PT2173886E - Partículas semelhantes ao vírus da gripe (vlps) compreendendo hemaglutinina produzida numa planta - Google Patents

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PT2173886E
PT2173886E PT87832010T PT08783201T PT2173886E PT 2173886 E PT2173886 E PT 2173886E PT 87832010 T PT87832010 T PT 87832010T PT 08783201 T PT08783201 T PT 08783201T PT 2173886 E PT2173886 E PT 2173886E
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Marc-Andre D Aoust
Manon Couture
Frederic Ors
Sonia Trepanier
Pierre-Olivier Lavoie
Nathalie Landry
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Description

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DESCRIÇÃO "PARTÍCULAS SEMELHANTES AO VÍRUS DA GRIPE (VLPS) COMPREENDENDO HEMAGLUTININA PRODUZIDA NUMA PLANTA"
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à produção de partículas semelhantes a vírus. Mais especificamente, a presente invenção é dirigida à produção de partículas semelhantes a vírus compreendendo antigénios da gripe.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A gripe é a principal causa de morte em seres humanos devido a um vírus respiratório. Os sintomas comuns incluem febre, garganta inflamada, respiração ofegante e dores musculares, entre outros. Durante a temporada da gripe, o vírus da gripe infeta 10-20% da população mundial, levando a 250-500 000 mortes por ano.
Os vírus da gripe são vírus com envelope que brotam a partir da membrana do plasma de células de mamífero infetadas. Estes são classificados nos tipos A, B ou C, com base nas nucleoproteínas e antigénios da proteína da matriz presentes. O vírus da gripe de tipo A pode ser ainda dividido em subtipos de acordo com a combinação das glicoproteínas de superfície de hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) apresentadas. A HA governa a aptidão do vírus para se ligar e penetrar na célula hospedeira. A NA remove resíduos de ácido siálico terminais a partir de cadeias de glicano na célula hospedeira e nas proteínas da superfície virai, o que impede a agregação virai e facilita a mobilidade do vírus. Atualmente são reconhecidos 16 2 subtipos HA (H1-H16) e 9 ΝΑ (N1-N9). Cada vírus da gripe de tipo A apresenta um tipo de glicoproteína HA e um tipo de glicoproteína NA. Geralmente, cada subtipo exibe uma especificidade para a espécie; por exemplo, sabe-se que todos os subtipos HA e NA infetam aves, contudo foi demonstrado que apenas os subtipos Hl, H2, H3, H5, H7, H9, H10, Nl, N2, N3 e N7 infetam seres humanos (Horimoto 2006; Suzuki 2005) . Os vírus da gripe que compreendem H5, H7 e H9 são considerados as formas mais altamente patogénicas do vírus da gripe A e têm muito probabilidade de originar futuras pandemias.
As pandemias de gripe são geralmente provocadas por vírus da gripe extremamente transmissíveis e virulentos, e podem levar a níveis elevados de doença e morte à escala mundial. O aparecimento de novos subtipos de gripe A resultou em 4 pandemias muito importantes no século 20. A gripe Espanhola, provocada por um vírus H1N1, em 1918-1919 levou à morte de mais de 50 milhões de pessoas em todo o mundo entre 1917 e 1920. Atualmente, o risco de aparecimento de um novo subtipo, ou da transmissão para os seres humanos de um subtipo endémico em animais, está sempre presente. De particular preocupação é uma forma altamente virulenta de gripe aviária (também chamada "gripe das aves"), da qual têm sido relatados surtos em vários países de todo o mundo. Em muitos casos, esta gripe aviária pode resultar em taxas de mortalidade próximas de 100% em menos de 48 horas. A disseminação do vírus da gripe aviária (H5N1), inicialmente identificado em Hong Kong em 1997, para outros países Asiáticos e Europeus tem sido considerada como estando ligada aos padrões de migração das aves selvagens. O método atual para combater a gripe em seres humanos é por vacinação anual. A vacina é geralmente uma associação de várias estirpes que se prevê serem as estirpes dominantes 3 na próxima "temporada de gripe". A previsão é coordenada pela Organização Mundial de Saúde. Em geral, o número de doses de vacinas produzidas em cada ano não é suficiente para vacinar a população mundial. Por exemplo, o Canadá e os Estados Unidos obtêm doses de vacinas suficientes para imunizar cerca de um terço da sua população, enquanto a União Europeia pode vacinar apenas 17% da sua população. É evidente que a atual produção mundial de vacinas contra a gripe seria insuficiente perante uma pandemia mundial de gripe. Mesmo se, de alguma forma, pudesse ser satisfeita a produção anual necessária num dado ano, as estirpes dominantes alteram de ano para ano, pelo que o armazenamento em alturas de menor necessidade no ano não é eficaz. A produção económica, em grande escala de uma vacina eficaz contra a gripe é de interesse significativo tanto para o governo como para a indústria privada.
Os lotes virais a serem utilizados em vacinas são produzidos em ovos fertilizados. As partículas de vírus são colhidas e, para uma vacina virai inativada, rompidas como detergente para inativar. As vacinas vivas atenuadas são feitas de vírus da gripe que foram adaptados para crescerem a temperatura baixa, o que significa que à temperatura corporal normal, a vacina é atenuada. Uma vacina desse tipo está autorizada nos EUA para ser utilizada em indivíduos desde os 5 até aos 4 9 anos de idade. As vacinas de vírus inteiros inativados são tornadas inofensivas por inativação com agentes químicos e têm sido produzidas em ovos embrionários ou cultura de células de mamíferos. Todos estes tipos de vacina apresentam algumas vantagens e desvantagens específicas. Uma vantagem das vacinas derivadas de vírus inteiros é o tipo de imunidade induzida por tais vacinas. Em geral, as vacinas fragmentadas induzem uma resposta de anticorpos forte, ao passo que as vacinas feitas de vírus inteiros induzem uma resposta de anticorpos 4 (humoral) e celular. Apesar de uma resposta de anticorpos funcional ser um critério para licenciamento que correlaciona com a proteção induzida por uma vacina, há cada vez mais evidência de que uma resposta de células T é também importante na imunidade contra a gripe - isto também pode proporcionar melhor proteção nos idosos. A fim de induzir uma resposta imunológica celular, foram desenvolvidas vacinas feitas de virus inteiros. Devido à alta patogenicidade da estirpe da gripe (por exemplo H5N1), estas vacinas são produzidas em instalações BL3+. Para estirpes de gripe altamente patogénicas tal como a H5N1, alguns fabricantes modificaram a sequência genética da hemaglutinina a fim de reduzir a patogenicidade da estirpe da gripe e torná-la não virulenta e mais fácil de produzir em ovos embrionários ou cultura de células de mamiferos. Outros também utilizaram estirpes de gripe recombinantes nas quais as sequências genéticas para as proteinas de hemaglutinina e neuraminidase são clonadas numa estirpe doadora da gripe pouco patogénica de alto rendimento (A/PR/8/34; Quan F-S et al, 2007) . Apesar de estes métodos poderem produzir vacinas úteis, eles não proporcionam uma solução para a necessidade de produção rápida, a baixo custo e de grande volume de vacinas à escala necessária para satisfazer a necessidade mundial num ano normal, e seriam quase certamente insuficientes perante uma pandemia.
Ao utilizar esta tecnologia genética inversa, poderia ser também necessário mutar a sequência genética da proteina HA para torná-la não virulenta. Para estirpes de gripe altamente patogénicas, a produção de vacinas de virus inteiros requer procedimentos de restrição ou as vacinas resultantes não coincidem exatamente com a sequência genética do virus circulante. No caso de vacinas vivas atenuadas há ainda o risco de que a vacina administrada 5 possa recombinar-se com um vírus da gripe do hospedeiro, conduzindo a um novo vírus da gripe.
Apesar de este método manter o epítopo antigénico e as modificações pós-tradução, existe um número de desvantagens para este método, incluindo o risco de contaminação devido à utilização de vírus inteiros e rendimentos variáveis dependendo da estirpe do vírus. Níveis de proteção inferiores aos ideais podem resultar de heterogeneidade genética no vírus devido à sua introdução em ovos. Outras desvantagens incluem a planificação intensiva para obter ovos, os riscos de contaminação devido aos produtos químicos utilizados na purificação e os tempos de produção longos. Além disso, as pessoas hipersensíveis às proteínas do ovo não podem ser candidatos elegíveis para receber a vacina.
No caso de uma pandemia, a produção de vacinas fragmentadas está limitada pela necessidade de adaptar a estirpe ao crescimento em ovos e pelos rendimentos de produção variáveis alcançados. Embora esta tecnologia tenha sido utilizada durante anos para a produção de vacinas sazonais, ela dificilmente responderá num prazo razoável a uma pandemia e a capacidade de produção mundial é limitada. A fim de evitar a utilização de ovos, os vírus da gripe também têm sido produzidos em cultura de células de mamíferos, por exemplo em células MDCK ou PERC.6, ou semelhantes. Outra abordagem é a genética inversa, na qual os vírus são produzidos por transformação de células com genes virais. No entanto, estes métodos requerem também a utilização de vírus inteiros bem como métodos elaborados e meios de cultura específicos. 6 Vários produtos recombinantes foram desenvolvidos como candidatos de vacinas contra a gripe recombinante. Estas abordagens focaram-se na expressão, produção e purificação das proteínas HA e NA da gripe de tipo A, incluindo a expressão destas proteínas utilizando células de inseto infetadas por baculovírus (Crawford et al, 1999; Johansson, 1999), vetores virais e construções de vacinas de ADN (Olsen et al., 1997).
Os detalhes de uma infeção pelo vírus da gripe são bem conhecidos. Resumidamente, o ciclo infeccioso é iniciado pela fixação da proteína HA da superfície do virião a um recetor celular contendo ácido siálico (glicoproteínas e glicolípidos). A proteína NA medeia o processamento do recetor de ácido siálico e a penetração do vírus na célula depende da endocitose mediada pelo recetor dependente de HA. Nos limites de acidez dos endossomas internalizados contendo um virião da gripe, a proteína HA sofre alterações conformacionais que levam à fusão das membranas virai e celular e ao desnudamento do vírus e à libertação mediada por M2 de proteínas MI a partir de ribonucleoproteínas associadas ao nucleocapsídeo (RNPs), as quais migram para o núcleo da célula para síntese do ARN virai. Os anticorpos contra as proteínas HA impedem a infeção pelo vírus neutralizando a infetividade do vírus, enquanto os anticorpos contra as proteínas NA medeiam o seu efeito nas fases iniciais da replicação virai.
Crawford et al. (1999) divulgam a expressão da HA da gripe em células de inseto infetadas por baculovírus. As proteínas expressadas são descritas como sendo capazes de prevenir uma doença de gripe letal provocada pelos subtipos da gripe aviária H5 e H7. Johansson et al. (1999) ensinam que as proteínas HA e NA da gripe expressadas em baculovírus induzem respostas imunológicas em animais 7 superiores àquelas induzidas por uma vacina convencional. A imunogenicidade e eficácia da hemaglutinina do virus da gripe equina expressada em baculovirus foi comparada com um candidato de vacina de ADN homólogo (Olsen et al., 1997) . Conjuntamente, estes dados demonstram que pode ser induzido um alto grau de proteção contra um desafio de virus da gripe com proteínas HA ou NA recombinantes, utilizando várias abordagens experimentais e em diferentes modelos animais.
Uma vez que investigação anterior demonstrou que as glicoproteinas da superfície da gripe, HA e NA, são os alvos primários para obtenção de imunidade protetora contra o vírus da gripe e que a Ml proporciona um alvo conservado para imunidade celular contra a gripe, um novo candidato de vacina pode incluir estes antigénios virais como uma partícula macromolecular proteica, tais como as partículas semelhantes a vírus (VLPs). Como produtos para vacinas, as VLPs oferecem a vantagem de serem mais imunogénicas do que a subunidade ou os antigénios recombinantes e são capazes de estimular tanto a resposta imunológica humoral como a resposta imunológica celular (Grgacic e Anderson, 2006). Além disso, a partícula com estes antigénios da gripe podem exibir epítopos conformacionais que desencadeiam anticorpos neutralizantes para estirpes múltiplas do vírus da gripe. A produção de uma estirpe do vírus da gripe não infecciosa para efeitos de vacina é uma forma de evitar infeção negligente. Alternativamente, investigaram-se partículas semelhantes a vírus (VLPs) como substitutos para os vírus cultivados. As VLPs imitam a estrutura do capsídeo virai, mas carecem de um genoma e, deste modo, não podem replicar-se ou proporcionar um meio para uma infeção secundária. Vários estudos demonstraram que as proteínas de gripe recombinantes se auto-reunem em VLPs em cultura de células utilizando plasmideos de expressão de mamíferos ou vetores de baculovirus (Gomez-Puertas et al., 1999; Neumann et al., 2000; Latham e Galarza, 2001). Gomez-Puertas et al. (1999) divulgam que a formação eficiente da VLP da gripe depende dos niveis de expressão de várias proteínas virais. Neumann et al. (2000) estabeleceram um sistema baseado em plasmídeo de expressão de mamífero para gerar partículas semelhantes ao vírus da gripe infecciosa completamente a partir de ADNc clonados. Latham e Galarza (2001) descreveram a formação de VLPs da gripe em células de inseto infetadas com baculovirus recombinantes que co-expressam genes de HA, NA, Ml e M2. Estes estudos demonstraram que as proteínas do virião da gripe podem-se auto-reunir durante a co-expressão em células eucarióticas.
Gomez-Puertas et al. (2000) ensina que, além da hemaglutinina (HA), a proteína da matriz (Ml) do vírus da gripe é essencial para germinação da VLP a partir de células de inseto. No entanto, Chen et al. (2007) ensina que a Ml pode não ser necessária para a formação de VLP e observou que a libertação eficiente de Ml e VLPs requereu a presença de HA e da atividade sialidase proporcionada pela NA. A NA dissocia os ácidos siálicos das glicoproteínas na superfície das células produzindo as VLPs e libertando as VLPs no meio.
Quan et al 2007 ensina que uma vacina de VLP produzida num sistema de expressão de baculovirus (célula de inseto) induz uma imunidade protetora contra algumas estirpes de vírus da gripe (A/PR8/34 (H1N1)). Foi observado que as VLPs estudadas por Quan germinavam a partir da membrana do plasma e foram considerados ser do tamanho e morfologia 9 corretos, semelhantes àqueles obtidos num sistema mamífero (células MDCK).
Os vírus com envelope podem obter o seu envelope lipídico quando 'germinam' para fora da célula infetada e obtêm a membrana a partir da membrana do plasma ou a partir da membrana de um organito interno. As partículas do vírus da gripe e VLPs germinam a partir da membrana do plasma da célula hospedeira. Por exemplo, em sistemas de células de mamífero ou baculovírus, a gripe germina a partir da membrana do plasma (Quan et al 2007). Sabe-se que apenas alguns vírus com envelope infetam plantas (por exemplo, os membros dos Topovírus e Rhabdovírus) . Os vírus com envelope de plantas conhecidos caracterizam-se por germinar a partir de membranas internas da célula hospedeira, e não a partir da membrana do plasma. Apesar de um número pequeno de VLPs recombinantes ter sido produzido em hospedeiros vegetais, nenhum deles derivou da membrana do plasma, levantando a questão se as VLPs derivadas da membrana do plasma, incluindo as VLPs da gripe, podem ser produzidas em plantas.
As tecnologias atuais de produção da VLP da gripe assentam na co-expressão de proteínas virais múltiplas e esta dependência representa uma desvantagem destas tecnologias, já que no caso de uma pandemia e de epidemias anuais, o tempo de resposta é crucial para a vacinação. Um sistema de produção de VLP mais simples, que se baseie na expressão de apenas uma proteína virai é desejável para acelerar o desenvolvimento da vacina. A fim de proteger a população mundial da gripe e anular pandemias futuras, os fabricantes de vacinas terão de desenvolver métodos de produção de doses de vacinas rápidos e eficazes. A utilização atual de ovos fertilizados para 10 produzir vacinas é insuficiente e envolve um processo longo.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO É um objetivo da invenção proporcionar partículas semelhantes ao vírus da gripe (VLPs) melhoradas. A presente invenção também proporciona um método de produção de partículas semelhantes ao vírus da gripe (VLPs) numa planta compreendendo: a) introduzir um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica uma hemaglutinina (HA) da gripe, operacionalmente ligado a uma região reguladora ativa da planta, na planta ou parte da mesma, b) incubar a planta ou uma parte da mesma sob condições que permitem a expressão do ácido nucleico, produzindo deste modo as VLPs, colher a planta e purificar ou separar as VLPs a partir do tecido vegetal, em que as VLPs variam em tamanho desde 80-300 nm. A presente invenção inclui o método acima em que, no passo de introdução (passo a), o ácido nucleico pode ser expressado transitoriamente na planta ou expressado de forma estável na planta. Além disso, as VLPs podem ser purificadas utilizando cromatografia de exclusão molecular. A presente invenção também proporciona uma partícula semelhante a vírus (VLP) produzida de acordo com o método 11 compreendendo uma proteína HA do vírus da gripe e um ou mais do que um lípido vegetal.
Está também incluída na presente invenção, uma composição compreendendo uma dose eficaz de uma VLP produzida de acordo com o método compreendendo uma proteína HA do vírus da gripe, um ou mais do que um lípido vegetal, e um veículo farmaceuticamente aceitável. São também considerados os fragmentos ou porções de proteínas HA que formam VLPs numa planta. A VLP pode compreender um proteína HA de um, ou mais do que um subtipo, incluindo Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15 ou H16 ou fragmento ou parte da mesma. Os exemplos de subtipos compreendendo tais proteínas HA incluem A/Nova Caledónia/20/99 (H1N1), A/Indonésia/5/2006 (H5N1), A/galinha/Nova Iorque/1995, A/gaivota prateada/DE/677/88 (H2N8), A/Texas/32/2003, A/pato-selvagem/MN/33/00, A/pato/Xangai/1/2000, A/arrabio do norte/TX/828189/02, A/Peru/Ontário/6118/68 (H8N4), A/pato-trombeteiro/Irão/G54/03, A/galinha/Alemanha/N/1949 (H10N7), A/pato/Inglaterra/56 (H11N6), A/pato/Alberta/60/76 (H12N5), A/Gaivota/Maryland/704/77 (H13N6) , A/Pato-selvagem/Gurjev/263/82, A/pato/Austrália/341/83 (H15N8), A/guincho-comum/Suécia/5/99 (H16N3), B/Lee/40, C/Joanesburgo/66, A/Porto Rico/8/34 (H1N1), A/Brisbânia/59/2007 (H1N1), A/Ilhas Salomão 3/2006 (H1N1), A/Brisbânia 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), B/Malásia/2506/2004, B/Flórida/4/2006, A/Singapura/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietname/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Equina/Praga/56 (H7N7), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)). 12
Num aspeto da invenção, a proteína HA pode ser um subtipo Hl, H2, H3, H5, H6, H7 ou H9. Num outro aspeto, a proteína Hl pode ser da estirpe A/Nova Caledónia/20/99 (H1N1), A/.Porto Rico/8/34 (H1N1), A/Brisbânia/59/2007 (H1N1) ou A/Ilhas Salomão 3/2006 (H1N1). A proteína H3 também pode ser da estirpe A/Brisbânia 10/2007 (H3N2) ou A/Wisconsin/67/2005 (H3N2). Num outro aspeto da invenção, a proteína H2 pode ser da estirpe A/Singapura/1/57 (H2N2). A proteína H5 pode ser da estirpe A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietname/1194/2004 (H5N1) ou A/Indonésia/5/2005. Num aspeto da invenção, a proteína H6 pode ser da estirpe A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1). A proteína H7 pode ser da estirpe A/Equina/Praga/56 (H7N7). Num aspeto da invenção, a proteína H9 é da estirpe A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) . Num outro aspeto da invenção, a proteína HA pode ser de um vírus da gripe de tipo B, incluindo B/Malásia/2506/2004 ou B/Flórida/4/2006. Os exemplos de sequências de aminoácidos das proteínas HA dos subtipos Hl, H2, H3, H5, H6, H7 ou H9 incluem as SEQ ID NOs: 48-59. A proteína HA do vírus da gripe pode ser H5 Indonésia. A presente invenção envolve moléculas de ácido nucleico compreendendo sequências que codificam uma proteína HA. As moléculas de ácido nucleico podem compreender ainda uma ou mais regiões reguladoras operacionalmente ligadas à sequência que codifica uma proteína HA. As moléculas de ácido nucleico podem compreender uma sequência que codifica uma Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15 ou H16. A proteína HA codificada pela molécula de ácido nucleico pode ser um subtipo Hl, H2, H3, H5, H6, H7 ou H9. A proteína Hl codificada pela molécula de ácido nucleico é da estirpe A/Nova Caledónia/20/99 (H1N1), A/.Porto Rico/8/34 (H1N1), A/Brisbânia/59/2007 (H1N1) ou A/Ilhas Salomão 3/2006 (H1N1). A proteína H3 codificada 13 pela molécula de ácido nucleico pode ser da estirpe A/Brisbânia 10/2007 (H3N2) ou A/Wisconsin/67/2005 (H3N2). A proteina H2 codificada pela molécula de ácido nucleico pode ser da estirpe A/Singapura/1/57 (H2N2). A proteina H5 codificada pela molécula de ácido nucleico também pode ser da estirpe A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietname/1194/2004 (H5N1) ou A/Indonésia/5/2005. A proteina H6 codificada pela molécula de ácido nucleico pode ser da estirpe A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1). A proteina H7 codificada pela molécula de ácido nucleico também pode ser da estirpe A/Equina/Praga/56 (H7N7). Adicionalmente, a proteina H9 codificada pela molécula de ácido nucleico pode ser da estirpe A/Hong Kong/1073/99 (H9N2). Os exemplos de sequências de moléculas de ácido nucleico que codificam tais proteínas HA dos subtipos Hl, H2, H3, H5, H6, H7 ou H9 incluem as SEQ ID NOs: 36-47 e 60-73. A sequência de ácido nucleico pode codificar a proteína HA do vírus da gripe H5 Indonésia.
As regiões reguladoras que podem ser operacionalmente ligadas a uma sequência que codifica uma proteína HA incluem aquelas que são operacionais numa célula vegetal, uma célula de inseto ou uma célula de levedura. Tais regiões reguladoras podem incluir uma região reguladora de plastocianina, uma região reguladora de carboxilase/oxigenase de 1,5-bisfosfato de Ribulose (RuBisCO), proteína de ligação a clorofila a/b (CAB), ST-LSl, uma região reguladora de poli-hedrina ou uma região reguladora de gp64. Outras regiões reguladoras incluem uma UTR 5', UTR 3' ou sequências de terminação. A região reguladora de plastocianina pode ser uma região reguladora de plastocianina de luzerna; a UTR 5', UTR 3' ou sequências de terminação também podem ser sequências de luzerna. 14 A composição da invenção é útil na indução de imunidade a uma infeção pelo virus da gripe num indivíduo. Aquela pode compreender a administração da partícula semelhante a vírus compreendendo uma proteína HA do vírus da gripe, um ou mais do que um lípido vegetal, e um veículo farmaceuticamente aceitável. A partícula semelhante a vírus pode ser administrada a um indivíduo por via oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa ou subcutânea.
Além disso, a presente invenção refere-se a uma partícula semelhante a vírus (VLP) compreendendo uma proteína HA do vírus da gripe e um ou mais do que um lípido hospedeiro derivado de uma planta. São também consideradas composições compreendendo VLPs de duas ou mais estirpes ou subtipos de gripe. Os dois ou mais subtipos ou estirpes podem ser selecionados do grupo compreendendo: A/Nova Caledónia/20/99 (H1N1), A/Indonésia/5/2006 (H5N1), A/galinha/Nova Iorque/1995, A/gaivota prateada/DE/677/88 (H2N8), A/Texas/32/2003, A/pato-selvagem/MN/33/00, A/pato/Xangai/1/2000, A/arrabio do norte/TX/828189/02, A/Peru/Ontário/6118/68 (H8N4), A/pato-trombeteiro/Irão/G54/03, A/galinha/Alemanha/N/194 9 (H10N7), A/pato/Inglaterra/56 (H11N6), A/pato/Alberta/60/76 (H12N5), A/Gaivota/Maryland/704/77 (H13N6), A/Pato-selvagem/Gurjev/263/82, A/pato/Austrália/341/83 (H15N8), A/guincho-comum/Suécia/5/99 (H16N3), B/Lee/40, C/Joanesburgo/66, A/Porto Rico/8/34 (H1N1), A/Brisbânia/59/2007 (H1N1), A/Ilhas Salomão 3/2006 (H1N1), A/Brisbânia 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), B/Malásia/2506/2004, B/Flórida/4/2006, A/Singapura/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietname/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Equina/Praga/56 (H7N7) ou A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)). Os dois ou mais 15 subtipos ou estirpes de VLPs podem estar presentes em quantidades aproximadamente equivalentes; alternativamente, um ou mais dos subtipos ou estirpes pode ser a maioria das estirpes ou subtipos representados. A presente invenção refere-se a uma composição da invenção para ser utilizada na indução de imunidade à infeção pelo virus da gripe num animal ou organismo alvo compreendendo administrar uma dose eficaz de uma vacina compreendendo uma ou mais do que uma VLP, a VLP produzida utilizando um hospedeiro vegetal. A vacina pode ser administrada por via oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa ou subcutânea. 0 organismo alvo pode ser selecionado do grupo compreendendo humanos, primatas, cavalos, porcos, aves (aviárias) aquáticas, aves migratórias, codorniz, pato, gansos, aves domésticas, galinha, camelo, canino, cães, felino, gatos, tigre, leopardo, civeta, marta, fuinha, furões, animais de estimação, gado, ratos, ratazanas, foca, baleias e semelhantes. A presente invenção refere-se a um método para produzir VLPs contendo hemaglutinina (HA) a partir de diferentes estirpes de gripe num hospedeiro vegetal capaz de produzir uma VLP. As VLPs que são produzidas em plantas que contêm lípidos de origem vegetal. A produção de VLPs em plantas apresenta várias vantagens em relação à produção destas partículas em cultura de células de inseto. Os lípidos vegetais podem estimular células imunitárias específicas e melhorar a resposta imunológica induzida. As membranas vegetais são feitas de lípidos, fosfatidilcolina (PC) e fosfatidiletanolamina (PE) e também contêm glicosfingolípidos que são únicos a plantas e algumas bactérias e protozoários. Os esfingolípidos são 16 invulgares pelo fato de eles não serem ésteres de glicerol como a PC ou PE mas, pelo contrário, consistirem de um amino álcool de cadeia longa que forma uma ligação amida com uma cadeia de ácido gordo contendo mais do que 18 carbonos. A PC e a PE bem como os glicosfingolipidos podem ligar-se a moléculas CD1 expressadas por células imunitárias de mamifero tais como as células apresentadoras de antigénio (APCs) como as células dendriticas e macrófagos e outras células incluindo linfócitos B e T no timo e figado (Tsuji M, . 2006) . Além disso, além do potencial efeito adjuvante da presença de lípidos vegetais, a aptidão dos N-glicanos vegetais para facilitar a captura de antigénios de glicoproteina por células apresentadoras de antigénio (Saint-Jore-Dupas, 2007) pode ser uma vantagem da produção de VLPs em plantas.
