタンパク質配列又は核酸配列は、タンパク質の特性(例えば、宿主における改善された発現、強化された免疫原性、又は、改善された共有結合性など、これらに限定されない)を改善するために変化させることができる。
代替として、ウイルス様粒子と組み合わされるHAタンパク質又はHAタンパク質フラグメントは配列番号17(表5)に由来する。他の実施形態において、本発明で利用されるインフルエンザウイルスタンパク質は、配列番号17のHAタンパク質又はHAタンパク質フラグメントの完全なアミノ酸が可能であり、あるいは、配列番号17から選択される少なくとも20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、220個、240個、260個、280個、300個、320個、340個、360個、380個、400個、420個、440個、460個、480個、500個、520個、530個、537個又はそれ以上のアミノ酸を含むそれらのサブセットが可能である。選択されたインフルエンザウイルスタンパク質は、配列番号17のアミノ酸配列、あるいは、配列番号17から選択される少なくとも20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、220個、240個、260個、280個、300個、320個、340個、360個、380個、400個、420個、440個、460個、480個、500個、520個、530個、537個又はそれ以上のアミノ酸を含むそれらのサブセットに対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。他の実施形態において、インフルエンザのタンパク質配列又は核酸配列は、タンパク質の特性(例えば、宿主における改善された発現、強化された免疫原性、又は、改善された共有結合性など、これらに限定されない)を改善するために変化させることができる。
他の実施形態において、HAタンパク質フラグメントは、配列番号19(表5)のヌクレオチド配列によってコードされる、A/Thailand/3(SP−83)/2004(H5N1)株の36kDaのHA1フラグメント(配列番号18、表5)である。他の実施形態において、本発明で利用されるインフルエンザウイルスタンパク質は、配列番号18のHAタンパク質又はHAタンパク質フラグメントの完全なアミノ酸が可能であり、あるいは、配列番号18から選択される少なくとも20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、220個、240個、260個、280個、300個、320個、340個、350個、352個又はそれ以上のアミノ酸を含むそれらのサブセットが可能である。選択されたインフルエンザウイルスタンパク質は、配列番号18のアミノ酸配列、あるいは、配列番号18から選択される少なくとも20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、220個、240個、260個、280個、300個、320個、340個、350個、352個又はそれ以上のアミノ酸を含むそれらのサブセットに対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。他の実施形態において、インフルエンザのタンパク質配列又は核酸配列は、タンパク質の特性(例えば、宿主における改善された発現、強化された免疫原性、又は、改善された共有結合性など、これらに限定されない)を改善するために変化させることができる。
他の実施形態において、HAタンパク質フラグメントは、配列番号21(表5)のヌクレオチド配列によってコードされる、A/Thailand/3(SP−83)/2004(H5N1)株の26kDaのHA2フラグメント(配列番号20、表5)である。他の実施形態において、本発明で利用されるインフルエンザウイルスタンパク質は、配列番号20のHAタンパク質又はHAタンパク質フラグメントの完全なアミノ酸が可能であり、あるいは、配列番号20から選択される少なくとも20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個又はそれ以上のアミノ酸を含むそれらのサブセットが可能である。選択されたインフルエンザウイルスタンパク質は、配列番号20のアミノ酸配列、あるいは、配列番号20から選択される少なくとも20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個又はそれ以上のアミノ酸を含むそれらのサブセットに対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。他の実施形態において、インフルエンザのタンパク質配列又は核酸配列は、タンパク質の特性(例えば、宿主における改善された発現、強化された免疫原性、又は、改善された共有結合性など、これらに限定されない)を改善するために変化させることができる。
本発明の実施形態において、ウイルス様粒子と組み合わされるHAタンパク質又はHAタンパク質フラグメントは、配列番号26〜配列番号28(表5)のヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号25(表5)でのA/Vietnam/CL20/2004(H5N1)株の565アミノ酸の配列、その誘導体又は相同体に由来する。他の実施形態において、本発明で利用されるインフルエンザウイルスタンパク質は、A/Vietnam/CL20/2004(H5N1)株のHAタンパク質又はHAタンパク質フラグメントの完全なアミノ酸が可能であり、あるいは、配列番号25から選択される少なくとも20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、220個、240個、260個、280個、300個、320個、340個、360個、380個、400個、420個、440個、460個、480個、500個、520個、540個、560個、565個又はそれ以上のアミノ酸を含むそれらのサブセットが可能である。1つの実施形態形態において、本発明で利用されるインフルエンザウイルスタンパク質は、生来的なN末端シグナルならびにC末端の膜貫通ドメイン及び細胞質テールを有さない、配列番号29(表5)でのA/Vietnam/CL20/2004(H5N1)株のHAタンパク質フラグメントが可能である。選択されたインフルエンザウイルスタンパク質は、A/Vietnam/CL20/2004(H5N1)株のHAタンパク質又はHAタンパク質フラグメントのアミノ酸配列、あるいは、配列番号25及び配列番号29から選択される少なくとも20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、220個、240個、260個、280個、300個、320個、340個、360個、380個、400個、420個、440個、460個、480個、500個、520個、540個、560個、565個又はそれ以上のアミノ酸を含むそれらのサブセット、あるいは、配列番号25及び配列番号29から選択される少なくとも20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個又はそれ以上のアミノ酸を含むそれらのサブセットに対して少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%の相同性を示すことができる。他の実施形態において、インフルエンザのタンパク質配列又は核酸配列は、タンパク質の特性(例えば、宿主における改善された発現、強化された免疫原性、又は、改善された共有結合性など、これらに限定されない)を改善するために変化させることができる。
1つの実施形態において、インフルエンザペプチドを含有するウイルス様粒子は、インフルエンザウイルス(ヒトインフルエンザウイルス又はトリインフルエンザウイルスを含む)に由来する少なくとも1つのNAタンパク質又はNAタンパク質フラグメント、及び、インフルエンザウイルス(ヒトインフルエンザウイルス又はトリインフルエンザウイルスを含む)に由来する少なくとも1つのHAタンパク質又はHAタンパク質フラグメントと組み合わせられる。さらなる実施形態において、インフルエンザペプチドを含有するウイルス様粒子は、インフルエンザウイルスに由来する少なくとも1つのNAタンパク質又はNAタンパク質フラグメント、インフルエンザウイルスに由来する少なくとも1つのHAタンパク質又はHAタンパク質フラグメント、ならびに、M1、M2、NP、PB1、PB2、PA及びNP2からなる群より選択されるインフルエンザウイルスのタンパク質又はタンパク質フラグメント(ヒトインフルエンザ及び/又はトリインフルエンザのタンパク質又はタンパク質フラグメントを含む)、その誘導体又は相同体の任意の組合せと組み合わせられる。
a.抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントの製造
本発明では、インフルエンザの抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントを製造するための合成的システム又は任意のタイプの生物学的発現システムの使用が意図される。タンパク質発現の現在の方法には、昆虫細胞発現システム、細菌細胞発現システム(例えば、E.coli、B.subtilus及びP.fluorescensなど)、植物発現システム及び植物細胞培養発現システム、酵母発現システム(例えば、S cerevisiae及びP.pastorisなど)、ならびに、哺乳動物発現システムが含まれる。
本発明では、インフルエンザの抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントを製造するための合成的システム又は任意のタイプの生物学的発現システムの使用が意図される。タンパク質発現の現在の方法には、昆虫細胞発現システム、細菌細胞発現システム(例えば、E.coli、B.subtilus及びP.fluorescensなど)、植物発現システム及び植物細胞培養発現システム、酵母発現システム(例えば、S cerevisiae及びP.pastorisなど)、ならびに、哺乳動物発現システムが含まれる。
1つの実施形態において、タンパク質又はタンパク質フラグメントが、植物細胞(植物体及び植物細胞培養物を含む)又は蛍光菌細胞から選択される宿主細胞において発現させられる。本発明のさらなる実施形態には、タンパク質又はタンパク質フラグメントが植物体の宿主において発現させられる実施形態が含まれる。さらなる実施形態において、タンパク質又はタンパク質フラグメントが植物細胞培養において発現させられる。組み換えのタンパク質又はタンパク質フラグメントを上記の宿主細胞において発現させるための様々な技術が当分野では周知である。1つの実施形態において、植物ウイルスベクターが、インフルエンザのタンパク質又はタンパク質フラグメントを植物体又は植物細胞において発現させるために使用される。本発明の実施形態には、PVXベクターが、HAタンパク質又はHAタンパク質フラグメントをニコチアナ・ベンタミアナ(Nicotiana benthamiana)植物において発現させるために使用される実施形態が含まれる。別の実施形態において、PVXベクターが、HAタンパク質又はHAタンパク質フラグメントをタバコNT1植物細胞において発現させるために使用される。ウイルスベクターを利用するための技術が、例えば、米国特許第4,885,248号、米国特許第5,173,410号、米国特許第5,500,360号、米国特許第5,602,242号、米国特許第5,804,439号、米国特許第5,627,060号、米国特許第5,466,788号、米国特許第5,670,353号、米国特許第5,633,447号及び米国特許第5,846,795号、ならびに、下記の実施例14及び実施例15に記載される。他の実施形態において、トランスジェニック植物又はトランスジェニック植物細胞培養物が、HAタンパク質又はHAタンパク質フラグメントを発現させるために使用される。タンパク質又はタンパク質フラグメントをトランスジェニック植物又はトランスジェニック植物細胞において発現させるために利用される様々な方法が当分野では周知である。1つの実施形態において、また、実施例18及び実施例19において、HAタンパク質又はHAタンパク質フラグメントが蛍光菌の細胞質又はペリプラズムにおいて発現させられる。
宿主細胞において発現したインフルエンザのタンパク質又はタンパク質フラグメントの単離及び精製のために利用することができる方法は、カプシド融合ペプチドの単離及び精製のための例において以前に記載された方法と類似するか、又は同じである。
III.インフルエンザペプチド含有VLP及びインフルエンザ抗原タンパク質の組合せ
本発明は、i)ウイルス粒子又はウイルス様粒子を形成するために会合することができる組み換えカプシド融合ペプチドを形成する植物ウイルス由来のカプシドタンパク質に融合させる、インフルエンザウイルスに由来する少なくとも1つのペプチドと、ii)インフルエンザウイルスに由来する少なくとも1つの抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントとを含む、インフルエンザウイルスに対するワクチンとして使用される組成物を提供する。本発明の1つの実施形態において、抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントはウイルス様粒子に化学的に結合又は連結されない。他の実施形態において、抗原性のインフルエンザタンパク質又はインフルエンザタンパク質フラグメントはウイルス粒子又はウイルス様粒子に化学的にコンジュゲートされる。例えば、図1及び図2を参照のこと。
