JP2007528727A - 植物細胞における高効率ペプチド生産 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、「植物細胞における高効率ペプチド生産」と題する、2004年2月27日出願の米国特許仮出願第60/548,744号の優先権を主張する。
本出願は、国立衛生研究所、国立アレルギー及び感染症研究所(NIAID)、共同契約第1−U01−AI054641−01号との米国政府契約下にある。
本発明は、組換えペプチドの生産のための改善された方法を提供する。特に、本発明は、植物細胞懸濁培養においてインビボで集合され得るウイルスカプシド融合タンパク質の形態の組換えペプチドの生産のための改善された方法を提供する。本発明はまた、非感染性ウイルスカプシド融合ペプチド生産を可能にするプラスミド、配列及び植物細胞を含む。
宿主細胞発現系におけるペプチド生産を改善するための1つのアプローチは、対象組換えペプチドを生産するために感染性組換えウイルスの性質を利用することである。植物宿主系における感染性ウイルスの使用は特に周知である。例えばPorta & Lomonossoff, (2002) “Viruses as vectors for the expression of foreign sequences in plants, “Biotechnology and Genetic Enginering Reviews 19:245-291参照。
a)植物細胞を提供すること;
b)少なくとも1個の異種ペプチドと少なくとも1個のウイルスカプシドタンパク質から成る融合ペプチドをコードする非感染性核酸を提供すること;
c)前記植物細胞を形質転換し、前記核酸がその後植物細胞のゲノムに組み込まれること;
d)前記植物細胞を発酵工程において懸濁植物細胞培養中で増殖させ、前記植物細胞において前記核酸を発現させること;
e)前記植物細胞における発現が、前記融合ペプチドのウイルス様粒子へのインビボ集合を提供すること;及び
d)前記ウイルス様粒子を単離すること
を含む、組換えペプチドを生産するための方法を提供する。
a)植物細胞培地中で増殖することができる植物細胞;
b)少なくとも1個の組換えペプチドと少なくとも1個のウイルスカプシドを含む融合ペプチドをコードし、植物細胞においてゲノムに組み込まれて発現することができる、非感染性核酸;及び
c)増殖培地
を含む、組換えペプチドの生産のための発現系が提供される。
(I.組換え植物細胞)
Plant Cell 4: 39-45 参照。
1つの実施形態では、本発明は、宿主ゲノムに安定に組み込まれた非感染性プラスミドからのウイルスカプシドに融合したペプチドの発現によってペプチドを生産するための方法における使用のための植物細胞を提供する。前記発現は、細胞内で少なくとも1個のウイルス様粒子(VLP)の形成を生じさせ得る。
本発明の1つの実施形態では、カプシドのアミノ酸配列は、何らかの形態を有すると分類されるウイルスのカプシドから選択される。1つの実施形態では、カプシドは桿状ウイルスに由来する。特定実施形態では、カプシドは桿状植物ウイルスに由来する。より特定の実施形態では、カプシドは、タバコモザイクウイルス(TMV)及びジャガイモXウイルス(PVX)から選択される群に由来する桿状植物ウイルスカプシドである。TMVは、桿状粒子(300nm)を生じさせる独自のコードタンパク質(17.5kDa)でカプシド形成された単一プラス−センスゲノムRNA(6.5kb)から成る。ジャガイモXウイルスは、515nmの明瞭なモード長と13nmの幅を有するひも状で被包されていない、通常は屈曲性のウイルスである(Brands, 1964)。カプシド構造は3.4nmのピッチで基本螺旋を形成する(Verma et al., 1968)。
ウイルス分類学は、以下の分類群のカプシド形成粒子実体を承認する:
・グループIウイルス、すなわちdsDNAウイルス;
・グループIIウイルス、すなわちssDNAウイルス;
・グループIIIウイルス、すなわちdsRNAウイルス;
・グループIVウイルス、すなわちDNA段階を持たないssRNA(+)鎖ウイルス;
・グループVウイルス、すなわちssRNA(−)鎖ウイルス;
・グループVIウイルス、すなわちssRNA逆転写ウイルスである、RNAレトロイドウイルス;
・グループVIIウイルス、すなわちdsDNA逆転写ウイルスである、DNAレトロイドウイルス;
・デルタウイルス;
・ウイロイド;及び
・サテライト核酸及びプリオンを除く、サテライトファージ及びサテライトウイルス。