Sem se pretender ficar limitado pela teoria, prevê-se que as VLPs feitas em plantas induzirão uma reação imunológica mais forte do que as VLPs feitas noutros sistemas de produção e que a reação imunológica induzida por estas VLPs feitas por plantas será mais forte em comparação com a reação imunológica induzida por vacinas de virus inteiros vivos ou atenuados.
Ao contrário das vacinas feitas de virus inteiro, as VLPs proporcionam a vantagem de não serem infecciosas, pelo que a contenção biológica restritiva não é uma questão tão importante quanto seria se se trabalhasse com um virus infeccioso inteiro, e não é necessária na produção. As VLPs feitas em plantas proporcionam novamente uma outra vantagem ao permitir que o sistema de expressão seja cultivado numa estufa ou campo, sendo assim significativamente mais económico e adequado para aumento de escala. 17
Além do mais, as plantas não compreendem as enzimas envolvidas na sintese e adição de resíduos de ácido siálico a proteínas. As VLPs pode ser produzidas na ausência de neuraminidase (NA) e não há necessidade de co-expressar a NA ou de tratar as células produtoras ou o extrato com sialidase (neuraminidase) , para garantir a produção de VLP em plantas.
As VLPs produzidas de acordo com a presente invenção não compreendem proteína Ml, a qual é conhecida por se ligar ao ARN. 0 ARN é um contaminante na preparação de VLP e é indesejado quando se obtém aprovação regulamentar para o produto de VLP.
Este sumário da invenção não descreve necessariamente todas as características da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Estas e outras características da invenção tornar-se-ão mais evidentes a partir da descrição seguinte na qual é feita referência aos desenhos apensos em que: A FIGURA IA mostra uma sequência de uma cassete de expressão baseada em plastocianina de luzerna utilizada para a expressão de Hl de acordo com uma forma de realização da presente invenção (SEQ ID N0:8). 0 péptido sinal de isomerase de dissulfureto de proteína (PDI) está sublinhado. Os sítios de restrição BglII (AGATCT) e Saci (GAGCTC) utilizados para clonagem são mostrados a negrito. A Figura 1B mostra um diagrama esquemático dos domínios funcionais da hemaglutinina da gripe. Após dissociação da HAO, os fragmentos HA1 e HA2 permanecem ligados em conjunto por um ponte dissulfureto. 18 A FIGURA 2A mostra uma representação do plasmídeo 540 montado para a expressão da HA de subtipo Hl. A FIGURA 2B mostra uma representação do plasmídeo 660 montado para a expressão da HA de subtipo H5. A FIGURA 3 mostra uma cromatografia de exclusão molecular de extratos proteicos de folhas que produzem hemaglutinina Hl ou H5. A FIGURA 3A mostra o perfil de eluição de Hl; Dextrano Azul 2000 (triângulos) e proteínas (losangos) . A FIGURA 3B mostra a imunodeteção (transferência de western; anti Hl) de frações de eluição de Hl após cromatograf ia de exclusão molecular (esferas S500HR). A FIGURA 3C mostra o perfil de eluição de H5; Dextrano Azul 2000 (triângulos) e proteínas (losangos). A FIGURA 3D mostra a imunodeteção (transferência de western; anti H5) de frações de eluição de H5 após cromatografia de exclusão molecular (esferas S500HR). A FIGURA 4 mostra uma fotomicrografia de microscopia eletrónica de estruturas grandes de hemaglutinina Hl e H5 da fração de eluição 9 de uma coluna de exclusão molecular. A FIGURA 4A mostra uma ampliação de 50 000 vezes de uma VLP de Hl que mostra a presença de estruturas semelhantes múltiplas (a barra representa 200 nm) . A FIGURA 4B mostra uma ampliação de 150 000 vezes de uma VLP de Hl (a barra representa 10 0 nm) . A FIGURA 4C mostra uma ampliação de 50 000 vezes de uma VLP de H5 que mostra a presença de estruturas semelhantes múltiplas (a barra representa 50 nm) . A FIGURA 5A mostra a sequência do fragmento N terminal de Hl (SEQ ID NO:l). A FIGURA 5B mostra o fragmento C terminal de Hl (SEQ ID NO:2). A FIGURA 5C mostra a sequência completa que codifica a HA0 de Hl (SEQ ID NO:28). 19 A FIGURA 6 mostra a sequência que codifica a H5 flanqueada por um sitio HindIII imediatamente a montante do ATG inicial e um sitio Saci imediatamente a jusante do codão de paragem (TAA) (SEQ ID NO:3) A FIGURA 7A mostra a sequência do iniciador Plasto-443c (SEQ ID NO:4). A FIGURA 7B mostra a sequência do iniciador SpHA(Ind)-Plasto.r (SEQ ID N0:5). A FIGURA 7C mostra a sequência do iniciador Plasto-SpHA(Ind) .c (SEQ ID N0:6). A FIGURA 7D mostra a sequência do iniciador HA(Ind)-Sac.r (SEQ ID NO:7). A FIGURA 8A mostra a sequência de aminoácidos da sequência peptidica HA1 (SEQ ID NO:9). A FIGURA 8B mostra a sequência de aminoácidos da sequência peptidica HA5 (SEQ ID NO:10). O péptido sinal nativo é indicado a negrito. A FIGURA 9 mostra a sequência de HA da gripe A de subtipo H7 (SEQ ID No: 11).
A FIGURA 10A mostra a sequência da HA da Gripe A, subtipo H2 (SEQ ID NO:12). A FIGURA 10B mostra a sequência da HA da Gripe A de subtipo H3 (SEQ ID NO:13). A FIGURA 10C mostra a sequência da HA da Gripe A de subtipo H4 (SEQ ID NO: 14). A FIGURA 10D mostra a sequência da HA da Gripe A de subtipo H5 (SEQ ID NO:15). A FIGURA 10E mostra a sequência da HA da Gripe A de subtipo H6 (SEQ ID NO:16). A FIGURA 10F mostra a sequência da HA da Gripe A de subtipo H8 (SEQ ID NO: 17). A FIGURA 10G mostra a sequência da HA da Gripe A de subtipo H9 (SEQ ID NO:18). A FIGURA 10H mostra a sequência da HA da Gripe A de subtipo H10 (SEQ ID NO:19). A FIGURA 101 mostra a sequência da HA da Gripe A de subtipo Hll (SEQ ID NO:20). A FIGURA 10J mostra a sequência da HA da Gripe A de subtipo H12 (SEQ ID NO:21) . A FIGURA 10K mostra a sequência da HA da Gripe A de subtipo H13 (SEQ ID NO:22) . A FIGURA 10L 20 mostra a sequência da HA da Gripe A de subtipo H14 (SEQ ID NO:23). A FIGURA 10M mostra a sequência da HA da Gripe A de subtipo H15 (SEQ ID NO:24). A FIGURA 10N mostra a sequência da HA da Gripe A de subtipo H16 (SEQ ID NO:25) . A FIGURA 100 mostra a sequência da HA da Gripe B (SEQ ID NO: 26) . A FIGURA 10P mostra a sequência da HA da Gripe C (SEQ ID NO:27). A FIGURA 10Q mostra a sequência do iniciador Xmal-pPlas.c (SEQ ID NO: 29). A FIGURA 10R mostra a sequência do iniciador SacI-ATG-pPlas. r (SEQ ID NO: 30). A FIGURA 10S mostra a sequência do iniciador SacI-PlasTer.c (SEQ ID NO: 31). A FIGURA 10T mostra a sequência do iniciador EcoRI-PlasTer.r (SEQ ID NO: 32). A FIGURA 11 mostra uma representação esquemática de várias construções como aqui utilizadas. A construção 660 compreende a sequência de nucleótidos que codifica a HA de subtipo H5 operacionalmente ligada ao promotor de plastocianina (plasto) e finalizador (Pter); a construção 540 compreende a sequência de nucleótidos que codifica a HA de subtipo Hl em associação com um péptido sinal de isomerase de dissulfureto de proteina de luzerna (SP PDI), e está operacionalmente ligado a um promotor de plastocianina (Plasto) e finalizador (Pter); a construção 544 montada para a expressão da HA de subtipo Hl, a sequência de nucleótidos que codifica a Hl é combinada com um péptido sinal de isomerase de dissulfureto de proteina de luzerna (SP PDI) e um fecho de leucina GCN4pII (em vez do domínio transmembranar e cauda citoplasmática de Hl) e operacionalmente ligado ao promotor de plastocianina (Plasto) e finalizador (Pter); e a construção 750 para a expressão da região de codificação de Ml da gripe A/PR/8/34 é combinada como a UTR 5' do vírus da gravura do tabaco (TEV), e operacionalmente ligado com o promotor duplo 35S e finalizador NOS. 21 A FIGURA 12 mostra a imunodeteção de H5, utilizando anticorpos anti-H5 (Vietname), em extratos proteicos de folhas de N. benthamiana transformadas com a construção 660 (faixa 3). A H5 da gripe A/Vietname/1203/2004 comercial foi utilizada como controlo positivo de deteção (faixa 1) e um extrato proteico de folhas transformadas com um vetor vazio foi utilizado como controlo negativo (faixa 2). A FIGURA 13 mostra a caracterização de estruturas de hemaglutinina por cromatografia de exclusão molecular. O extrato proteico de biomassas separadas produtoras de H5, Hl, Hl solúvel, ou Hl e Ml foram separadas por filtração em gel sobre S-500 HR. Foi também fracionado Hl comercial na forma de rosetas (Hl roseta). A FIGURA 13A mostra frações de eluição analisadas em relação ao teor relativo de proteína (Nível Relativo de Proteína - é mostrado um perfil de eluição de proteína padrão de um fracionamento de biomassa) . É indicado o pico de eluição do Dextrano Azul 2000 (padrão de referência de 2 MDa). A FIGURA 13B mostra frações de eluição analisadas quanto à presença de hemaglutinina por imunotransferência com anticorpos anti-H5 (Vietname) (para H5). A FIGURA 13C mostra frações de eluição analisadas em relação a anticorpos anti-gripe A para Hl. A FIGURA 13D mostra frações de eluição analisadas em relação a anticorpos anti-gripe A para a Hl solúvel. A FIGURA 13E mostra frações de eluição analisadas em relação a anticorpos anti-gripe A para a Hl roseta. A FIGURA 13F mostra frações de eluição analisadas em relação a anticorpos anti-gripe A para Hl+Ml. A FIGURA 14 mostra a concentração de estruturas H5 da gripe por centrifugação em gradiente de sacarose e exame de microscopia eletrónica de frações concentradas de hemaglutinina. A FIGURA 14A mostra a caracterização de frações de centrifugação com gradiente de densidade de 22 sacarose. Cada fração foi analisada em relação à presença de H5 por imunotransferência utilizando anticorpos anti-H5 (Vietname) (painel superior) e em relação ao seu teor relativo de proteina e capacidade de hemaglutinação (gráfico). A FIGURA 14B mostra o exame de microscopia eletrónica de transmissão de revelação negativa das frações 17, 18 e 19 da centrifugação em gradiente de sacarose misturadas. A barra representa 100 nm. A FIGURA 15 mostra a purificação de VLPs de H5 da gripe. A FIGURA 15A mostra a análise por SDS-PAGE revelada com Azul de Coomassie do teor de proteina nos passos de clarificação - faixa 1, extrato em bruto; faixa 2, extrato ajustado a pH 6; faixa 3, extrato tratado termicamente; faixa 4, extrato filtrado por DE; os passos de purificação por afinidade em fetuina: faixa 5, carga; faixa 6, lavagem; faixa 7, eluição (concentrada 10X) . A FIGURA 15B mostra o exame de microscopia eletrónica de transmissão de revelação negativa da amostra de VLP de H5 purificada. A barra representa 100 nm. A FIGURA 15C mostra VLP de H5 isolada ampliada para mostrar os pormenores da estrutura. A FIGURA 15D mostra o produto de VLP de H5 num SDS-PAGE redutor revelado com Coomassie (faixa A) e a transferência de Western (faixa B) utilizando anticorpo policlonal de coelho gerado contra a HA da estirpe A/Vietname/1203/2004 (H5N1). A FIGURA 16 mostra uma sequência de nucleótidos para o gene de hemaglutinina (HA) do virus da Gripe A (A/Nova Caledónia/20/99(H1N1)), cds completo. N° de Acesso do GenBank AY289929 (SEQ ID NO: 33) A FIGURA 17 mostra uma sequência de nucleótidos para o ARNm da isomerase de dissulfureto de proteina da Medicago sativa. N° de Acesso do GenBank Z11499 (SEQ ID NO: 34). 23 FIGURA 18 mostra uma sequência de nucleótidos para o segmento 7 do vírus da Gripe A (A/Porto Rico/8/34(H1N1)), sequência completa. N° de Acesso do GenBank NC 002016,1 (SEQ ID NO: 35). A FIGURA 19 mostra a localização da acumulação de VLP por observação através de microscopia eletrónica de transmissão por revelação positiva de tecido produtor de H5. CW: parede celular, ch: cloroplasta, pm: membrana do plasma, VLP: partícula semelhante a vírus. A barra representa 100 nm. A FIGURA 20 mostra a indução de respostas de anticorpos séricos 14 dias após reforço em ratos BALB/c vacinados com VLP de H5 da gripe produzida numa planta ou HA solúvel recombinante. FIGURA 20(A) Respostas de anticorpos de ratos imunizados através de injeção intramuscular. FIGURA 20 (B) Respostas de anticorpos de ratos imunizados através de administração intranasal. As respostas de anticorpos foram medidas contra vírus H5N1 (A/Indonésia/5/05) inteiros inativados. GMT: título médio geométrico. Os valores são o GMT (log2) de títulos finais recíprocos de cinco ratos por grupo. As barras representam desvio da média. * p< 0,05 em comparação com HA solúvel recombinante. A FIGURA 21 mostra a resposta de anticorpos de inibição da hemaglutinação (HAI) 14 dias após reforço em ratos BALB/c vacinados com VLP de H5 da gripe produzida numa planta ou HA solúvel recombinante. FIGURA 21 (A) Respostas de anticorpos de ratos imunizados através de injeção intramuscular. FIGURA 21(B) Respostas de anticorpos de ratos imunizados através de administração intranasal. As respostas de anticorpo HAI foram medidas utilizando vírus H5N1 (A/Indonésia/5/05) inteiros inativados. GMT: título médio geométrico. Os valores são o GMT (log2) de títulos finais recíprocos de cinco ratos por grupo. As barras 24 representam o desvio da média. * p< 0,05 e ** p< 0,01 em comparação com a HA solúvel recombinante. A FIGURA 22 mostra o efeito do adjuvante na imunogenicidade das VLPs em ratos. FIGURA 22(A) Efeito do alúmen em ratos imunizados através de injeção intramuscular FIGURA 22 (B) Efeito do Quitosano em ratos imunizados através de administração intranasal. As respostas de anticorpo HAI foram medidas utilizando virus H5N1 (A/Indonésia/5/05) inteiros inativados. GMT: titulo médio geométrico. Os valores são o GMT (log2) de titulos finais recíprocos de cinco ratos por grupo. As barras representam o desvio da média. * p< 0,05 em comparação com a HA solúvel recombinante correspondente. A FIGURA 23 mostra a resposta de anticorpos à administração de VLP. FIGURA 23(A) Isotipo de imunoglobulina anti-Indonésia/5/05 em ratos vacinados com injeção intramuscular, 30 dias após reforço. Os valores são o GMT (log2) de titulos finais recíprocos de cinco ratos por grupo. ELISA realizado utilizando vírus inteiros inativados como o agente de revestimento. As barras representam o desvio da média. * p< 0,05, ** p< 0,001 em comparação com a HA solúvel recombinante correspondente. FIGURA 23 (B) Títulos de anticorpo contra vírus inteiros inativados. Todos os grupos são estatisticamente diferentes em relação ao controlo negativo. A FIGURA 24 mostra o título de anticorpo contra vírus (A/Indonésia/5/05) inteiros inativados homólogos, 2 semanas após a primeira dose (semana 2) , 14 dias após reforço (semana 5) ou 30 dias após reforço (semana 7) . GMT: título médio geométrico. Os valores são o GMT (log2) de títulos 25 finais recíprocos de cinco ratos por grupo. * p< 0,05 em comparação com a HA solúvel recombinante. A FIGURA 25 mostra a reatividade cruzada in vitro de anticorpos séricos. (A) Títulos de anticorpo contra vírus inteiros inativados. (B) Títulos de inibição da hemaglutinação contra vários vírus inteiros inativados. Os valores são o GMT (log2) de títulos finais recíprocos de cinco ratos por grupo. As barras representam o desvio da média. Todos os grupos são estatisticamente diferentes em relação ao controlo negativo. * p< 0,05, ** p< 0,001 em comparação com a HA solúvel recombinante correspondente. A FIGURA 2 6 mostra a eficácia da VLP de H5 produzida em planta. (A) Taxa de sobrevivência de ratos após desafio com 10 LD50 (4,09x105 CCID5o) da estirpe da gripe A/Turquia/582/06 (H5N1) (B) Peso corporal de ratos imunizados após desafio. Os valores são o peso corporal médio de ratos sobreviventes A FIGURA 27 mostra a Origem de VLPs da gripe derivados de planta. (A) Composição de lípidos polares de VLPs da gripe purificadas. Os lípidos contidos num equivalente de 40 pg de proteínas foram extraídos a partir da VLP como descrito, separados por HP-TLC e comparados com o perfil de migração de lípidos isolados da membrana do plasma (PM) de tabaco altamente purificados. As abreviaturas dos lípidos são as seguintes: DGDG, Digalactosildiacilglicerol; gluCER, glucosil-ceramida; PA, ácido fosfático; PC, fosfatidilcolina; PE, fosfatidiletanolamina; PG, fosfatidilglicerol; PI, fosfatidilinositol; PS, fosfatidilserina; SG, Esteril-glicósido. (B) Composição de lípidos neutros de VLPs da gripe purificadas. Os lípidos contidos num equivalente de 20 pg de proteínas foram 26 extraídos a partir da VLP como descrito, separados por HP-TLC e comparados com a migração de sitosterol. (C) Imunodeteção da bomba de protões marcadora da membrana do plasma ATPase (PMA) em VLPs purificadas e PM de folhas de tabaco (PML) altamente purificadas e células de tabaco BY2 (PMby2) · Foram carregados dezoito microgramas de proteína em cada faixa. A FIGURA 28 mostra a sequência que vai desde o sítio DralII ao sítio Saci do clone 774 - sequência de nucleótidos de A/Brisbânia/59/2007 (H1N1) (SEQ ID NO: 36). A sequência de codificação é flanqueada por uma região reguladora de plastocianina que começa com um sítio de restrição DralII na extremidade 5' e por um codão de paragem e um sítio Saci na extremidade 3'. Os sítios de restrição estão sublinhados; ATG está a negrito e sublinhado. A FIGURA 29 mostra a sequência que vai desde o sítio DralII ao sítio Saci do clone 775 - sequência de nucleótidos de A/Ilhas Salomão 3/2006 (H1N1) (SEQ ID NO: 37) . A sequência de codificação é flanqueada por uma região reguladora de plastocianina que começa com um sítio de restrição DralII na extremidade 5' e por um codão de paragem e um sítio Saci na extremidade 3'. Os sítios de restrição estão sublinhados; ATG está a negrito e sublinhado. A FIGURA 30 mostra a sequência que vai desde o sítio DralII ao sítio Saci do clone 776 - sequência de nucleótidos de A/Brisbânia 10/2007 (H1N1) (SEQ ID NO: 38) . A sequência de codificação é flanqueada por uma região reguladora de plastocianina que começa com um sítio de restrição DralII na extremidade 5' e por um codão de paragem e um sítio Saci na extremidade 3'. Os sítios de restrição estão sublinhados; ATG está a negrito e sublinhado. 27 A FIGURA 31 mostra a sequência que vai desde o sitio DralII ao sitio Saci do clone 777 - sequência de nucleótidos de A/Wisconsin/67/2 0 05 (H3N2) (SEQ ID NO: 39) . A sequência de codificação é flanqueada por uma região reguladora de plastocianina que começa com um sitio de restrição DralII na extremidade 5' e por um codão de paragem e um sitio Saci na extremidade 3'. Os sitios de restrição estão sublinhados; ATG está a negrito e sublinhado. A FIGURA 32 mostra a sequência que vai desde o sítio DralII ao sítio Saci do clone 778 - sequência de nucleótidos de B/Malásia/2506/2004 (SEQ ID NO: 40) . A sequência de codificação é flanqueada por uma região reguladora de plastocianina que começa com um sítio de restrição DralII na extremidade 5' e por um codão de paragem e um sítio Saci na extremidade 3'. Os sítios de restrição estão sublinhados; ATG está a negrito e sublinhado. A FIGURA 33 mostra a sequência que vai desde o sítio DralII ao sítio Saci do clone 779 - sequência de nucleótidos de B/Flórida/4/2006 (SEQ ID NO: 41). A sequência de codificação é flanqueada por uma região reguladora de plastocianina que começa com um sítio de restrição DralII na extremidade 5' e por um codão de paragem e um sítio Saci na extremidade 3'. Os sítios de restrição estão sublinhados; ATG está a negrito e sublinhado. A FIGURA 34 mostra a sequência que vai desde o sítio DralII ao sítio Saci do clone 780 - sequência de nucleótidos de A/Singapura/1/57 (H2N2) (SEQ ID NO: 42) . A sequência de codificação é flanqueada por uma região reguladora de plastocianina que começa com um sítio de restrição DralII na extremidade 5' e por um codão de paragem e um sítio Saci na extremidade 3'. Os sítios de restrição estão sublinhados; ATG está a negrito e sublinhado. 28 A FIGURA 35 mostra a sequência que vai desde o sitio DralII ao sitio Saci do clone 781 - sequência de nucleótidos de A/Anhui/1/2005 (H5N1) (SEQ ID NO: 43) . A sequência de codificação é flanqueada por uma região reguladora de plastocianina que começa com um sitio de restrição DralII na extremidade 5' e por um codão de paragem e um sitio Saci na extremidade 3'. Os sitios de restrição estão sublinhados; ATG está a negrito e sublinhado. A FIGURA 36 mostra a sequência que vai desde o sitio DralII ao sitio Saci do clone 782 - sequência de nucleótidos de A/Vietname/1194/2004 (H5N1) (SEQ ID NO: 44). A sequência de codificação é flanqueada por uma região reguladora de plastocianina que começa com um sitio de restrição DralII na extremidade 5' e por um codão de paragem e um sitio Saci na extremidade 3'. Os sitios de restrição estão sublinhados; ATG está a negrito e sublinhado. A FIGURA 37 mostra a sequência que vai desde o sitio DralII ao sitio Saci do clone 783 - sequência de nucleótidos de A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) (SEQ ID NO: 45). A sequência de codificação é flanqueada por uma região reguladora de plastocianina que começa com um sitio de restrição DralII na extremidade 5' e por um codão de paragem e um sitio Saci na extremidade 3'. Os sitios de restrição estão sublinhados; ATG está a negrito e sublinhado. A FIGURA 38 mostra a sequência que vai desde o sitio DralII ao sitio Saci do clone 784 - sequência de nucleótidos de A/Equina/Praga/56 (H7N7) (SEQ ID NO: 46). A sequência de codificação é flanqueada por uma região reguladora de plastocianina que começa com um sitio de restrição DralII na extremidade 5' e por um codão de paragem e um sitio Saci 29 na extremidade 3'. Os sítios de restrição estão sublinhados; ATG está a negrito e sublinhado. A FIGURA 39 mostra a sequência que vai desde o sítio DralII ao sítio Saci do clone 785 - sequência de nucleótidos de A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (SEQ ID NO: 47) . A sequência de codificação é flanqueada por uma região reguladora de plastocianina que começa com um sítio de restrição DralII na extremidade 5' e por um codão de paragem e um sítio Saci na extremidade 3'. Os sítios de restrição estão sublinhados; ATG está a negrito e sublinhado. A FIGURA 40A mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 48) do polipéptido traduzido a partir do clone 774 (A/Brisbânia/59/2007 (H1N1)). A grelha de leitura aberta do clone 774 começa com o ATG indicado na Figura 28. A Figura 40B mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 49) do polipéptido traduzido a partir do clone 775 (A/Ilhas Salomão 3/2006 (H1N1)). A grelha de leitura aberta do clone 775 começa com o ATG indicado na Figura 29. A FIGURA 41A mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 50) do polipéptido traduzido a partir do clone 776 (A/Brisbânia/10/2007 (H3N2)). A grelha de leitura aberta do clone 776 começa com o ATG indicado na Figura 30. A Figura 41B mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 51) do polipéptido traduzido a partir do clone 777 (A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)). A grelha de leitura aberta do clone 777 começa com o ATG indicado na Figura 31. A FIGURA 42A mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 52) do polipéptido traduzido a partir do clone 778 (B/Malásia/2506/2004) . A grelha de leitura aberta do clone 778 começa com o ATG indicado na Figura 32. A Figura 42B mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 53) do 30 polipéptido traduzido a partir do clone 779 (B/Flórida/4/2006). A grelha de leitura aberta do clone 779 começa com o ATG indicado na Figura 33. A FIGURA 43A mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 54) do polipéptido traduzido a partir do clone 780 (A/Singapura/1/57 (H2N2)). A grelha de leitura aberta do clone 780 começa com o ATG indicado na Figura 34. A Figura 43B mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 55) do polipéptido traduzido a partir do clone 781 (A/Anhui/1/2005 (H5N1)). A grelha de leitura aberta do clone 781 começa com o ATG indicado na Figura 35. A FIGURA 44A mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 56) do polipéptido traduzido a partir do clone 782 (A/Vietname/1194/2004 (H5N1)). A grelha de leitura aberta do clone 782 começa com o ATG indicado na Figura 36. A Figura 44B mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 57) do polipéptido traduzido a partir do clone 783 (A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N 1)). A grelha de leitura aberta do clone 783 começa com o ATG indicado na Figura 37. A FIGURA 45A mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 58) do polipéptido traduzido a partir do clone 784 (A/Equina/Praga/56 (H7N7)). A grelha de leitura aberta do clone 784 começa com o ATG indicado na Figura 38. A Figura 45B mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 59) do polipéptido traduzido a partir do clone 785 (A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)). A grelha de leitura aberta do clone 785 começa com o ATG indicado na Figura 39. A FIGURA 46 mostra a imunodeteção (transferência de western) de frações de eluição de VLPs produzidas em plantas, após cromatografia de exclusão molecular. São mostrados os subtipos Hl, H2, H5, H6 e H9 de hemaglutinina. 31 A hemaglutinina é detetada nas frações 7-14, correspondentes à eluição de VLPs. A FIGURA 47 mostra uma análise de imunotransferência da expressão de uma série de hemaglutinina Hl de estirpes epidémicas anuais. Nas faixas 1 e 2 foram carregados dez e vinte microgramas de extratos proteicos, respetivamente. A FIGURA 48 mostra uma análise de imunotransferência de expressão de uma série de hemaglutinina H5 de estirpes pandémicas potenciais. Nas faixas 1 e 2 foram carregados dez e vinte microgramas de extratos proteicos, respetivamente. A FIGURA 49 mostra uma imunotransferência de H5 da estirpe A/Indonésia/5/2005 em extratos proteicos de folhas de Nicotiana tabacum, agroinfiltrado com AGL1/660. Foram infiltradas duas plantas e foram carregados 10 e 20 yg de proteina solúvel de cada planta nas faixas 1 e 2, respetivamente. A FIGURA 50 mostra a reatividade cruzada in vitro de anticorpos séricos. Títulos de inibição da hemaglutinação (Hl) em soros de furão, 14 dias (A) após a Ia imunização e (B) após 2o reforço com VLP de H5 da gripe produzida numa planta. As respostas de anticorpo HAI foram medidas utilizando os seguintes vírus H5N1 inteiros inativados: A/peru/Turquia/1/05, A/Vietname/1194/04, A/Anhui/5/05 e a estirpe homóloga A/Indonésia/5/05. Os valores são o GMT (log2) de títulos finais recíprocos de cinco furões por grupo. Lista diagonal - A/Indonésia/6/06 (ciado 2.1.3); axadrezado - A/peru/Turquia/1/05 (ciado 2.2); barra branca - A/Vietname/1194/04 (ciado 1); barra preta A/Anhui/5/05. Os respondedores são indicados. As barras representam desvio da média. 32 A FIGURA 51 mostra a sequência de ácido nucleico de uma cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da H5 de A/Indonésia/5/2005 (Construção # 660), UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação. A FIGURA 52 mostra a sequência de ácido nucleico de uma cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da Hl de A/Nova Caledónia/20/1999 (Construção # 540), UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação. A FIGURA 53 mostra a sequência de ácido nucleico de uma cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da Hl de A/Brisbânia/59/2007 (construção #774), UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação. A FIGURA 54 mostra a sequência de ácido nucleico de uma cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da Hl de A/Ilhas Salomão/3/2006 (H1N1) (construção #775), UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação. A FIGURA 55 mostra a sequência de ácido nucleico de uma cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da H2 de A/Singapura/1/57 (H2N2) (construção # 780), UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação. 33 A FIGURA 56 mostra a sequência de ácido nucleico de uma cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da H5 de A/Anhui/1/2005 (H5N1) (Construção# 781), UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação. A FIGURA 57 mostra a sequência de ácido nucleico de uma cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da H5 de A/Vietname/1194/2004 (H5N1) (Construção # 782), UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação. A FIGURA 58 mostra a sequência de ácido nucleico de uma cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da H6 de A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) (Construção # 783), UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação. A FIGURA 59 mostra a sequência de ácido nucleico de uma cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da H9 de A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (Construção # 785), UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação. A FIGURA 60 mostra a sequência de ácido nucleico de uma cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da H3 de A/Brisbânia/10/2007 (H3N2), UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação. 34 A FIGURA 61 mostra a sequência de ácido nucleico de uma cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da H3 de A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação. A FIGURA 62 mostra a sequência de ácido nucleico de uma cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da H7 de A/Equina/Praga/56 (H7N7), UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação. A FIGURA 63 mostra a sequência de ácido nucleico de uma cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da HA de B/Malásia/2506/2004, UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação. A FIGURA 64 mostra a sequência de ácido nucleico de uma cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da HA de B/Flórida/4/2006, UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação. A FIGURA 65 mostra uma sequência de aminoácidos consenso (SEQ ID NO: 74) para a HA de A/Nova Caledónia/20/99 (H1N1) (codificada pela SEQ ID NO: 33), A/Brisbânia/59/2007 (H1N1) (SEQ ID NO: 48), A/Ilhas Salomão/3/2006 (H1N1) (SEQ ID NO: 49) e SEQ ID NO: 9. XI (posição 3) é A ou V; X2 (posição 52) é D ou N; X3 (posição 90) é K ou R; X4 (posição 99) é K ou T; X5 (posição 111) é Y ou Η; X6 (posição 145) é V ou T; X7 (posição 154) é E ou K; X8 (posição 161) é R ou K; X9 (posição 181) é V ou A; X10 (posição 203) é D ou N; Xll (posição 205) é R ou K; X12 (posição 210) é T ou K; X13 (posição 225) é R ou K; X14 (posição 268) é W ou R; X15 35 (posição 283) é T ou N; X16 (posição 290) é E ou K; X17 (posição 432) é I ou L; X18 (posição 489) é N ou D. A FIGURA 66 mostra a sequência de aminoácidos da Hl de Nova Caledónia (AAP34324.1) codificada pela SEQ ID NO: 33. A FIGURA 67 mostra a sequência de aminoácidos da Hl de Porto Rico (NC_0409878.1) codificada pela SEQ ID NO: 35.