本発明は、i)ウイルス粒子又はウイルス様粒子を形成するために会合することができる組み換えカプシド融合ペプチドを形成する植物ウイルス由来のカプシドタンパク質に融合させる、インフルエンザウイルスに由来する少なくとも1つのペプチドと、ii)インフルエンザウイルスに由来する少なくとも1つの抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントとを含む、インフルエンザウイルスに対するワクチンとして使用される組成物を提供する。本発明の1つの実施形態において、抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントはウイルス様粒子に化学的に結合又は連結されない。他の実施形態において、抗原性のインフルエンザタンパク質又はインフルエンザタンパク質フラグメントはウイルス粒子又はウイルス様粒子に化学的にコンジュゲートされる。例えば、図1及び図2を参照のこと。
本発明の抗原性のインフルエンザタンパク質又はインフルエンザタンパク質フラグメント及びウイルス様粒子は、当分野における任意のコンジュゲート方法を使用してコンジュゲートすることができる。例えば、Gillitzer E, Willits D, Young M, Douglas T. (2002) 「Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation」, Chem Commun (Camb) 20:2390-1;Wang Q, Kaltgrad E, Lin T, Johnson JE, Finn MG (2002) 「Natural supramolecular building blocks. Wild-type cowpea mosaic virus」 Chem Biol. 9(7):805-11;Wang Q, Lin T, Tang L, Johnson JE, Finn MG (2002) 「Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks」, Angew Chem Int Ed Engl. 41(3):459-62;Raja et al. (2003) 「Hybrid virus-polymer materials. 1. Synthesis and properties of Peg-decorated cowpea mosaic virus」, Biomacromolecules 4:472-476;Wang Q、Linn T, Johnson JE, Finn MG (2002) 「Natural supramolecular building blocks. Cysteine-added mutants of cowpea mosaic virus」, Chem Biol. 9(7):813-9を参照のこと。
他のコンジュゲート方法には、例えば、スルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(sSMCC)、N-[ε-マレイミドカプロイルオキシ]スルホスクシンイミドエステル(sEMCS)、N-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、グルタルアルデヒド、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDCI)、ビス-ジアゾベンジジン(BDB)又はN-アセチルホモシステインチオラクトン(NAHT)を使用することが含まれ得る。
キャリアマレイミド活性化方法では、コンジュゲートが、スルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(sSMCC)又はN-マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)を使用して達成される。sSMCCを使用する方法が広く使用され、非常に特異的である(例えば、Meyer他、2002、J.of Virol.76、2150−2158を参照のこと)。sSMCCにより、システイン残基のSH基がウイルス様タンパク質上のリシン残基のアミノ基に架橋される。
sSMCCを使用するコンジュゲート反応では、ウイルス様粒子が最初に、sSMCC試薬をウイルス粒子又はウイルス様粒子のアミン残基(例えば、リシン残基)に結合することによって活性化される。活性化されたウイルス粒子又はウイルス様粒子を過剰な試薬及び副生成物から分離した後、システイン含有ペプチドが加えられ、連結が、SH基を活性化されたウイルス粒子又はウイルス様粒子のマレイミド官能基に付加することによって生じる。MBSを使用する方法では、ペプチド及びウイルス粒子又はウイルス様粒子が類似の機構によってコンジュゲートされる。
sSMCCを使用するコンジュゲートはSH基に対して非常に特異的であり得る。従って、抗原性のインフルエンザタンパク質又はインフルエンザタンパク質フラグメントにおけるシステイン残基が容易なコンジュゲートのために不可欠である。抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントがシステイン残基を有さないならば、システイン残基を、好ましくはN末端又はC末端において、ペプチドに付加することができる。タンパク質又はタンパク質フラグメントにおける所望されるエピトープがシステインを含有するならば、コンジュゲートは、sSMCCにより活性化されたウイルス粒子又はウイルス様粒子を使用しない方法により達成されるに違いない。タンパク質又はタンパク質フラグメントが2又はそれ以上のシステイン残基を含有するならば、タンパク質又はタンパク質フラグメントは、余分なシステイン残基を除去又は修飾することができない限り、sSMCCを使用してウイルス粒子又はウイルス様粒子にコンジュゲートされないに違いない。
連結は、タンパク質又はタンパク質フラグメントにおける所望されるエピトープを妨害してはならない。システインは、好ましくは、所望されるエピトープ配列から、スペーサーとしての少なくとも1個のアミノ酸の距離により離される。
本発明において有用な別のコンジュゲートが、N-アセチルホモシステインチオラクトン(NAHT)を使用して達成される。例えば、チオラクトンを、チオール官能基をウイルス粒子又はウイルス様粒子の表面に導入して、マレイミド化ペプチド又はブロモ-アセチル化ペプチドとのコンジュゲートを可能にするために使用することができる(Tolman et al., Int. J. Peptide Protein Res. 41, 1993, 455-466;Conley et al., Vaccine 1994, 12, 445-451)。
本発明のさらなる実施形態において、タンパク質又はタンパク質フラグメントをウイルス粒子又はウイルス様粒子にカップリングするためのコンジュゲート反応は、内因性の求核基を一方の反応物に導入すること、及び/又は、一方の反応物における内因性の求核基を使用すること、ならびに、内因性の親電子基を一方の反応物に導入すること、及び/又は、一方の反応物における内因性の親電子基を使用することを伴う。1つの活性化スキームは、求核性のチオール基をウイルス粒子又はウイルス様粒子に導入し、かつ、親電子性の基(好ましくは、アルキルハリド又はマレイミド)をインフルエンザタンパク質又はインフルエンザタンパク質フラグメントに付加することである。得られるコンジュゲートは、タンパク質又はタンパク質フラグメント及びウイルス粒子又はウイルス様粒子を連結するチオールエーテル結合を有する。インフルエンザタンパク質又はインフルエンザタンパク質フラグメントの親電子基(マレイミド又はアルキルハリド)と、ウイルス粒子又はウイルス様粒子の内因性の求核基(好ましくは、第一級アミン又はチオール)との直接の反応により、二次的なアミン連結又はチオールエーテル結合がもたらされる。代わりのスキームでは、マレイミド基又はアルキルハリドをウイルス粒子又はウイルス様粒子に付加すること、及び、末端システインをインフルエンザタンパク質又はインフルエンザタンパク質フラグメントに導入すること、及び/又は、インフルエンザの内因性タンパク質のチオールを再び使用し、これにより、チオールエーテル連結を生じさせることが伴う。
含硫アミノ酸は反応性のイオウ基を含有する。含硫アミノ酸の例には、システイン及び非タンパク質アミノ酸(例えば、ホモシステインなど)が含まれる。加えて、反応性のイオウは、活性化、及び、ウイルス粒子又はウイルス様粒子との反応の前においてジスルフィド形態で存在する場合がある。例えば、インフルエンザタンパク質又はインフルエンザタンパク質フラグメントに存在するシステインを、親電子基(例えば、マレイミド又はアルキルハリドなど)により活性化されたウイルス粒子又はウイルス様粒子に対するカップリング反応において使用することができる。反応性のマレイミド及び活性化エステルを含有するヘテロ二官能性架橋剤を使用するマレイミド基の導入が一般的である。
インフルエンザタンパク質をウイルス様粒子に連結する共有結合性リンカーは生理学的条件のもとで安定であり得る。そのようなリンカーの例が、非特異的な架橋剤、モノジェネティック(monogenetic)スペーサー及びバイジェネリック(bigeneric)スペーサーである。非特異的な架橋剤及びその使用が当分野では周知である。そのような試薬及びその使用の例には、グルタルアルデヒドとの反応;スクシニル化されたウイルス粒子又はウイルス様粒子の混合物の存在下又は非存在下でのN-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドとの反応;グリコシル化された置換基の過ヨウ素酸酸化、それに続く、水素化ホウ素ナトリウム又はシアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下でのウイルス粒子又はウイルス様粒子の遊離アミノ基へのカップリング;アシル化されていない末端セリン残基及びトレオニン残基の過ヨウ素酸酸化は末端アルデヒドを生じさせることができ、その後、末端アルデヒドはアミン又はヒドラジドと反応して、シアノ水素化ホウ素物で第二級アミンに還元することができるシッフ塩基又はヒドラゾンを生じさせることができる;芳香族アミノ基のジアゾ化、それに続く、タンパク質のチロシン側鎖残基でのカップリング;イソシナートとの反応;又は混合無水物の反応が含まれる。一般には、Briand他、1985 J.Imm.Meth.78:59を参照のこと。
モノジェネリック(monogeneric)スペーサー及びその使用が当分野では周知である。モノジェネリックスペーサーは二官能性であり、反応対のパートナーの一方のみの官能基化が、コンジュゲートが行われる前に要求される。バイジェネリックスペーサー及びその使用が当分野では周知である。バイジェネリックスペーサーは、反応対のそれそれのパートナーが官能基化された後に形成される。コンジュゲートが、それぞれの官能基化されたパートナーがその相対するパートナーと反応して、安定な共有結合性の結合を形成するときに生じる(例えば、Marburg他、1986 J.Am.Chem.Sot.108:5282−5287、及び、米国特許第4,695,624号(Marburg他)を参照のこと)。
本発明の利点の1つは、コンジュゲートにおけるウイルス粒子又はウイルス様粒子に対するインフルエンザタンパク質の様々なモル比を達成することができることである。ウイルス粒子又はウイルス様粒子におけるこの「ペプチドカップリング負荷」は、コンジュゲート手法の態様を、所望の性質を有するコンジュゲートを達成するために試行錯誤的に変更することによって変化させることができる。例えば、ウイルス粒子又はウイルス様粒子におけるすべての反応性部位がインフルエンザタンパク質又はインフルエンザタンパク質フラグメントにコンジュゲートされるように、大きいカップリング負荷が所望されるならば、ウイルス粒子又はウイルス様粒子における反応性部位を評価し、大モル過剰量のインフルエンザタンパク質又はインフルエンザタンパク質フラグメントをカップリング反応に含むことができる。低密度のカップリング負荷が所望されるならば、ウイルス粒子又はウイルス様粒子における反応性部位の1モルについて1mol未満のモル比のインフルエンザタンパク質を含むことができる。
選ばれる具体的な条件は究極的には、達成される収率、コンジュゲートの物理的性質、得られるコンジュゲートの効力、投与することが望まれる患者集団及び所望される投与量によって左右される。ワクチンにおける総タンパク質が重要な検討事項でないならば、異なるカップリング負荷及び異なる免疫原性のコンジュゲートの服用量を、同じ効果的な服用量を送達するために処方することができる。しかしながら、総タンパク質又は総体積が重要な検討事項であるならば、例えば、コンジュゲートが、混合ワクチンで使用されることが意図されるならば、コンジュゲートが最終的な混合ワクチンに寄与する総体積又は総タンパク質に留意することができる。その場合、異なるカップリング負荷を有するいくつかのコンジュゲートの免疫原性を評価し、その後、十分な免疫原性と、混合ワクチンに添加するために許容可能なレベルの総タンパク質又は総体積とを有するコンジュゲートを使用することを選ぶことができる。
IV.ワクチン
本発明は、インフルエンザウイルスに対するワクチンとして使用される組成物を提供する。1つの実施形態において、本発明の組成物を含む医薬組成物は酸性塩又は塩基性塩として調製することができる。医薬品として許容し得る塩(これは水溶性製造物又は油溶性製造物又は分散性製造物の形態である)には、例えば、無機又は有機の酸又は塩基から形成される従来からの非毒性の塩又は常用されるアンモニウム塩が含まれる。そのような塩の例には、酸付加塩、例えば、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、2-ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩(pamoate)、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシラート及びウンデカン酸塩など、ならびに、塩基の塩、例えば、アンモニウム塩、アルカリ金属塩(例えば、ナトリウム塩及びカリウム塩など)、アルカリ土類金属塩(例えば、カルシウム塩及びマグネシウム塩など)、有機塩基との塩(例えば、ジシクロヘキシルアミン塩、N-メチル-D-グルカミンなど)、及び、アミノ酸(例えば、アルギニン及びリシンなど)との塩などが含まれる。