本発明のウイルスカプシドは、ここで述べる宿主細胞において非感染性である。1つの実施形態では、ウイルス科の発現の間又は発現後に宿主細胞においてウイルス様粒子(VLP)又はケージ構造が形成される。1つの実施形態では、VLP又はケージ構造はまた、対象とするペプチドも含み、特定実施形態では、対象ペプチドがVLPの表面に発現される。前記発現系は、典型的にはウイルスの感染性を可能にする付加的なウイルスタンパク質を含まない。典型的実施形態では、発現系は、宿主細胞、及び1又はそれ以上のウイルスカプシド及び作動可能に連結された対象ペプチドをコードするベクターを含む。前記ベクターは、典型的には付加的なウイルスタンパク質を含まない。本発明は、ウイルスカプシドがある種の宿主細胞においてより大きな度合で形成され、組換えペプチドのより効率的な回収を可能にするという発見に由来する。
1つの実施形態では、ウイルスカプシド配列に作動可能に連結されたペプチドは、少なくとも2個のアミノ酸を含む。もう1つの実施形態では、前記ペプチドは、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5又は少なくとも6アミノ酸の長さである。別の実施形態では、ペプチドは少なくとも7アミノ酸の長さである。ペプチドはまた、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、45、50、60、65、75、85、95、96、99又はそれ以上のアミノ酸の長さである。1つの実施形態では、コードされるペプチドは少なくとも25kDである。
ウイルスカプシドに融合する対象ペプチドは、ウイルスに由来しない、及び場合により、当該細胞と同じ種に由来しない、異種タンパク質であり得る。
1つの実施形態では、抗原性ペプチドはウイルスカプシドによる発現を通して生産される。抗原性ペプチドは、感染因子、寄生生物、癌細胞及び他の病原因子を含む、ヒト又は動物病原因子の抗原性ペプチドであるものから選択することができる。そのような病原因子はまた、ビルレンス因子及び病原因子、例えばそれらの因子の体外毒素、内毒素等を含む。病原因子は何らかのレベルのビルレンスを示し得る、すなわちそれらは、例えば毒性、無毒性、偽毒性、半毒性等であり得る。1つの実施形態では、抗原性ペプチドは、病原因子からのエピトープアミノ酸配列を含む。1つの実施形態では、エピトープアミノ酸配列は、少なくとも1個のそのような因子の表面ペプチドの少なくとも一部であるものを含む。1つの実施形態では、カプシド−組換えペプチドウイルス様粒子は、ヒト又は動物適用におけるワクチンとして使用することができる。
もう1つの特定実施形態では、組換えペプチドは、遊離単量体形態であるとき宿主細胞に対して毒性であるペプチドである。ある実施形態では、ウイルスカプシドと共に発現される対象ペプチドは宿主細胞毒性ペプチドである。宿主細胞毒性ペプチドは、それが発現される宿主細胞に対して、又は宿主細胞がその成員である細胞培養中又は生物中の他の細胞に対して、又は宿主細胞を提供する生物又は種の細胞に対して、生物抑制性、生物致死性又は毒性である生物阻害性ペプチドを指示する。1つの実施形態では、宿主細胞毒性ペプチドは、それが発現される宿主細胞に対して生物抑制性、生物致死性又は毒性である生物阻害性ペプチドである。宿主細胞毒性ペプチドの一部の例は、ペプチド毒素、抗菌ペプチド及び他の抗生物質ペプチドを含むが、これらに限定されない。
もう1つの特定実施形態では、組換えペプチドは、抗菌性ペプチドであるペプチドである。抗菌ペプチドは、例えば抗細菌ペプチド、例えばマガイニン、βデフェンシン、一部のαデフェンシン;カテリシジン;ヒスタチン;抗真菌ペプチド;抗原生動物ペプチド;合成AMP;ペプチド抗生物質又はその線状又は前環化オリゴ又はポリペプチド部分;他の抗生物質ペプチド(例えば駆虫性ペプチド、溶血ペプチド、殺腫瘍性ペプチド);及び抗ウイルスペプチド(例えば一部のαデフェンシン;殺ウイルス性ペプチド;ウイルス感染を阻害するペプチド)を含む。1つの特定実施形態では、抗菌ペプチドは、D2A21抗菌ペプチドから成る群より選択される。
本発明のウイルスカプシド又はウイルスカプシド融合ペプチドの発現のための宿主として使用する細胞(「宿主細胞」とも称する)は、ウイルスカプシドが細胞の複製又は感染を許容しないものである。1つの実施形態では、ウイルスカプシドは、宿主細胞が由来する細胞の特定種に感染しないウイルスに由来する。例えば、1つの実施形態では、ウイルスカプシドは二十面体植物ウイルスに由来し、ウイルスの天然栄養宿主ではない植物種の宿主細胞において発現される。もう1つの実施形態では、ウイルス種は哺乳動物に感染し、発現系は植物宿主細胞を含む。代替的実施形態では、ウイルスは、カプシド−組換えペプチド融合物を発現するための宿主細胞として使用される特定植物種の栄養ウイルスである。