DESCRIÇÃO DETALHADA A presente invenção refere-se à produção de particulas semelhantes a virus. Mais especificamente, a presente invenção é dirigida à produção de particulas semelhantes a virus compreendendo antigénios de gripe. A descrição seguinte é de uma forma de realização preferida. A presente invenção envolve um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica uma hemaglutinina (HA) da gripe, operacionalmente ligada a uma região reguladora ativa numa planta.
Além disso, a presente invenção proporciona um método de produção de particulas semelhantes a virus (VLPs) numa planta. O método envolve a introdução de um ácido nucleico que codifica uma hemaglutinina (HA) da gripe operacionalmente ligada a uma região reguladora ativa na planta, na planta ou porção da planta, e incubação da planta ou uma porção da planta sob condições que permitem a expressão do ácido nucleico, produzindo deste modo as VLPs.
As VLPs de acordo com a invenção são produzidos a partir de virus da gripe, contudo, perspetiva-se que as VLPs também 36 podem ser produzidas a partir de outros virus derivados da membrana do plasma incluindo mas não estando limitados a Sarampo, Ebola, Marburgo e HIV. A invenção inclui VLPs compreendendo hemaglutinina (HA) da gripe de todos os tipos de virus da gripe que possam infetar humanos, incluindo por exemplo, mas não estando limitados aos subtipos A (H1N1) muito prevalecentes (por exemplo A/Nova Caledónia/20/99 (H1N1)), o subtipo A/Indonésia/5/05 (H5N1) (SEQ ID NO: 60) e o tipo B menos comum (por exemplo, SEQ ID NO:26, Figura 100), e tipo C (SEQ ID NO:27, Figura 10P), e a HAs obtidas de outros subtipos de gripe. As VLPs de outros subtipos de gripe estão também incluídos na presente invenção, por exemplo, A/Brisbânia/59/2007 (H1N1; SEQ ID NO:48), A/Ilhas
Salomão/3/2006 (H1N1; SEQ ID NO:49), A/Singapura/1/57 (H2N2; SEQ ID NO:54), A/Anhui/1/2005 (H5N1; SEQ ID NO:55), A/Vietname/1194/2004 (H5N1; SEQ ID NO:56), A/Cerceta/Hong
Kong/W312/97 (H6N1; SEQ ID NO:57), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2; SEQ ID NO:59), A/Brisbânia/10/2007 (H3N2; SEQ ID NO:50) , A/Wisconsin/67/2 0 05 (H3N2; SEQ ID NO:51), A/Equina/Praga/56 (H7N7; SEQ ID NO:58), B/Malásia/2506/2004 (SEQ ID NO:52) ou B/Flórida/4/2006 (SEQ ID NO:53). A presente invenção também refere-se a vírus da gripe que infetam outros mamíferos ou animais hospedeiros, por exemplo humanos, primatas, cavalos, porcos, aves, aves aquáticas, aves migratórias, codorniz, pato, gansos, aves domésticas, galinha, camelo, canino, cães, felino, gatos, tigre, leopardo, civeta, marta, fuinha, furões, animais de estimação, gado, ratos, ratazanas, foca, baleia e semelhantes. A invenção também inclui, mas não se limita a, VLPs derivadas da gripe que obtêm um envelope lipídico a partir 37 da membrana do plasma da célula na qual as proteínas VLP são expressadas. Por exemplo, quando a VLP é expressada num sistema baseado em plantas, a VLP pode obter um envelope lipídico a partir da membrana do plasma da célula.
Em geral, o termo "lípido" refere-se a moléculas naturais solúveis em gordura (lipófilas). 0 termo é também utilizado mais especificamente para referir ácidos gordos e seus derivados (incluindo tri-, di- e monoglicéridos, e fosfolípidos), bem como outros metabolitos contendo esterol solúveis em gordura ou esteróis. Os fosfolípidos são um componente principal de todas as membranas biológicas, juntamente com glicolípidos, esteróis e proteínas. Os exemplos de fosfolípidos incluem fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina e semelhantes. Os exemplos de esteróis incluem zoosteróis (por exemplo, colesterol) e fitosteróis. Foram identificados mais de 200 fitosteróis em várias espécies vegetais, sendo os mais comuns os campesterol, estigmasterol, ergosterol, brassicasterol, delta-7-estigmasterol, delta-7-avenasterol, daunosterol, sitosterol, 24-metilcolesterol, colesterol ou beta-sitosterol. Como um especialista na técnica compreenderia, a composição lipídica da membrana do plasma de uma célula pode variar com as condições de cultura ou crescimento da célula ou organismo a partir do qual é obtido a célula.
As membranas celulares compreendem geralmente bicamadas lipídicas, bem como proteínas para várias funções. Podem ser encontradas concentrações localizadas de lípidos particulares na bicamada lipídica, referidas como 'jangadas lipídicas'. Sem pretender ficar limitado pela teoria, as jangadas lipídicas podem ter papéis significativos na endo e exocitose, entrada ou saída de vírus ou outros agentes infecciosos, transdução de sinal inter-celular, interação 38 com outros componentes estruturais da célula ou organismo, tais como as matrizes intracelulares e extracelulares.
Relativamente ao virus da gripe, o termo "hemaglutinina" ou "HA" como aqui utilizado refere-se a uma glicoproteina presente do lado de fora de partículas virais da gripe. A HA é uma glicoproteina de tipo I homotrimérica da membrana, compreendendo geralmente um péptido sinal, um dominio HA1, e um dominio HA2 compreendendo um sitio de ancoragem que atravessa a membrana na extremidade C-terminal e uma pequena cauda citoplasmática (Figura 1B) . As sequências de nucleótidos que codificam a HA são bem conhecidas e estão disponíveis - ver, por exemplo, a base BioDefence Public Health (Virus da Gripe; ver URL: biohealthbase.org) ou National Center for Biotechnology Information (ver URL: ncbi.nlm.nih.gov).
0 termo "homotrímero" ou "homotrimérico" indica que um oligómero é formado por três moléculas de proteína HA. Sem pretender ficar limitado pela teoria, a proteína HA é sintetizada como uma proteína precursora monomérica (HAO) de cerca de 75 kDa, a qual se reúne à superfície numa proteína trimérica alongada. Antes de ocorrer a trimerização, a proteína precursora é dissociada num sítio de dissociação de ativação conservado (também referido como péptido de fusão) em 2 cadeias polipeptídicas, HAl e HA2 (compreendendo a região transmembranar) , ligadas por uma ligação dissulfureto. 0 segmento HAl pode ter 328 aminoácidos de comprimento e o segmento HA2 pode ter 221 aminoácidos de comprimento. Apesar de esta dissociação poder ser importante para a infetividade do vírus, ela pode não ser essencial para a trimerização da proteina. A inserção de HA na membrana do retículo endoplasmático (ER) da célula hospedeira, a dissociação do péptido sinal e a glicosilação da proteína são eventos co-tradução. A 39 redobragem correta da HA requer a glicosilação da proteína e a formação de 6 ligações dissulfureto intra-cadeia. 0 trímero HA reúne-se dentro do complexo cis- e trans-Golgi, desempenhando o domínio transmembranar um papel no processo de trimerização. As estruturas cristalinas de proteínas HA tratadas com bromelina, as quais carecem do domínio transmembranar, apresentaram uma estrutura altamente conservada entre as estirpes de gripe. Foi também estabelecido que a HA sofre alterações conformacionais importantes durante o processo de infeção, o qual requer que o precursor HAO seja dissociado nas 2 cadeias polipeptídicas HA1 e HA2. A proteína HA pode ser processada (isto é, compreende os domínios HA1 e HA2) ou pode ser não processada (isto é, compreende o domínio HAO). A presente invenção refere-se à utilização de uma proteína HA compreendendo o domínio transmembranar e inclui os domínios HA1 e HA2, por exemplo a proteína HA pode ser HAO, ou HA processada compreendendo HA1 e HA2. A proteína HA pode ser utilizada na produção ou formação de VLPs utilizando um sistema de expressão numa planta ou célula vegetal. A HA expressada de acordo com a presente invenção pode ser obtida de qualquer subtipo. Por exemplo, a HA pode ser de subtipo Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15 ou H16. A HA recombinante também pode compreender uma sequência de aminoácidos com base na sequência de qualquer hemaglutinina conhecida na técnica -ver, por exemplo, a base BioDefence Public Health (Vírus da Gripe; ver URL: biohealthbase.org) ou National Center for Biotechnology Information (ver URL: ncbi.nlm.nih.gov). Além disso, a HA pode basear-se na sequência de uma hemaglutinina que é isolada a partir de um ou mais vírus da gripe emergentes ou identificados de novo. 40 A presente invenção inclui também VLPs que compreendem HAs obtidas de um ou mais do que um subtipo de gripe. Por exemplo, as VLPs podem compreender um ou mais do que uma HA do subtipo Hl (codificado pela SEQ ID NO:28), H2 (codificado pela SEQ ID NO:12), H3 (codificado pela SEQ ID NO: 13) , H4 (codificado pela SEQ ID NO: 14), H5 (codificado pela SEQ ID NO:15), H6 (codificado pela SEQ ID NO: 16), H7 (codificado pela SEQ ID ΝΟ:11), H8 (codificado pela SEQ ID NO: 17), H9 (codificado pela SEQ ID NO:18), H10 (codificado pela SEQ ID NO:19), Hll (codificado pela SEQ ID NO:20), H12 (codificado pela SEQ ID NO:21), H13 (codificado pela SEQ ID NO:27), H14 (codificado pela SEQ ID NO:23), H15 (codificado pela SEQ ID NO:24), H16 (codificado pela SEQ ID NO:25) ou uma associação dos mesmos. Uma ou mais do que uma HA do um ou mais do que um subtipos de gripe podem ser co-expressadas numa planta ou célula de inseto para garantir que a sintese da uma ou mais do que uma HA resulta na formação de VLPs compreendendo uma associação de HAs obtidas a partir de um ou mais do que um subtipo de gripe. A seleção da associação de HAs pode ser determinada pela utilização pretendida da vacina preparada a partir da VLP. Por exemplo, uma vacina a ser utilizada na inoculação de aves pode compreender qualquer associação de subtipos HA, enquanto as VLPs úteis para a inoculação de humanos pode compreender subtipos de um ou mais do que um dos subtipos Hl, H2, H3, H5, H7, H9, H10, Nl, N2, N3 e N7. No entanto podem ser preparadas outras associações de subtipos de HA dependendo da utilização do inoculo.
Por conseguinte, a presente invenção é dirigida a uma VLP produzida de acordo com a invenção compreendendo um ou mais do que um subtipo de HA. 41
Assim, a presente invenção envolve ácidos nucleicos que codificam hemaglutininas que formam VLPs quando expressadas em plantas.
As proteínas HA da gripe exibem uma gama de semelhanças e diferenças em relação ao peso molecular, ponto isoelétrico, tamanho, complemento de glicano e semelhantes. As propriedades físico-químicas das várias hemaglutininas podem ser úteis para permitir diferenciar entre as HAs expressadas numa planta, célula de inseto ou sistema de levedura, e pode ser de utilidade particular quando mais do que uma HA é co-expressada num único sistema. Exemplos de tais propriedades físico-químicas são proporcionados no Quadro 1. 42
Quadro 1: Propriedades físico-químicas de hemaglutininas da gripe
Clone N° Tipo Estirpes de gripe HAO AA HA1 HA2 Glic HAO Hi anos U HA2 HAO Massa HAO1 Mole HA1 :ular HAl1 (kDA) HA2 HA21 Por isoelí HAO Hi ito ;trico \l HA2 m Hl A/Brisbânia/59/2007 548 iiii 222 9 $...... 2 61 75 1111! llllll 25 28 0,4 ........ .........5,3 775 Hl A/Ilhas Salomão/3/2006 548 iiii 222 y .....1...... 2 61 75 111 llllll 25 28 6,1 l| 11 5,3 m H3 A/Brisbânia/10/2007 550 llilll 221 ............... .....1........ 1 62 80 §1! lllllll 25 27 8,5 1 II 5,2 111 H3 A/Wisconsin/67/2005 550 III 221 11 $1 $.....! 1 62 79 li llllll 25 27 8,8 .....1» 1: 5,3 m B B/Malásia/2506/2004 570 111! 223 12 II 4 62 80 III lllllll 24 30 8,0 || 11 4,5 115 B B/Flórida/4/2006 569 ji 223 1U ............. 3 62 77 li lllllll 24 29 8,o...... 11 4,5 780 H2 A/Singapura/1/57 547 III 222 b ........ 2 62 71 II! llllll 25 28 o,o i 11 4,9 781 H5 A/Anhui/1/2005 551 li!! 222 1 ....... 2 62 73 li 1111 25 28 0,2 ...... ............ 782 H5 A/Vietname/1194/2004 552 III 222 1 ....... 2 63 74 III lllllll 25 28 0,4 ....... ...........4,8 783 H6 A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 550 iiii 222 8 ....... 3 62 75 111 111 25 30 5,0 ...... li 5,6 784 H7 A/Equina/Praga/56 552 1! 221 6 ....... 2 62 71 jj§ ííllíílll 25 28 8,9 !| 11 4,9 785 H9 A/Hong Kong/1073/99 542 llllll 199 9 $...... 2 61 75 llllll lllillllllll 23 26 8,4 ...... 1 5,3 43 A presente invenção também envolve as sequências de nucleótidos SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:3; SEQ ID N0:11, que codificam a HA de Hl, H5 ou H7, respetivamente, uma sequência de nucleótidos que hibridiza sob condições de hibridização estringentes com a SEQ ID NO:28; SEQ ID N0:3; SEQ ID NO:11, ou uma sequência de nucleótidos que hibridiza sob condições de hibridização estringentes com um complemento de SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 3; SEQ ID N0:1, em que a sequência de nucleótidos codifica uma proteína hemaglutinina que quando expressada forma uma VLP e em que a VLP induz a produção de um anticorpo quando administrada a um indivíduo. Por exemplo, a expressão da sequência de nucleótidos dentro de uma célula vegetal forma uma VLP e a VLP pode ser utilizada para produzir um anticorpo que é capaz de ligar a HA, incluindo a HA madura, HAO, HA1 ou HA2 de um ou mais tipos ou subtipos de gripe. A VLP, quando administrada a um indivíduo, induz uma resposta imunológica. A hibridização sob condições de hibridização estringentes é conhecida na técnica (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. 1995 e suplementos; Maniatis et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Sambrook e Russell, in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition 2001. Um exemplo de tais condições de hibridização estringentes pode ser cerca de hibridização durante 16-20 horas em 4 X SSC a 65°C, seguida de lavagem em 0,1 X SSC a 65°C durante uma hora ou 2 lavagens em 0,1 X SSC a 65°C durante 20 ou 30 minutos cada. Alternativamente, uma condição de hibridização estringente ilustrativa poderia ser de um dia para o outro (16 -20 horas) em formamida a 50%, 4 X SSC a 42° C, seguida de lavagem em 0 ,1 X SSC a 65°C durante uma hora ou 2 lavagens em 0,1 X SSC a 65°C durante 20 ou 30 minutos cada, ou de um dia para 0 44 outro (16-20 horas), ou hibridização em tampão de fosfato aquoso de Church (7% de SDS; tampão de NaP04 0,5M, pH 7,2; EDTA 10 mM) a 65°C, com 2 lavagens a 50°C em 0,1 X SSC, 0,1% de SDS durante 20 ou 30 minutos cada, ou 2 lavagens a 65°C em 2 X SSC, 0,1% de SDS durante 20 ou 30 minutos cada.
Além disso, a presente invenção pode envolver sequências de nucleótidos que são caracterizadas por ter cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre aqueles, de identidade de sequência, ou semelhança de sequência, com a sequência de nucleótidos que codifica a HA de Hl (SEQ ID NO:28), H5 (SEQ ID NO:3) ou H7 (SEQ ID NO:ll), em que a sequência de nucleótidos codifica uma proteína hemaglutinina que quando expressada em plantas forma uma VLP e em que a VLP induz a produção de um anticorpo. Por exemplo, a expressão da sequência de nucleótidos dentro de uma célula vegetal forma uma VLP, e a VLP pode ser utilizada para produzir um anticorpo que é capaz de ligar a HA, incluindo HA madura, HA0, HA1 ou HA2. A VLP, quando administrada a um indivíduo, induz uma resposta imunológica.
Analogamente, a presente invenção envolve HAs associadas aos seguintes subtipos Hl (codificado pela SEQ ID NO:28), H2 (codificado pela SEQ ID NO:12), H3 (codificado pela SEQ ID NO: 13), H4 (codificado pela SEQ ID NO: 14), H5 (codificado pela SEQ ID NO:15), H6 (codificado pela SEQ ID NO:16), H7 (codificado pela SEQ ID NO:11), H8 (codificado pela SEQ ID NO:17), H9 (codificado pela SEQ ID NO:18), H10 (codificado pela SEQ ID NO:19), Hll (codificado pela SEQ ID NO:20), H12 (codificado pela SEQ ID NO:21), H13 (codificado pela SEQ ID NO:27), H14 (codificado pela SEQ ID NO:23), H15 (codificado pela SEQ ID NO:24), H16 (codificado pela SEQ ID NO:25); ver Figuras 10A a 10P), e as sequências de nucleótidos que são caracterizadas por ter desde cerca de 45
70 a 100% ou qualquer quantidade entre aquelas, 80 a 100% ou qualquer quantidade entre aquelas, 90-100% ou qualquer quantidade entre aquelas, ou 95-100% ou qualquer quantidade entre aquelas, de identidade de sequência com Hl (SEQ ID NO: 2 8) , H2 (SEQ ID NO:12), H3 (SEQ ID NO:13), H4 (SEQ ID
NO: 14) , H5 (SEQ ID NO:15), H6 (SEQ ID NO:16), H7 (SEQ ID
NO:11), H8 (SEQ ID NO:17), H9 (SEQ ID NO:18), H10 (SEQ ID
NO:19), Hl1 (SEQ ID NO:20), H12 (SEQ ID NO:21), H13 (SEQ ID
NO:27), H14 (SEQ ID NO:23), H15 (SEQ ID NO:24), H16 (SEQ ID NO:25), em que a sequência de nucleótidos codifica uma proteina hemaglutinina que quando expressada forma uma VLP e em que a VLP induz a produção de um anticorpo. Por exemplo, a expressão da sequência de nucleótidos dentro de uma célula vegetal forma uma VLP e a VLP pode ser utilizada para produzir um anticorpo que é capaz de ligar a HA, incluindo HA madura, HA0, HAl ou HA2. A VLP, quando administrada a um indivíduo, induz uma resposta imunológica.
Uma "resposta imunológica" refere-se geralmente a uma resposta do sistema imunitário adaptativo. O sistema imunitário adaptativo compreende geralmente uma resposta humoral e uma resposta mediada por células. A resposta humoral é o aspeto da imunidade que é mediado por anticorpos segregados, produzidos nas células da linhagem dos linfócitos B (células B) . Os anticorpos segregados ligam-se aos antigénios nas superfícies de micróbios invasores (tais como virus ou bactérias), que os marcam para destruição. A imunidade humoral é geralmente utilizada para se referir a produção de anticorpos e os processos que a acompanham, bem como as funções efetoras de anticorpos, incluindo a ativação de células Th2 e produção de citocinas, geração de células de memória, promoção de opsonina da fagocitose, eliminação de agentes patogénicos e semelhantes. Os termos "modulam" ou "modulação" ou 46 semelhantes referem-se a um aumento ou diminuição de uma resposta ou parâmetro particular, como determinado por qualquer um de vários ensaios geralmente conhecidos ou utilizados, alguns dos quais são aqui exemplificados.
Uma resposta mediada por células é uma resposta imunológica que não envolve anticorpos mas, em vez disso, envolve a ativação de macrófagos, células assassinas naturais (NK) , linfócitos T citotóxicos específicos para antigénios e a libertação de várias citocinas em resposta a um antigénio. A imunidade mediada por células é geralmente utilizada para se referir a alguma ativação de células Th, ativação de células Tc e respostas mediadas por células T. A imunidade mediada por células é de particular importância na resposta a infeções virais.
Por exemplo, a indução de linfócitos T positivos para CD8 específicos para antigénios pode ser medida utilizando um ensaio ELISPOT; a estimulação de Linfócitos T positivos para CD4 pode ser medida utilizando um ensaio de proliferação. Os títulos de anticorpos anti-gripe podem ser quantificados utilizando um ensaio ELISA; os isotipos de anticorpos específicos para antigénios ou de reatividade cruzada também podem ser medidos utilizando anticorpos anti-isotipo (por exemplo anti-IgG, IgA, IgE ou IgM). Os métodos e técnicas para realizar tais ensaios são bem conhecidos na técnica.
Pode ser também utilizado um ensaio de inibição de hemaglutinação (Hl, ou HAI) para demonstrar a eficácia dos anticorpos induzidos por uma vacina, ou a composição de vacina pode inibir a aglutinação de glóbulos vermelhos (RBC) pela HA recombinante. Os títulos de anticorpos inibidores de hemaglutinação de amostras de soro podem ser avaliados por HAI microtítulo (Aymard et al 1973) . Podem 47 ser utilizados eritrócitos de qualquer uma de várias espécies - por exemplo cavalo, peru, galinha ou semelhantes. Este ensaio fornece informação indireta sobre a associação do trimero de HA na superfície da VLP, confirmando a apresentação apropriada de sítios antigénicos nas HAs.