本発明は、インフルエンザウイルスに対するワクチンとして使用される組成物を提供する。1つの実施形態において、本発明の組成物を含む医薬組成物は酸性塩又は塩基性塩として調製することができる。医薬品として許容し得る塩(これは水溶性製造物又は油溶性製造物又は分散性製造物の形態である)には、例えば、無機又は有機の酸又は塩基から形成される従来からの非毒性の塩又は常用されるアンモニウム塩が含まれる。そのような塩の例には、酸付加塩、例えば、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、2-ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩(pamoate)、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシラート及びウンデカン酸塩など、ならびに、塩基の塩、例えば、アンモニウム塩、アルカリ金属塩(例えば、ナトリウム塩及びカリウム塩など)、アルカリ土類金属塩(例えば、カルシウム塩及びマグネシウム塩など)、有機塩基との塩(例えば、ジシクロヘキシルアミン塩、N-メチル-D-グルカミンなど)、及び、アミノ酸(例えば、アルギニン及びリシンなど)との塩などが含まれる。
本発明の1つの実施形態において、本発明の組成物は、アジュバントを伴うことなく動物又は患者に投与される。他の実施形態において、本発明の組成物はアジュバントとともに投与される。
アルミニウムに基づく様々なアジュバントが当分野では一般に使用され、これらには、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、アルミニウムヒドロキシホスファート(Aluminium hydroxy-phosphate)及びアルミニウムヒドロキシスルファートホスファート(Aluminium hydroxy-sulphate-phosphate)が含まれる。一般に使用されているアジュバントの商品名には、ADJUPHOS、MERCK ALUM及びALHYDROGELが含まれる。組成物は、使用される具体的なアジュバントについて所望されるように、また、適するように、アジュバントに結合させることができ、又は、アジュバントと同時に沈殿させることができる。
非アルミニウムアジュバントもまた使用することができる。非アルミニウムアジュバントには、QS21、Lipid-A及びその誘導体又は変化体、フロイント完全アジュバント又はフロイント不完全アジュバント、中性リポソーム、ワクチン及びサイトカイン又はケモカインを含有するリポソームが含まれる。さらなるアジュバントには、CpG配列をはじめとする免疫刺激核酸が含まれる。例えば、図3を参照のこと。
本発明の組成物は、例えば、経口、粘膜、静脈内、筋肉内、クモ膜下、硬膜外、腹腔内又は皮下をはじめとする、当分野で現在利用される任意の技術を使用して投与することができる。本発明の実施形態には、組成物が、鼻、口又は皮膚を介して粘膜送達される実施形態が含まれる。本発明のさらなる実施形態には、組成物が鼻腔内送達される実施形態が含まれる。他の実施形態において、組成物は、組成物が製造された植物宿主細胞を消化することによって経口投与される。別の実施形態において、組成物はパッチにより経皮投与される。
好適な服用法が、好ましくは、対象の年齢、体重、性別及び医学的状態;投与経路;所望される効果;及び用いられた具体的な組成物(例えば、インフルエンザタンパク質、ウイルス粒子又はウイルス様粒子におけるタンパク質負荷など)を含めて、当分野で周知である要因を考慮に入れて決定される。ワクチンは多回用量ワクチン接種形式で使用することができる。
1つの実施形態において、服用量は約1ug〜約1.0mgの総タンパク質の範囲から成る。本発明の別の実施形態において、範囲は約0.01mg〜約1.0mgである。しかしながら、送達されるペプチドの量に基づいて投薬量を調節することが好ましい。いずれの実施形態においても、これらの範囲は指針である。より正確な投薬量は、免疫学的に効果的な用量が送達されるように、製造されたコンジュゲートの免疫原性を評価することによって決定することができる。免疫学的に効果的な用量は、患者の免疫系を刺激して、免疫学的応答を確立する用量である。好ましくは、免疫系刺激のレベルは、特定のインフルエンザウイルスによる感染によって引き起こされる疾患に対する長期間の保護を提供するために十分な免疫学的記憶を発達させるために十分である。
服用の時期は、当分野で周知である要因に依存する。最初の投与の後、1回又はそれ以上のブースター服用量を続いて、抗体力価を維持するために施すことができる。服用法の一例が、1日目での服用、1ヶ月又は2ヶ月での2回目の服用、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月又は12ヶ月又は12ヶ月以降のいずれかでの3回目の服用、及び、必要とされるようなその後でのさらに間を置いた間隔でのブースター服用である。
そのようにして生じさせた免疫応答は、インフルエンザウイルスによる感染によって引き起こされる疾患及び衰弱性症状に対して完全又は部分的な保護であり得る。
IV.インフルエンザペプチド含有VLP及びインフルエンザ抗原タンパク質の組合せ物を製造するための方法
本発明の別の態様において、ヒト又は動物におけるインフルエンザワクチンでの使用のための組成物を製造する方法が提供され、この場合、この方法は、
i)M1、M2、HA、NA、NP、PB1、PB2、PA及びNP2からなる群より選択されるインフルエンザウイルスペプチドに遺伝子融合した植物ウイルスカプシドタンパク質を含む組み換えカプシド融合ペプチドをコードする第1の核酸を提供し、第1の核酸を、植物細胞又は蛍光菌細胞から選択される宿主細胞において発現すること;
ii)カプシド融合ペプチドを会合させて、宿主細胞由来の原形質膜又は細胞壁タンパク質を含有さないウイルス粒子又はウイルス様粒子を形成すること;
iii)新しく出現したインフルエンザウイルス株に由来する少なくとも1つの抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントをコードする少なくとも1つの第2の核酸を提供し、第2の核酸を、植物細胞又は蛍光菌細胞である宿主細胞において発現すること(この場合、場合により、新しく出現したインフルエンザウイルス株は世界保健機関によって特定される);及び
iv)抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントを単離及び精製すること;及び
v)ウイルス粒子又はウイルス様粒子と、抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントとを組み合わせて、ヒト又は動物に投与することができる組成物を形成すること
を含む。
本発明の別の態様において、ヒト又は動物におけるインフルエンザワクチンでの使用のための組成物を製造する方法が提供され、この場合、この方法は、
i)M1、M2、HA、NA、NP、PB1、PB2、PA及びNP2からなる群より選択されるインフルエンザウイルスペプチドに遺伝子融合した植物ウイルスカプシドタンパク質を含む組み換えカプシド融合ペプチドをコードする第1の核酸を提供し、第1の核酸を、植物細胞又は蛍光菌細胞から選択される宿主細胞において発現すること;
ii)カプシド融合ペプチドを会合させて、宿主細胞由来の原形質膜又は細胞壁タンパク質を含有さないウイルス粒子又はウイルス様粒子を形成すること;
iii)新しく出現したインフルエンザウイルス株に由来する少なくとも1つの抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントをコードする少なくとも1つの第2の核酸を提供し、第2の核酸を、植物細胞又は蛍光菌細胞である宿主細胞において発現すること(この場合、場合により、新しく出現したインフルエンザウイルス株は世界保健機関によって特定される);及び
iv)抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントを単離及び精製すること;及び
v)ウイルス粒子又はウイルス様粒子と、抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントとを組み合わせて、ヒト又は動物に投与することができる組成物を形成すること
を含む。
1つの実施形態において、ウイルス粒子又はウイルス様粒子が、植物宿主において、例えば、植物体又は植物細胞培養において製造される。他の実施形態において、ウイルス様粒子が蛍光菌宿主細胞において製造される。1つの実施形態において、抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントが、植物宿主において、例えば、植物体又は植物細胞培養において製造される。他の実施形態において、抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントが蛍光菌宿主細胞において製造される。1つの実施形態において、ウイルス粒子又はウイルス様粒子及び抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントが、同じ植物宿主細胞又は蛍光菌宿主細胞において同時に製造され、カプシド融合ペプチドがインビボで会合して、ウイルス粒子又はウイルス様粒子を形成する。代替として、抗原タンパク質及びウイルス様粒子が植物宿主細胞及び/又は蛍光菌宿主細胞において製造され、単離及び精製される。この場合、カプシド融合ペプチドはインビボで会合されられるか、又は、インビトロで再会合させられて、ウイルス様粒子を形成し、また、インフルエンザの抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントと組み合わされて、ヒト又は動物に投与することができる組成物を形成する。
実施例1.ササゲクロロティックモットルウイルス(CCMV)コートタンパク質(CP)内へのA型インフルエンザウイルスのM2−eユニバーサルエピトープのクローニング
A型インフルエンザウイルスのM2タンパク質に由来する2つの23 AAペプチド(M2e−1及びM2e−2)を独立して、CCMVウイルス様粒子(VLP)上に発現させるためにCCMVのCP遺伝子の中にクローン化した。
M2e−1ペプチドの配列:
SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(配列番号1)
M2e−2ペプチドの配列:
SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD(配列番号2)
A型インフルエンザウイルスのM2タンパク質に由来する2つの23 AAペプチド(M2e−1及びM2e−2)を独立して、CCMVウイルス様粒子(VLP)上に発現させるためにCCMVのCP遺伝子の中にクローン化した。
M2e−1ペプチドの配列:
SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(配列番号1)
M2e−2ペプチドの配列:
SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD(配列番号2)
利用されたオリゴヌクレオチドには、下記が含まれる。
M2e−1F
5’CGG GGA TCC TGT CAC TCT TGA CAG AGG TAG AAA CAC CGA TAC GTA ATG AAT GG3’(配列番号14)
M2e−1R
5’CGC AGG ATC CCA TCT GAA GAA TCA TTA CAA CGA CAG CCC CAT TCA TTA CGT ATC3’(配列番号30)
M2e−2F
5’CGG GGA TCC TGT CAC TCT TGA CAG AGG TAG AAA CAC CGA TAC GTA ATG AAT GG3’(配列番号31)
M2e−2R
5’CGC AGG ATC CCA TCT GAA GAG CCA TTA CAA CGA CAT TCC CAT TCA TTA CG 3’(配列番号32)
M2e−1F
5’CGG GGA TCC TGT CAC TCT TGA CAG AGG TAG AAA CAC CGA TAC GTA ATG AAT GG3’(配列番号14)
M2e−1R
5’CGC AGG ATC CCA TCT GAA GAA TCA TTA CAA CGA CAG CCC CAT TCA TTA CGT ATC3’(配列番号30)
M2e−2F
5’CGG GGA TCC TGT CAC TCT TGA CAG AGG TAG AAA CAC CGA TAC GTA ATG AAT GG3’(配列番号31)
M2e−2R
5’CGC AGG ATC CCA TCT GAA GAG CCA TTA CAA CGA CAT TCC CAT TCA TTA CG 3’(配列番号32)