本発明はさらに、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれることができ、カプシドと組換えペプチドの融合ペプチドをコードする非感染性核酸構築物を提供する。融合ペプチドはプロモーター配列と終結配列に作動可能に連結され得る。1つの実施形態では、a)組換えペプチドをコードする核酸配列、及びb)ウイルスカプシドをコードする核酸配列、を含む植物宿主細胞を形質転換するときに使用するための核酸構築物が提供され、a)の核酸とb)の核酸は融合タンパク質を形成するように作動可能に連結されており、前記核酸構築物は植物宿主細胞のゲノムに安定に挿入され、植物細胞において発現される。
1つの実施形態では、核酸構築物は、カプシド−組換えペプチド融合ペプチドをコードする核酸配列に作動可能に結合されたプロモーター配列を含む。作動可能な結合又は連結は、転写及び何らかの翻訳調節エレメントが、宿主細胞の作用により、調節エレメントが対象配列の発現を指令することができるように前記配列に共有結合している立体配置を指す。代替的実施形態では、カプシド融合タンパク質をコードする核酸構築物は、遺伝子捕獲戦略を利用して宿主細胞天然プロモーターとインフレームで挿入することができる。
他の調節エレメントを発現構築物に含めることができる。そのようなエレメントは、例えば転写エンハンサー配列、翻訳エンハンサー配列、他のプロモーター、アクチベーター、翻訳開始及び終結シグナル、転写ターミネーター、シストロニック調節因子、ポリシストロニック調節因子、発現されるペプチドの特定、分離、精製又は単離を容易にするタグ配列、例えばヌクレオチド配列「タグ」及び「タグ」ペプチドコード配列、例えばHisタグ、Flagタグ、T7タグ、Sタグ、HSVタグ、Bタグ、Strepタグ、ポリアルギニン、ポリシステイン、ポリフェニルアラニン、ポリアスパラギン酸、(Ala−Trp−Trp−Pro)n、チオレドキシン、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、シクロマルトデキストリングルコノトランスフェラーゼ、CTP:CMP−3−デオキシ−D−マンノ−オクツロソネートシチジルトランスフェラーゼ、trpE又はtrpLE、アビジン、ストレプトアビジン、T7遺伝子10、T4gp55、ブドウ球菌プロテインA、連鎖球菌プロテインG、GST、DHFR、CBP、MBP、ガラクトース結合ドメイン、カルモジュリン結合ドメイン、GFP、KSI、c−myc、ompT、ompA、pelB、NusA、ユビキチン及びヘモシリンA、を含むが、これらに限定されない。
宿主細胞ゲノムに安定に組込み、カプシド−組換えペプチド融合ペプチドを発現するとき植物細胞において使用するための有用な発現ベクターは、機能的プロモーターを有する作動可能な読み枠内に、適切な翻訳開始及び終結シグナルと共にカプシドペプチドに融合した所望標的ペプチドをコードする構造DNA配列を挿入することによって構築される。ベクターはまた、宿主細胞の選択を可能にする1又はそれ以上の表現型選択マーカー又はスクリーニングマーカーを含み得る。あるいは、選択又はスクリーニングマーカーは別のプラスミド上で提供され得る。
本発明はまた、組換えペプチドを生産するための方法を提供する。その方法は、
a)植物細胞を提供すること;
b)組換えペプチドと二十面体カプシドの融合ペプチドをコードする発現カセットを含む非感染性核酸を提供すること;
c)前記植物において前記核酸を発現し、前記細胞における発現が前記融合ペプチドのウイルス様粒子へのインビボ集合を提供すること;及び
d)前記ウイルス様粒子を単離すること
を含む。
1つの実施形態では、前記方法は、e)カプシドから組換えペプチドを分離するために前記融合産物を切断すること、をさらに提供する。
本発明の方法は、最適には、所望配列及び立体配座での、宿主植物細胞における所望カプシド−融合産物の生産上昇を導く。生産上昇は、選択的に、生産されるタンパク質のグラム当り又は宿主タンパク質のグラム当り又は生産される総組換えペプチドのパーセンテージとしての、所望ペプチドのレベル上昇であり得る。生産上昇はまた、組換え体のグラム当り又は宿主細胞タンパク質のグラム当りで生産される回収可能なペプチド、例えば可溶性タンパク質のレベル上昇であり得る。生産上昇はまた、タンパク質の総レベル上昇と活性又は可溶性レベル上昇の何らかの組合せであり得る。