Podem ser também utilizados títulos HAI de reatividade cruzada para demonstrar a eficácia de uma resposta imunológica a outras estirpes de vírus relacionadas com o subtipo da vacina. Por exemplo, o soro de um indivíduo imunizado com uma composição de vacina de uma primeira estirpe (por exemplo VLPs de A/Indonésia 5/05) pode ser utilizado num ensaio HAI com uma segunda estirpe de vírus inteiro ou partículas de vírus (por exemplo A/Vietname/1194/2004) e determinado o título de HAI.
Pode ser também quantificada a presença ou níveis de citocinas. Por exemplo, uma resposta de células auxiliares T (Thl/Th2) caracterizar-se-á pela medição de células secretoras de IFN-γ e IL-4 utilizando ELISA (por exemplo kits OptEIA de BD Biosciences). As células mononucleares de sangue periférico (PBMC) ou esplenócitos obtidos de um indivíduo podem ser cultivados e o sobrenadante analisado. Os linfócitos T também podem ser quantificados por triagem celular ativada por fluorescência (FACS) , utilizando etiquetas fluorescentes específicas marcadoras e métodos como são conhecidos na técnica.
Pode ser também realizado um ensaio de microneutralização para caracterizar uma resposta imunológica num indivíduo, ver, por exemplo, os métodos de Rowe et al., 1973. Os títulos de neutralização de vírus podem ser obtidos de várias formas, incluindo: 1) enumeração de placas de lise (ensaio em placa) após fixação/coloração de células com 48 violeta de cristal; 2) observação microscópica da lise de células em cultura; 3) ELISA e deteção espetrofotométrica de proteina de virus NP (correlacionam com a infeção de células hospedeiras pelo virus). A identidade de sequência ou semelhança de sequência pode ser determinada utilizando um programa de comparação de sequências de nucleótidos, tal como aquele proporcionado em DNASIS (por exemplo, utilizando, mas não se limitando aos seguintes parâmetros: Penalidade de lacuna 5, # de diagonais máximas 5, Penalidade de lacuna fixa 10, k-tuple 2, lacuna móvel 10 e tamanho de janela 5) . No entanto, outros métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica, por exemplo os algoritmos de Smith & Waterman (1981, Adv. Appl. Math. 2:482), Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), Pearson & Lipman (1988, Proc. Nat'1. Acad. Sei. USA 85:2444) e por implementações computorizadas destes algoritmos (por exemplo LACUNA, BESTFIT, FASTA e BLAST), ou por alinhamento manual e inspeção visual. O termo "domínio de hemaglutinina" refere-se a um péptido compreendendo o domínio HAO, ou os domínios HA1 e HA2. O domínio de hemaglutinina não inclui o péptido sinal, domínio transmembranar ou a cauda citoplasmática presente na proteína natural. O termo "partícula semelhante a vírus" (VLP), ou "partículas semelhantes a vírus" ou "VLPs" refere-se a estruturas que se auto-reunem e compreendem proteínas estruturais tal como a proteína HA da gripe. As VLPs são geralmente semelhantes em termos morfológicos e antigénicos a viriões produzidos numa infeção, mas carecem de informação genética suficiente para replicar-se e, desse modo, não são infecciosos. Nalguns exemplos, as VLPs podem 49 compreender uma única espécie de proteína, ou mais do que uma espécie de proteína. Para as VLPs compreendendo mais do que uma espécie de proteína, a espécie de proteína pode ser da mesma espécie de vírus ou pode compreender uma proteína de uma espécie, género, subfamília ou família diferente de vírus (como designado pela nomenclatura ICTV). Noutros exemplos, uma ou mais das espécies de proteínas compreendendo uma VLP podem ser modificadas a partir da sequência natural. As VLPs podem ser produzidas nas células hospedeiras adequadas incluindo células hospedeiras de plantas e insetos. Após extração a partir da célula hospedeira e após isolamento e purificação subsequente sob condições adequadas, as VLPs podem ser purificadas como estruturas intactas.
As VLPs produzidas a partir de proteínas derivadas da gripe, de acordo com a presente invenção não compreendem a proteína Ml. A proteína Ml é conhecida por ligar ARN (Wakefield e Brownlee, 1989) o qual é um contaminante da preparação da VLP. A presença de ARN é indesejada quando se obtém aprovação regulamentar para o produto de VLP, por conseguinte uma preparação de VLP que carece de ARN pode ser vantajosa.
As VLPs da presente invenção são produzidas numa célula hospedeira que se caracteriza por carecer da aptidão para sialilar as proteínas, por exemplo que carece de sialidase, isto é, uma célula vegetal. As VLPs produzidas como aqui descrito não compreendem tipicamente neuramindase (NA). No entanto, a NA pode ser co-expressada com HA caso se deseje que as VLPs compreendam HA e NA.
Uma VLP produzida numa planta de acordo com alguns aspetos da invenção podem estar complexadas com lípidos derivados da planta. A VLP pode compreender um péptido HAO, HA1 ou 50 ΗΑ2. Os lípidos derivados da planta podem estar na forma de uma bicamada de lípidos e podem compreender ainda um envelope que circunda a VLP. Os lípidos derivados da planta podem compreender componentes lipídicos da membrana do plasma da planta onde a VLP é produzida, incluindo, mas não se limitando a, fosfatidilcolina (PC) , fosfatidiletanolamina (PE), glicosfingolípidos, fitosteróis ou uma combinação dos mesmos. Um lípido derivado de planta pode ser alternativamente referido como um 'lípido vegetal'. Na técnica são conhecidos exemplos de fitosteróis e incluem, por exemplo, estigmasterol, sitosterol, 24-metilcolesterol e colesterol - ver, por exemplo, Mongrand et al., 2004.
As VLPs podem ser avaliadas quanto à estrutura e tamanho, por exemplo, pelo ensaio de hemaglutinação, microscopia eletrónica ou por cromatografia de exclusão molecular.
Para cromatografia de exclusão molecular, as proteínas solúveis totais podem ser extraídas a partir de tecido vegetal, homogeneizando (Polytron) a amostra de material vegetal triturado congelado em tampão de extração e removendo o material insolúvel por centrifugação. A precipitação com PEG também pode ser vantajosa. A proteína solúvel é quantificada e o extrato feito passar através de uma coluna Sephacryl™. O Dextrano Azul 2000 pode ser utilizado como um padrão de calibração. Após cromatografia, as frações podem ser ainda analisadas por imunotransferência para determinar o complemento de proteína da fração.
Sem pretender ficar limitado pela teoria, a capacidade da HA para se ligar às RBC de diferentes animais é determinada pela afinidade da HA para os ácidos siálicos oí2,3 ou a2,3 e pela presença destes ácido siálicos na superfície das RBC. 51 A HA equina e aviária dos virus da gripe aglutinam os eritrócitos de todas as diferentes espécies, incluindo perus, galinhas, patos, porquinhos-da-índia, humanos, ovelhas, cavalos e vacas; enquanto as HAs humanas ligar-se-ão a eritrócitos de peru, galinhas, patos, porquinhos-da-índia, humanos e ovelhas (ver também Ito T. et al, 1997, Virology, vol 227, p493-499; e Medeiros R et al, 2001, Virology, vol 289 p.74-85). Os exemplos da reatividade para as espécies de HAs de diferentes estirpes da gripe é mostrada nos Quadros 2A e 2B.
Quadro 2A: Espécie de RBC ligada pelas HAs de estirpes de gripe sazonais selecionadas.
Sazonal Estirpe N° Origem Cavalo Peru Hl A/Brisbânia/59/2007 (H1N1) 774 Humana + ++ A/Ilhas Salomão/3/2006 (H1N1) 775 Humana + ++ H3 A/Brisbânia/10/2007 (H3N2) 776 Humana + ++ A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) 777 Humana + ++ B B/Malásia/2506/2004 778 Humana + ++ B/Flórida/4/2006 779 Humana + ++
Quadro 2B: Espécie de RBC ligada pelas HAs de estirpes de gripe pandémicas selecionadas
Pandémica Estirpe N° Origem Cavalo Peru H2 A/Singapura/1/57 (H2N2) 780 Humana + ++ H5 A/Anhui/1/2005 (H5N1) 781 Hu-Av ++ + A/Vietname/1194/2004 (H5N1) 782 Hu-Av ++ + H6 A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) 783 Aviária ++ + H7 A/Equina/Praga/56 (H7N7) 784 Equina ++ ++ 52
Pandémica Estirpe N° Origem Cavalo Peru H9 A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) 785 Humana + + +
Como aqui utilizada, uma "proteina" refere-se geralmente a uma cadeia de aminoácidos ligados por uma ligação peptidica, a qual pode ser dobrada numa estrutura secundária, terciária ou quaternária para conseguir uma morfologia particular. Alternativamente, os termos polipéptido, péptido ou fragmentos de péptido podem ser utilizados num contexto semelhante.
Um fragmento ou porção de uma proteina, proteina de fusão ou polipéptido inclui um péptido ou polipéptido compreendendo um subconjunto do complemento de aminoácidos de uma proteina ou polipéptido particular, na condição de que o fragmento possa formar uma VLP quando expressada. Por exemplo, o fragmento pode compreender uma região antigénica, uma região indutora de resposta de stress ou uma região compreendendo um dominio funcional da proteina ou polipéptido. 0 fragmento também pode compreender uma região ou dominio comum a proteínas da mesma família geral ou o fragmento pode incluir uma sequência de aminoácidos suficiente para identificar especificamente a proteína inteira a partir da qual é derivada.
Por exemplo, um fragmento ou porção pode compreender desde cerca de 60% até cerca de 100%, do comprimento da proteína inteira, ou qualquer quantidade entre aquelas, na condição de que o fragmento possa formar uma VLP quando expressada. Por exemplo, desde cerca de 60% até cerca de 100%, desde cerca de 70% até cerca de 100%, desde cerca de 80% até cerca de 100%, desde cerca de 90% até cerca de 100%, desde cerca de 95% até cerca de 100%, do comprimento da proteína 53 inteira, ou qualquer quantidade entre aquelas. Alternativamente, um fragmento ou porção pode ter desde cerca de 150 até cerca de 500 aminoácidos, ou qualquer quantidade entre aquelas, dependendo da HA, e na condição de que o fragmento possa formar uma VLP quando expressada. Por exemplo, um fragmento pode ter desde 150 até cerca de 500 aminoácidos, ou qualquer quantidade entre aquelas, desde cerca de 200 até cerca de 500 aminoácidos, ou qualquer quantidade entre aquelas, desde cerca de 250 até cerca de 500 aminoácidos, ou qualquer quantidade entre aquelas, desde cerca de 300 até cerca de 500 ou qualquer quantidade entre aquelas, desde cerca de 350 até cerca de 500 aminoácidos, ou qualquer quantidade entre aquelas, desde cerca de 400 até cerca de 500 ou qualquer quantidade entre aquelas, desde cerca de 450 até cerca de 500 ou qualquer quantidade entre aquelas, dependendo da HA e na condição de que o fragmento possa formar uma VLP quando expressada. Por exemplo, cerca de 5, 10, 20, 30, 40 ou 50 aminoácidos, ou qualquer quantidade entre aquelas, podem ser removidos a partir da extremidade C-terminal, da extremidade N-terminal ou de ambas as extremidades N e exterminai de uma proteína HA, na condição de que o fragmento possa formar uma VLP quando expressada. A numeração de aminoácidos em qualquer sequência dada é em relação à sequência particular, contudo um especialista pode determinar facilmente a 'equivalência' de um aminoácido particular numa sequência com base na estrutura e/ou sequência. Por exemplo, se foram removidos 6 aminoácidos N-terminais quando se construiu um clone para cristalografia, isto mudaria a identidade numérica específica do aminoácido (por exemplo, relativamente ao comprimento total da proteína), mas não alteraria a posição relativa do aminoácido na estrutura. 54
As comparações de uma sequência ou sequências podem ser feitas utilizando um algoritmo BLAST (Altschul et al., 1990. J. Mol Biol 215:403-410). Uma pesquisa BLAST permite comparar uma sequência de consulta com uma sequência especifica ou grupo de sequências, ou com uma biblioteca maior ou base de dados (por exemplo GenBank ou GenPept) de sequências, e identificar não só sequências que exibem 100% de identidade, mas também aquelas com menores graus de identidade. Os ácidos nucleicos ou sequências de aminoácidos podem ser comparados utilizando um algoritmo BLAST. Além disso, a identidade entre duas ou mais sequências pode ser determinada alinhando as sequências em conjunto e determinando a % de identidade entre as sequências. O alinhamento pode ser realizado utilizando o Algoritmo BLAST (por exemplo, como disponível através de GenBank; URL: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/ utilizando os parâmetros por defeito: Programa: blastn; Base de dados: nr; previsão 10; filtro: por defeito; Alinhamento: emparelhado; Códigos genéticos de Consulta: Padrão(1)), ou BLAST2 através de EMBL URL: embl-heidelberg.de/Services/ índice.htmL utilizando os parâmetros por defeito: Matriz BLOSUM62; Filtro: por defeito, ecofiltro: ligado, Previsão: 10, corte: por defeito; Cadeia: ambas; Descrições: 50, Alinhamentos: 50; ou FASTA, utilizando os parâmetros por defeito) ou comparando manualmente as sequências e calculando a % de identidade. A presente invenção descreve, mas não se limita à clonagem de um ácido nucleico que codifica a HA num vetor de expressão vegetal e à produção de VLPs da gripe a partir da planta, adequadas para a produção de vacinas. Os exemplos de tais ácidos nucleicos incluem, por exemplo, mas não se limitam a uma HA do vírus da gripe A/Nova Caledónia/20/99 (H1N1) (por exemplo, SEQ ID NO: 61), uma HA de subtipo A/Indonésia/5/05 (H5N1) (por exemplo, SEQ ID NO: 60), 55 A/Brisbânia/59/2007 (H1N1) (por exemplo, SEQ ID NO: 36, 48,62), A/Ilhas Salomão/3/2006 (H1N1) (por exemplo, SEQ ID NO: 37, 49, 63), A/Singapura/1/57 (H2N2) (por exemplo, SEQ ID NO: 42, 54, 64), A/Anhui/1/2005 (H5N1) (por exemplo, SEQ ID NO: 43, 55, 65), A/Vietname/1194/2004 (H5N1) (por exemplo, SEQ ID NO: 44, 56, 66), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) (por exemplo, SEQ ID NO: 45, 57, 67), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (por exemplo, SEQ ID NO: 47, 59, 68), A/Brisbânia/10/2007 (H3N2) (por exemplo, SEQ ID NO: 38, 50, 69), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) (por exemplo, SEQ ID NO: 39, 51, 70), A/Equina/Praga/56 (H7N7) (por exemplo, SEQ ID NO: 46, 58, 71), B/Malásia/2506/2004 (por exemplo, SEQ ID NO: 40, 52, 72), B/Flórida/4/2006 (por exemplo, SEQ ID NO: 41, 53, 73). Os números de clone ou construção correspondentes para estas estirpes são proporcionados no Quadro 1. As sequências de ácido nucleico correspondentes às SEQ ID NOs: 36-47 compreendem uma plastocianina a montante e operacionalmente ligada à sequência de codificação da HA para cada um dos tipos ou subtipos, como ilustrado nas Figuras 28-39. As sequências de ácido nucleico correspondentes às SEQ ID NO: 60-73 compreendem uma cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina de uma HA, UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação, como ilustrado nas Figuras 51-64.
As VLPs também podem ser utilizadas para produzir reagentes constituídos por proteínas estruturais da gripe recombinantes que se auto-reunem em estruturas proteicas macromoleculares homotípicas funcionais e imunogénicas, incluindo partículas de gripe subvirais e VLP da gripe, em células vegetais transformadas. 56
Por conseguinte, a invenção proporciona VLPs e um método para produzir VLPs virais num sistema de expressão vegetal, a partir da expressão de uma única proteina do envelope. As VLPs são VLPs da gripe. A presente invenção envolve ainda a clonagem de um ácido nucleico que codifica, por exemplo, uma HA, mas não se limita à HA do virus da gripe A/Indonésia/5/05 (H5N1) humana, num vetor vegetal e produção de candidatos ou reagentes de vacina contra a gripe constituídos por proteínas estruturais da gripe recombinantes que se auto-reunem em estruturas proteicas macromoleculares homotipicas funcionais e imunogénicas, incluindo partículas de gripe subvirais e VLP da gripe, em células vegetais transformadas. 0 ácido nucleico que codifica a HA é expressada numa célula vegetal ou numa planta. 0 ácido nucleico que codifica a HA pode ser sintetizado por transcrição inversa e reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando ARN de HA. Como um exemplo, o ARN pode ser isolado a partir de virus da gripe A/Nova Caledónia/20/99 (H1N1) humana ou virus da gripe A/Indonésia/5/05 (H5N1) humana ou outro virus da gripe por exemplo A/Brisbânia/59/2007 (H1N1), A/Ilhas Salomão/3/2006 (H1N1), A/Singapura/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietname/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2), A/Brisbânia/10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), A/Equina/Praga/56 (H7N7), B/Malásia/2506/2004, B/Flórida/4/2006, ou a partir de células infetadas com um virus da gripe. Para transcrição inversa e PCR podem ser utilizados iniciadores oligonucleotidicos específicos para o ARN de HA, por exemplo mas não se limitando a, sequências de HA do virus da gripe A/Nova Caledónia/20/99 (H1N1) humana ou sequências de HAO do virus da gripe A/Indonésia/5/05 (H5N1) humana ou 57 sequências de HA dos subtipos de gripe A/Brisbânia/59/2007 (H1N1), A/Ilhas Salomão/3/2006 (H1N1), A/Singapura/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietname/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2), A/Brisbânia/10/2007 (H3N2) , A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), A/Equina/Praga/56 (H7N7), B/Malásia/2506/2004, B/Flórida/4/2006. Além disso, um ácido nucleico que codifica a HA pode ser sintetizado quimicamente utilizando métodos como seriam conhecidos para um especialista na técnica.
As cópias de ADNc resultantes destes genes podem ser clonadas num vetor de expressão adequado conforme necessário pelo sistema de expressão hospedeiro. Os exemplos de vetores de expressão apropriados para plantas são descritos abaixo. A presente invenção é ainda dirigida a uma construção genética compreendendo um ácido nucleico que codifica a HA, como descrito acima, operacionalmente ligado a um elemento regulador que é funcional numa planta. Os exemplos de elementos reguladores funcionais numa célula vegetal e que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção incluem mas não se limitam a uma região reguladora de plastocianina (US 7,125,978), ou uma região reguladora de carboxilase/oxigenase de 1,5-bisfosfato de Ribulose (RuBisCO; US 4,962,028), proteina de ligação a clorofila a/b (CAB; Leutwiler et al; 1985), ST-LS1 (associada ao complexo de libertação de oxigénio do fotossistema II e descrita por Stockhaus et al. 1987, 1989. Um exemplo de uma região reguladora de plastocianina é uma sequência compreendendo os nucleótidos 10-85 de SEQ ID NO: 36 ou uma região semelhante de qualquer uma das SEQ ID NOS: 37-47. 58
Por conseguinte, a invenção refere-se a um ácido nucleico compreendendo uma região reguladora e uma sequência que codifica uma HA da gripe. A região reguladora pode ser um elemento regulador de plastocianina e a HA da gripe pode ser selecionada de um grupo de estirpes ou subtipos de gripe, compreendendo A/Nova Caledónia/20/99 (H1N1), subtipo A/Indonésia/5/05 (H5N1), A/Brisbânia/59/2007 (H1N1), A/Ilhas Salomão/3/2006 (H1N1), A/Singapura/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietname/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2), A/Brisbânia/10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), A/Equina/Praga/56 (H7N7), B/Malásia/2506/2004, B/Flórida/4/2006. As sequências de ácido nucleico compreendendo um elemento regulador de plastocianina e uma HA da gripe são aqui exemplificadas pelas SEQ ID NOs: 36-47.
Sabe-se que podem existir diferenças de sequência nas sequências de aminoácidos da hemaglutinina da gripe, ou nos ácidos nucleicos que as codificam, quando o virus da gripe é cultivado em ovos ou células de mamifero, (por exemplo células MDCK) ou quando isolado a partir de um indivíduo infetado. Os exemplos não limitativos de tais diferenças são aqui ilustrados, incluindo o Exemplo 18. Além disso, como um especialista na técnica perceberia, podem ser observadas variações adicionais nas hemaglutininas da gripe obtidas a partir de novas estirpes à medida que continuam a ocorrer mutações adicionais. Devido à variabilidade de sequência conhecida entre as diferentes hemaglutininas da gripe, a presente invenção inclui VLPs que podem ser preparadas utilizando qualquer hemaglutinina da gripe na condição de que quando expressada num hospedeiro como aqui descrito, a hemaglutinina da gripe forma uma VLP. 59
Os alinhamentos de sequências e as sequências consenso podem ser determinados utilizando qualquer um de vários pacotes de software conhecidos na técnica, por exemplo MULTALIN (F. CORPET, 1988, Nucl. Acids Res., 16 (22), 10881-10890), ou as sequências podem ser alinhadas manualmente e determinadas as semelhanças e diferenças entre as sequências. A estrutura de hemaqlutininas está bem estudada e as estruturas são conhecidas como sendo altamente conservadas. Quando as estruturas de hemaglutinina são sobrepostas é observado um alto grau de conservação estrutural (rmsd <2A) . Esta conservação estrutural é observada mesmo que a sequência de aminoácidos possa variar em algumas posições (ver, por exemplo, Skehel e Wiley, 2000 Ann Rev Biochem 69:531-69; Vaccaro et al 2005). As regiões das hemaglutininas são também bem observadas, por exemplo: • Dominios estruturais: A poliproteina HA0 é dissociada para proporcionar a HA madura. A HA é um homotrimero em que cada monómero compreende um domínio de ligação a recetor (HA1) e um domínio de ancoragem na membrana (HA2) ligados por uma única ligação dissulfureto; os 20 resíduos N-terminais da subunidade HA2 também podem ser referidos como o domínio ou sequência de fusão de HA. Está também presente uma região de 'cauda' (interna ao envelope da membrana). Cada hemaglutinina compreende estas regiões ou domínios. As regiões ou domínios individuais são tipicamente conservados em termos de comprimento. • Todas as hemaglutininas contêm o mesmo número e posição de pontes dissulfureto intra- e intermoleculares. A quantidade e posição na sequência de aminoácidos das cisteínas que participam na rede de pontes dissulfureto são conservadas entre as HAs. Os exemplos de estruturas que 60 ilustram as pontes dissulfureto intra- e intermoleculares caracteristicas e outros aminoácidos conservados e as suas posições relativas são descritas em, por exemplo, Gamblin et al 2004 (Science 303:1838-1842). As estruturas e sequências ilustrativas incluem 1RVZ, 1RVX, 1RVT, 1RV0, 1RUY, 1RU7, disponíveis a partir de Protein Data Bank (URL: www.rcsb.org). • Cauda citoplasmática - a maioria das hemaglutininas compreendem 3 cisteínas em posições conservadas. Uma ou mais destas cisteínas pode ser palmitoilada como uma modificação pós-tradução. A variação de aminoácidos é tolerada em hemaglutininas do vírus da gripe. Esta variação proporciona novas estirpes que são continuamente identificadas. A infetividade entre as novas estirpes pode variar. No entanto, a formação de trímeros de hemaglutinina, os quais formam subsequentemente VLPs, é mantida. Por conseguinte, a presente invenção refere-se a uma sequência de aminoácidos de hemaglutinina, ou um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos de hemaglutinina, que formam VLPs numa planta, e inclui sequências conhecidas e sequências variantes que se possam desenvolver. A Figura 65 ilustra um exemplo de uma variação desse tipo conhecida. Esta figura mostra uma sequência de aminoácidos consenso (SEQ ID NO: 74) para a HA das seguintes estirpes H1N1: A/Nova Caledónia/20/99 (H1N1) (codificada pela SEQ ID NO: 33) , A/Brisbânia/59/2007 (H1N1) (SEQ IDNO: 48), A/Ilhas Salomão/3/2006 (H1N1) (SEQ ID NO: 49) e
SEQ ID NO: 9. XI (posição 3) é A ou V; X2 (posição 52) é D ou N; X3 (posição 90) é K ou R; X4 (posição 99) é K ou T; 61 X5 (posição 111) é Y ou Η; X6 (posição 145 ) é V ou T; : X7 (posição 154 ) é E ou K; X8 (posição 161) é R ou K; X9 (posição 181 ) é V ou A; X10 (posição 203) é D ou N; Xll (posição 205 ) é R ou K; X12 (posição 210) é T ou K; XI3 (posição 225 ) é R ou K; XI4 (posição 268) é W ou R; XI5 (posição 283 ) é T ou N; XI 6 (posição 290) é E ou K; X17 (posição 432) é : I ou L ; X18 (posição 48 9) é N ou D.
Como outro exemplo de uma variação desse tipo é mostrado um alinhamento de sequências e da sequência consenso para a HA de A/Nova Caledónia/20/99 (H1N1) (codificada pela SEQ ID NO: 33), A/Brisbânia/59/2007 (H1N1) (SEQ ID NO: 48), A/Ilhas Salomão/3/2006 (H1N1) (SEQ ID NO: 49), A/Porto
Rico/8/34 (H1N1) e SEQ ID NO: 9 no Quadro 3 abaixo.