得られたPCR生成物をBamHI制限酵素で消化し、BamHIで切断され、その後、脱リン酸化されたシャトルベクターpESC−CCMV129にサブクローン化した。その後、キメラなCCMV−CP遺伝子のコード配列を、挿入されたペプチド配列の配向及び改変されたCP遺伝子の完全性を保証するために配列決定した。その後、キメラなコートタンパク質遺伝子をシャトルプラスミドからSpeI及びXhoIにおいて切り出し、蛍光菌発現プラスミドpDOW1803にSpeI及びXhoIにおいてサブクローン化した。得られたプラスミドを、その後、テトラサイクリン(15ug/ml)を選抜剤として用いて、エレクトロコンピテントなP.fluorescens MB214にエレクトロポレーションによって形質転換した。
実施例2.ササゲクロロティックモットルウイルス(CCMV)コートタンパク質(CP)内へのA型インフルエンザウイルスのNPエピトープのクローニング
A型インフルエンザウイルスのNPタンパク質に由来する2つのペプチド(NP55−69及びNP147−158)を独立して、CCMVウイルス様粒子(VLP)上に発現させるためにCCMVのCP遺伝子の中にクローン化した。
NP55−69ペプチドの配列:
RLIQNSLTIERMVLS(配列番号9)
NP147−158ペプチドの配列:
TYQRTRALVRTG(配列番号10)
A型インフルエンザウイルスのNPタンパク質に由来する2つのペプチド(NP55−69及びNP147−158)を独立して、CCMVウイルス様粒子(VLP)上に発現させるためにCCMVのCP遺伝子の中にクローン化した。
NP55−69ペプチドの配列:
RLIQNSLTIERMVLS(配列番号9)
NP147−158ペプチドの配列:
TYQRTRALVRTG(配列番号10)
インサートのそれぞれを、実施例1において詳しく記載されるようなサーモサイクル処理プログラムを用いて、重複するDNAオリゴヌクレオチドによって合成した。
オリゴヌクレオチドには、下記が含まれる。
NP55−69F
5’GATCCTGCGCCTGATCCAGAACAGCCTGACCATCGAACGCATGGTGCTGAGCGG3’(配列番号33)
NP55−69R
5’GATCCCGCTCAGCACCATGCGTTCGATGGTCAGGCTGTTCTGGATCAGGCGCAG3’(配列番号34)
NP147−158F
5’GATCCTGACCTACCAGCGCACCCGCGCTCTGGTGCGCACCGGCGG3’(配列番号35)
NP147−158R
5’GATCCCGCCGGTGCGCACCAGAGCGCGGGTGCGCTGGTAGGTCAG3’(配列番号36)
NP55−69F
5’GATCCTGCGCCTGATCCAGAACAGCCTGACCATCGAACGCATGGTGCTGAGCGG3’(配列番号33)
NP55−69R
5’GATCCCGCTCAGCACCATGCGTTCGATGGTCAGGCTGTTCTGGATCAGGCGCAG3’(配列番号34)
NP147−158F
5’GATCCTGACCTACCAGCGCACCCGCGCTCTGGTGCGCACCGGCGG3’(配列番号35)
NP147−158R
5’GATCCCGCCGGTGCGCACCAGAGCGCGGGTGCGCTGGTAGGTCAG3’(配列番号36)
得られたPCR生成物をBamHI制限酵素で消化し、BamHIで切断され、その後、脱リン酸化されたシャトルベクターpESC−CCMV129にサブクローン化した。その後、キメラなCCMV−CP遺伝子のコード配列を、挿入されたペプチド配列の配向及び改変されたCP遺伝子の完全性を保証するために配列決定した。その後、キメラなコートタンパク質遺伝子をシャトルプラスミドからSpeI及びXhoIにおいて切り出し、蛍光菌発現プラスミドpDOW1803にSpeI及びXhoIにおいてサブクローン化した。得られたプラスミドを、その後、テトラサイクリン(15ug/ml)を選抜剤として用いて、エレクトロコンピテントなP.fluorescens MB214にエレクトロポレーションによって形質転換した。
実施例3.ササゲクロロティックモットルウイルス(CCMV)コートタンパク質(CP)内へのA型インフルエンザウイルスのHAエピトープのクローニング
A型インフルエンザウイルスのHAタンパク質に由来するペプチド(HA91−108)を独立して、CCMVウイルス様粒子(VLP)上に発現させるためにCCMVのCP遺伝子の中にクローン化した。
HA91−108ペプチドの配列:
SKAFSNCYPYDVPDYASL(配列番号7)
A型インフルエンザウイルスのHAタンパク質に由来するペプチド(HA91−108)を独立して、CCMVウイルス様粒子(VLP)上に発現させるためにCCMVのCP遺伝子の中にクローン化した。
HA91−108ペプチドの配列:
SKAFSNCYPYDVPDYASL(配列番号7)
インサートを、実施例1において詳しく記載されるようなサーモサイクル処理プログラムを用いて、重複するDNAオリゴヌクレオチドによって合成した。
オリゴヌクレオチドには、下記が含まれた:
HA91−108F
5’GATCCTGAGCAAGGCTTTCAGCAACTGCTACCCGTACGACGTGCCGGACTACGCTAGCCTGGG3’(配列番号37)
HA91−108R
5’GATCCCCAGGCTAGCGTAGTCCGGCACGTCGTACGGGTAGCAGTTGCTGAAAGCCTTGCTCAG3’(配列番号38)
HA91−108F
5’GATCCTGAGCAAGGCTTTCAGCAACTGCTACCCGTACGACGTGCCGGACTACGCTAGCCTGGG3’(配列番号37)
HA91−108R
5’GATCCCCAGGCTAGCGTAGTCCGGCACGTCGTACGGGTAGCAGTTGCTGAAAGCCTTGCTCAG3’(配列番号38)
得られたPCR生成物をBamHI制限酵素で消化し、BamHIで切断され、その後、脱リン酸化されたシャトルベクターpESC−CCMV129にサブクローン化した。その後、キメラなCCMV−CP遺伝子のコード配列を、挿入されたペプチド配列の配向及び改変されたCP遺伝子の完全性を保証するために配列決定した。その後、キメラなコートタンパク質遺伝子をシャトルプラスミドからSpeI及びXhoIにおいて切り出し、蛍光菌発現プラスミドpDOW1803にSpeI及びXhoIにおいてサブクローン化した。得られたプラスミドを、その後、テトラサイクリン(15ug/ml)を選抜剤として用いて、エレクトロコンピテントなP.fluorescens MB214にエレクトロポレーションによって形質転換した。
実施例4.組み換えCCMVカプシド融合ペプチドの発現
CCMV129融合ペプチドの発現プラスミドを下記のプロトコルに従って蛍光菌MB214宿主細胞に形質転換した。宿主細胞を、氷の上に維持されたバイアルにおいて徐々に解凍した。それぞれの形質転換のために、1μLの精製された発現プラスミドDNAを宿主細胞に加え、得られた混合物をピペットチップにより穏やかにゆすって混合し、その後、氷上で30分間インキュベーションした。混合物をエレクトロポレーション用の使い捨てキュベット(BioRad Gene Pulser Cuvette、0.2cmの電極間隔、カタログ番号165−2086)に移した。キュベットを、200オーム、25μファラッド、2.25kVで事前に設定されたBiorad Gene Pulserに入れた。細胞に短時間のパルス処理を行った(約1秒〜2秒)。その後、冷LB培地を直ちに加え、得られた懸濁物を30℃で2時間インキュベーションした。その後、細胞をLB tet15(テトラサイクリン補充LB培地)寒天に置床し、30℃で一晩成長させた。
CCMV129融合ペプチドの発現プラスミドを下記のプロトコルに従って蛍光菌MB214宿主細胞に形質転換した。宿主細胞を、氷の上に維持されたバイアルにおいて徐々に解凍した。それぞれの形質転換のために、1μLの精製された発現プラスミドDNAを宿主細胞に加え、得られた混合物をピペットチップにより穏やかにゆすって混合し、その後、氷上で30分間インキュベーションした。混合物をエレクトロポレーション用の使い捨てキュベット(BioRad Gene Pulser Cuvette、0.2cmの電極間隔、カタログ番号165−2086)に移した。キュベットを、200オーム、25μファラッド、2.25kVで事前に設定されたBiorad Gene Pulserに入れた。細胞に短時間のパルス処理を行った(約1秒〜2秒)。その後、冷LB培地を直ちに加え、得られた懸濁物を30℃で2時間インキュベーションした。その後、細胞をLB tet15(テトラサイクリン補充LB培地)寒天に置床し、30℃で一晩成長させた。
1つのコロニーをそれぞれの平板から選び、選んだサンプルをバッフル付き振とうフラスコにおいて50mLのLB種培養に接種した。液体懸濁培養物を、250rpmで振とうしながら30℃で一晩成長させた。その後、それぞれの得られた種培養物の10mLを使用して、1リットルのバッフル付き振とうフラスコにおいて200mLの振とうフラスコ培地(すなわち、酵母抽出物及び微量元素の塩;クエン酸ナトリウムならびにグリセロール、pH6.8)に接種した。テトラサイクリンを選抜のために加えた。接種された培養物を、250rpmで振とうしながら30℃で一晩成長させ、CCMV129融合ペプチドのキメラなコートタンパク質を発現させるためにIPTGにより誘導した。
その後、それぞれの振とうフラスコ培養物からの1mLのアリコットを遠心分離して、細胞をペレットにした。細胞ペレットを、2mMのEDTAを含有する0.75mLの冷50mM Tris−HCl(pH8.2)に再懸濁した。その後、0.1%体積の10% Triton X−100界面活性剤を加え、その後、リゾチームを0.2mg/mLの最終濃度に加えた。その後、細胞を氷上で2時間インキュベーションした。そのとき、透明かつ粘性の細胞溶解物が現れるはずである。
溶解物に1/200体積の1M MgCl2を加え、その後、1/200体積の2mg/mL DNaseIを加え、その後、インキュベーションを氷上で1時間行った。そのときまでに、溶解物は、粘性がはるかに低下した液体になるはずである。その後、処理済みの溶解物を、卓上遠心分離機において最大速度で、4℃で30分間遠心分離し、上清を清浄なチューブに移した。移された上清は「可溶性」タンパク質画分である。その後、残留するペレットを、0.75mLのTE緩衝液(10mM Tris−Cl(pH7.5)、1mM EDTA)に再懸濁した。再懸濁されたペレットは「不溶性」画分である。
実施例5.組み換えCCMVカプシド融合ペプチドの分析
「可溶性」画分及び「不溶性」画分を、製造者の説明書に従って、1.0mmで15個のウエルを有するNuPAGE 4−12% Bis−Trisゲル(Invitrogenから得られる;カタログ:NP0323)で電気泳動した。5ulの各画分を5ulの2X還元SDS−PAGE負荷緩衝液と一緒にし、5分間煮沸し、その後、ゲルで泳動した。ゲルをSimplyBlue Safe Stain(Invitrogenから得られる;カタログ:LC6060)で染色し、水により一晩、脱染色した。
「可溶性」画分及び「不溶性」画分を、製造者の説明書に従って、1.0mmで15個のウエルを有するNuPAGE 4−12% Bis−Trisゲル(Invitrogenから得られる;カタログ:NP0323)で電気泳動した。5ulの各画分を5ulの2X還元SDS−PAGE負荷緩衝液と一緒にし、5分間煮沸し、その後、ゲルで泳動した。ゲルをSimplyBlue Safe Stain(Invitrogenから得られる;カタログ:LC6060)で染色し、水により一晩、脱染色した。
図4は、SimplyBlue Safe Stain(Invitrogen)によって染色されたSDS−PAGEによって検出されたときの、M2e−1インフルエンザウイルスペプチドと融合したCCMV129 CPの蛍光菌での発現を示す。
図5は、SimplyBlue Safe Stain(Invitrogen)によって染色されたSDS−PAGEによって検出されたときの、M2e−2インフルエンザウイルスペプチドと融合したCCMV129 CPの蛍光菌での発現を示す。
図6は、SimplyBlue Safe Stain(Invitrogen)によって染色されたSDS−PAGEによって検出されたときの、NP55−69インフルエンザウイルスペプチドと融合したCCMV129 CPの蛍光菌での発現を示す。
図7は、SimplyBlue Safe Stain(Invitrogen)によって染色されたSDS−PAGEによって検出されたときの、NP147−158インフルエンザウイルスペプチドと融合したCCMV129 CPの蛍光菌での発現を示す。
図8は、SimplyBlue Safe Stain(Invitrogen)によって染色されたSDS−PAGEによって検出されたときの、HA91−108インフルエンザウイルスペプチドと融合したCCMV129 CPの蛍光菌での発現を示す。
実施例6.組み換えCCMV VLPの精製
キメラなCCMV VLPを精製するために使用されたプロトコルは下記の工程を含んだ。(1)細胞溶解、(2)封入体(IB)の洗浄及び分離、(3)IBの可溶化、(4)熱ショックタンパク質(HSP)混入物の除去、(5)エンドトキシンの除去、(6)コートタンパク質の再生、(7)清澄化、(8)VLPの組み立て、(9)PBS(pH7.0)への緩衝液交換、及び(10)滅菌ろ過。
下記の緩衝液を使用した。
a.溶解緩衝液−100mM NaCl/5mM EDTA/0.1−0.2mM PMSF/50mM Tris(pH7.5)
b.緩衝液AU−低イオン強度−8M尿素/1mM DTT/20mM Tris(pH7.5)
c.緩衝液B(8M尿素含有)−1M NaCl/8M尿素/1mM DTT/20mM Tris(pH7.5)
d.CIP溶液−0.5N NaOH/2M NaCl
e.カラム調製溶液−100mM Tris(pH7.5)
f.保存液−20% EtOH
g.緩衝液B−1M NaCl/1mM DTT/20mM Tris(pH7.5)