ベクターによる植物宿主細胞の形質転換は、当技術分野で公知のいかなる形質転換法を用いて実施してもよく、植物宿主細胞を無傷細胞(intact cells)として又はプロトプラストとして形質転換し得る。例示的な形質転換法は上記に述べられている。
本発明に従った植物細胞発現系は、約20g/L(2%充填細胞量)から550g/L(55%充填細胞量)より多くまでの細胞密度又は匹敵する充填湿細胞密度を提供することができる。1つの実施形態では、充填細胞量は2%−約60%である。もう1つの実施形態では、充填細胞量は、2%、5%、10%、15%、20%、25%、35%、40%、50%、55%、60%、70%又は85%である。
ある実施形態では、本発明は、ウイルスカプシドとの連結及び共発現を通して発現の間ペプチドを保護することにより、対象ペプチドの回収率を改善するための方法を提供する。ある実施形態では、ウイルスカプシド融合は、細胞溶解産物から容易に分離することができるVLPを形成する。
二次及び三次タンパク質構造立体配座を生成するために不溶性タンパク質を復元又はリフォールディングすることができる。タンパク質リフォールディング工程は、必要に応じて、組換え産物の立体配置を完成させるときに使用できる。リフォールディング及び復元は、タンパク質の解離/会合を促進する当技術分野で公知の物質を用いて実施することができる。例えばタンパク質をジチオトレイトールと共にインキュベートし、次に酸化グルタチオンニナトリウム塩と共にインキュベートして、さらにその後リフォールディング剤、例えば尿素を含む緩衝液と共にインキュベートすることができる。
活性タンパク質は、その配列が由来する天然ペプチドの活性の少なくとも20%、30%又は40%、好ましくは少なくとも50%、60%又は70%、最も好ましくは少なくとも80%、90%又は95%の比活性を有し得る。さらに、基質特異性(Kcat/Km)は、場合により天然ペプチドと実質的に同様である。典型的には、Kcat/Kmは、天然ペプチドの少なくとも30%、40%又は50%、より好ましくは少なくとも60%、70%、80%又は90%である。タンパク質及びペプチドの活性及び基質特異性(Kcat/Km)を検定する方法及び定量手段は当業者に周知である。
以下の実施例では、カウピークロロティックモトルウイルス(CCMV)を所望組換えペプチドの発現のためのコートタンパク質のソースとして使用した。CCMVは、ブロモウイルス科ブロモウイルス群の成員である。ブロモウイルスは、4成分のプラスセンス一本鎖RNAゲノムを有する直径25−28nmの二十面体ウイルスである。RNA1及びRNA2はレプリカーゼ酵素をコードする。RNA3は、植物宿主内のウイルス運動に関与するタンパク質をコードする。RNA4(RNA3に由来するサブゲノムRNA)、すなわちsgRNA4は、20kDaのコートタンパク質(CP)(配列番号13)(表1)をコードする。各々のCCMV粒子は、180コピーのCCMV CPを含む。CCMV CPをコードする例示的DNA配列を配列番号14(表2)に示す。
異なる記載がない限り、分子生物学の分野において公知の標準手法、ベクター、制御配列エレメント及び他の発現系エレメントを、核酸操作、形質転換及び発現のために使用する。そのような標準手法、ベクター及びエレメントは、例えばAusubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (1995) (John Wiley & Sons); Sambrook, Fritsch, & Maniatis (eds.), Molecular Cloning (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) ; Berger & Kimmel, Methods in Enzymology 152: Guide to Molecular Cloning Techniques(1987) (Academic Press); and Bukhari et al. (eds. ), DNA Insertion Elements, Plasmids and Episomes (1977) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)に見出すことができる。
カウピークロロティックモトルウイルス(CCMV)を、4個の異なる抗原性ペプチドの1個を含むように工作したカプシドタンパク質(CP)と共に使用して、炭疽菌抗原性ペプチドの発現を全植物体において実施した。