Quadro 3. Alinhamento de sequências e sequência consenso para a HA de estirpes H1N1 selecionadas 62 62 Sequência SEQID NO. 1 75 MXAKLLVLLC TFTATYADTI 9 MKAKLLVLLC TFTATYADTI 48 MKVKLLVLLC TFTATYADTI 49 MKVXLLVLLC TFTATYADTI 7 6 Consenso mkxkllvllc tftatyadti 51 75 EDSHNGKLCL LKGIAPLQLG 9 EDSHNGKLCL LKGIAFLQLG 48 ENSHNGKLCL LKGIAPLQLG 49 EDSHNGKLCL LKGIAPLQLG 76 Consenso exshngklcl lkgiaplqlg 50
CXGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL cigyhannst dtvdtvlekn vtvthsvnll 100
NCSVAGWILG NPECELLISK ESWSYIVETP NCSVAGWILG NPECELLISK ESWSYIVETP NCSVAGWILG NPECELLISK ESWSYIVEKP NCSVAGWILG NPECELLISR ESWSYIVEKP ncsvagwilg npecellis. eswsyive.p 101 150
75 NPENGTCYPG YFADYEELRE QLSSVSSFER FEIFPKESSW PNHTVTGVSA 9 NPENGTCYPG YFADYEELRE QLSSVSSFER FEIFPKESSW PNHTVTGVSA
48 NPENGTCYPG HFADYEELRE QLSSVSSFER FEIFPKESSW PNHTVTGVSA
49 NPENGTCYPG HFADYEELRE QLSSVSSFER FEIFPKESSW PNHTTTGVSA 76 ...................................................
Consenso npengtcypg xfadyeelre qlssvssfer feifpkessw pnhtxtgvsa 75 9 48 49 76 Consenso scsimgxssf yxnllwltgk nglypnlsks yxnnkekevl 151
SCSHNGKSSF
SCSHNGKSSF
SCSHNGESSF
SCSHNGESSF
YRNLLWLTGK
YRNLLWLTGK
YRNLLWLTGK
YKNLLWLTGK
NGLYPNLSKS
NGLYPNLSKS
NGLYPNLSKS
NGLYPNLSKS
YVNNKEKEVL
YVNNKEKEVL
YANNKEKEVL
YANNKEKEVL 200
VLWGVHHPPN
VLWGVHHPPN
VLWGVHHPPN VLWGVHHPPN vlwgvhhppn 250 AKRPKVRDQE GRINYYWTLL AKRPKVRDQE GRINYYWTLL AKRPKVRDQE GRINYYWTLL AKRPKVRDQE GRINYYWTLL PSGPLKAEIA QRLEDVFAGK akrPkvrfqe gRiiyywtll 201 75 9 48 49 76 Consenso
IGNQRALYHT ENAYVSWSS HYSRRFTPEI IGNQRALYHT ENAYVSWSS HYSRRFTPEI IGDQKALYHT ENAYVSWSS HYSRRFTPEI IGDQRALYHK ENAYVSWSS HYSRKFTPEI
...............MSLLT EVETYVLSII igxqxalyhx enayvswss hysrxftpel 75 9 48 49 76 Consenso 251 EPGDTIIFEA EPGDTIIFEA EPGDTIIFEA EPGDTIIFEA NTDLEVLMEW tpgdt!ífEa NGNLIAPWYA NGNLIAPWYA NGNLIAPRYA NGNLIAPRYA ...LKTRPIL ngnLiapxya
FALSRGFGSG
FALSRGFGSG
FALSRGFGSG
FALSRGFGSG
SPLTKGILGF faLsrGfgsg
IITSNAPMDE IITSNAPMDE IINSNAPMDK IINSNAPMDE VFTLTVPSER !itsnaPm#X 300
CDAKCQTPQG
CDAKCQTPQG
CDAKCQTPQG
CDAKCQTPQG
GLQRRRFVQN cdakcqtpQg 75 9 48 49 301
AINSSLPFQN
AINSSLPFQN
AINSSLPFQN
AINSSLPFQN
VHPVTIGECP
VHPVTIGECP
VHPVTIGECP
VHPVTIGECP
KYVRSAKLRM
KYVRSAKLRM
KYVRSAKLRM
KYVRSAKLRM
VT.GLRNIPS
VT.GLRNIPS
VT.GLRNIPS
VT.GLRNIPS 350
IQSRGLFGAI
IQSSGLFGAI
IQSRGLFGAI
IQSRGLFGAI 63 63 76 Consenso
ALNG.....N GDPNNMDKAV KLYRKLKREI TFHGAKEISL SYSAGALASC
AiNsslpfqN vhPvtigecp KyvRsaRlrm vtxGlr#Ips iqSrGlfgai 75 9 48 49 76 Consenso 75 9 48 49 76 Consenso 75 9 48 49 76 Consenso GKEFNXLERR GKEFNKLERR GKEFNKLERR GKEFNKLERR .KAKEQMAGS gKef#k$err
NLYEKVKSQL NLYEXVXSQL NLYEKVKSQL NLYEKVKSQL GLKNDLLENL nLy#kvks#L 351
AGF1EGGWTG AGFIEGGWTG AGFΓEGGWTG AGFIEGGWTG MGLIYNRM.G aGfleggwtG 401
EKMNTQFTAV
EKMNTQFTAV
EKMNTQFTAV
EKMNTQFTAV
NRMVLASTTA ikMntqfTav 451
TLDFHDSNVK
TLDFHDSNVK
TLDFHDSNVK
TLDFHDSNVK
TIGTHPSSSA
TldfHdSnvk
MVDGWYGYHH
MVDGWYGYHH
MVDGWYGYHH
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QNEQGSGYAA
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MENLNKKVDD
MENLNKKVDD
MENLNKKVDD
MENLNKKVDD
SEQAAEAMEV mE#lnkkv#d
KNNAKEIGNG
KNNAKEIGNG
KNNAKEIGNG
KNNAKEIGNG
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DQKSTQNAIN
DQKSTQNAIN
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CFEFYHKCNN
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CFEFYHKCND «QRFK..... cfeFyhkcnx 400
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GITNKVNSVI
GITNKVNSVI
TTTNPLIRHE giTNkvnsvi 450
ELLVLLENER
ELLVLLENER
ELLVLLENER
ELLVLLENER
QARQMVQAMR
#llv$l#neR 500
ECMESVKNGT
ECMESVKNGT
ECMESVKNGT ECMESVKNGT ecmesvkngc 75 9 48 49 76 Consenso 75 9 48 49 76 Consenso
501 550 YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTVASS LVLLVSLGAI YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTVASS LVLLVSLGAI YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTVASS LVLLVSLGAI YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTVASS LVLLVSLGAI ydypkysees klnrekidgv klesmgvyqi laiystvass Ivllvslgai
551 566 SFWMCSNGSL QCRICI SFWMCSNGSL QCRICI SFWMCSNGSL QCRICI SFWMCSNGSL QCRICI sfwmcsngsl qcrici A sequência consenso indica em maiúsculas aminoácidos comuns a todas as sequências numa posição designada; as minúsculas indicam aminoácidos comuns a pelo menos metade ou uma maioria das sequências; o símbolo ! é qualquer um de I ou V; o símbolo $ é qualquer um de L ou Μ; o símbolo % é qualquer um de F ou Y; o símbolo # é qualquer um de N, D, Q, E, B ou Z; o símbolo "." é nenhum aminoácido (por exemplo uma supressão) ; X na posição 3 é qualquer um de A ou V; X na posição 52 é qualquer um de E ou N; X na posição 64 90 é K ou R; X na posição 99 é T ou K; X na posição 111 é qualquer um de Y ou Η; X na posição 145 é qualquer um de V ou T; X na posição 157 é K ou E; X na posição 162 é R ou K; X na posição 182 é V ou A; X na posição 203 é N ou D; X na posição 205 é R ou K; X na posição 210 é T ou K; X na posição 225 é K ou Y; X na posição 333 é H ou uma supressão; X na posição 433 é I ou L; X na posição 49 é N ou D.
Como outro exemplo de uma variação desse tipo é mostrado um alinhamento de sequências e sequência consenso para a HA de A/Anhui/1/2005 (H5N1) (SEQ IDNO: 55), A/Vietname/1194/2004 (H5N1) e A/Indonésia/5/200 6 (H5N1) (SEQ ID NO: 10) no Quadro 4 abaixo.
Quadro 4. Alinhamento de sequências e sequência consenso para a HA de estirpes H1N1 selecionadas
50 65SEQID NO
Sequência
10 1 MEKIVLLLAI 56 MEKIVLLFAI 55 MEKIVLLLAI Consenso MEKIVLL1AI 10 51 KTHNGKLCDL 56 KTHNGKLCDL 55 KTHNGKLCDL Consenso KTHNGKLCDL 10 101 PTNDLCYPGS 56 PVNDLCYPGD 55 PANDLCYPGN Consenso PxNDLCYPGx 10 151 CPYLGSPSFF 56 CPYQGKSSFF 55 CPYQGTPSFF Consenso CPYqGxpSFF 10 201 AEQTRLYQNP 56 AEQTKLYQNP 55 AEQTKLYQNP Consenso AEQTkLYQNP 10 251 PNDAINFESN 56 PNDAINFESN 55 PNDAINFESN Consenso PNDAINFESN 10 301 INSSMPFHNI 56 XNSSMPFHNI 55 INSSMPFHNI VSLVKSDQIC IGYHANNSTE VSLVKSDQIC IGYHANNSTE VSLVKSDQIC IGYHANNSTE VSLVKSDQIC IGYHANNSTE DGVKPLILRD CSVAGWLLGN DGVKPLILRD CSVAGWLLGN DGVKPLILRD CSVAGWLLGN DGVKPLILRD CSVAGWLLGN FNDYEELKHL LSRINHFEKI FNDYEELKHL LSRINHFEKI FNDYEELKHL LSRINHFEKI FNDYEELKHL LSRINHFEKI RNWWLIKKN STYPTIKKSY RNWWLIKKN STYPTIKRSY RNWWLIKKN NTYPTIKRSY RNWWLIKKN sTYFTIKrSY TTYISIGTST LNQRLVPKIA TTYISVGTST LNQRLVPRIA TTYISVGTST LNQRLVPKIA TTYISIGTST LNQRLVPklA GNFIAPEYAY KIVKKGDSAI GNFIAPEYAY KIVKKGDSTI GNFIAPEYAY KIVKKGDSAI GNFIAPEYAY KIVKKGDSAI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA HPLTIGECPK YVKSNRLVLA HPLTIGECPK YVKSNRLVLA
QVDTIMEKNV TVTHAQDILE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE 100
PMCDEFINVP EWSYIVEKAN PMCDEFINVP EWSYIVEKAN PMCDEFINVP EWSYIVEKAN PMCDEFINVP EWSYIVEKAN 150
QIIPKSSWSD HEASSGVSSA QIIPKSSWSS HEASLGVSSA QIIPKSSWSD HEASSGVSSA QIIPKSSWSd HEASSGVSSA 200
NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA NNTNQEDLLI LWGIHHSNDA NNTNQEDLL i LWGIHHpNDA 250
TRSKVNGQSG RJMEFFWTILK TRSKVNGQSG RMEFFWTILK TRSKVNGQSG RMDFFWTILK TRSKVNGQSG RM#FFWTILK 300
MKSELEYGNC NTKCQTPMGA MKSELEYGNC NTKCQTPMGA VKSEVEYGNC NTKCQTPIGA mKSElEYGNC NTKCQTPmGA 350
TGLRNSPQRE SRRKKRGLFG TGLRNSPQRE RRRKKRGLFG TGLRNSPLRE RRRK.RGLFG 66
66 Consenso INSSMPFHNI 351 10 AIAGFIEGGW 56 AIAGFIEGGW 55 AIAGFIEGGW Consenso AIAGFIEGGW 401 10 IIDKMíTQFE 56 IIDKMNTQFE 55 IIDKMNTQFE Consenso IIDKMNTQFE 451 10 ERTLDFHDSN 56 ERTLDFHDSN 55 ERTLDFHDSN Consenso ERTLDFHDSN 501 10 GTYNYPQYSE 56 GTYDYPQYSE 55 GTYDYPQYSE Consenso GTY#YPQYSE 551 10 GLSLWMCSNG 56 GLSLWMCSNG 55 GLSLWMCSNG Consenso GLSLWMCSNG HPLTIGBCPK YVKSNrLVLA QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AVGREFNNLE RRIENLNKKM AVGREFNNLE RRIENLNKKM AVGREFNNLE RRIENLNKKM AVGREFNNLE RRIENLNKKM VKNLYDKVRL QLRDNAKELG VKNLYDKVRL QLRDNAKELG VKNLYDKVRL QLRDNAKELG VKNLYDKVRL QLRDNAKELG
EARLKREEIS GVKLESIGTY EARLKREEIS GVKLESIGIY EARLKREEIS GVKLESIGTY EARLKREEIS GVKLESIGtY 5S8
SLQCRICI
SLQCRICX
SLQCRICI
SLQCRICI TGLRNSPCjRE rRRKkRGLFG 400
AADKESTQKA IDGVTNKVNS AADKESTQKA IDGVTNKVNS AADKESTQKA IDGVTNKVNS AADKESTQKA IDGVTNKVNS 450
EDGFLDVWTY NAELLVLMEN EDGFLDVWTY NAELLVLMEN EDGFLDVWTY NAELLVLMEN EDGFLDVWTY NAELLVLMEN 500
NGCFEFYKKC DNECMESIRN NGCFEFYHKC DNECMESVRN NGCFEFYHKC DNECMESVRN NGCFEFYKKC DNECMES!RN 550
QILSIYSTVA SSLALAIMMA QILSIYSTVA SSLALAIMVA QILSIYSTVA SSLALAIMVA QILSIYSTVA SSLALAIMVA A sequência consenso indica em maiúsculas aminoácidos comuns a todas as sequências numa posição designada; as minúsculas indicam aminoácidos comuns a pelo menos metade ou uma maioria das sequências; o símbolo ! é qualquer um de I ou V; o símbolo $ é qualquer um de L ou Μ; o símbolo % é qualquer um de F ou Y; o símbolo # é qualquer um de N, D, Q, E, B ou Z; X na posição 102 é qualquer um de T, V ou A; X na posição 110 é qualquer um de S, D ou N; X na posição 156 é qualquer um de S, K ou T.
Os alinhamentos e sequências consenso ilustrados e descritos acima são exemplos não limitativos de variantes nas sequências de aminoácidos da hemaglutinina que podem ser utilizados em várias formas de realização da invenção para a produção de VLPs numa planta. 67
Um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos pode ser facilmente determinado, já que os codões para cada aminoácido são conhecidos na técnica. Por conseguinte, a indicação de uma sequência de aminoácidos, ensina as sequências degeneradas de ácidos nucleicos que a codificam. Por conseguinte, a presente invenção proporciona uma sequência de ácido nucleico que codifica a hemaglutinina das estirpes e subtipos de gripe aqui divulgados (por exemplo A/Nova Caledónia/20/99 (H1N1), A/Indonésia/5/2006 (H5N1), A/galinha/Nova Iorque/1995, A/gaivota prateada/DE/677/88 (H2N8), A/Texas/32/2003, A/pato-selvagem/MN/33/00, A/pato/Xangai/1/2000, A/arrabio do norte/TX/828189/02, A/Peru/Ontário/6118/68(H8N4), A/pato-trombeteiro/Irão/G54/03, A/galinha/Alemanha/N/1949(H10N7), A/pato/Inglaterra/56(H11N6), A/pato/Alberta/60/76(H12N5), A/Gaivota/Maryland/704/77(H13N6), A/Pato-selvagem/Gurjev/263/82, A/pato/Austrália/341/83 (H15N8), A/guincho-comum/Suécia/5/99(H16N3), B/Lee/40, C/Joanesburgo/66, A/Porto Rico/8/34 (H1N1), A/Brisbânia/59/2007 (H1N1), A/Ilhas Salomão 3/2006 (H1N1), A/Brisbânia 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), B/Malásia/2506/2004, B/Flórida/4/2006, A/Singapura/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietname/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Equina/Praga/56 (H7N7), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)), bem como as sequências degeneradas que codificam as hemaglutininas acima.
Além disso, uma sequência de aminoácidos codificada por um ácido nucleico pode ser facilmente determinada, já que são conhecidos o codão ou codões para cada aminoácido. Por conseguinte, a indicação de um ácido nucleico, ensina uma sequência de aminoácidos codificada pelo mesmo. Por conseguinte, a invenção proporciona sequências de aminoácidos de hemaglutinina das estirpes e subtipos de gripe aqui divulgados daqueles aqui divulgados (por 68 exemplo, A/Nova Caledónia/20/99 (H1N1), A/Indonésia/5/2006 (H5N1), A/galinha/Nova Iorque/1995, A/gaivota prateada/DE/677/88 (H2N8), A/Texas/3212003, A/pato-selvagem/MN/33/00, A/pato/Xangai/1/2000, A/arrabio do norte/TX/828189/02, A/Peru/Ontário/6118/68(H8N4), A/pato-trombeteiro/Irão/G54/03, A/galinha/Alemanha/N/1949(H10N7), A/pato/Inglaterra/56(H11N6), A/pato/Alberta/60/76(H12N5), A/Gaivota/Maryland/704/77(H13N6), A/Pato-selvagem/Gurjev/263/82, A/pato/Austrália/341/83 (H15N8), A/guincho-comum/Suécia/5/99(H16N3), B/Lee/40, C/Joanesburgo/66, A/Porto Rico/8/34 (H1N1), A/Brisbânia/59/2007 (H1N1), A/Ilhas Salomão 3/2006 (H1N1), A/Brisbânia 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), B/Malásia/2506/2004, B/Flórida/4/2006, A/Singapura/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietname/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Equina/Praga/56 (H7N7), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)).
Nas plantas, as VLPs da gripe germinam a partir da membrana do plasma (ver Exemplo 5 e Figura 19) pelo que a composição lipidica das VLPs reflete a sua origem. As VLPs produzidas de acordo com a presente invenção compreendem a HA de um ou mais do que um tipo ou subtipo de gripe, complexada com lipidos derivados da planta. Os lipidos vegetais podem estimular células imunitárias especificas e melhorar a resposta imunológica induzida. As membranas vegetais são feitas de lipidos, fosfatidilcolina (PC) e fosfatidiletanolamina (PE), e contêm também glicosfingolipidos, saponinas e fitosteróis. Além disso, estão também presentes jangadas lipídicas nas membranas do plasma das plantas - estes microdominios estão enriquecidos em esfingolipidos e esteróis. Nas plantas, sabe-se que ocorre uma variedade de fitosteróis, incluindo estigmasterol, sitosterol, 24-metilcolesterol e colesterol (Mongrand et al., 2004). 69
As PC e PE, bem como os glicosfingolípidos podem ligar-se a moléculas CD1 expressadas pelas células imunitárias de mamíferos tais como as células apresentadoras de antigénio (APCs) como células dendríticas e macrófagos e outras células incluindo linfócitos B e T no timo e fígado (Tsuji M,. 2006). As moléculas CD1 são estruturalmente semelhantes às moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) de classe I e o seu papel é apresentar os antigénios glicolipídicos a células NKT (Células T Assassinas Naturais). Após ativação, as células NKT ativam células imunitárias inatas tais como células NK e células dendríticas e ativam também células imunitárias adaptativas como as células B produtoras de anticorpo e células T.
Pode encontrar-se uma variedade de fitosteróis numa membrana do plasma - o complemento específico pode variar dependendo da espécie, condições de crescimento, recursos de nutrientes ou estado patogénico, para nomear apenas alguns fatores. Em geral, o beta-sitosterol é o fitosterol mais abundante.
Os fitosteróis presentes numa VLP da gripe complexada com uma bicamada de lípidos, tal como um envelope derivado da membrana do plasma pode proporcionar uma composição de vacina vantajosa. Sem pretender ficar limitado pela teoria, as VLPs feitas em plantas complexadas com uma bicamada de lípidos, tal como um envelope derivado da membrana do plasma, podem induzir uma reação imunológica mais forte do que as VLPs feitas noutros sistemas de expressão e podem ser semelhantes à reação imunológica induzida por vacinas de vírus inteiros vivos ou atenuados.
Por conseguinte, nalgumas formas de realização, a invenção proporciona uma VLP produzida de acordo com a invenção complexada com um bicamada de lípidos derivada da planta. 70
Nalgumas formas de realização, a bicamada de lípidos derivada da planta pode compreender o envelope da VLP. A VLP produzida numa planta pode induzir uma HA compreendendo N-glicanos específicos da planta. Por conseguinte, esta invenção também proporciona uma VLP compreendendo HA possuindo N-glicanos específicos da planta.
Além disso, a modificação de N-glicanos em plantas é conhecida (ver, por exemplo, U.S. 60/944,344) e podem ser produzidas HA possuindo N-glicanos modificados. Pode ser obtida HA compreendendo um padrão de glicosilação modificado, por exemplo com N-glicanos fucosilados, xilosilados, ou ambos, fucosilados e xilosilados, reduzidos ou pode ser obtida HA possuindo um padrão de glicosilação modificado, em que a proteína carece de fucosilação, xilosilação, ou ambas, e compreende galatosilação aumentada. Além disso, a modulação de modificações pós-tradução, por exemplo, a adição de galactose terminal pode resultar numa redução de fucosilação e xilosilação da HA expressada quando comparada com uma planta de tipo selvagem que expressa HA.
Como um exemplo, o qual não é para ser considerado limitativo, a síntese de HA possuindo um padrão de glicosilação modificado pode ser conseguida por co-expressão da proteína de interesse juntamente com uma sequência de nucleótidos que codifica, por exemplo, a beta-1,4-galactosil-transferase (GalT), mas não se limita à GalT de mamífero ou GalT humana, podendo contudo ser utilizada GalT de outras fontes. O domínio catalítico da GA1T também pode ser fundido com um domínio CTS (isto é, a cauda citoplasmática, domínio transmembranar, região eixo) da N-acetilglucosaminil-transferase (GNTI), para produzir uma 71 enzima GNTl-GalT híbrida e a enzima híbrida pode ser co-expressada com HA. A HA também pode ser co-expressada juntamente com uma sequência de nucleótidos que codifica, por exemplo, a N-acetilglucosaminil-transferase III (GnT-III) mas não se limita a GnT-III mamífera ou GnT-III, GnT-III humana, podendo também ser utilizada de outras fontes. Além disso também pode ser utilizada uma enzima híbrida GNTl-GnT-III, compreendendo o CTS de GNT1 fundido com GnT-III.
Por conseguinte a presente invenção inclui também VLPs compreendendo HA possuindo N-glicanos modificados, as quais são produzidas pelos métodos da invenção.
Sem pretender ficar limitado pela teoria, a presença de N-glicanos vegetais na HA pode estimular a resposta imunológica promovendo a ligação da HA por células apresentadoras de antigénio. A estimulação da resposta imunológica utilizando N-glicanos vegetais foi proposta por Saint-jore-Dupas et al. (2007). Além disso, a conformação da VLP pode ser vantajosa para a apresentação do antigénio, e melhorar o efeito adjuvante da VLP quando complexada com uma camada de lípidos derivados de planta.
Por "região reguladora" "elemento regulador" ou "promotor" pretende-se referir uma porção de ácido nucleico tipicamente, mas nem sempre, a montante da região de codificação de proteína de um gene, a qual pode ser constituída por ADN ou ARN, ou ambos ADN e ARN. Quando uma região reguladora está ativa, e em associação funcional, ou ligada operacionalmente, com um gene de interesse, isto pode resultar na expressão do gene de interesse. Um elemento regulador pode ser capaz de mediar a especificidade para o órgão, ou controlar a ativação durante o desenvolvimento ou temporal do gene. Uma "região 72 reguladora" inclui elementos promotores, elementos promotores centrais que exibem uma atividade promotora basal, elementos que são indutíveis em resposta a um estímulo externo, elementos que medeiam a atividade promotora tal como os elementos reguladores negativos ou intensificadores da transcrição. "Região reguladora", como aqui utilizado, inclui também elementos que estão ativos após transcrição, por exemplo, elementos reguladores que modulam a expressão do gene tais como intensificadores da tradução e transcrição, repressores da tradução e transcrição, sequências de ativação a montante e determinantes da instabilidade do ARNm. Vários destes últimos elementos podem estar localizados proximais à região de codificação.
No contexto desta divulgação, o termo "elemento regulador" ou "região reguladora" refere-se tipicamente a uma sequência de ADN, geralmente, mas nem sempre, a montante (5') da sequência de codificação de um gene estrutural, o qual controla a expressão da região de codificação que proporciona o reconhecimento da ARN polimerase e/ou outros fatores necessários para a transcrição começar num sítio particular. No entanto, é para ser entendido que outras sequências de nucleótidos, localizadas dentro dos intrões ou a 3' da sequência também podem contribuir para a regulação da expressão de uma região de codificação de interesse. Um exemplo de um elemento regulador que proporciona o reconhecimento da ARN polimerase ou outros fatores de transcrição para assegurar o começo num sítio particular é um elemento promotor. A maioria, mas nem todos os elementos promotores eucarióticos contêm uma caixa TATA, uma sequência de ácido nucleico conservada constituída por pares de bases nucleotídicos de adenosina e timidina situados aproximadamente 25 pares de bases a montante de um sítio de início da transcrição. Um elemento promotor 73 compreende um elemento promotor basal, responsável pelo início da transcrição, bem como outros elementos reguladores (como listados acima) que modificam a expressão do gene.
Existem vários tipos de regiões reguladoras, incluindo aquelas que são reguladas pelo desenvolvimento, indutíveis ou constitutivas. Uma região reguladora que é regulada pelo desenvolvimento ou controla a expressão diferencial de um gene sob o seu controlo, é ativada dentro de certos órgãos ou tecidos de um órgão em alturas específicas durante o desenvolvimento desse órgão ou tecido. No entanto, algumas regiões reguladoras que são reguladas pelo desenvolvimento podem estar preferencialmente ativas dentro de certos órgãos ou tecidos em fases específicas do desenvolvimento, elas também podem estar ativas de uma maneira regulada pelo desenvolvimento ou a um nível basal noutros órgãos ou tecidos dentro da planta. Os exemplos de regiões reguladoras específicas para o tecido, por exemplo ver uma região reguladora específica, incluem o promotor de napina, e o promotor de cruciferina (Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau et al., 1994, Plant Cell 14: 125-130) . Um exemplo de um promotor específico para a folha inclui o promotor de plastocianina (Figura lb ou SEQ ID NO:23); US 7, 125, 9786) .
Uma região reguladora indutível é uma que é capaz de ativar direta ou indiretamente a transcrição de uma ou mais sequências de ADN ou genes em resposta a um indutor. Na ausência de um indutor as sequências de ADN ou genes não serão transcritos. Tipicamente, o fator proteico que se liga especificamente a uma região reguladora indutível para ativar a transcrição pode estar presente numa forma inativa, a qual é depois direta ou indiretamente convertida na forma ativa pelo indutor. No entanto, o fator proteico 74 também pode estar ausente. 0 indutor pode ser um agente químico tal como uma proteína, metabolito, regulador do crescimento, herbicida ou composto fenólico ou um stress fisiológico imposto diretamente pelo calor, frio, sal ou elementos tóxicos ou indiretamente através da ação de um agente patogénico ou agente patológico tal como um vírus. Uma célula vegetal contendo uma região reguladora indutível pode ser exposta a um indutor aplicando externamente o indutor à célula ou planta tal como por pulverização, irrigação, aquecimento ou métodos semelhantes. Os elementos reguladores indutíveis podem ser derivados de genes vegetais ou não vegetais (por exemplo Gatz, C. e Lenk, I.R.P., 1998, Trends Plant Sei. 3, 352-358). Os exemplos de promotores indutíveis potenciais incluem, mas não se limitam a, promotor indutível por tetraciclinas (Gatz, C., 1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108 ), promotor indutível por esteroides (Aoyama, T. e
Chua, N.H.,1997, Plant J. 2, 337-404) e promotor indutível por etanol (Salter, M.G., et al, 1998, Plant Journal 16, 127-132; Caddick, M.X., et al, 1998, Nature Biotech. 16, 177-180) genes IB6 e CKI1 indutíveis por citocininas (Brandstatter,1. e Kieber, J.J.,1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, T., 1996, Science 274, 982-985) e o elemento indutível por auxina, DR5 (Ulmasov, T., et al., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971.