h.Mustang E(Pall、cat.# MSTG25E3)−ろ過されたウイルス組み立て緩衝液−0.1 NaOAc (pH4.8)、0.1M NaCl、0.0002M PMSF
i.Mustang E−ろ過されたPBS(pH7.0)
キメラなCCMV VLPを精製するために使用されたプロトコルは下記の工程を含んだ。(1)細胞溶解、(2)封入体(IB)の洗浄及び分離、(3)IBの可溶化、(4)熱ショックタンパク質(HSP)混入物の除去、(5)エンドトキシンの除去、(6)コートタンパク質の再生、(7)清澄化、(8)VLPの組み立て、(9)PBS(pH7.0)への緩衝液交換、及び(10)滅菌ろ過。
下記の緩衝液を使用した。
a.溶解緩衝液−100mM NaCl/5mM EDTA/0.1−0.2mM PMSF/50mM Tris(pH7.5)
b.緩衝液AU−低イオン強度−8M尿素/1mM DTT/20mM Tris(pH7.5)
c.緩衝液B(8M尿素含有)−1M NaCl/8M尿素/1mM DTT/20mM Tris(pH7.5)
d.CIP溶液−0.5N NaOH/2M NaCl
e.カラム調製溶液−100mM Tris(pH7.5)
f.保存液−20% EtOH
g.緩衝液B−1M NaCl/1mM DTT/20mM Tris(pH7.5)
h.Mustang E(Pall、cat.# MSTG25E3)−ろ過されたウイルス組み立て緩衝液−0.1 NaOAc (pH4.8)、0.1M NaCl、0.0002M PMSF
i.Mustang E−ろ過されたPBS(pH7.0)
15g〜20gのP.fluorescens湿潤細胞ペーストを50mlの円錐チューブに計り取り、溶解緩衝液を40mlの総体積に加えた。細胞ペースト溶液をボルテックス処理し、幾分か均一になるまで撹拌した。細胞を、高ギアを使用して1280psiでFrench Pressに2回通すことにより溶解した。溶解物(約33ml)を、4℃で10分間、10000xGで遠心分離した。上清を捨てた。ペレットは詰まり、粉末状のコンシステンシーであり、白っぽい色で、細胞ペーストとは異なっていた。4ml〜5mlの溶解緩衝液をペレットに加え、その後、溶液をボルテックス処理し、ペレットが溶解するまでスパチュラにより撹拌した。溶解緩衝液を40mlの総体積に加えた。サンプルを、ペレットが溶解するまでボルテックス処理した。サンプルを、4℃で10分間、10000xGで遠心分離した。IBの洗浄を溶解緩衝液により少なくともさらに1回繰り返し、DI水を使用して最後の1回行った。IBをボルテックス処理によって4ml〜5mlの8M尿素/1mM DTT/20mM Tris(pH7.5)に溶解した。IB溶液の体積を8M尿素/1mM DTT/20mM Tris(pH7.5)により40mlに調節した。この溶液を、適宜、冷却された浴での超音波処理機で15分間にわたって超音波処理し、その後、4℃で一晩ゆすり、その後、(4℃において10000xGで10分間遠心分離することによって、又は、0.45umのWhatman GD/X(cat.# 6976−2504)によるろ過によって)清澄化した。Q−Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)カラムを、10倍カラム体積(CV)の緩衝液AU−低イオン強度−8M尿素/1mM DTT/20mM Tris(pH7.5)(AU−Low)を使用して平衡化した。8mlのIB溶液を1mlの樹脂について負荷し、2mlずつの素通り(FT)分画物を集めた。カラムを、緩衝液AU−Lowを使用して6倍CVにより洗浄し、5倍CVの緩衝液B(8M尿素含有)により溶出した。カラムを、6倍CVのCIP溶液を使用することによって清浄化及び再生し、20% EtOHにおいて保存した。HSP混入物が除かれたCCMVコートタンパク質が、プールされたFT分画物に見出された。Sartobind Q15Xフィルターメンブラン又はQ100Xフィルターメンブラン(Sartorius)を10mlの緩衝液AU−Lowにより平衡化した。IB溶液をこのフィルターでろ過し、ろ液を清澄化した。ろ過された溶液を、5x体積の緩衝液Bを含む容器に加え、直ちに混合した。希釈された溶液を4℃で数分間混合することができ、その後、ゆっくり撹拌しながら、3,500Daのメンブランを使用して4℃で一晩、緩衝液Bに対して透析した。緩衝液を少なくとも1回交換した。透析後、溶液を、適宜清澄化した。再生されたタンパク質の溶液を12時間にわたってウイルス組み立て緩衝液に透析し、遠心分離又は0.2μmでのろ過によって清澄化した。再会合VLPの溶液を、3回の緩衝液交換を使用して、300kDaメンブランの上でウイルス組み立て緩衝液で濃縮し、かつ、PBS(pH7.0)に交換した。最終的な滅菌ろ過を0.2μmのフィルターによって行った。
実施例7.精製された組み換えCCMV VLPのアッセイ
精製されたVLPを、製造者の説明書に従って、1.0mmで15個のウエルを有するNuPAGE 4−12% Bis−Trisゲル(Invitrogenから得られる;カタログ:NP0323)で電気泳動した。5ulのサンプルを5ulの2X還元SDS−PAGE負荷緩衝液と一緒にし、5分間煮沸し、その後、ゲルで泳動した。ゲルをSimplyBlue Safe Stain(Invitrogenから得られる;カタログ:LC6060)で染色し、水により一晩、脱染色した。ウエスタンブロット検出では、抗CCMV IgG(アクセション番号AS0011(DSMZ(ドイツ)から得られる)、抗A型インフルエンザM2タンパク質(マウスモノクローナルIgG1κ、cat #:MA1−082)(ABR(Affinity BioReagents)から得られる)を一次抗体として用い、WESTERN BREEZEキット(Invitrogenから得られる;カタログ:WB7105)を製造者のプロトコルに従って用いた。
精製されたVLPを、製造者の説明書に従って、1.0mmで15個のウエルを有するNuPAGE 4−12% Bis−Trisゲル(Invitrogenから得られる;カタログ:NP0323)で電気泳動した。5ulのサンプルを5ulの2X還元SDS−PAGE負荷緩衝液と一緒にし、5分間煮沸し、その後、ゲルで泳動した。ゲルをSimplyBlue Safe Stain(Invitrogenから得られる;カタログ:LC6060)で染色し、水により一晩、脱染色した。ウエスタンブロット検出では、抗CCMV IgG(アクセション番号AS0011(DSMZ(ドイツ)から得られる)、抗A型インフルエンザM2タンパク質(マウスモノクローナルIgG1κ、cat #:MA1−082)(ABR(Affinity BioReagents)から得られる)を一次抗体として用い、WESTERN BREEZEキット(Invitrogenから得られる;カタログ:WB7105)を製造者のプロトコルに従って用いた。
図9は、SimplyBlue Safe Stain(Invitrogen)によって染色されたSDS−PAGEによって検出されたときの、M2e−1インフルエンザウイルスペプチドと融合した精製CCMV129 CPの蛍光菌での発現及び検出を示す。
図10は、抗CCMV抗体及び抗M2抗体14Bによるウエスタンブロティングによって検出されたときの、M2e−1インフルエンザウイルスペプチドと融合したCCMV129 CPの蛍光菌での発現を示す。M2eペプチドが抗M2抗体によって認識される。
実施例8.ササゲモザイクウイルス(CPMV)コートタンパク質(CP)内へのA型インフルエンザウイルスのM2−eユニバーサルエピトープのクローニング
A型インフルエンザウイルスのM2タンパク質に由来するペプチド(M2e−3)を独立して、CPMVウイルス粒子(VLP)上に発現させるためにCPMVスモールCP遺伝子の中にクローン化した。
M2e−3ペプチドの配列:
SLLTEVETPIRNEGCRCNDSSD(配列番号3)
A型インフルエンザウイルスのM2タンパク質に由来するペプチド(M2e−3)を独立して、CPMVウイルス粒子(VLP)上に発現させるためにCPMVスモールCP遺伝子の中にクローン化した。
M2e−3ペプチドの配列:
SLLTEVETPIRNEGCRCNDSSD(配列番号3)
インサートを、実施例1において詳しく記載されるようなサーモサイクル処理プログラムを用いて、重複するDNAオリゴヌクレオチドによって合成した。
オリゴヌクレオチドは、
M2e−3F
5’ATG GAT AGC TAG CAC TCC TCC TGC TAG TCT GCT GAC CGA AGT GGA AAC CCC GAT TCG CAA CGA AGG CTG3’(配列番号39)
M2e−3R
5’TGC CTG TGA CGT CTG AAA ATG GAT CGC TGC TAT CGT TGC AGC GGC AGC CTT CGT TGC GAA TCG G3’(配列番号40)
であった。
M2e−3F
5’ATG GAT AGC TAG CAC TCC TCC TGC TAG TCT GCT GAC CGA AGT GGA AAC CCC GAT TCG CAA CGA AGG CTG3’(配列番号39)
M2e−3R
5’TGC CTG TGA CGT CTG AAA ATG GAT CGC TGC TAT CGT TGC AGC GGC AGC CTT CGT TGC GAA TCG G3’(配列番号40)
であった。
得られたPCR生成物をAatII及びNheIの制限酵素(NEB)で消化し、AatII及びNheIで切断され、脱リン酸化されたベクターpDOW2604にサブクローン化した。2μlの連結生成物をTop 10 Oneshot大腸菌細胞(Invitrogen)に形質転換した。細胞/連結生成物の混合物を氷上で30分間インキュベーションし、45秒間の熱ショックを与え、その後、0.5mlのLB動物非含有ダイズ加水分解物(Teknova)を加えた。形質転換体を37℃で1時間振とうし、その後、100μg/mlのアンピシリンを選抜のために含むLB動物非含有ダイズ加水分解物寒天平板に置床した。
その後、キメラなCPMV−CP遺伝子(pDOW−M2e−3)のコード配列を、挿入されたペプチド配列の配向及び改変されたCP遺伝子の完全性を保証するために配列決定した。
実施例9.A型インフルエンザウイルスのM2−eユニバーサルエピトープを含有する組み換えCPMVのササゲ植物における産生
植物におけるキメラなCPMV粒子の産生
Ferry Morseから得られるササゲ・カリホルニア#5種子(品番1450)を湿ったペーパータオルにおいて室温で一晩発芽させた。発芽した種子を土に移した。発芽後7日で、実生に、CPMV RNA1及びキメラなCPMV RNA2を研磨剤の存在下で接種した。これらのCPMV RNAを、MluIで切断されたプラスミドpDOW2605、及び、EcoRIで切断されたプラスミドpDOW−M2e−3からのインビトロ転写によって作製した。線状化されたプラスミドDNAを、Qiagenクリーンアップカラム又は同等なクリーンアップキットを使用することによってカラム精製した。転写反応を、CAP(40mM)を含有するT7 MEGAscriptキット(Ambion、カタログ#1334)を製造者の説明書に従って使用することによって行った。転写物の品質を、1μlのRNA転写物をアガロースゲルで泳動することによって分析した。
植物におけるキメラなCPMV粒子の産生
Ferry Morseから得られるササゲ・カリホルニア#5種子(品番1450)を湿ったペーパータオルにおいて室温で一晩発芽させた。発芽した種子を土に移した。発芽後7日で、実生に、CPMV RNA1及びキメラなCPMV RNA2を研磨剤の存在下で接種した。これらのCPMV RNAを、MluIで切断されたプラスミドpDOW2605、及び、EcoRIで切断されたプラスミドpDOW−M2e−3からのインビトロ転写によって作製した。線状化されたプラスミドDNAを、Qiagenクリーンアップカラム又は同等なクリーンアップキットを使用することによってカラム精製した。転写反応を、CAP(40mM)を含有するT7 MEGAscriptキット(Ambion、カタログ#1334)を製造者の説明書に従って使用することによって行った。転写物の品質を、1μlのRNA転写物をアガロースゲルで泳動することによって分析した。
接種後、植物を、2週間〜3週間、16時間の照明及び8時間の消灯の光期間を用いて25℃で成長させた。症状を示した葉を集め、精製前に−80℃で凍結した。
キメラなCPMV粒子の精製
40gのCMPV感染葉組織を−80℃で凍結した。凍結された葉組織を手で粉砕し、Waring高速ブレンダー(品番8011S)に入れた。PMSFを含む120mlの冷AIEC結合緩衝液(30mM Tris Base(pH7.50)、0.2mM PMSF)を、破砕された葉に注いだ。葉を、高速度で3秒間、2回粉砕した。溶液を500mlの遠心分離ボトルにデカンテーションによって移した。ブレンダーを30mlの冷AIEC結合緩衝液により洗浄し、洗浄液を500mlの遠心分離ボトルに注いだ。溶液を15,000Gで30分間遠心分離して、植物細胞破片を除いた。上清をメスシリンダーにデカンテーションによって移した。CPMVウイルスを沈殿させるために、冷PEG6000溶液(20% PEG6000、1M NaCl)を上清に加えて、最終的なPEG濃度を、0.2MのNaClを伴う4%のPEG6000にし、溶液を穏やかに混合した。溶液を氷上で1時間沈殿させた。その後、ウイルス沈殿物の溶液を15,000Gで30分間遠心分離して、CMPVウイルスペレットを集めた。上清を捨て、ウイルスペレットをアニオン交換結合緩衝液(30mM Tris塩基、pH7.50)に直ちに再懸濁した。このウイルス様粒子をさらに精製するために、タンパク質混合物を、Applied Biosystemsから得られるPOROS 50 HQ強アニオン交換樹脂(品番1−2599−11)を使用してアニオン交換クロマトグラフィーによって分画した。20カラム体積のグラジェントは緩衝液A(30mM Tris塩基、pH6.75)から緩衝液B(1M NaClを含む30mM Tris塩基、pH6.75)にであった。クロマトグラフィーを、Amersham Biosciencesから得られるAKTAexplorer(品番18−1112−41)を用いて行った。グラジエントにおける最初のピークが、所望されるウイルス様粒子を含有し、これを、100kDaのカットオフメンブランでのMilliporeスピン濃縮装置(品番UFC910096)を使用してPBSに緩衝液交換した。その後、サンプルを−80℃で保存した。