同じCCMV−ペプチドをコードする構築物の発現を植物細胞懸濁培養において実施した。ニコチアナ・タバカムNT1細胞を、キメラCCMVコートタンパク質をコードするCCMV RNA3及びレプリカーゼ遺伝子をコードするCCMV RNA1及び2のRNA転写産物での電気穿孔によってトランスフェクトした。野生型CCMVコートタンパク質をコードするRNA3及び適切なBamHI制限部位を含むが挿入物を含まない工作したCCMVコートタンパク質をコードするRNA3を対照として使用した。
1)培地の調製:
NTI培地(1リットル):
ムラシゲ&スクーグ基礎塩4.33g(Phyto Technology Laboratories KSカタログ番号M524)ミオ−イノシトール100mg(Sigmaカタログ番号I−3011)、塩酸チアミンの1mg/ml溶液1ml(Sigmaカタログ番号T−3902)、リン酸二水素カリウム(KH2PO4)180mg(Sigmaカタログ番号P−8416)、スクロース30g(Sigmaカタログ番号S−5390)、及び10mg/mlの2,4−D溶液200μl(Sigmaカタログ番号D−7299)を少量の水中で混合した。精製水を前記溶液に添加して容量を1リットルにした。pHを5.8に調整し、溶液を加圧滅菌した。
マンニトール36.43g(Sigmaカタログ番号M−1902)を少量の精製水に添加した。精製水を添加して容量を500mlにし、pHを5.5に調整した。滅菌するために溶液をオートクレーブに入れた。
0.4M マンニトール及び0.02M MESを少量の水中で混合した。精製水を添加して容量を500mlにし、pHを5.5に調整した。滅菌するために溶液をオートクレーブに入れ、溶液を4℃で保存した。使用前に、1%セルライシン(Carbiochemカタログ番号219466)及び0.3%マセラーゼペクチナーゼ(Carbiochemカタログ番号441201)を溶液に添加し、セルライシンとマセラーゼペクチナーゼが溶解するまで溶液を振とうした。
0.8%NaCl、0.02%KC1、0.02%KH2PO4及び0.11%Na2HPO4を少量の精製水に添加した。精製水を添加して溶液を100mlにし、pHを6.5に調整した。緩衝液を加圧滅菌し、4℃で保存した。
タバコ細胞系NT1を電気穿孔の前に以下のように部分消化した。週に1回継代培養することによって強固な細胞系を維持し、細胞を、静かに振とうしながらNT1培地において24℃又は28℃で増殖させ、消化の3日前に、細胞懸濁液5mlをNT1培地50mlに継代培養して28℃でインキュベートした。細胞を50mlチューブにおいて800rpmで5分間遠心沈殿させた。酵素溶液を調製し、細胞をマンニトール洗浄液(約40ml)で洗った。細胞を800rpmで5分間遠心し、3容の酵素溶液を細胞に添加した。倒置して細胞を再懸濁し、10cmペトリ皿に注ぎ入れて移し、皿をアルミニウム箔に包んで60−120分間、室温で非常に緩やかに振とうした。次に細胞を50mlプラスチックチューブに戻し、800rpmで5分間遠心した。細胞をマンニトール洗浄液40mlで洗い、再び遠心して、電気穿孔緩衝液で洗浄し、遠心した。3容の電気穿孔緩衝液(総容量は通常20mlである)を細胞に添加した;細胞をアルミニウム箔に包んで4℃で保存した。
消化した細胞1mlをアリコートに分けて電気穿孔キュベットに入れた(4mm間隔)。各々のRNA転写産物2μg−CCMV RNA1、RNA2及びキメラRNA3−をキュベットに添加し、5分間氷上に置いた。NT1平板培養培地10ml(NT1+0.4M マンニトール)を各々のペトリ皿に添加した。細胞を500μF、250Vで電気穿孔し、キュベットを氷上に戻した。次に細胞をペトリ皿に移し、暗所で振とうせずに室温でインキュベートした。トランスフェクション後48時間目に分析のために細胞を収集した。
キメラコートタンパク質の発現を、抗CCMVコートタンパク質ポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法によって分析した。また、各々の培養物からRNAを抽出し、キメラCCMV RNA4をcDNAに逆転写して、それをPCRによって増幅した。PCR産物を実施例1で述べたように配列決定した。RNA1及び2だけでトランスフェクトした陰性対照を除いて、全ての試料がウエスタンブロット法で陽性であった。
プラスミドpIL−Tab358を植物発現ベクターとして使用した。CCMV CP挿入のために選択した制限部位はXbaIとEcoRIであった。このプラスミドは、XbaI部位の上流にキャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター及びEcoRI部位の下流にNosターミネーターを含む。前記ベクターは、XbaI及びEcoRIで消化し、脱リン酸化した後、挿入物と連結することによって作製した。