Uma região reguladora constitutiva coordena a expressão de um gene ao longo das várias partes de uma planta e continuamente ao longo do desenvolvimento vegetal. Os exemplos de elementos reguladores constitutivos conhecidos incluem promotores associados ao transcrito CaMV 35S (Odell et al., 1985, Nature, 313: 810-812), os genes da actina 1 de arroz (Zhang et al, 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165), actina 2 (An et al., 1996, Plant J., 10: 107-121) ou tms 2 (U.S. 5, 428,147), e triosefosfato isomerase 1 (Xu et al., 75 1994, Plant Physiol. 106: 459-467), o gene da ubiquitina 1 do milho (Cornejo et al, 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), os genes da ubiquitina 1 e 6 de Arabidopsis (Holtorf et al, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646) e o gene do fator 4A de inicio da tradução do tabaco (Mandei et al, 1995 Plant Mol. Biol. 29: 995-1004). O termo "constitutivo" como aqui utilizado não indica necessariamente que um gene sob o controlo da região reguladora constitutiva é expressado ao mesmo nivel em todos os tipos de células, mas que o gene é expressado numa vasta gama de tipos de células ainda que seja frequentemente observada variação na abundância.
Por "operacionalmente ligado" entende-se que as sequências particulares, por exemplo um elemento regulador e uma região de codificação de interesse, interagem direta ou indiretamente para realizar uma função pretendida, tal como a mediação ou modulação da expressão do gene. A interação de sequências ligadas operacionalmente pode ser mediada, por exemplo, por proteinas que interagem com as sequências ligadas operacionalmente. A uma ou mais do que uma sequência de nucleótidos utilizadas nos métodos da presente invenção podem ser expressadas em qualquer hospedeiro vegetal adequado que é transformado pela sequência de nucleótidos, ou construções, ou vetores da presente invenção. Os exemplos de hospedeiros adequados incluem, mas não se limitam a, culturas agricolas incluindo luzerna, canola, Brassica spp., milho, Nicotiana spp., luzerna, batata, ginsengue, ervilha, aveia, arroz, seja, trigo, cevada, girassol, algodão e semelhantes. A uma ou mais construções genéticas quiméricas da presente invenção podem compreender ainda uma região 3' não traduzida. Uma região 3' não traduzida refere-se àquela 76 porção de um gene compreendendo um segmento de ADN que contém um sinal de poliadenilação e quaisquer outros sinais reguladores capazes de efetuar o processamento de ARNm ou a expressão do gene. 0 sinal de poliadenilação é geralmente caracterizado efetuando a adição de sequências de poli(ácido adenílico) na extremidade 3' do precursor de ARNm. Os sinais de poliadenilação são geralmente reconhecidos pela presença de homologia com a forma canónica 5' AATAAA-3' embora não sejam invulgares variações. Uma ou mais das construções genéticas quiméricas da presente invenção podem incluir também outros intensificadores, intensificadores de tradução ou transcrição, consoante for necessário. Estas regiões intensificadoras são bem conhecidas para os especialistas na técnica, e podem incluir o codão de inicio ATG e as sequências adjacentes. 0 codão de inicio tem de estar em fase com a grelha de leitura da sequência de codificação para assegurar a tradução de toda a sequência.
Os exemplos não limitativos de regiões 3' adequadas são as regiões 3' transcritas, não traduzidas contendo um sinal de poliadenilação de genes do plasmídeo de indução de tumor (Ti) de Agrobacterium, tal como a sinta-se de nopalina (gene Nos) e genes vegetais tais como os genes da proteína de conservação de soja, o gene da pequena subunidade da ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase (ssRUBISCO; US 4,962,028), o promotor utilizado na regulação da expressão da plastocianina (Pwee e Gray 1993) . Um exemplo de um promotor de plastocianina é descrito na US 7,125,978.
Como aqui descrito, foi determinado que os promotores que compreendem sequências intensificadoras com eficiência demonstrada na expressão da folha são eficazes na expressão transitória. Sem pretender ficar limitado pela teoria, a fixação de elementos reguladores a montante de um gene 77 fotossintético por fixação à matriz nuclear pode mediar expressão forte. Por exemplo, pode utilizar-se até -784 do sitio de inicio da tradução do gene de plastocianina da ervilha para mediar uma expressão forte do gene repórter. A fim de ajudar na identificação de células vegetais transformadas, as construções desta invenção podem ser ainda manipuladas para incluir marcadores vegetais selecionáveis. Os marcadores selecionáveis úteis incluem enzimas que proporcionam resistência a substâncias quimicas tais como um antibiótico, por exemplo, gentamicina, higromicina, canamicina ou herbicidas tais como fosfinotricina, glifosato, clorossulfurão e semelhantes. Analogamente podem ser utilizadas enzimas que proporcionam a produção de um composto identificável por alteração da cor tal como GUS (beta-glucuronidase), ou luminescência, tal como luciferase ou GFP.
Igualmente utilizadas de acordo com os métodos desta invenção são as plantas transgénicas, células vegetais ou sementes contendo a construção de gene quimérico. Os métodos de regeneração de plantas inteiras a partir de células vegetais também são conhecidos na técnica. Em geral, as células vegetais transformadas são cultivadas num meio apropriado, o qual pode conter agentes seletivos tais como antibióticos, onde são utilizados marcadores selecionáveis para facilitar a identificação de células vegetais transformadas. Uma vez formado o calo, a formação de rebentos pode ser encorajada utilizando as hormonas vegetais apropriadas de acordo com métodos conhecidos e os rebentos transferidos para meio de enraizamento para regeneração das plantas. As plantas podem ser depois utilizadas para estabelecer gerações repetitivas, quer a partir de sementes quer utilizando técnicas de propagação 78 vegetativa. As plantas transgénicas podem ser também geradas sem utilizar culturas de tecido. São também consideradas parte desta invenção as plantas e árvores transgénicas contendo a construção de gene quimérico compreendendo um ácido nucleico que codifica a HAO recombinante para a produção de VLP, de acordo com a presente invenção.
Os elementos reguladores utilizados na presente invenção também podem ser combinados com a região de codificação de interesse para expressão numa gama de organismos hospedeiros que são adequados para transformação ou expressão transitória. Tais organismos incluem, mas não se limitam a plantas, tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas, por exemplo mas não se limitando a milho, plantas de cereais, trigo, cevada, aveia, Nicotiana spp, Brassica spp, soja, feijão, ervilha, luzerna, batata, tomate, ginsengue e Arabidopsis.
Os métodos para transformação estável e regeneração destes organismos são estabelecidos na técnica e conhecidos para um especialista na técnica. 0 método para obter plantas transformadas e regeneradas não é critico para a presente invenção.
Por "transformação" pretende-se referir a transferência interespecifica estável de informação genética (sequência de nucleótidos) que se manifesta genotipicamente, fenotipicamente ou ambas. A transferência interespecifica de informação genética de uma construção quimérica para um hospedeiro pode ser hereditária e a transferência de informação genética considerada estável ou o transferência pode ser transitória e a transferência de informação genética não é hereditária. 79
Através do termo "matéria vegetal" pretende-se referir qualquer material derivado de uma planta. A matéria vegetal pode compreender uma planta inteira, tecido, células ou qualquer fração dos mesmos. Além disso, matéria vegetal pode compreender componentes vegetais intracelulares, componentes vegetais extracelulares, extratos liquidos ou sólidos de plantas, ou uma combinação dos mesmos. Além disso, a matéria vegetal pode compreender plantas, células vegetais, tecido, um extrato liquido ou uma combinação dos mesmos, de folhas, caules, fruto, raizes de plantas ou uma combinação dos mesmos. A matéria vegetal pode compreender uma planta ou parte da mesma que não foi submetida a quaisquer passos de processamento. No entanto, considera-se também que o material vegetal pode ser submetido a passos de processamento minimo como definido abaixo ou a processamento mais rigoroso, incluindo purificação parcial ou substancial de proteína utilizando técnicas geralmente conhecidas na técnica incluindo, mas não se limitando a cromatografia, eletroforese e semelhantes.
Através do termo "processamento mínimo" pretende-se referir matéria vegetal, por exemplo, um planta ou parte da mesma compreendendo uma proteína de interesse que é parcialmente purificado para produzir um extrato vegetal, homogenato, fração de homogenato vegetal ou semelhantes (isto é, processada minimamente). A purificação parcial pode compreender, mas não se limita a romper estruturas celulares vegetais criando desse modo uma composição compreendendo componentes vegetais solúveis e componentes vegetais insolúveis, os quais podem ser separados, por exemplo, mas não se limitando a, centrifugação, filtração ou uma combinação dos mesmos. A este respeito, as proteínas segregadas dentro do espaço extracelular da folha ou outros tecidos poderiam ser facilmente obtidas utilizando extração a vácuo ou centrífuga, ou os tecidos poderiam ser extraídos 80 sob pressão por passagem através de cilindros ou trituração ou semelhantes para espremer ou libertar a proteina livre a partir do espaço extracelular. 0 processamento minimo poderia também envolver a preparação de extratos de proteínas solúveis em bruto, uma vez que estas preparações teriam contaminação insignificante de produtos vegetais secundários. Além disso, o processamento minimo pode envolver extração aquosa da proteina solúvel a partir das folhas, seguida de precipitação com qualquer sal adequado. Outros métodos podem incluir maceração em grande escala e extração de sumo para permitir a utilização direta do extrato. A matéria vegetal, na forma de material ou tecido vegetal pode ser administrado por via oral a um indivíduo. A matéria vegetal pode ser administrada como parte de um suplemento dietético, juntamente com outros alimentos, ou encapsulada. A matéria ou tecido vegetal também pode ser concentrado para melhorar ou aumentar a agradabilidade ao paladar, ou proporcionada juntamente com outros materiais, ingredientes ou excipientes farmacêuticos, consoante necessário.
Os exemplos de um indivíduo ou organismo alvo ao qual podem ser administradas as VLPs produzidas de acordo com a presente invenção incluem, mas não se limitam a, humanos, primatas, aves, aves aquáticas, aves migratórias, codorniz, pato, gansos, aves domésticas, galinha, suino, ovelhas, equino, cavalo, camelo, canino, cães, felino, gatos, tigre, leopardo, civeta, marta, fuinha, furões, animais de estimação, gado, coelhos, ratos, ratazanas, porquinhos-da-índia ou outro roedores, foca, baleia e semelhantes. Tais organismo alvos são ilustrativos e não são para serem considerados limitativos para as aplicações e utilizações da presente invenção. 81
Considera-se que uma planta compreendendo a proteína de interesse ou que expressa a VLP compreendendo a proteína de interesse pode ser administrada a um indivíduo ou organismo alvo de uma variedade de maneiras dependendo da necessidade e da situação. Por exemplo, a proteína de interesse obtida a partir da planta pode ser extraída antes da sua utilização quer numa forma em bruto, parcialmente purificada ou purificada. Se a proteína é para ser purificada, então ela pode ser produzida em plantas comestíveis ou não comestíveis. Além disso, se a proteína é administrada por via oral, o tecido vegetal pode ser colhido e dado diretamente ao indivíduo, ou o tecido colhido pode ser seco antes de ser dado como alimento, ou pode permitir-se que um animal paste sobre a planta sem que ocorra qualquer colheita prévia. É também considerado no âmbito desta invenção que os tecidos vegetais colhidos sejam proporcionados como um suplemento alimentar em alimentos compostos para animais. Se o tecido vegetal for dado a um animal com pouco ou nenhum processamento adicional, prefere-se que o tecido vegetal a ser administrado seja comestível. 0 silenciamento de genes pós-transcrição (PTGS) pode estar envolvido na limitação da expressão de transgenes nas plantas e pode ser utilizada a co-expressão de um supressor de silenciamento do vírus Y da batata (HcPro) para neutralizar a degradação específica de ARNms de transgenes (Brigneti et al., 1998). Supressores de silenciamento alternativos são bem conhecidos na técnica e podem ser utilizados como aqui descrito (Chiba et al., 2006, Virology 346:7-14), por exemplo mas não se limitando a, TEV-pl/HC-Pro (vírus da gravura do Tabaco-pl/HC-Pro), BYV-p21, pl9 do vírus do raquitismo do Tomate (TBSV pl9), proteína do capsídeo do vírus do enrugamento do Tomate (TCV -CP), 2b do vírus do mosaico do Pepino; CMV-2b) , p25 do vírus X da 82
Batata (PVX-p25), pll do vírus M da Batata (PVM-pll), pll do vírus S da Batata (PVS-pll), pl6 do vírus da queimadura do Mirtilo, (BScV-pl6), p23 do vírus tristexa dos Citrinos (CTV-p23), p24 do vírus-2 associado ao enrolamento foliar da videira, (GLRaV-2 p24), plO do vírus A da Videira, (GVA-plO), pl4 do vírus B da Videira (GVB-pl4), plO do vírus latente de Heracleum (HLV-plO) ou pl6 do vírus latente comum do Alho (GCLV-pl6). Por conseguinte, um supressor de silenciamento, por exemplo, mas não se limitando a, HcPro, TEV-pl/HC-Pro, BYV-p21, TBSV pl9, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-pll, PVS-pll, BScV-pl6, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-pl4, HLV-plO, GCLV-pl6 ou GVA-plO, pode ser co-expressado juntamente com a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de interesse para garantir ainda mais níveis altos de produção de proteína numa planta.
Além disso, podem ser produzidas VLPs que compreendem uma associação de subtipos de HA. Por exemplo, as VLPs podem compreender uma ou mais do que uma HA do subtipo Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15, H16 ou uma associação dos mesmos. A seleção da associação de HAs pode ser determinada pela utilização pretendida da vacina preparada a partir da VLP. Por exemplo, uma vacina para ser utilizada na inoculação de aves pode compreender qualquer associação de subtipos de HA, enquanto as VLPs úteis para inocular humanos podem compreender subtipos de um ou mais do que um dos subtipos Hl, H2, H3, H5. No entanto podem ser preparadas outras associações de subtipos de HA dependendo da utilização da VLP. A fim de produzir as VLPs compreendendo associações de subtipos de HA, o subtipo desejado de HA pode ser co-expressado dentro da mesma célula vegetal.
Além disso, as VLPs produzidas como descrito aqui não compreendem neuraminidase (NA) . No entanto, a NA pode ser 83 co-expressada com a HA caso se desejem VLPs compreendendo HA e NA.
Por conseguinte, a presente invenção inclui ainda um vetor adequado compreendendo a construção quimérica adequada para ser utilizada com sistemas de expressão estáveis ou transitórios. A informação genética pode ser também proporcionada em uma ou mais do que uma construção. Por exemplo, uma sequência de nucleótidos que codifica uma proteina de interesse pode ser introduzida numa construção e uma segunda sequência de nucleótidos que codifica uma proteina que modifica a glicosilação da proteina de interesse pode ser introduzida utilizando uma construção separada. Estas sequências de nucleótidos podem ser depois co-expressadas numa planta. No entanto, também pode ser utilizada uma construção compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica tanto a proteina de interesse como a proteina que modifica o perfil de glicosilação da proteina de interesse. Neste caso a sequência de nucleótidos compreenderia uma primeira sequência compreendendo uma primeira sequência de ácido nucleico que codifica a proteina de interesse operacionalmente ligada a uma região promotora ou reguladora, e uma segunda sequência compreendendo uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica a proteina que modifica o perfil de glicosilação da proteina de interesse, a segunda sequência operacionalmente ligada a uma região promotora ou reguladora.
Por "co-expressada" entende-se que duas, ou mais do que duas, sequências de nucleótidos são expressadas aproximadamente na mesma altura na planta e no mesmo tecido da planta. No entanto, as sequências de nucleótidos não têm de ser expressadas exatamente ao mesmo tempo. Mais propriamente, as duas ou mais sequências de nucleótidos são 84 expressadas de uma maneira de forma a que os produtos codificados têm a possibilidade de interagir. Por exemplo, a proteína que modifica a glicosilação da proteína de interesse pode ser expressada antes ou durante o período em que a proteína de interesse é expressada de maneira a que ocorra a modificação da glicosilação da proteína de interesse. As duas ou mais do que duas sequências de nucleótidos podem ser co-expressadas utilizando um sistema de expressão transitório, em que as duas ou mais sequências são introduzidas na planta aproximadamente na mesma altura sob condições em que ambas as sequências são expressadas. Alternativamente, uma planta plataforma compreendendo uma das sequências de nucleótidos, por exemplo a sequência que codifica a proteína que modifica o perfil de glicosilação da proteína de interesse, pode ser transformada, quer transitoriamente ou de um modo estável, com uma sequência adicional que codifica a proteína de interesse. Neste caso, a sequência que codifica a proteína que modifica o perfil de glicosilação da proteína de interesse pode ser expressada dentro de um tecido desejado, durante uma fase desejado do desenvolvimento, ou a sua expressão pode ser induzida utilizando um promotor indutível e a sequência adicional que codifica a proteína de interesse pode ser expressada sob condições semelhantes e no mesmo tecido, para assegurar que as sequências de nucleótidos são co-expressadas .
As construções podem ser introduzidas em células vegetais utilizando plasmídeos Ti, plasmídeos Ri, vetores de vírus de plantas, transformação direta de ADN, micro-injeção, eletroporação, etc. Para uma revisão de tais técnicas ver, por exemplo, Weissbach e Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421-463 (1988); Geierson e Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed. (1988); e Miki e Iyer, Fundamentais of Gene Transfer in 85
Plants. In Plant Metabolism, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. London, pp. 561-579 (1997) . Outros métodos incluem a captação direta de ADN, a utilização de lipossomas, eletroporação, por exemplo utilizando protoplastos, micro-injeção, microprojéteis ou filamentos, e infiltração a vácuo. Ver, por exemplo, Bilang, et al. (Gene 100: 247-250 (1991), Scheid et al. (Mol. Gen. Genet. 228: 104-112, 1991), Guerche et al. (Plant Science 52: 111-116, 1987), Neuhause et al. (Theor. Appl Genet. 75: 30-36, 1987), Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987); Howell et al. (Science 208: 1265, 1980), Horsch et al. (Science 227: 1229-1231, 1985), DeBlock et al., Plant Physiology 91: 694-701, 1989), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach e Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler e Zielinski, eds., Academic
Press Inc., 1989). Liu e Lomonossoff (J. Virol Meth, 105:343-348, 2002,), Pat. U.S. n° 4,945, 050; 5,036,006; e 5,100,792, Pedidos de Patente U.S. n° de série 08/438,666, apresentado em 10 de Maio de 1995 , e 07/951,715, apresentado em 25 de Setembro de 1992.
Podem ser utilizados métodos de expressão transitória para expressar as construções utilizadas nos métodos da presente invenção (ver Liu e Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348). Alternativamente, pode ser utilizado um método de expressão transitória baseado em vácuo, como descrito por Kapila et al. 1997. Estes métodos podem incluir, por exemplo, mas não se limitam a, um método de Agro-inoculação ou Agro-infiltração, contudo, também podem ser utilizados outros métodos transitórios como assinalados acima. Com Agro-inoculação ou Agro-infiltração, uma mistura de Agrobacteria compreendendo o ácido nucleico desejado entram nos espaços intercelulares de um tecido, por exemplo as folhas, porção aérea da planta (incluindo 86 caule, folhas e flor) , outra porção da planta (caule, raiz, flor) ou a planta inteira. Depois de atravessar a epiderme a Agrobacterium infeta e transfere cópias de ADN-t para as células. 0 ADN-t é descrito epissomicamente e o ARNm traduzido, levando à produção da proteína de interesse nas células infetadas, contudo, a passagem do ADN-t para dentro do núcleo é transitória.
Se a sequência de nucleótidos de interesse codifica um produto que é direta ou indiretamente tóxico para a planta, então ao utilizar o método da presente invenção, essa toxicidade pode ser reduzida na planta expressando seletivamente a sequência de nucleótidos de interesse num tecido desejado ou numa fase desejada do desenvolvimento da planta. Além disso, o período de expressão limitado resultante da expressão transitória pode reduzir o efeito quando se produz um produto tóxico na planta. Pode ser utilizado um promotor indutível, um promotor específico de tecido ou um promotor específico de células, para expressão direta seletiva da sequência de interesse.
As VLPs de HA recombinantes produzidas de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas em conjunto com vacinas existentes contra a gripe, para suplementar as vacinas, torná-las mais eficazes e para reduzir as dosagens de administração necessárias. Como seria conhecido para um especialista na técnica, a vacina pode ser dirigida contra um ou mais do que um vírus da gripe. Os exemplos de vacinas adequadas incluem, mas não se limitam àquelas comercialmente disponíveis de Sanofi-Pasteur, ID Biomedical, Merial, Sinovac, Chiron, Roche, Medlmmune, GlaxoSmithKline, Novartis, Sanofi-Aventis, Serono, Shire Pharmaceuticals e semelhantes. 87
Se desejado, as VLPs produzidas de acordo com a presente invenção podem ser misturadas com um adjuvante adequado como seria conhecido para um especialista na técnica. Além disso, a VLP pode ser utilizada numa composição de vacina compreendendo uma dose eficaz da VLP para o tratamento de um organismo alvo, como definido acima. Além disso, a VLP produzida de acordo com a presente invenção pode ser combinada com VLPs obtidas utilizando diferentes proteínas da gripe, por exemplo, neuraminidase (NA).
Por conseguinte, a presente invenção proporciona VLPs e composições da invenção para induzir imunidade à infeção pelo vírus da gripe num animal ou organismo alvo compreendendo administrar uma dose eficaz de uma vacina compreendendo uma ou mais do que uma VLP. A vacina pode ser administrada por via oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa ou subcutânea. A administração de VLPs produzidas de acordo com a presente invenção é descrita no Exemplo 6. A administração de VLP de H5 feita em plantas resultou numa resposta significativamente mais alta em comparação com a administração de HA solúvel (ver Figuras 21A e 21B).
Como se mostra nas Figuras 26A e 26B, um indivíduo administrado com VLPs de H5 de A/Indonésia/5/05 proporcionou proteção cruzada a um desafio com gripe A/Turquia/582/06 (H5N1; "H5N1 da Turquia"). A administração de VLPs de H5 de Indonésia antes do desafio não resultou em qualquer perda de massa corporal. No entanto, os indivíduos que não foram administrados com VLPs de H5, mas foram sujeitos a desafio com H5N1 da Turquia, exibiram perda significativa de massa corporal, e vários indivíduos morreram.
Por conseguinte, estes dados demonstram que as VLPs da gripe feitas em plantas compreendendo a proteina virai hemaglutinina H5 induzem uma resposta imunológica especifica para estirpes de gripe patogénicas e que as particulas semelhantes a virus podem germinar a partir da membrana do plasma da planta.
Por conseguinte, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo uma dose eficaz de uma VLP produzida de acordo com a invenção compreendendo uma proteina HA do virus da gripe, um ou mais do que um lipido vegetal, e um veiculo farmaceuticamente aceitável. A proteina HA do virus da gripe pode ser H5 Indonésia/5/2006. É também proporcionada uma VLP ou composição para ser utilizada na indução de imunidade a uma infeção pelo virus da gripe num indivíduo. Compreendendo a utilização, a administração da partícula semelhante a vírus compreendendo uma proteína HA do vírus da gripe, um ou mais do que um lípidos vegetais, e um veículo farmaceuticamente aceitável. A partícula semelhante a vírus pode ser administrada a um indivíduo por via oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa ou subcutânea.
As composições de acordo com várias formas de realização da invenção podem compreender VLPs de duas ou mais estirpes ou subtipos de gripe. "Duas ou mais" refere-se a duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, 10 ou mais estirpes ou subtipos. As estirpes ou subtipos representados podem ser de um único subtipo (por exemplo todos H1N1 ou todos H5N1) ou podem ser uma associação de subtipos. Os subtipos e estirpes ilustrativos incluem, mas não se limitam àqueles aqui divulgados (por exemplo A/Nova Caledónia/20/99 (H1N1), A/Indonésia/5/2006 (H5N1), A/galinha/Nova Iorque/1995, A/gaivota prateada/DE/677/88 (H2N8), A/Texas/32/2003, A/pato-selvagem/MN/33/00, A/pato/Xangai/1/2000, A/arrabio 89 do norte/TX/828189/02, A/Peru/Ontário/6118/68 (H8N4), A/pato-trombeteiro/Irão/G54/03, A/galinha/Alemanha/N/194 9 (H10N7), A/pato/Inglaterra/56 (H11N6), A/pato/Alberta/60/76 (H12N5), A/Gaivota/Maryland/704/77 (H13N6), A/Pato-selvagem/Gurjev/263/82, A/pato/Austrália/341/83 (H15N8), A/guincho-comum/Suécia/5/99 (H16N3), B/Lee/40, C/Joanesburgo/66, A/Porto Rico/8/34 (H1N1), A/Brisbânia/59/2007 (H1N1), A/Ilhas Salomão 3/2006 (H1N1), A/Brisbânia 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), B/Malásia/2506/2004, B/Flórida/4/2006, A/Singapura/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietname/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Equina/Praga/56 (H7N7), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)). A escolha da associação de estirpes e subtipos pode depender da área geográfica dos indivíduos suscetíveis de serem expostos à gripe, proximidade da espécie animal a uma população humana a ser imunizada (por exemplo espécie de ave aquática, animais agrícolas tais como suíno, etc) e as estirpes de que são portadores, a que estão expostos ou a que estão suscetíveis de serem expostos, previsões do desvio antigénico dentro de subtipos ou estirpes, ou associações destes fatores. Encontram-se disponíveis exemplos de associações utilizadas nos últimos anos (ver URL: who.int/csr/disease/influenza/vaccine recommendationsl/en). Algumas ou todas estas estirpes podem ser utilizadas nas associações mostradas, ou noutras associações, na produção de uma composição de vacina.
Mais particularmente, as associações ilustrativas podem incluir VLPs de duas ou mais estirpes ou subtipos selecionadas do grupo compreendendo: A/Brisbânia/59/2007 (H1N1), um vírus semelhante a A/Brisbânia/59/2007 (H1N1), A/Brisbânia/10/2007 (H3N2), um vírus semelhante a 90 A/Brisbânia/10/2007 (H3N2), B/Flórida/4/2006 ou um vírus semelhante a B/Flórida/4/2006.