40gのCMPV感染葉組織を−80℃で凍結した。凍結された葉組織を手で粉砕し、Waring高速ブレンダー(品番8011S)に入れた。PMSFを含む120mlの冷AIEC結合緩衝液(30mM Tris Base(pH7.50)、0.2mM PMSF)を、破砕された葉に注いだ。葉を、高速度で3秒間、2回粉砕した。溶液を500mlの遠心分離ボトルにデカンテーションによって移した。ブレンダーを30mlの冷AIEC結合緩衝液により洗浄し、洗浄液を500mlの遠心分離ボトルに注いだ。溶液を15,000Gで30分間遠心分離して、植物細胞破片を除いた。上清をメスシリンダーにデカンテーションによって移した。CPMVウイルスを沈殿させるために、冷PEG6000溶液(20% PEG6000、1M NaCl)を上清に加えて、最終的なPEG濃度を、0.2MのNaClを伴う4%のPEG6000にし、溶液を穏やかに混合した。溶液を氷上で1時間沈殿させた。その後、ウイルス沈殿物の溶液を15,000Gで30分間遠心分離して、CMPVウイルスペレットを集めた。上清を捨て、ウイルスペレットをアニオン交換結合緩衝液(30mM Tris塩基、pH7.50)に直ちに再懸濁した。このウイルス様粒子をさらに精製するために、タンパク質混合物を、Applied Biosystemsから得られるPOROS 50 HQ強アニオン交換樹脂(品番1−2599−11)を使用してアニオン交換クロマトグラフィーによって分画した。20カラム体積のグラジェントは緩衝液A(30mM Tris塩基、pH6.75)から緩衝液B(1M NaClを含む30mM Tris塩基、pH6.75)にであった。クロマトグラフィーを、Amersham Biosciencesから得られるAKTAexplorer(品番18−1112−41)を用いて行った。グラジエントにおける最初のピークが、所望されるウイルス様粒子を含有し、これを、100kDaのカットオフメンブランでのMilliporeスピン濃縮装置(品番UFC910096)を使用してPBSに緩衝液交換した。その後、サンプルを−80℃で保存した。
実施例10.A型インフルエンザウイルスのM2−eユニバーサルエピトープを含有する組み換えCPMVの分析
スモールコートタンパク質及びラージコートタンパク質の安定性をSDS PAGEによりアッセイした。組み立てられたキメラなCPMVウイルス粒子の完全性を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用してアッセイした。精製された粒子を、製造者の説明書に従って、1.0mmで15個のウエルを有するNuPAGE 4−12% Bis−Trisゲル(Invitrogenから得られる;カタログ:NP0323)で電気泳動した。5ulのサンプルを5ulの2X還元SDS−PAGE負荷緩衝液と一緒にし、5分間煮沸し、その後、ゲルで泳動した。ゲルをSimplyBlue Safe Stain(Invitrogenから得られる;カタログ:LC6060)で染色し、水により一晩、脱染色した。ウエスタンブロット検出では、ポリクローナル抗CPMVポリクローナルウサギIgG J16、抗A型インフルエンザM2タンパク質(マウスモノクローナルIgG1κ、cat #:MA1−082)(ABR(Affinity BioReagents)から得られる)を一次抗体として用い、WESTERN BREEZEキット(Invitrogenから得られる;カタログ:WB7105)を製造者のプロトコルに従って用いた。
スモールコートタンパク質及びラージコートタンパク質の安定性をSDS PAGEによりアッセイした。組み立てられたキメラなCPMVウイルス粒子の完全性を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用してアッセイした。精製された粒子を、製造者の説明書に従って、1.0mmで15個のウエルを有するNuPAGE 4−12% Bis−Trisゲル(Invitrogenから得られる;カタログ:NP0323)で電気泳動した。5ulのサンプルを5ulの2X還元SDS−PAGE負荷緩衝液と一緒にし、5分間煮沸し、その後、ゲルで泳動した。ゲルをSimplyBlue Safe Stain(Invitrogenから得られる;カタログ:LC6060)で染色し、水により一晩、脱染色した。ウエスタンブロット検出では、ポリクローナル抗CPMVポリクローナルウサギIgG J16、抗A型インフルエンザM2タンパク質(マウスモノクローナルIgG1κ、cat #:MA1−082)(ABR(Affinity BioReagents)から得られる)を一次抗体として用い、WESTERN BREEZEキット(Invitrogenから得られる;カタログ:WB7105)を製造者のプロトコルに従って用いた。
図11は、SDS−PAGE、ならびに、抗CPMV抗体及び抗M2抗体14Bによるウエスタンブロティングによって検出されたときの、M2e−1インフルエンザウイルスペプチドと融合したCPMVの植物での発現を示す。M2eペプチドが抗M2抗体によって認識される。
実施例11.植物及び植物細胞における発現のために使用されるHA遺伝子及びHA遺伝子フラグメント
インフルエンザウイルスA/Thailand/3(SP−83)/2004(H5N1)株から配列番号15で特定されるインフルエンザHAをコードする遺伝子を、合成のために、DNA 2.0(DNA 2.0、Menlo Park、CA 94025、米国)に注文した。合成されたHA遺伝子を、植物でのコドン使用頻度の偏りを利用するために、また、作製された制限部位を、同じ制限部位が遺伝子内に存在しない場合、クローニング目的のために遺伝子に隣接して含有するために操作した。合成された全長のHA遺伝子はC末端の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを有さない。図12及び図13を参照のこと。クローニング及び植物細胞での発現のために使用された完全なHA遺伝子のORFのコドン最適化後のヌクレオチド配列が表5に示される(配列番号16の配列)。配列番号16から翻訳される全長のHAタンパク質のアミノ酸配列が表5に示される(配列番号17)。この全長のHAタンパク質はC末端の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを有さず、Hisタグをタンパク質のC末端に含有する。HAタンパク質フラグメント(HA1及びHA2)についてのコドン最適化後のヌクレオチド配列が表5に示される(配列番号19及び配列番号21)。配列番号19及び配列番号21から翻訳されるHA1タンパク質フラグメント及びHA2タンパク質フラグメントのアミノ酸配列が表5に示される(配列番号18及び配列番号20)。両方のHAフラグメントは生来的なシグナルペプチドを含有し、C末端の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインが除かれ、Hisタグをタンパク質フラグメントのC末端に含有する。
インフルエンザウイルスA/Thailand/3(SP−83)/2004(H5N1)株から配列番号15で特定されるインフルエンザHAをコードする遺伝子を、合成のために、DNA 2.0(DNA 2.0、Menlo Park、CA 94025、米国)に注文した。合成されたHA遺伝子を、植物でのコドン使用頻度の偏りを利用するために、また、作製された制限部位を、同じ制限部位が遺伝子内に存在しない場合、クローニング目的のために遺伝子に隣接して含有するために操作した。合成された全長のHA遺伝子はC末端の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを有さない。図12及び図13を参照のこと。クローニング及び植物細胞での発現のために使用された完全なHA遺伝子のORFのコドン最適化後のヌクレオチド配列が表5に示される(配列番号16の配列)。配列番号16から翻訳される全長のHAタンパク質のアミノ酸配列が表5に示される(配列番号17)。この全長のHAタンパク質はC末端の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを有さず、Hisタグをタンパク質のC末端に含有する。HAタンパク質フラグメント(HA1及びHA2)についてのコドン最適化後のヌクレオチド配列が表5に示される(配列番号19及び配列番号21)。配列番号19及び配列番号21から翻訳されるHA1タンパク質フラグメント及びHA2タンパク質フラグメントのアミノ酸配列が表5に示される(配列番号18及び配列番号20)。両方のHAフラグメントは生来的なシグナルペプチドを含有し、C末端の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインが除かれ、Hisタグをタンパク質フラグメントのC末端に含有する。
実施例12.インフルエンザのHA全長体、HA1及びHA2のpDOW3451 PVX型発現ベクターへのクローニング
全長のHA遺伝子を、ベクターGO1129(DNA 2.0)から切り出すことを可能にする制限酵素のEcoRV及びBspE1を使用して単離した。消化されたGO1129をアガロースゲルで泳動して、ベクター骨格をHA遺伝子から分離した。HA遺伝子をゲル精製し、その後、同様にEcoRV+BspE1で切断され、かつ、子ウシアルカリホスファターゼ(CIP)を使用して脱リン酸化されたベクターpDOW3451にサブクローン化した。図14を参照のこと。新しいベクターpDOW3471の成功したクローニングを制限マッピング及びHA遺伝子についてのコロニーPCRスクリーニングによって確認した。
全長のHA遺伝子を、ベクターGO1129(DNA 2.0)から切り出すことを可能にする制限酵素のEcoRV及びBspE1を使用して単離した。消化されたGO1129をアガロースゲルで泳動して、ベクター骨格をHA遺伝子から分離した。HA遺伝子をゲル精製し、その後、同様にEcoRV+BspE1で切断され、かつ、子ウシアルカリホスファターゼ(CIP)を使用して脱リン酸化されたベクターpDOW3451にサブクローン化した。図14を参照のこと。新しいベクターpDOW3471の成功したクローニングを制限マッピング及びHA遺伝子についてのコロニーPCRスクリーニングによって確認した。
HA1及びHA2の遺伝子フラグメントを、GO1129をPCR反応におけるテンプレートとして使用して単離した。最初のPCR反応は、EcoRV制限部位、シグナルペプチド及びOFRの開始を含むHA1遺伝子を増幅するために役立った。リバースプライマーは、C末端での6xHisタグと、BspEI制限部位とを付加するために役立った。PCR反応を、SuperPCR Mix(Invitrogen)を製造者の説明書に従って行った。
HA1フラグメントを増幅するために使用されたプライマーは、
Thai 1 FHA1
5’ GCGCGATATCAACAATGGAGAAGATAGTTC 3’(配列番号41)
Thai 3 HA1 BspE1
5’ GCGCTCCGGATTTAGTGGTGATGGTGATGATGTCTCTTCTTACGTC 3’(配列番号42)
であった。
2回目の反応は、HA2フラグメントを増幅するために役立った。下記のプライマーを使用した。
Thai 8 FHA2 EcoRV
GCGATATCAACAATGGAGAAGATAGTTCTCTTGTTTGCCATCGTCAGTTTGGTCAAATCAGGATTGTTCG 3’(配列番号43)
Thai 7 HA2 BspEI
5’ GCGCTCCGGATTTAGTGGTGATGGTGATGATGTTGGTAGATACC 3’(配列番号44)
PCR反応のためのサーモサイクラー設定には、下記が含まれた。
1.95℃で2分間
2.94℃で30秒間
3.56℃で30秒間
4.68℃で1:10分間
5.工程2に、34回
6.68℃で10分間
7.4℃
Thai 1 FHA1
5’ GCGCGATATCAACAATGGAGAAGATAGTTC 3’(配列番号41)
Thai 3 HA1 BspE1
5’ GCGCTCCGGATTTAGTGGTGATGGTGATGATGTCTCTTCTTACGTC 3’(配列番号42)
であった。
2回目の反応は、HA2フラグメントを増幅するために役立った。下記のプライマーを使用した。
Thai 8 FHA2 EcoRV
GCGATATCAACAATGGAGAAGATAGTTCTCTTGTTTGCCATCGTCAGTTTGGTCAAATCAGGATTGTTCG 3’(配列番号43)
Thai 7 HA2 BspEI
5’ GCGCTCCGGATTTAGTGGTGATGGTGATGATGTTGGTAGATACC 3’(配列番号44)
PCR反応のためのサーモサイクラー設定には、下記が含まれた。
1.95℃で2分間
2.94℃で30秒間
3.56℃で30秒間
4.68℃で1:10分間
5.工程2に、34回
6.68℃で10分間
7.4℃
PCR後、HA1フラグメント及びHA2フラグメントについての生成物をEcoRV及びBspE1で消化し、DNAゲルで泳動し、バンドを、ベクターpDOW3451へのクローニングのために使用するために切り出した。成功したクローニングを制限消化マッピング及びHAフラグメントについてのコロニーPCRスクリーニングによって確認した。