CCMV CP−PA融合物を、プライマーCCMV−CP−XbaI(配列番号22)及びCCMV−CP−EcoRI(配列番号23)を使用してpDOW2147(pUC−CCMV−RNA3−CP129BamHI−PA1)、pDOW2148(pUC−CCMV−RNA3−CP129BamHI−PA2)、pDOW2149(pUC−CCMV−RNA3−CP129BamHI−PA3)、pDOW2150(pUC−CCMV−RNA3−CP129BamHI−PA4)からPCRによって増幅し、pDOW2160(pIL−Tab−CCMV129BamHI−PA1)(配列番号5)、pDOW2161(pIL−Tab−CCMV129BamHI−PA2)(配列番号6)、pDOW2162(pIL−Tab−CCMV129BamHI−PA3)(配列番号7)及びpDOW2163(pIL−Tab−CCMV129BamHI−PA4)(配列番号8)を作製した。pDOW2160、pDOW2161、pDOW2162及びpDOW2163についてのプラスミド地図を図5、6、7及び8に示す。
植物細胞をプラスミドpDOW2160、pDOW2161、pDOW2162及びpDOW2163 10μgでトランスフェクトした。植物細胞トランスフェクションは実施例2におけるように実施した。
129BamHI部位の4つのPAペプチド−CCMV CP融合物全てがタバコ細胞において成功裏に発現された。図9は、pDOW2160、pDOW2161、pDOW2162及びpDOW2163でトランスフェクトした細胞におけるキメラCCMV CPの発現を示す。対照(挿入物を含まないCCMVコートタンパク質)と比較して、4つのキメラコートタンパク質全てが、PA挿入物を有することを表すより緩慢な運動性を示した。
1)ベクターの構築:
プラスミドpIL−Tab358を植物発現ベクターとして使用した。CCMV CP挿入のために選択した制限部位はXbaIとEcoRIであった。このプラスミドは、XbaI部位の上流にキャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター及びEcoRI部位の下流にNosターミネーターを含む。前記ベクターは、XbaI及びEcoRIで消化し、脱リン酸化した後、挿入物と連結することによって作製した。
RNA3の3’UTRを含むCCMV CP−PA融合物を、プライマーCCMV−CP−XbaI及びCCMV−CP−EcoRI−3’UTR(配列番号24)を使用してpDOW2147、pDOW2148、pDOW2149及びpDOW2150からPCRによって増幅し、pDOW2169(pIL−Tab−CP129BamHI−PA1−3’UTR)(配列番号9)、pDOW2170(pIL−Tab−CP129BamHI−PA2−3’UTR)(配列番号10)pDOW2171(pIL−Tab−CP129BamHI−PA3−3’UTR)(配列番号11)及びpDOW2172(pIL−Tab−CP129BamHI−PA4−3’UTR)(配列番号12)を作製した。
植物細胞をプラスミドpDOW2169、pDOW2170、pDOW2171及びpDOW2172 10μgでトランスフェクトした。植物細胞トランスフェクションは実施例2におけるように実施した。
3’UTRを含む129BamHI部位の4つのPAペプチド−CCMV CP融合物全てがタバコ細胞において成功裏に発現された。図10は、pDOW2169、pDOW2170、pDOW2171及びpDOW2172でトランスフェクトした細胞におけるキメラCCMV CPの発現を示す。対照(挿入物を含まないCCMVコートタンパク質)と比較して、4つのキメラコートタンパク質全てが、PA挿入物を有することを表すより緩慢な運動性を示した。
タバコ細胞系NT1を、週に1回継代培養することによって維持した。細胞を、静かに振とうしながらNT1培地において24℃又は28℃で増殖させた。トランスフェクションの3日前に、細胞懸濁液5mlをNT1培地50mlに継代培養して28℃でインキュベートした。
プラスミドpDOW2160、pDOW2161、pDOW2162、pDOW2163及びキャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーターによって駆動される植物選択マーカーPatを含む植物発現プラスミドpBBV(pBBV)を、マイクロパーティクルガン法によるNT1タバコ細胞形質転換のために使用した。使用したプラスミド比は、1:6 pBBV:pDOW2160、pBBV:pDOW2161、pBBV:pDOW2162又はpBBV:pDOW2163であった。合計5μgのプラスミドDNAは、6回のパーティクルガン法のために十分であった。Chen, L et al. Plant Cell Reports (1998) 18: 25-31 に述べられているBioradパーティクルガンプロトコールを形質転換のために使用した。