Outra associação ilustrativa pode incluir VLPs de duas ou mais estirpes ou subtipos selecionadas do grupo compreendendo A/Indonésia/5/2005, um vírus semelhante a A/Indonésia/5/2005, A/Vietname/1194/2004, um vírus semelhante a A/Vietname/1194/2004, A/Anhui/1/05, um vírus semelhante a A/Anhui/1/05, A/ganso/Guiyang/337/2006, vírus semelhante a A/ganso/Guiyang/337/2006, A/galinha/Shanxi/2/2006 ou vírus semelhante a A/galinha/Shanxi/2/200 6.
Outra associação ilustrativa pode incluir VLPs das estirpes A/Galinha/ltália/13474/99 (H7 tipo) ou A/Galinha/Colúmbia Britânica/04 (H7N3) da gripe.
Outra associação ilustrativa pode incluir VLPs de A/Galinha/Hong Kong/G9/97 ou A/Hong Kong/1073/99. Outra associação ilustrativa pode compreender VLPs de A/Ilhas Salomão/3/2006. Outra associação ilustrativa pode compreender VLPs de A/Brisbânia/10/2007. Outra associação ilustrativa pode compreender VLPs de A/Wisconsin/67/2005. Outra associação ilustrativa pode compreender VLPs das estirpes ou subtipos B/Malásia/2506/2004, B/Flórida/4/2006 ou B/Brisbânia/3/2007.
As duas ou mais VLPs podem ser expressadas individualmente, e as VLPs purificadas ou semi-purificadas subsequentemente combinadas. Alternativamente, as VLPs podem ser co-expressadas no mesmo hospedeiro, por exemplo uma planta. As VLPs podem ser combinadas ou produzidas numa proporção desejada, por exemplo em proporções aproximadamente equivalentes, ou podem ser combinadas de uma maneira em que 91 um subtipo ou estirpe compreende a maioria das VLPs na composição.
Por conseguinte, a invenção proporciona composições compreendendo VLPs de duas ou mais estirpes ou subtipos, produzidas de acordo com os métodos da invenção.
As VLPs de virus com envelope adquirem geralmente o seu envelope a partir da membrana através da qual elas germinam. As membranas do plasma da planta têm um complemento de fitosterol que pode ter efeitos imunoestimuladores. Para investigar esta possibilidade, as VLPs de H5 feitas em plantas foram administradas a animais na presença ou ausência de um adjuvante e determinada a HAI (resposta de anticorpos de inibição da hemaglutinação) (Figuras 22A, 22B). Na ausência de um adjuvante adicionado, as VLPs de H5 feitas em plantas demonstram uma HAI significativa, indicativa de uma resposta imunológica sistémica à administração do antigénio. Além disso, os perfis de isotipo de anticorpos das VLPs administradas na presença ou ausência de adjuvante são semelhantes (Figura 23A) . 0 Quadro 5 lista sequências proporcionadas em várias formas de realização da invenção.
Quadro 5: Descrição da sequência para identificadores de sequência. SEQ ID No Descrição da Sequência Na Divulgação 1 fragmento Hl N-terminal Figura 5a 2 fragmento Hl C-terminal Figura 5b 3 sequência de codificação de H5 Figura 6 4 iniciador Plato-443c Figura 7a 92 SEQ ID No Descrição da Sequência Na Divulgação 5 iniciador SpHA(Ind)-Plasto.r Figura 7b 6 iniciador Plasto-SpHA(Ind).c Figura 7c 7 iniciador HA(Ind)-Sac.r Figura 7d 8 Sequência da cassete de expressão baseada em plastocianina de luzerna utilizada para a expressão de Hl Figura 1 9 sequência do péptido HA1 (A/Nova Caledónia/20/99) Figura 8a 10 sequência do péptido HA5 (A/Indonésia/5/2006) Figura 8b 11 Sequência de codificação do Subtipo H7 da Gripe A (A/galinha/Nova Iorque/1995) Figura 9 12 Sequência de codificação do Subtipo H2 da Gripe A (A/gaivota prateada/DE/677/88 (H2N8)) Figura 10a 13 Sequência de codificação do Subtipo H3 da Gripe A (A/Texas/32/2003) Figura 10b 14 Sequência de codificação do Subtipo H4 da Gripe A (A/pato-selvagem/MN/33/00) Figura 10c 15 Sequência de codificação do Subtipo H5 da Gripe A (A/pato/Xangai/1/2000) Figura lOd 16 Sequência de codificação do Subtipo H6 da Gripe A (A/arrabio do norte/TX/828189/02) Figura lOe 17 Sequência de codificação do Subtipo H8 da Gripe A (A/Peru/Ontário/6118/68(H8N4)) Figura lOf 18 Sequência de codificação do Subtipo H9 da Gripe A (A/pato-trombeteiro/lrão/G54/03) Figura lOg 19 Sequência de codificação do Subtipo H10 da Gripe A (A/galinha/Alemanha/N/1949(H10N 7)) Figura lOh 93 SEQ ID No Descrição da Sequência Na Divulgação 20 Sequência de codificação do Subtipo Hll da Gripe A (A/pato/Inglaterra/56(H11N6)) Figura lOi 21 Sequência de codificação do Subtipo H12 da Gripe A (A/pato/Alberta/60/76(H12N5)) Figura lOj 22 Sequência de codificação do Subtipo H13 da Gripe A (A/Gaivota/Maryland/704/77(H13N6) ) Figura lOk 23 Sequência de codificação do Subtipo H14 da Gripe A (A/Pato-selvagem/Gurj ev/263/82) Figura 101 24 Sequência de codificação do Subtipo H15 da Gripe A (A/pato/Austrália/341/83 (H15N8)) Figura lOm 25 Sequência de codificação do Subtipo H16 da Gripe A (A/guincho-comum/Suécia/5/99 (H16N3)) Figura 10η 26 Sequência de codificação da HA da Gripe B (B/Lee/40) Figura 10o 27 Sequência de codificação da HA da Gripe C (C/Joanesburgo/66) Figura lOp 28 Sequência completa de Hl de HAO Figura 5c 29 Iniciador Xmal-pPlas.c Figura lOq 30 Iniciador SacI-ATG-pPlas.r Figura lOr 31 Iniciador SacI-PlasTer.c Figura lOs 32 Iniciador EcoRI-PlasTer.r Figura lOt 33 A/Nova Caledónia/20/99 (H1N1) N° de Acesso do GenBank AY289929 Figura 16 34 Isomerase de dissulfureto de proteina de M. Sativa N° de Acesso do GenBank Z11499 Figura 17 35 A/.Porto Rico/8/34 (H1N1) N° de Acesso do GenBank NC_002016,1 Figura 18 94 SEQ ID No Descrição da Sequência Na Divulgação 36 Clone 774: ADN desde DralII até Saci compreendendo a região reguladora de plastocianina operacionalmente ligada à sequência de codificação de HA de A/Brisbânia/59/2007 (H1N1) Figura 28 37 Clone 775: ADN desde DralII até Saci compreendendo a região reguladora de plastocianina operacionalmente ligada à sequência de codificação de HA de A/Ilhas Salomão 3/2006 (H1N1) Figura 29 38 Clone 776: ADN desde DralII até Saci compreendendo a região reguladora de plastocianina operacionalmente ligada à sequência de codificação de HA de A/Brisbânia 10/2007 (H3N2) Figura 30 39 Clone 777: ADN desde DralII até Saci compreendendo a região reguladora de plastocianina operacionalmente ligada à sequência de codificação de HA de A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) Figura 31 40 Clone 778: ADN desde DralII até Saci compreendendo a região reguladora de plastocianina operacionalmente ligada à sequência de codificação de HA de B/Malásia/2506/2004 Figura 32 41 Clone 779: ADN desde DralII até Saci compreendendo a região reguladora de plastocianina operacionalmente ligada à sequência de codificação de HA de B/Flórida/4/2006 Figura 33 95
SEQ ID No Descrição da Sequência Na Divulgação 42 Clone 780: ADN desde DralII até Saci compreendendo a região reguladora de plastocianina operacionalmente ligado à sequência de codificação de HA de A/Singapura/1/57 (H2N2) Figura 34 43 Clone 781: ADN desde DralII até Saci compreendendo a região reguladora de plastocianina operacionalmente ligada à sequência de codificação de HA de A/Anhui/1/2005 (H5N1) Figura 35 44 Clone 782: ADN desde DralII até Saci compreendendo a região reguladora de plastocianina operacionalmente ligada à sequência de codificação de HA de A/Vietname/1194/2004 (H5N1) Figura 36 45 Clone 783: ADN desde DralII até Saci compreendendo a região reguladora de plastocianina operacionalmente ligada à sequência de codificação de HA de A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) Figura 37 46 Clone 784: ADN desde DralII até Saci compreendendo a região reguladora de plastocianina operacionalmente ligada à sequência de codificação de HA de A/Equina/Praga/56 (H7N7) Figura 38 47 Clone 785: ADN desde DralII até Saci compreendendo a região reguladora de plastocianina operacionalmente ligada à sequência de codificação de HA de A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) Figura 39 48 Clone 774 Sequência de aminoácidos de HA de A/Brisbânia/59/2007 (H1N1) Figura 40A 96 SEQ ID No Descrição da Sequência Na Divulgação 49 Clone 775 Sequência de aminoácidos de HA de A/Ilhas Salomão 3/2006 (H1N1) Figura 40B 50 Clone 776 Sequência de aminoácidos de HA de A/Brisbânia 10/2007 (H3N2) Figura 41A 51 Clone 777 Sequência de aminoácidos de HA de A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) Figura 41B 52 Clone 778 Sequência de aminoácidos de HA de B/Malásia/2506/2004 Figura 42A 53 Clone 779 Sequência de aminoácidos de HA de B/Flórida/4/2006 Figura 42B 54 Clone 780 Sequência de aminoácidos de HA de A/Singapura/1/57 (H2N2) Figura 43A 55 Clone 781 Sequência de aminoácidos de HA de A/Anhui/1/2005 (H5N1) Figura 43B 56 Clone 782 Sequência de aminoácidos de HA de A/Vietname/1194/2004 (H5N1) Figura 44A 57 Clone 783 Sequência de aminoácidos de HA de A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) Figura 44B 58 Clone 784 Sequência de aminoácidos de HA de A/Equina/Praga/56 (H7N7) Figura 45A 59 Clone 785 Sequência de aminoácidos de HA de A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) Figura 45B 60 Cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da H5 de A/Indonésia/5/2005 (Construção # 660), UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação Figura 51 97 SEQ ID No Descrição da Sequência Na Divulgação 61 Cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da Hl de A/Nova Caledónia/20/1999 (Construção # 540) , UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação Figura 52 62 Cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da Hl de A/Brisbânia/59/2007 (construção #774), UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação Figura 53 63 Cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da Hl de A/Ilhas Salomão/3/2006 (H1N1) (construção #775), UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação Figura 54 64 Cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da H2 de A/Singapura/1/57 (H2N2) (construção # 780), UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação Figura 55 98 SEQ ID No Descrição da Sequência Na Divulgação 65 Cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da H5 de A/Anhui/1/2005 (H5N1) (Construção# 781), UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação Figura 56 66 Cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da H5 de A/Vietname/1194/2004 (H5N1) (Construção # 782), UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação Figura 57 67 Cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da H6 de A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) (Construção # 783), UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação Figura 58 68 Cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da H9 de A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (Construção # 785) , UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação Figura 59 99 SEQ ID No Descrição da Sequência Na Divulgação 69 Cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da H3 de A/Brisbânia/10/2007 (H3N2), UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação Figura 60 70 Cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da H3 de A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação Figura 61 71 Cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da H7 de A/Equina/Praga/56 (H7N7), UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação Figura 62 72 Cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da HA de B/Malásia/2506/2004, UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação Figura 63 previsão 100 SEQ ID NO Descrição da Sequência Na Divulgação 73 Cassete de expressão de HA compreendendo o promotor e UTR 5' de plastocianina de luzerna, sequência de codificação de hemaglutinina da HA de B/Flórida/4/2006, UTR 3' de plastocianina de luzerna e sequências de terminação Figura 64 74 Consensos de SEQ ID NO: 49, 48, 33 e 9 Figura 65 75 Sequência de aminoácidos de Hl de Nova Caledónia (AAP34324.1) codificada pela SEQ ID NO: 33 Figura 67 76 Sequência de aminoácidos de Hl de Porto Rico (NC 0409878.1) codificada pela SEQ ID NO: 35 Figuras 68 A invenção será agora descrita em pormenor por meio de referência apenas aos seguintes exemplos não limitativos. Métodos e Materiais 1. Montagem de cassetes de expressão
Todas as manipulações foram feitas utilizando os protocolos gerais de biologia molecular de Sambrook e Russell (2001). O primeiro passo de clonagem consistiu na montagem de um plasmideo de recetor contendo a montante e a jusante elementos reguladores do gene de plastocianina de luzerna. As sequências do promotor e UTR 5' de plastocianina foram amplificadas a partir de ADN genómico de luzerna utilizando iniciadores oligonucleotidicos Xmal-pPlas.c (SEQ ID NO: 29; Figura 10Q) e SacI-ATG-pPlas.r (SEQ ID NO: 30; Figura 10R). O produto de amplificação resultante foi digerido com Xmal e Saci e ligado com pCAMBIA2300 (Cambia, Canberra, 101
Austrália), previamente digerido com as mesmas enzimas, para criar pCAMBIApromo Plasto. Analogamente, as sequências 3'UTR e o finalizador do gene da plastocianina foram amplificados a partir de ADN genómico de luzerna utilizando os seguintes iniciadores: Saci-PiasTer.c (SEQ ID NO: 31; Figura 10S) e EcoRI-PlasTer.r (SEQ ID NO: 32; Figura 10T), e o produto foi digerido com Saci e EcoRI antes de ser inserido nos mesmos sitios de pCAMBIApromo-Plasto para gerar pCAMBIAPlasto. A grelha de leitura aberta do gene de Hl da estirpe da gripe A/Nova Caledónia/20/99 (H1N1) foi sintetizada em dois fragmentos (Plant Biotechnology Institute, National Research Council, Saskatoon, Canadá). Um primeiro fragmento sintetizado corresponde à sequência de codificação da Hl de tipo selvagem (N° acesso do GenBank AY289929; SEQ ID NO: 33; Figura 16) que carece da sequência de codificação do péptido sinal na extremidade 5' e da sequência de codificação do dominio transmembranar na extremidade 3'. Foi adicionado um sitio de restrição BglII na extremidade 5' da sequência de codificação e foi adicionado um sitio duplo SacI/StuI imediatamente a jusante do codão de paragem na extremidade 3'-terminal do fragmento para produzir a SEQ ID NO: 1 (Figura 5A) . Foi também sintetizado um segundo fragmento que codifica a extremidade C-terminal da proteína Hl (compreendendo um domínio transmembranar e cauda citoplasmática) desde o sítio Kpnl até ao codão de paragem, e flanqueado em 3' pelos sítios de restrição Saci e StuI (SEQ ID NO. 2; Figura 5B). O primeiro fragmento de Hl foi digerido com BglII e Saci e clonado nos mesmos sítios de um vetor binário (pCAMBIAPlasto) contendo o promotor e UTR 5' de plastocianina fundido com o gene do péptido sinal da 102 isomerase de dissulfureto de proteína de luzerna (PDI) (nucleótidos 32-103; N° de Acesso Z11499; SEQ ID NO: 34; Figura 17) resultando num gene quimérico PDI-H1 a jusante dos elementos reguladores de plastocianina. A sequência da cassete baseada em plastocianina contendo o péptido sinal da PDI é apresentada na Figura 1 (SEQ ID NO:8). O plasmídeo resultante continha a região de codificação de Hl fundida com o péptido sinal da PDI e flanqueada pelos elementos reguladores de plastocianina. A adição da região de codificação da extremidade C-terminal (que codifica o domínio transmembranar e a cauda citoplasmática) foi obtida inserindo o fragmento sintetizado (SEQ ID NO: 2; Figura 5B) previamente digerido com Kpnl e Saci, no plasmídeo de expressão de Hl. O plasmídeo resultante, designado 540, é apresentado na Figura 11 (ver também Figura 2A). 2. Montagem da cassete de expressão de H5
Um fragmento que codifica a hemaglutinina da estirpe da gripe A/Indonésia/5/05 (H5N1; N° Acesso LANL ISDN125873) foi sintetizado pelo Epoch Biolabs (Sugar Land, TX, EUA). O fragmento produzido, contendo a região de codificação de H5 completa incluindo o péptido sinal nativo flanqueado por um sitio Hindlll imediatamente a montante do ATG inicial e um sitio Saci imediatamente a jusante do codão de paragem (TAA) , é apresentado na SEQ ID NO: 3 (Figura 6) . A região de codificação de H5 foi clonada numa cassete de expressão baseada em plastocianina pelo método de ligação baseado em PCR apresentado em Darveau et al. (1995). Resumidamente foi obtida uma primeira amplificação de PCR utilizando iniciadores Plato-443c (SEQ ID NO: 4; Figura 7A) e SpHA(Ind)-Plasto.r (SEQ ID NO:5; Figura 7B) e pCAMBIA promoPlasto como cadeia molde. Em paralelo foi realizada uma segunda amplificação com iniciadores Plasto-SpHA(Ind).c (SEQ ID NO: 6; Figura 7C) e HA (Ind)-Sac. r (SEQ ID NO:7; 103
Figura 7D) com fragmento de codificação de H5 como cadeia molde. As amplificações obtidas de ambas as reações foram misturadas em conjunto e a mistura serviu como cadeia molde para uma terceira reação (reação de associação) utilizando Plato-443c (SEQ ID NO: 4; Figura 7A) e HA (Ind)-Sac. r (SEQ ID NO: 7; Figura 7D) como iniciadores. O fragmento resultante foi digerido com BamHI (no promotor de plastocianina) e Saci (na extremidade 3' do fragmento) e clonado em pCAMBIAPlasto previamente digerido com as mesmas enzimas. O plasmideo resultante, designado 660, é apresentado na figura 2B (ver também Figura 11). A cassete que codifica a forma solúvel de Hl foi preparada substituindo a região que codifica o domínio transmembranar e a cauda citoplasmática em 540 por um fragmento que codifica a variante do fecho de leucina GCN4 pll (Harbury et al, 1993, Science 1993; 262: 1401-1407). Este fragmento foi sintetizado com sitios flanqueadores Kpnl e Saci para facilitar a clonagem. O plasmideo resultante desta substituição foi designado 544 e a cassete de expressão é ilustrada na figura 11.
Foi sintetizada uma fusão entre a UTR 5' do vírus da gravura do tabaco (TEV) e o gene da grelha de leitura aberta da gripe A/PR/8/34 Ml (# Acesso NC_002016) com um sítio flanqueador Saci adicionado a jusante do codão de paragem. O fragmento foi digerido com SwaI (na UTR 5' do TEV) e Saci, e clonado numa cassete de expressão baseada em 2X35S/TEV num plasmideo binário pCAMBIA. O plasmideo resultante tinha a região de codificação de Ml sob o controlo de um promotor 2X35S/TEV e UTR 5' e o finalizador NOS (construção 750; figura 11).
Foi preparada uma construção HcPro (35HcPro) como descrita em Hamilton et al. (2002). Todos os clones foram 104
sequenciados para confirmar a integridade das construções. Os plasmideos foram utilizados para transformar Agrobacteium tumefaciens (AGL1; ATCC, Manassas, VA 20108, USA) por eletroporação (Mattanovich et al., 1989). A integridade de todas as estirpes de A. tumefaciens foram confirmadas por mapeamento de restrição. 3. Preparação de biomassa vegetal, inoculo, agroinfiltração e colheita
Foram cultivadas plantas Nicotiana benthamiana ou Nicotiana tabacum a partir de sementes em cestos cheios com um substrato de turfa comercial. As plantas foram deixadas crescer na estufa sob um fotoperiodo de 16/8 e um regime de temperatura de 25°C de dia/20°C de noite. Três semanas após a sementeira, as plântulas individuais foram apanhadas, transplantadas em vasos e deixadas crescer na estufa durante mais três semanas nas mesmas condições ambientais. Antes da transformação, os rebentos apicais e axilares foram removidos em várias alturas como indicado abaixo, cortando com a unha os rebentos da planta ou tratando quimicamente a planta.
Agrobacteria transfetadas com as construções 660, 540, 544, 750 ou 35SHcPro foram cultivadas num meio YEB suplementado com ácido 2-[N-morfolino]etanossulfónico (MES) 10 mM, acetosseringona 20 μΜ, 50 pg/mL de canamicina e 25 pg/mL de carbenicilina, pH 5,6 até atingirem uma OD60o entre 0,6 e 1,6. As suspensões de Agrobacterium foram centrifugadas antes da utilização e ressuspensas em meio de infiltração (MgCl2 10 mM e MES 10 mM, pH 5,6) . A infiltração com seringa foi realizada como descrito por Liu e Lomonossoff (2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348). Para infiltração a vácuo, suspensões de A. tumefaciens foram 105 centrifugadas, ressuspensas no meio de infiltração e conservadas de um dia para o outro a o o o dia de infiltração, os lotes de cultura foram diluídos em 2,5 volumes de cultura e deixados aquecer antes da utilização. As plantas inteiras de N. benthamiana ou N. Tabacum foram colocadas invertidas na suspensão bacteriana num tanque de aço inoxidável hermeticamente fechado sob um vácuo de 20-40 Torr durante 2 min. Após infiltração com seringa ou vácuo, as plantas foram retornadas à estufa durante um período de 4-5 dias de incubação até à colheita. 4. Amostragem de folhas e extração da proteína total
Após incubação, a parte aérea das plantas foi colhida, congelada a -80°C, triturada em pedaços. As proteínas solúveis totais foram extraídas homogeneizando (Polytron) cada amostra de material vegetal triturado congelado em 3 volumes de Tris 50 mM, pH 7,4, frio, NaCl 0,15 M e fluoreto de fenilmetanossulfonilo 1 mM. Após homogeneização, as suspensões espessas foram centrifugadas a 20 000 g durante 20 min a 4°C e estes extratos em bruto clarificados (sobrenadantes) mantidos para análise. O teor total de proteína dos extratos em bruto clarificados foi determinado pelo ensaio de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA) utilizando albumina de soro bovino como o padrão de referência. 5. Cromatografia de exclusão molecular do extrato proteico
Colunas de cromatografia de exclusão molecular (SEC) de 32 mL com esferas de alta resolução de Sephacryl™ S-500 (S- 500 HR : GE Healthcare, Uppsala, Suécia, N° de catálogo 17-0613-10) foram empacotadas e equilibradas com tampão de equilíbrio/eluição (Tris 50 mM, pH8, NaCl 150 mM) . Um mililitro e meio de extrato proteico em bruto foi carregado na coluna seguido de um passo de eluição com 45 mL de 106 tampão de equilíbrio/eluição. A eluição foi recolhida em frações de 1,5 mL, o teor relativo de proteína das frações eluídas foi seguido misturando 10 yL da fração com 200 pL de reagente corante de proteína Bio-Rad diluído (Bio-Rad, Hercules, CA) . A coluna foi lavada com 2 volumes de coluna de NaOH 0,2N, seguidos de 10 volumes de coluna de Tris 50 mM, pH8, NaCl 150 mM, 20% de etanol. Cada separação foi seguida de uma calibração da coluna com Dextrano Azul 2000 (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ, EUA). Os perfis de eluição do Dextrano Azul 2000 e das proteínas solúveis do hospedeiro foram comparadas entre cada separação para assegurar a uniformidade dos perfis de eluição entre as colunas utilizadas. 6. Análise da Proteína e Imunotransferência
As concentrações de proteína foram determinadas pelo ensaio de proteína BCA (Pierce Biochemicals, Rockport IL) . As proteínas foram separadas por SDS-PAGE sob condições de redução e reveladas com Azul de Coomassie. Os geles revelados foram examinados cuidadosamente e realizada análise de densitometria utilizando o Software ImageJ (NIH).
As proteínas da fração de eluição da SEC foram precipitadas com acetona (Bollag et al., 1996), ressuspensas em 1/5 de volume em tampão de equilíbrio/eluição e separadas por SDS-PAGE sob condições redutoras e eletrotransferidas para membranas de poli(difluoreto de vinileno) (PVDF) (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) para imunodeteção. Antes da imunotransferência, as membranas foram bloqueadas com 5% de leite desnatado e 0,1% de Tween-20 em soro fisiológico tamponado com Tris (TBS-T) durante 16-18h a 4°C. 107 A imunotransferência foi realizada por incubação com um anticorpo adequado (Quadro 6), em 2 pg/mL de 2% de leite desnatado em TBS-Tween 20 a 0,1%. Os anticorpos secundários utilizados para deteção por quimioluminescência foram como indicados no Quadro 4, diluídos como indicado em 2% de leite desnatado em TBS-Tween 20 a 0,1 %. Os complexos imunorreativos foram detetados por quimioluminescência utilizando luminol como o substrato (Roche Diagnostics Corporation). A conjugação de peroxidase de rábano silvestre-enzima do anticorpo de IgG humana foi realizada utilizando o kit de conjugação de Peroxidase Ativada EZ-Link Plus® (Pierce, Rockford, ILO) .
Quadro 6: Condições de eletroforese, anticorpos e diluições para a imunotransferência de proteínas expressadas.