実施例13.pDOW3457及びpDOW3466からのRNA転写物の調製
pDOW3471及びpDOW3466(コートタンパク質での欠失を有するPVXゲノムを含有するヘルパープラスミド)をともに、制限酵素SpeIを使用して線状化し、Quickspinカラム(Qiagen)で清浄化し、ヌクレアーゼ非含有水(Ambion)により溶出した。インビトロ転写反応液を、mMessage Machine T7キャップドキット(Ambion)の構成成分を使用して下記のように組み立てた。
反応液を氷上で組み立て、その後、37℃で2時間インキュベーションした。インビトロでのRNA転写の後、それぞれの反応液の少量のサンプルを泳動して、RNA生成物を可視化した。
pDOW3471及びpDOW3466(コートタンパク質での欠失を有するPVXゲノムを含有するヘルパープラスミド)をともに、制限酵素SpeIを使用して線状化し、Quickspinカラム(Qiagen)で清浄化し、ヌクレアーゼ非含有水(Ambion)により溶出した。インビトロ転写反応液を、mMessage Machine T7キャップドキット(Ambion)の構成成分を使用して下記のように組み立てた。
実施例14.ニコチアナ・ベンタミアナ植物への接種及び植物におけるHAタンパク質の産生
ニコチアナ・ベンタミアナ植物に、pDOW3475及びpDOW3466からのインビトロ転写RNAを使用して接種した。2週齢〜3週齢の植物からの1枚の葉に少量のカーボランダムをまぶした。RNA接種物を若い葉及びカーボランダムに付けた。清浄な手袋を使用して、RNAを葉の組織にこすりつけた。pDOW3466と一緒にされたpDOW3475の1回の接種物(20μLのインビトロ転写RNA)を1回の植物接種について使用した。植物を症状形成について観察した。図15を参照のこと。
ニコチアナ・ベンタミアナ植物に、pDOW3475及びpDOW3466からのインビトロ転写RNAを使用して接種した。2週齢〜3週齢の植物からの1枚の葉に少量のカーボランダムをまぶした。RNA接種物を若い葉及びカーボランダムに付けた。清浄な手袋を使用して、RNAを葉の組織にこすりつけた。pDOW3466と一緒にされたpDOW3475の1回の接種物(20μLのインビトロ転写RNA)を1回の植物接種について使用した。植物を症状形成について観察した。図15を参照のこと。
実施例15.NTIタバコ細胞への接種及び植物細胞におけるHAタンパク質の産生
タバコNT1細胞のトランスフェクションをNT1プロトプラストへのインビトロ転写RNAのエレクトロポレーションによって行った。NT1プロトプラストを、セルライシン(cellulysin)及びマセラーゼを使用して細胞壁を除くことによってエレクトロポレーションのために調製した。細胞へのpDOW3475 RNAのエレクトロポレーションの5分前に、HcPro遺伝子を含有するプラスミドの5ugを細胞とインキュベーションした。HcProは、遺伝子のサイレンシングを防止すること、従って、ウイルスの複製及び活性の量を増大させることが以前から明らかにされている。相補が、植物細胞培養物が、HA遺伝子を発現するウイルスRNAを増殖させるために必要でないことが推論された。pDOW3466由来のRNAを接種物として使用した。エレクトロポレーションの直前に、5μLのインビトロ転写RNAを、氷冷された0.4cm間隔キュベット(Biorad)における1mLの処理済みの植物細胞に加え、素早く混合した。細胞を11秒〜13秒の時定数において500μF及び250Vでパルス処理した。細胞をペトリ皿における5mLのNT1置床培地に置床し、パラフィルムでシールし、その後、室温で48時間成長させた。
タバコNT1細胞のトランスフェクションをNT1プロトプラストへのインビトロ転写RNAのエレクトロポレーションによって行った。NT1プロトプラストを、セルライシン(cellulysin)及びマセラーゼを使用して細胞壁を除くことによってエレクトロポレーションのために調製した。細胞へのpDOW3475 RNAのエレクトロポレーションの5分前に、HcPro遺伝子を含有するプラスミドの5ugを細胞とインキュベーションした。HcProは、遺伝子のサイレンシングを防止すること、従って、ウイルスの複製及び活性の量を増大させることが以前から明らかにされている。相補が、植物細胞培養物が、HA遺伝子を発現するウイルスRNAを増殖させるために必要でないことが推論された。pDOW3466由来のRNAを接種物として使用した。エレクトロポレーションの直前に、5μLのインビトロ転写RNAを、氷冷された0.4cm間隔キュベット(Biorad)における1mLの処理済みの植物細胞に加え、素早く混合した。細胞を11秒〜13秒の時定数において500μF及び250Vでパルス処理した。細胞をペトリ皿における5mLのNT1置床培地に置床し、パラフィルムでシールし、その後、室温で48時間成長させた。
細胞を、成功したトランスフェクション及びHAの産生についてアッセイした。細胞培養物全体を、Hisタグ化HAタンパク質をNi−NTAスピンカラム(Qiagen)により非変性条件下及び変性条件下で精製するためにペレット化し、凍結し、乳棒ですりつぶし、溶解した。その後、サンプルを、一次の抗His抗体(Qiagen3パックセット)及び二次の抗マウスAP(Western Breeze、Invitrogen)を利用するウエスタンブロットによって検出した。
実施例16.蛍光菌におけるHA又はHAフラグメントの発現
インフルエンザウイルスA/Vietnam/2004(H5N1)株から配列番号25で特定されるインフルエンザHAをコードする遺伝子を、合成のために、DNA 2.0(DNA 2.0、Menlo Park、CA 94025、米国)に注文した。合成されたHA遺伝子を、P.fluorescensでのコドン使用頻度の偏りを利用するために、また、リボゾーム結合部位、及び、同じ制限部位が遺伝子内に存在しない場合、クローニング目的のために遺伝子に隣接する作製された制限部位を含有するために操作した。クローニング及びP.fluorescens細胞での発現のために使用された完全なHA遺伝子のORFのコドン最適化後のヌクレオチド配列が表5に示される(配列番号26の配列)。HAタンパク質遺伝子をプラスミドからSpeI及びXhoIで切り出し、buibui遺伝子の代わりにSpeI及びXhoIにおいて蛍光菌発現プラスミドpDOW1803にサブクローン化した。
インフルエンザウイルスA/Vietnam/2004(H5N1)株から配列番号25で特定されるインフルエンザHAをコードする遺伝子を、合成のために、DNA 2.0(DNA 2.0、Menlo Park、CA 94025、米国)に注文した。合成されたHA遺伝子を、P.fluorescensでのコドン使用頻度の偏りを利用するために、また、リボゾーム結合部位、及び、同じ制限部位が遺伝子内に存在しない場合、クローニング目的のために遺伝子に隣接する作製された制限部位を含有するために操作した。クローニング及びP.fluorescens細胞での発現のために使用された完全なHA遺伝子のORFのコドン最適化後のヌクレオチド配列が表5に示される(配列番号26の配列)。HAタンパク質遺伝子をプラスミドからSpeI及びXhoIで切り出し、buibui遺伝子の代わりにSpeI及びXhoIにおいて蛍光菌発現プラスミドpDOW1803にサブクローン化した。
得られたプラスミドをエレクトコンピテントなP.fluorescens MB214にエレクトロポレーションによって形質転換した。宿主細胞を、氷の上に維持されたバイアルにおいて徐々に解凍した。それぞれの形質転換のために、1μLの精製された発現プラスミドDNAを宿主細胞に加え、得られた混合物をピペットチップにより穏やかにゆすって混合し、その後、氷上で30分間インキュベーションした。混合物をエレクトロポレーション用の使い捨てキュベット(BioRad Gene Pulser Cuvette、0.2cmの電極間隔、カタログ番号165−2086)に移した。キュベットを、200オーム、25μファラッド、2.25kVで事前に設定されたBiorad Gene Pulserに入れた。細胞に短時間のパルス処理を行った(約1秒〜2秒)。その後、冷LB培地を直ちに加え、得られた懸濁物を30℃で2時間インキュベーションした。その後、細胞をLB tet15(15ug/mlのテトラサイクリンが補充されたLB培地)寒天に置床し、30℃で一晩成長させた。
1つのコロニーをそれぞれの平板から選び、選んだサンプルをバッフル付き振とうフラスコにおいて50mLのLB種培養に接種した。液体懸濁培養物を、250rpmで振とうしながら30℃で一晩成長させた。その後、それぞれの得られた種培養物の10mLを使用して、1リットルのバッフル付き振とうフラスコにおいて200mLの振とうフラスコ培地(すなわち、酵母抽出物及び微量元素の塩;クエン酸ナトリウムならびにグリセロール、pH6.8)に接種した。テトラサイクリンを選抜のために加えた。接種された培養物を、250rpmで振とうしながら30℃で一晩成長させ、HAタンパク質を発現させるためにIPTGにより誘導した。
実施例17.pbp−HAのクローニング及びP.fluorescens DC454のペリプラズムにおける発現
クローニング:
実施例17.pbp−HAのクローニング及びP.fluorescens DC454のペリプラズムにおける発現
クローニング:
24残基のリン酸結合タンパク質分泌(pbp)シグナルを、その生来的な分泌シグナル及びC末端の膜貫通ドメインを有さない配列番号29での改変されたインフルエンザウイルスA/Vietnam/2004(H5N1)株のN末端に融合した。
pbpシグナルを下記のプライマー対によりpDOW1113から増幅した。
pbpF−SpeI
5’−GGACTAGTAGGAGGTAACTTATGAAACTGAAACGTTTGATG−3’(配列番号45)
pbp−HA−Rev
5’−GTGATAGCCGATGCAAATCTGGTCGGCCACCGCGTTGGC−3’(配列番号46)
pbpF−SpeI
5’−GGACTAGTAGGAGGTAACTTATGAAACTGAAACGTTTGATG−3’(配列番号45)
pbp−HA−Rev
5’−GTGATAGCCGATGCAAATCTGGTCGGCCACCGCGTTGGC−3’(配列番号46)
改変されたHAタンパク質を、下記のプライマー対によるPCRによって、配列番号26でのHA遺伝子を含有するシャトルプラスミドから増幅した。
pbp−HA−For
5’−GCCAACGCGGTGGCCGACCAGATTTGCATCGGCTATCAC−3’(配列番号47)
HA−Xhol−Rev
5’−CCGCTCGAGTCATTACTGATAGATCCCGATGCTCTCC−3’(配列番号48)
pbp−HA−For
5’−GCCAACGCGGTGGCCGACCAGATTTGCATCGGCTATCAC−3’(配列番号47)
HA−Xhol−Rev
5’−CCGCTCGAGTCATTACTGATAGATCCCGATGCTCTCC−3’(配列番号48)
その後、融合pbp−HA遺伝子を、下記のプライマー対を使用して増幅した。
pbpF−SpeI
5’−GGACTAGTAGGAGGTAACTTATGAAACTGAAACGTTTGATG−3’(配列番号49)
HA−Xhol−Rev
5’−CCGCTCGAGTCATTACTGATAGATCCCGATGCTCTCC−3’(配列番号48)
pbpF−SpeI
5’−GGACTAGTAGGAGGTAACTTATGAAACTGAAACGTTTGATG−3’(配列番号49)
HA−Xhol−Rev
5’−CCGCTCGAGTCATTACTGATAGATCCCGATGCTCTCC−3’(配列番号48)
工程1:pbpシグナルを有するプラスミドをPCRテンプレートとして使用した。pbpF−SpeIプライマー及びpbp−HA−Revプライマーを反応1において使用した。pbp−HA−Forプライマー及びHA−XhoI−Revプライマーを反応2において使用した。PCRを、上記で記載されたサーモサイクル処理プロトコルに従って行った。
工程2:PCR生成物1及びPCR生成物2をこの反応のためのPCRテンプレートとして使用した。pbpF−SpeIプライマー及びHA−XhoI−Revプライマーを、最終的なPCR生成物を増幅するために使用した。
その後、最終的なPCR生成物をSpeI及びXhoIによって消化し、SpeI及びXhoIにより制限され、脱リン酸化されたP.fluorescens発現ベクターpDow1169にサブクローン化した。連結生成物を、Micro Bio−spin 6 Chromatographyカラム(Biorad)による精製の後、P.fluorescens株DC454にエレクトロポレーションによって形質転換した。形質転換体を、LB培地において30℃で2時間振とうした後、M9グルコース平板(Teknova)に置床した。平板を30℃で48時間インキュベーションした。インサートの存在を制限消化及び配列決定によって確認した。
タンパク質発現:
単一形質転換体を50mlのM9グルコース培地に接種し、一晩成長させた。3.0〜5.0のOD600のP.fluorescens培養物を使用して、振とうフラスコ培養に接種した。振とうフラスコを、一晩、300rpmで振とうしながら30℃でインキュベーションした。15.0〜20.0のOD600の一晩培養物を300μMのイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)により誘導した。培養物を誘導後24時間で集めた。