パーティクルガンを打ち込んだ細胞を、非選択的NT1培地寒天プレートに4時間移した後、25μg/mlのグルフォシネート−アンモニウム(Sigmaカタログ番号45520)を含むNT1培地寒天プレートに移した。
21日後、白色綿毛状細胞増殖を有していたカルスを、CP融合物の発現を調べるためのウエスタンブロット法及びプロモーター−CP融合物遺伝子−ターミネーターカセットの植物ゲノムへの組込みを調べるためのPCRによる分析のために選択した。キメラCCMV CPを発現するトランスジェニックカルスをNT1液体培地に移した。細胞を、静かに振とうしながらNT1培地において24℃又は28℃で増殖させ、週に1回継代培養した。
図11は、pDOW2160、pDOW2161、pDOW2162及びpDOW2163で安定に形質転換された細胞におけるキメラCCMV CPの発現を示す。CCMVに対するポリクローナル抗体によってCP融合物を検出した。4つのキメラコートタンパク質導入遺伝子全ての発現が検出された。
イネ細胞系を、週に1回継代培養することによって維持した。細胞を、静かに振とうしながらNB培地(Li, L et al. Plant Cell Reports. (1993) 12: 250-255)において28℃で増殖させた。トランスフェクションの3日前に、細胞懸濁液5mlをNB培地50mlに継代培養して28℃でインキュベートした。
プラスミドpDOW2160、pDOW2161、pDOW2162及びpDOW2163、及びキャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーターによって駆動される植物選択マーカーPatを含む植物発現プラスミドpBBVを、マイクロパーティクルガン法によるイネ細胞形質転換のために使用した。使用したプラスミド比は、1:6 pBBV:pDOW2160、pBBV:pDOW2161、pBBV:pDOW2162又はpBBV:pDOW2163であった。合計5μgのプラスミドDNAは、6回のパーティクルガン法のために十分であった。Chen, L et al. Plant Cell Reports (1998) 18: 25-31 に述べられているBioradパーティクルガンプロトコールを形質転換のために使用した。
パーティクルガンを打ち込んだ細胞を、選択のために25μg/mlのグルフォシネート−アンモニウム(Sigmaカタログ番号45520)を含むNB培地寒天プレートに移した。
21日後、白色綿毛状細胞増殖を有していたカルスを、CP融合物の発現を調べるためのウエスタンブロット法及びプロモーター−CP融合物遺伝子−ターミネーターカセットの植物ゲノムへの組込みを調べるためのPCRによる分析のために選択した。
図12は、CCMVに対するポリクローナル抗体によって検出したときの、pDOW2160、pDOW2161、pDOW2162及びpDOW2163で安定に形質転換された細胞におけるキメラCCMV CPの発現を示す。4つのキメラコートタンパク質導入遺伝子全ての発現が検出された。
Master mix 25μl
CCMV−F(10mM)プライマー、配列番号25 1μl
Nos−term−R(10mM)プライマー、配列番号26 1μl
ゲノムDNA 1μl
水 22μl
合計 55μl
1サイクル 95℃ 2分間
35サイクル 95℃ 30秒間
55℃ 30秒間
70℃ 2分間
1サイクル 70℃ 5分間
4℃ 維持
以下のプロトコールに従って、振とうフラスコ培養試料を溶解し、生じた細胞溶解産物をPEG(ポリエチレングリコール)処理して、限外ろ過することにより、キメラVLPを沈殿させた:
Claims (35)
- a)融合ペプチドをコードする核酸配列を含む非感染性核酸で植物細胞を形質転換すること、但し前記融合ペプチドは少なくとも1個の対象異種ペプチドと少なくとも1個のウイルスカプシドタンパク質から成り、前記核酸は前記植物細胞ゲノムに組み込まれている;
b)前記植物細胞を発酵工程において懸濁植物細胞培養中で増殖させ、前記植物細胞において前記核酸を発現させること;
c)前記植物細胞における発現が、前記融合ペプチドのウイルス様粒子へのインビボ集合を提供すること;及び
d)前記ウイルス様粒子を単離すること