単一形質転換体を50mlのM9グルコース培地に接種し、一晩成長させた。3.0〜5.0のOD600のP.fluorescens培養物を使用して、振とうフラスコ培養に接種した。振とうフラスコを、一晩、300rpmで振とうしながら30℃でインキュベーションした。15.0〜20.0のOD600の一晩培養物を300μMのイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)により誘導した。培養物を誘導後24時間で集めた。
実施例18.インビトロでのCCMVウイルス又はCCMVウイルス様粒子へのHA又はHAフラグメントのコンジュゲート
インフルエンザのインサートを含有するキメラなCCMV VLP粒子を、実施例1〜実施例7に記載されるように作製し、その後、実施例11〜実施例17に記載されるように得られたHAタンパク質又はHAタンパク質のフラグメント又はHAタンパク質の変異体又はHAフラグメントの変異体をCCMVのコートタンパク質にコンジュゲートするためにさらに処理する。HAタンパク質又はHAタンパク質フラグメントをCCMV粒子又はその変異体における表面に露出したシステイン残基に結合する。これは、CCMV上のシステインチオールを、50mM酢酸ナトリウム(pH4.8)における1mMのCuSO4の存在下、385pMのHAに対して93pMのCCMVコートタンパク質のモル比により、タンパク質表面の遊離チオール基に酸化的にカップリングすることによって達成される。反応液を1時間〜4時間インキュベーションする。あるいは、HAタンパク質が、Gillitzer et al., Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation, Chem. Commun., 2002, 2390-2391に、また、Chatterji et al., Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea Mosaic Virus, Bioconjugate Chem., 2004, Vol. 15, 807-813に記載されるような方法によってCCMV VLPの表面に結合させられる。
インフルエンザのインサートを含有するキメラなCCMV VLP粒子を、実施例1〜実施例7に記載されるように作製し、その後、実施例11〜実施例17に記載されるように得られたHAタンパク質又はHAタンパク質のフラグメント又はHAタンパク質の変異体又はHAフラグメントの変異体をCCMVのコートタンパク質にコンジュゲートするためにさらに処理する。HAタンパク質又はHAタンパク質フラグメントをCCMV粒子又はその変異体における表面に露出したシステイン残基に結合する。これは、CCMV上のシステインチオールを、50mM酢酸ナトリウム(pH4.8)における1mMのCuSO4の存在下、385pMのHAに対して93pMのCCMVコートタンパク質のモル比により、タンパク質表面の遊離チオール基に酸化的にカップリングすることによって達成される。反応液を1時間〜4時間インキュベーションする。あるいは、HAタンパク質が、Gillitzer et al., Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation, Chem. Commun., 2002, 2390-2391に、また、Chatterji et al., Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea Mosaic Virus, Bioconjugate Chem., 2004, Vol. 15, 807-813に記載されるような方法によってCCMV VLPの表面に結合させられる。
コンジュゲートされた粒子を、1cmx30cmのSuperose 6カラム(GE Bioscienceから得られる)を0.1M NaPO4(pH7.00)の移動相とともに使用してサイズ排除クロマトグラフィーによって、コンジュゲートされていない粒子から分離する。あるいは、コンジュゲートされた粒子を、4% PEG/0.2M NaClによる沈殿化、続く、30mM Tris(pH7.50)での再懸濁によって遊離のHAタンパク質又はHAタンパク質フラグメントから分離する。
実施例19.インビトロでのCPMVウイルス又はCCMVウイルス様粒子へのHA又はHAフラグメントのコンジュゲート
インフルエンザのインサートを含有するキメラなCPMV VLP粒子を、実施例8〜実施例10に記載されるように作製し、その後、実施例11〜実施例17に記載されるように作製されたHAタンパク質又はHAタンパク質のフラグメント又はHAタンパク質の変異体又はHAフラグメントの変異体をCPMVのコートタンパク質にコンジュゲートするためにさらに処理する。
インフルエンザのインサートを含有するキメラなCPMV VLP粒子を、実施例8〜実施例10に記載されるように作製し、その後、実施例11〜実施例17に記載されるように作製されたHAタンパク質又はHAタンパク質のフラグメント又はHAタンパク質の変異体又はHAフラグメントの変異体をCPMVのコートタンパク質にコンジュゲートするためにさらに処理する。
HAタンパク質をCPMV又はその変異体における表面に露出したシステイン残基に結合する。これは、CPMV上のシステインチオールを、50mM酢酸ナトリウム(pH4.8)における1mMのCuSO4の存在下、385pMのHAに対して93pMのCPMVコートタンパク質のモル比により、タンパク質表面の遊離チオール基に酸化的にカップリングすることによって達成される。反応液を1時間〜4時間インキュベーションする。あるいは、HAタンパク質が、Gillitzer et al, Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation, Chem. Commun., 2002, 2390-2391に、また、Chatterji et al., Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea Mosaic Virus, Bioconjugate Chem., 2004, Vol. 15, 807-813に記載されるような方法によってCPMV VLP表面に結合させられる。
コンジュゲートされた粒子を、1cm×30cmのSuperose 6カラム(GE Bioscienceから得られる)を0.1M NaPO4(pH7.00)の移動相とともに使用してサイズ排除クロマトグラフィーによって、コンジュゲートされていない粒子から分離する。あるいは、コンジュゲートされた粒子を、4% PEG/0.2M NaClによる沈殿化、続く、30mM Tris(pH7.50)での再懸濁によって、コンジュゲートされていないHAタンパク質又はHAタンパク質フラグメントから分離する。
実施例20.M2eエピトープを含有するキメラなCCMV粒子及びCPMV粒子によるマウスの免疫化
インフルエンザペプチドのインサートを含有し、かつ、HAタンパク質にコンジュゲートされたCCMP VLPを、実施例18に記載されるように作製し、メスのBalb/cマウスに投与する。7週齢のBalb/cマウスに、100μgの精製されたHAコンジュゲートCCMV VLPを3週間毎に1回、腹腔内注射する。
インフルエンザペプチドのインサートを含有し、かつ、HAタンパク質にコンジュゲートされたCCMP VLPを、実施例18に記載されるように作製し、メスのBalb/cマウスに投与する。7週齢のBalb/cマウスに、100μgの精製されたHAコンジュゲートCCMV VLPを3週間毎に1回、腹腔内注射する。
鼻腔内免疫化のために、100μgのHAコンジュゲートCCMV VLPを、麻酔したマウスに投与する。合計で100μlの体積を2つの鼻孔に投与する(それぞれの鼻孔について50μl)。コントロールのマウスには、関連性がないペプチドインサート(例えば、炭疽保護抗原(PA)など)を含むCCMV VLPが、同じ投薬スケジュールで与えられる。場合により、コントロールのマウスには、PBS(pH7.0)が与えられる。
血清サンプル、鼻洗浄物及び肺洗浄物を、最初の投与の1日前、及び、2回のその後の投与のそれぞれの後の2週間で得る。その後、免疫化マウスを、最後の免疫化の後の2週間〜3週間で、マウスに適合化された生インフルエンザ株の4000PFU/マウスにより抗原投与する。その後、マウスを生存について観察する。その後、サンプルを、CCMV、HAタンパク質及びM2eタンパク質に対する免疫応答をELISAアッセイによって求めるためにAb力価について処理する。
Claims (23)
- ヒト又は動物におけるインフルエンザワクチンとして使用される組成物を作製する方法であって、
i)インフルエンザウイルスペプチドに融合した植物ウイルスカプシドタンパク質を含む組み換えカプシド融合ペプチドをコードする第1の核酸を提供し、カプシド融合ペプチドを宿主細胞において発現すること;
ii)ウイルス粒子又はウイルス様粒子を形成するためにカプシド融合ペプチドを会合させること;
iii)1つのインフルエンザウイルス株に由来する少なくとも1つの抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントをコードする少なくとも1つの第2の核酸を提供し、抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントを宿主細胞において発現すること;
iv)抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントを単離及び精製すること;及び
v)ヒト又は動物に投与することができる組成物を形成するために、ウイルス粒子又はウイルス様粒子及び抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントを組み合わせることを含む方法。 - 前記単離された抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントが前記ウイルス粒子又はウイルス様粒子にコンジュゲートされる、請求項1に記載の方法。
- 前記単離された抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントがインフルエンザの新しく出現した株に由来する、請求項1に記載の方法。
- 前記カプシド融合ペプチドが、保存されたインフルエンザウイルスペプチドに由来するインフルエンザウイルスペプチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記保存されたインフルエンザウイルスペプチドがインフルエンザM2ペプチドに由来する、請求項4に記載の方法。
- 前記M2ペプチドが、配列番号1〜配列番号5及び配列番号22〜配列番号24からなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記M2ペプチドが、配列番号3、配列番号22、配列番号23及び配列番号24からなる群より選択される、請求項6に記載の方法。
- 前記植物ウイルスカプシドタンパク質がCCMV植物ウイルス又はCPMV植物ウイルスに由来する、請求項1に記載の方法。
- 前記植物ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号11〜配列番号13からなる群より選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記ウイルス粒子又はウイルス様粒子が、宿主細胞の原形質膜又は細胞壁に由来するタンパク質を含有さない、請求項1に記載の方法。
- i)インフルエンザウイルスペプチドに融合した植物ウイルスカプシドタンパク質を含み、ウイルス粒子又はウイルス様粒子を形成するために会合する組み換えカプシド融合ペプチド、及び
ii)インフルエンザウイルスに由来する少なくとも1つの単離された抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメント
を含む組成物。 - 前記単離された抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントが前記ウイルス粒子又はウイルス様粒子にコンジュゲートされる、請求項11に記載の組成物。
- 前記単離された抗原性のタンパク質又はタンパク質フラグメントがインフルエンザの新しく出現した株に由来する、請求項11に記載の組成物。
- 前記カプシド融合ペプチドが、保存されたインフルエンザウイルスペプチドに由来するインフルエンザウイルスペプチドを含む、請求項11に記載の組成物。
- 前記保存されたインフルエンザウイルスペプチドがインフルエンザM2ペプチドに由来する、請求項14に記載の組成物。
- 前記M2ペプチドが、配列番号1〜配列番号5及び配列番号22〜配列番号24からなる群より選択される、請求項15に記載の組成物。
- 前記M2ペプチドが、配列番号3、配列番号22、配列番号23及び配列番号24からなる群より選択される、請求項16に記載の組成物。
- 前記植物ウイルスカプシドタンパク質がCCMV植物ウイルス又はCPMV植物ウイルスに由来する、請求項11に記載の組成物。
- 前記植物ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号11〜配列番号13からなる群より選択される、請求項18に記載の組成物。
- 前記ウイルス粒子又はウイルス様粒子が、宿主細胞の原形質膜又は細胞壁に由来するタンパク質を含有さない、請求項11に記載の組成物。
- 免疫刺激分子をさらに含む、請求項11に記載の組成物。
- 前記免疫刺激分子がCpG配列を含む、請求項21に記載の組成物。
- 配列番号3、配列番号22、配列番号23及び配列番号24からなる群より選択されるペプチド配列。
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