を含む、異種ペプチドを生産するための方法。 - 前記融合ペプチドをコードする前記核酸が、プロモーター配列及びターミネーター配列に作動可能に連結されている、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸がウイルス3’UTRをさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 前記3’UTRがカプシド形成シグナルを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記核酸がカプシド形成シグナルをさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 前記ウイルスカプシドタンパク質が、植物細胞宿主に対して天然栄養機能を示さないウイルスに由来する、請求項1に記載の方法。
- 前記ウイルスカプシドタンパク質が、植物細胞宿主に対して天然栄養機能を示すウイルスに由来する、請求項1に記載の方法。
- 前記ウイルスカプシドタンパク質が二十面体植物ウイルスに由来する、請求項1に記載の方法。
- 前記二十面体ウイルスが、カウピーモザイクウイルス(Cowpea Mosaic Virus)、カウピークロロティックモトルウイルス(Cowpea Chlorotic Mottle Virus)及びアルファルファモザイクウイルス(Alfalfa Mosaic Virus)から成るウイルスの群より選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記異種ペプチドが抗原性ペプチドである、請求項1に記載の方法。
- 前記抗原性ペプチドが炭疽菌(Bacillus anthracis)ペプチドである、請求項10に記載の方法。
- 前記抗原性ペプチドが、配列番号1−4から成る群より選択される、請求項11に記載の方法。
- 前記核酸が、配列番号5−12から成る群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記ウイルス様粒子をワクチンとして動物に投与する、請求項1に記載の方法。
- 前記植物細胞が双子葉植物である、請求項1に記載の方法。
- 前記植物細胞がニコチアナ・タバカム(タバコ)(Nicotiana tabacum)である、請求項15に記載の方法。
- 前記植物細胞が単子葉植物である、請求項1に記載の方法。
- 前記植物細胞がオリザ・サティバ(イネ科イネ)(Oryza sativa)である、請求項17に記載の方法。
- 前記核酸が、前記カプシドタンパク質以外のウイルスタンパク質をコードするウイルス配列を含まない、請求項1に記載の方法。
- 融合ペプチドをコードする核酸配列を含む非感染性核酸を含む植物細胞であって、前記融合ペプチドは少なくとも1個の対象異種ペプチドと少なくとも1個のウイルスカプシドタンパク質から成り、前記核酸は前記植物細胞ゲノムに組み込まれている、前記植物細胞。
- 前記植物細胞が前記融合ペプチドを発現する、請求項20に記載の植物細胞。
- 前記融合ペプチドがインビボでウイルス様粒子に集合される、請求項21に記載の植物細胞。
- 前記抗原性ペプチドが、配列番号1−4から成る群より選択される、請求項20に記載の植物細胞。
- 前記核酸が、配列番号5−12から成る群より選択される、請求項20に記載の植物細胞。
- 前記植物細胞がニコチアナ・タバカムである、請求項20に記載の植物細胞。
- 前記植物細胞がオリザ・サティバである、請求項20に記載の植物細胞。
- 前記核酸が3’UTRをさらに含む、請求項20に記載の植物細胞。
- 前記核酸がウイルス3’UTRをさらに含む、請求項20に記載の植物細胞。
- 前記3’UTRがカプシド形成シグナルを含む、請求項28に記載の植物細胞。
- 前記核酸がカプシド形成シグナルをさらに含む、請求項20に記載の植物細胞。
- 前記ウイルスカプシドタンパク質が、植物細胞宿主に対して天然栄養機能を示さないウイルスに由来する、請求項20に記載の植物細胞。
- 前記ウイルスカプシドタンパク質が、植物細胞宿主に対して天然栄養機能を示すウイルスに由来する、請求項20に記載の植物細胞。
- 前記ウイルスカプシドタンパク質が二十面体植物ウイルスに由来する、請求項20に記載の植物細胞。
- 前記二十面体ウイルスが、カウピーモザイクウイルス、カウピークロロティックモトルウイルス及びアルファルファモザイクウイルスから成るウイルスの群より選択される、請求項33に記載の植物細胞。
- 配列番号5−12から成る群より選択される配列を含む核酸構築物。
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