Subtipo de HA Estirpe da gripe Condição de eletroforese Anticorpo primário Diluição Anticorpo secundário Diluição Hl A/Brisbânia/59/ 2007 (H1N1) Redutora FII 10-150 4 pg/mL Cabra anti-rato (JIR 115-035-146) 1:10 000 Hl A/Ilhas Salomão/3/2006 (H1N1) Redutora NIBSC 07/104 1:2000 Coelho anti-ovelha (JIR 313-035-045) 1:10 000 Hl A/Nova Caledónia/20/99 (H1N1) Redutora FII 10-150 4 pg/mL Cabra anti-rato (JIR 115-035-146) 1:10 000 H2 A/Singapura/1/57 (H2N2) Não redutora NIBSC 00/440 1:1000 Coelho anti-ovelha (JIR 313-035-045) 1:10 000 108
Subtipo de HA Estirpe da gripe Condição de eletroforese Anticorpo primário Diluição Anticorpo secundário Diluição H5 A/Indonésia/5/2 005 (H5N1) Redutora itc iT-003-005V 1:4000 Cabra anti-coelho (JIR 111-035-144) 1:10 000 H5 A/Anhui/1/2005 (H5N1) Redutora NIBSC 07/338 1:750 Coelho anti-ovelha (JIR 313-035-045) 1:10 000 H5 A/Vietname/1194/ 2004 (H5N1) Não redutora ITC IT-003-005 1:2000 Cabra anti-coelho (JIR 111-035-144) 1:10 000 H6 A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) Não redutora BEI NR 663 1:500 Coelho anti-ovelha (JIR 313-035-045) 1:10 000 H9 A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) Redutora NIBSC 07/146 1:1000 Coelho anti-ovelha (JIR 313-035-045) 1:10 000 FII: Fitzgerald Industries International, Concord, MA, EUA; NISBIC: National Institute for Biological Standards and Control; JIR: Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EUA; BEI NR: Biodefense and emerging infetions research resources repository; ITC: Immune Technology Corporation, Woodside, NY, EUA. O ensaio de hemaglutinação para H5 baseou-se num método descrito por Nayak. e Reichl (2004). Resumidamente, foram feitas diluições por desdobramentos sucessivos das amostras de ensaio (100 pL) em placas microtitulo de 96 poços de fundo em V contendo 100 pL de PBS, fornecendo 100 pL de amostra diluida por poço. A cada poço foram adicionados cem microlitros de uma suspensão de glóbulos vermelhos de peru a 0,25% (Bio Link Inc., Syracuse, NY) e as placas foram incubadas durante 2h à temperatura ambiente. O reciproco da 109 diluição mais alta que exibe hemaglutinação total foi registado como atividade de HA. Em paralelo, um padrão de HA recombinante (A/Vietname/1203/2004 H5N1) (Protein
Science Corporation, Meriden, CT) foi diluído em PBS e analisado como um controlo em cada placa. 7. Ultracentrifugação em gradiente de sacarose
Um mililitro das frações 9, 10 e 11 eluídas a partir da cromatografia de filtração em gel de biomassa contendo H5 foram misturados, introduzidos num gradiente descontínuo de densidade de sacarose a 20-60% (p/v) e centrifugados 17,5 h a 125 000 g (4°C). O gradiente foi fracionado em 19 frações de 3 mL a partir do cimo e submetido a diálise para remover a sacarose antes da análise imunológica e ensaios de hemaglutinação. 8 . Microscopia eletrónica
As frações de eluição da SEC a serem observadas por microscopia eletrónica (EM) foram primeiro concentradas utilizando unidades de ultrafiltração 30 MWCO (Millipore, Billerica, MA, EUA) . As frações concentradas foram fixadas em PBS pH 7,4 contendo 2% de glutaraldeído durante 24 h a 4°C. Uma vez fixadas as amostras foram adsorvidas sobre grelhas de níquel de malha 200 revestidas com Formvar (Canemco, Lakefield, Canadá) durante 2 min e as grelhas foram lavadas duas vezes com água desionizada antes de serem reveladas em ácido fosfotúngstico a 1%. A observação foi realizada sob microscopia eletrónica de transmissão a ampliações que vão desde 10 000X até 150 000X (para as imagens nas Figuras 4A e 4B).
Alternativamente, cem microlitros das amostras a serem examinadas foram colocados num tubo de ultracentrifugação 110
Airfuge (Beckman Instruments, Paio Alto, CA, EUA) . Foi colocada uma grelha no fundo do tubo, o qual foi então centrifugado 5 min a 120 000 g. A grelha foi retirada, seca suavemente e colocada numa gota de ácido fosfotúngstico a 3% a pH 6 para revelação. As grelhas foram examinadas num microscópio eletrónico de transmissão (TEM) Hitachi 7100 (para as imagens nas Figuras 14B, 15B e 15C).
Para as imagens na Figura 19, blocos de folhas com aproximadamente 1 mm3 foram fixados em PBS contendo 2,5% de glutaraldeido e lavados em PBS contendo 3% de sacarose antes de um passo de pós-fixação em tetróxido de ósmio a 1,33%. As amostras fixadas foram embutidas em resina de Spurr e foram depositadas camada ultrafinas numa grelha. As amostras foram positivamente reveladas com acetato de uranilo a 5% e citrato de chumbo a 0,2% antes da observação. As grelhas foram examinadas num microscópio eletrónico de transmissão (TEM) Hitachi 7100. 9. Análise de lípidos da membrana do plasma
Foram obtidas membranas do plasma (PM) a partir de folhas de tabaco e células BY2 cultivadas após fracionamento das células de acordo com Mongrand et al. por partição num sistema bifásico polimérico aquoso com polietileno glicol 3350/dextrano T-500 (6,6% de cada). Todos os passos foram realizados a 4 °C.
Os lipidos foram extraídos e purificados a partir das diferentes frações de acordo com Bligh e Dyer. Os lipidos polares e neutros foram separados por HP-TLC monodimensional utilizando os sistemas solventes descritos em Lefebvre et al.. Os lipidos das frações PM foram detetados após revelação com acetato de cobre como descrito por Macala et al. Os lipidos foram identificados por 111 comparação do seu tempo de migração com aqueles de padrões (todos os padrões foram obtidos de Sigma-Aldrich, St-Louis, MO, EUA, exceto para a SG, a qual foi obtida de Matreya, Pleasant Lacuna, PA, EUA). 10. Purificação da VLP de H5
Folhas infiltradas 660 congeladas de N. benthamiana foram homogeneizadas em 1,5 volumes de Tris 50 mM, pH 8, NaCl 150 mM e 0,04% de meta-bissulfito de sódio utilizando um misturador comercial. O extrato resultante foi suplementado com PMSF 1 mM e ajustado a pH 6 com ácido acético 1 M antes de ser aquecido a 42°C durante 5 min. Foi adicionada terra de diatomáceas (DE) ao extrato tratado termicamente para adsorver os contaminantes precipitados pela alteração de pH e tratamento térmico, e a suspensão espessa foi filtrada através de um papel de filtro Whatman. 0 extrato clarificado resultante foi centrifugado a 10 000 x g durante 10 minutos à TA para remover DE residual, feita passar através de filtros Acropack 20 de 0,8/0,2 ym e carregada numa coluna de afinidade de fetuina-agarose (Sigma-Aldrich, St-Louis, MO, EUA). Após um passo de lavagem em NaCl 400 mM, Tris 25 mM, pH 6, as proteínas ligadas foram eluidas com NaCl 1,5 M, MES 50 mM, pH 6. As VLPs eluidas foram suplementadas com Tween-80 a uma concentração final of 0,0005% (v/ v) . As VLPs foram concentradas numa membrana Amicon de 100 kDa MWCO, centrifugadas a 10 000 x g durante 30 minutos a <D O o ressuspensas em PBS pH 7,4 com 0,01% de Tween-80 e 0,01% de timerosal. As VLPs suspensas foram esterilizadas por filtração antes da utilização. 11. Estudos em animais 112
Ratos
Os estudos sobre a resposta imunológica à administração da VLP da gripe foram realizadas com ratos BALB/c fêmeas com 6-8 semanas de idade (Charles River Laboratories). Setenta ratos foram divididos aleatoriamente em catorze grupos de cinco animais. Oito grupos foram utilizados para imunização intramuscular e seis grupos foram utilizados para testar a via de administração intranasal. Todos os grupos foram imunizados num regime de duas doses, sendo a imunização de reforço efetuada 3 semanas após a primeira imunização.
Para administração intramuscular nas patas traseiras, ratos não anestesiados foram imunizados com a vacina de VLP de H5 feita em planta (0,1, 1, 5 ou 12 yg) , ou um antigénio de hemaglutinina (HA) de controlo. A HA de controlo compreendia hemaglutinina solúvel recombinante produzida com base na estirpe A/Indonésia/5/05 H5N1 e purificada de cultura de células 293 (Immune Technology Corp., Nova Iorque, EUA) (utilizada a 5 yg por injeção, salvo indicação em contrário). O controlo de tampão era PBS. Este antigénio consiste dos aminoácidos 18-530 da proteína HA e tem uma etiqueta de His e um sitio de dissociação modificado. A microscopia eletrónica confirmou que este produto comercial não está na forma de VLPs.
Para medir o efeito de adjuvante, dois grupos de animais foram imunizados com 5 yg de vacina de VLP de H5 feita em planta mais um volume de Alidrogel a 2% (alúmen, Accurate Chemical & Scientific Corporation, Westbury, NY, EUA) ou com 5 yg de hemaglutinina recombinante purificada de cultura de células 293 mais 1 volume de alúmen. Setenta ratos foram divididos aleatoriamente em catorze grupos de cinco animais. Oito grupos foram utilizados para imunização intramuscular e seis grupos foram utilizados para testar a 113 via de administração intranasal. Todos os grupos foram imunizados de acordo com um regime primário-reforço, sendo a imunização de reforço realizada 3 semanas após a primeira imunização.
Para administração intramuscular nas patas traseiras, ratos não anestesiados foram imunizados com a VLP de H5 feita em planta (0,1, 1, 5 ou 12 yg) , ou o antigénio de hemaglutinina (HA) de controlo (5 yg) ou PBS. Todas as preparações de antigénio foram misturadas com Alidrogel a 1% (alúmen, Accurate Chemical & Scientific Corporation, Westbury, NY, EUA) numa proporção em volume de 1:1 antes das imunizações. Para medir o efeito de adjuvante, dois grupos de animais foram imunizados com 5 yg de vacina de VLP de H5 feita em planta ou com 5 yg de antigénio de HA de controlo sem qualquer adjuvante.
Para administração intranasal, os ratos foram brevemente anestesiados por inalação de isoflurano utilizando uma câmara de indução automatizada. Eles foram em seguida imunizados por adição de gota de 4 yL/narina com a vacina de VLP feita em planta (0,1 ou 1 yg) , ou com antigénio de HA de controlo (1 yg) ou com PBS. Todas as preparações de antigénio foram misturadas com glutamato de quitosano a 1% (Protosan, Novamatrix/ FMC BioPolimer, Noruega) antes das imunizações. Os ratos em seguida respiraram nas soluções. A fim de verificar o efeito de adjuvante com a via de administração intranasal, dois grupos de animais foram imunizados com 1 yg de vacina de VLP de H5 feita em planta ou com 1 yg de antigénio de HA de controlo.
Furões
Foram utilizados dez grupos de 5 furões (machos, 18-24 semanas de idade, massa de aproximadamente 1 kg). O 114 tratamento para cada grupo é como descrito no Quadro 7. 0 adjuvante utilizado foi Alidrogel (alúmen) (Superfos Biosector, Dinamarca) a 2% (final=l%). A composição de vacina foi VLPs de A/Indonésia/5/05 (H5N1) associadas a membrana produzidas como descrito. 0 controlo de vacina (controlo positivo) foi uma H5 recombinante ligada a membrana completamente glicosilada da estirpe Indonésia produzida utilizando adenovirus em cultura de células 293 por Immune Technology Corporation (ITC).
Quadro 7. Grupos de tratamento
Grupo n Produto injetado nos animais Via de admini s tração Adjuvante 1 5 PBS (controlo negativo) i .m. * - 2 5 Vacina-planta, 1 pg i .m. - 3 5 Vacina-planta, 1 pg i .m. Alúmen 4 5 Vacina-planta, 5 pg i .m. - 5 5 Vacina-planta, 5 pg i .m. Alúmen 6 5 Vacina-planta, 7,5 pg i .m. - 7 5 Vacina-planta, 15 pg i .m. - 8 5 Vacina-planta, 15 pg i .m. Alúmen 9 5 Vacina-planta, 30 pg i .m. — 10 5 Vacina-controlo, 5 pg i .m. - *i.m.: intramuscular
Os furões foram avaliados regularmente quanto à saúde e aspeto gerais (peso corporal, temperatura retal, postura, pelo, padrões de movimento, respiração, excrementos) durante o estudo. Os animais foram imunizados por injeção intramuscular (0,5-1,0 de volume total) nos quadríceps nos dias 0, 14 e 28; para protocolos que incorporam adjuvante, a composição de vacina foi combinada com Alidrogel imediatamente antes da imunização numa proporção em volume 115 de 1:1) . Foram obtidas amostras de soro no dia 0 antes da imunização, e nos dias 21 e 35. Os animais foram sacrificados (exsanguinação/punção cardíaca) nos dias 40-45 e os baços foram recolhidos e realizada necropsia.
Os títulos de anticorpos anti-gripe podem ser quantificados em ensaios ELISA utilizando vírus H5N1 homólogos ou heterólogos inativados.
Os títulos de anticorpos inibidores de hemaglutinação das amostras de soro (pré-imunes, dia 21 e dia 35) foram avaliados por HAI microtítulo como descrito (Aymard et al 1973). Resumidamente, os soros foram pré-tratados com enzima destruidora de recetores, termicamente inativados e misturados com uma suspensão de eritrócitos (glóbulos vermelhos-RBC lavados). Recomenda-se RBC de cavalo lavados (10%) de Lampire e tendo em consideração que o ensaio pode variar dependendo da fonte dos RBC (dependente do cavalo), foram testados RBCs lavados de 10 cavalos para selecionar o lote mais sensível. Alternativamente podem ser utilizados RBC de peru. O título de anticorpo foi expressado como o recíproco da diluição mais elevada que inibe completamente a hemaglutinação.
Os títulos de HAI de reatividade cruzada: títulos de HAI de furões imunizados com uma vacina para a A/Indonésia/5/05 (ciado 2.1) foram medidos utilizando estirpes de gripe H5N1 inativadas de outro subclado ou ciado tal como as estirpes de Vietname do ciado 1 A/Vietname/1203/2004 e A/Vietname/1194/2004 ou a A/Anhui/01/2005 (subclado 2.3) ou a A/peru/Turquia/1/05 (subclado 2.2). Todas as análises foram realizadas em amostras individuais.
Análise de dados: A análise estatística (ANOVA) será realizada em todos os dados para estabelecer se as 116 diferenças entre grupos são estatisticamente significativas.
Conceção experimental para o desafio letal (ratos)
Cento e vinte e oito ratos foram divididos aleatoriamente em dezasseis grupos de oito animais, sendo um grupo não imunizado e não sujeito a desafio (controlo negativo). Todos os grupos foram imunizados via administração intramuscular num regimen de duas doses, sendo a segunda imunização efetuada 2 semanas após a primeira imunização.
Para administração intramuscular nas patas traseiras, os ratos não anestesiados foram imunizados com a VLP de H5 feita em planta (1, 5 ou 15 yg) , ou 15 yg de antigénio de HA de controlo ou PBS. Todas as preparações de antigénio foram misturadas com um volume de Alidrogel a 1% antes das imunizações (alúmen, Accurate Chemical & Scientific Corporation, Westbury, NY, EUA).
Durante o periodo de imunização, os ratos foram pesados uma vez por semana e observados e seguidos em relação a reações locais no sitio de injeção.
Vinte e dois dias após a segunda imunização, os ratos anestesiados foram sujeitos a desafio por via intranasal (i.n.) num laboratório de contenção BL4 (P4-Jean Mérieux-INSERM, Lyon, França) com 4,09 x 106 dose 50% infecciosa de cultura de células (CCID50) do virus da gripe A/Turquia/582/06 (amavelmente proporcionado pelo Dr. Bruno Lina, Lyon University, Lyon, França) . Após desafio, os ratos foram observados em relação a sintomas clínicos de doença e pesados diariamente, ao longo de um período de 117 catorze dias. Os ratos com sintomas de infeção grave e perda de peso >25% foram sacrificados após anestesia.
Colheita de sangue, lavagens pulmonar e nasal e recolha do baço
Foi realizada colheita de sangue da veia safena lateral catorze dias após a primeira imunização e catorze dias após a segunda imunização no animal não anestesiado. 0 soro foi recolhido por centrifugação a 8000 g durante 10 min.
Quatro semanas após a segunda imunização, os ratos foram anestesiados com CO2 gasoso e imediatamente após o termo foi utilizada punção cardíaca para recolher sangue.
Após sangramento final foi inserido um cateter na traqueia em direção aos pulmões e um mL de uma solução cocktail de inibidores de protease em PBS fria foi colocado numa seringa de lcc ligada ao cateter e injetado nos pulmões e em seguida removido para análise. Este procedimento de lavagem foi realizado duas vezes. As lavagens do pulmão foram centrifugadas para remover os sedimentos celulares. Para as lavagens nasais, foi inserido um cateter em direção à área nasal e 0,5 mL da solução cocktail de inibidores de protease em PBS foram empurrados através do cateter para as passagens nasais e, em seguida, recolhidos. As lavagens nasais foram centrifugadas para remover os sedimentos celulares. A recolha do baço foi realizada em ratos imunizados por via intramuscular com 5 yg de vacina feita em planta adjuvada ou 5 yg de antigénio de H5 recombinante adjuvado bem como em ratos imunizados por via intranasal com 1 yg de vacina feita em planta adjuvada ou 1 yg de antigénio de H5 recombinante adjuvado. Os baços recolhidos foram colocados em RPMI suplementado com gentamicina e esmagados num tubo cónico de 50 mL com o êmbolo de uma 118 seringa de 10 mL. Os baços esmagados foram lavados 2 vezes e centrifugados a 2000 rpm durante 5 min e ressuspensos em tampão de lise ACK durante 5 min à temperatura ambiente. Os esplenócitos foram lavados em PBS-gentamicina, ressuspensos em RPMI a 5% e contados. Os esplenócitos foram utilizados no ensaio de proliferação. Títulos de anticorpo
Os titulos de anticorpo anti-gripe de soros foram medidos aos 14 dias após a primeira imunização bem como aos 14 e 28 dias após a segunda imunização. Os titulos foram determinados por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) utilizando o virus A/Indonésia/5/05 inativado como o antigénio de revestimento. Os titulos finais foram expressados como o valor reciproco da diluição mais alta que atingiu um valor de OD pelo menos 0,1 superior àquele das amostras de controlo negativo.
Para determinação da classe do anticorpo (IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM), os titulos foram avaliados por ELISA como anteriormente descrito. Títulos de inibição da hemaglutinação (Hl)
Os titulos de inibição da hemaglutinação (Hl) dos soros foram medidos aos 14 e 28 dias após a segunda imunização como anteriormente descrito (WHO 2002; Kendal 1982). Foram utilizadas preparações de virus inativados das estirpes A/Indonésia/5/05 ou A/Vietname/1203/2004 para testar as amostras de soro de rato quanto à atividade Hl. Os soros foram pré-tratados com enzima destruidora de recetores II (RDE II) (Denka Seiken Co., Tokyo, Japão) preparada a partir de Vibrio cholerae (Kendal 1982). Os ensaios de Hl 119 foram realizados com glóbulos vermelhos de peru a 0,5%. Os títulos de anticorpos de Hl foram definidos como o recíproco da diluição mais alta que origina inibição total da aglutinação.
Exemplos
Exemplo 1: Expressão transitória de hemaglutinina do vírus da gripe A/Indonésia/5/05 (H5N1) por agroinfiltração em plantas N. benthamiana A aptidão do sistema de expressão transitório para produzir hemaglutinina da gripe foi determinada através da expressão do subtipo H5 da estirpe A/Indonésia/5/05 (H5N1). Como apresentado na Figura 11, a sequência de codificação do gene da hemaglutinina (# Acesso EF541394), com o seu péptido sinal nativo e domínio transmembranar, foi primeiro reunida na cassete de expressão de plastocianina sequências promotora, UTR 5', UTR 3' e finalização da transcrição do gene de plastocianina de luzerna - e a cassete montada (660) foi inserida num plasmídeo binário pCAMBIA. Este plasmídeo foi então transfetado em Agrobacterium (AGL1), criando a estirpe recombinante AGL1/660, a qual foi utilizada para expressão transitória.
As plantas N. benthamiana foram infiltradas com AGL1/660 e as folhas foram colhidas após um período de incubação de seis dias. Para determinar se houve a acumulação de H5 nas folhas do aqroinfiltrado, a proteína foi inicialmente extraída do tecido da folha do infiltrado e analisada por transferência de Western utilizando anticorpos policlonais anti-H5 (Vietname). Nos extratos (Figura 12) foi detetada uma única banda de aproximadamente 72 kDa, correspondente em tamanho à forma HAO não dissociada da hemaglutinina da 120 gripe. A H5 comercial utilizada como controlo positivo (A/Vietname/1203/2004; Protein Science Corp., Meriden, CT, EUA) foi detetada como duas bandas de aproximadamente 48 e 28 kDa, correspondentes ao peso molecular dos fragmentos HA1 e HA2, respetivamente. Isto demonstrou que a expressão de H5 nas folhas de infiltrado resulta na acumulação do produto de tradução não dissociado. A formação de trimeros de HA ativos foi demonstrada pela capacidade dos extratos proteicos em bruto de folhas transformadas AGL1/660 de aglutinar os glóbulos vermelhos de peru (dados não apresentados).
Exemplo 2: Caracterização de estruturas contendo hemaglutinina em extratos vegetais utilizando cromatografia de exclusão molecular A associação de hemaglutinina da gripe produzida em plantas em estruturas de alto peso molecular foi avaliada por filtração em gel. Os extratos proteicos em bruto de plantas infiltradas AGL1/650 (1,5 mL) foram fracionados por cromatografia de exclusão molecular (SEC) em colunas de Sephacryl™ S-500 HR (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ, EUA). As frações de eluição foram avaliadas quanto ao seu teor total de proteina e quanto à abundância de HA utilizando imunodeteção com anticorpos anti-HA (Figura 13A) . Como se mostra na Figura 13A, a eluição de Dextrano Azul (2 MDa) atingiu um pico cedo na fração 10 enquanto a maior parte das proteínas do hospedeiro ficou retida na coluna e eluiu entre as frações 14 e 22. Quando as proteínas dos 200 yL de cada uma das frações de eluição da SEC foram concentradas (5 vezes) por precipitação com acetona e analisadas por transferência de Western (Figura 15A, H5) , a hemaglutinina (H5) foi principalmente 121 encontrada nas frações 9 a 14 (Figura 13B) . Sem pretender ficar limitado pela teoria, isto sugere que a proteina HA tinha sido reunida numa superestrutura maior ou que ela se tinha ligado a uma estrutura de alto peso molecular.
Foi montada uma segunda cassete de expressão com a sequência de ácido nucleico da Hl de A/Nova Caledónia/20/99 (H1N1) (SEQ ID NO: 33; Figura 16; N° de Acesso do GenBank AY289929) para produzir a construção 540 (Figura 11). Foi concebida uma construção de gene quimérico de forma a produzir uma forma trimérica solúvel de Hl na qual o péptido sinal era proveniente de um gene da isomerase de dissulfureto de proteina vegetal e o dominio transmembranar de Hl estava substituído pela variante pll do fecho de leucina GCN4, um péptido que se demonstrou que se auto-associa em trímeros (Harbury et al., 1993) (cassete 544, figura 11). Apesar de carecer do dominio transmembranar, esta forma trimérica solúvel foi capaz de hemaglutinação (dados não apresentados).
Os extratos proteicos de plantas infiltradas com AGL1/540 ou AGL1/544 foram fracionadas por SEC e a presença de frações eluidas com Hl foi examinada por transferência de Western com anticorpos anti-gripe A (Fitzgerald, Concord, MA, EUA). Nas folhas infiltradas com AGL1/540, a Hl acumulou-se principalmente como uma estrutura de peso molecular muito alto, com o pico distorcido para estruturas de menor tamanho (Hl; Figura 13C) . Nas folhas infiltradas com AGL1/544, a forma solúvel de Hl acumulou-se como trimeros isolados como demonstrado pelo padrão de eluição a partir da filtração em gel o qual é análogo ao perfil de eluição da proteina do hospedeiro (Hl solúvel; Figura 13D). Em comparação, a Hl rosetas (Proteina Science Corp., Meriden, CT, EUA) que consiste de micelas de 5-6 trimeros 122 de hemaglutinina eluiu nas frações 12 a 16 (Figura 13E) , mais cedo do que a forma solúvel de Hl (Figura 13D) e mais tarde do que a Hl nativa (Figura 13C). A fim de avaliar o impacto da co-expressão de Ml na associação de hemaglutinina à estrutura, foi montada uma cassete de expressão de Ml utilizando o ácido nucleico correspondente à sequência de codificação da Ml de A/PR/8/34 (H1N1) (SEQ ID NO: 35; Figura 18; N° de Acesso do GenBank NC_002016). A construção foi designada 750 e é apresentada na Figura 11. Para a co-expressão de Ml e Hl, suspensões de AGL1/540 e AGL1/750 foram misturadas em volumes iguais antes da infiltração. A co-infiltração de suspensões múltiplas de Agrobacterium permite a co-expressão de múltiplos transgenes. A análise por transferência de Western de frações de eluição da SEC mostra que a co-expressão de Ml não modificou o perfil de eluição das estruturas de Hl, mas resultou numa diminuição da acumulação de Hl nas folhas do agroinf iltrado (ver Figura 13F).
Exemplo 3: Isolamento de estruturas de H5 por centrifugação em gradiente de sacarose e observação sob microscopia eletrónica A observação da estrutura de hemaglutinina sob microscopia eletrónica (EM) requereu um nivel de concentração e pureza mais elevado do que aquele obtido a partir da SEC de extratos proteicos foliares em bruto. Para permitir a observação de estruturas de H5 por EM, um extrato proteico foliar em bruto foi inicialmente concentrado por precipitação com PEG (PEG a 20%) seguida de ressuspensão em 1/10 volumes de tampão de extração. O extrato proteico concentrado foi fracionado por filtração em gel S-500 HR e 123 as frações de eluição 9, 10 e 11 (correspondentes ao volume morto da coluna) foram misturadas e adicionalmente isoladas de proteínas do hospedeiro por ultracentrifugação num gradiente de densidade de sacarose a 20-60%. O gradiente de sacarose foi fracionado a partir do cimo e as frações foram submetidas a diálise e concentradas numa unidade de filtração centrífuga 100 NMWL antes da análise. Como se demonstra nas transferências de Western e resultados de hemaglutinação (Figura 14A), a H5 acumulou-se principalmente nas frações 16 a 19, as quais continham «60% de sacarose, enquanto a maioria das proteínas do hospedeiro atingiram o máximo na fração 13. As frações 17, 18 e 19 foram misturadas, reveladas negativamente e observadas sob EM. O exame da amostra demonstrou claramente a presença de estruturas esféricas com pontas que variam em tamanho desde 80 a 300 nm que condiziam com as caracterí sticas morfológicas das VLPs da gripe (Figura 14B).
Exemplo 4: Purificação das VLPs de H5 da gripe a partir da biomassa vegetal
Além de um teor abundante de proteínas solúveis, os extratos de folhas vegetais contêm uma mistura complexa de açúcares, ácidos nucleicos e lípidos solúveis. 0 extrato em bruto foi clarificado por uma alteração de pH e tratamento térmico, seguidos de filtração em terra de diatomáceas (ver Secção de Materiais e métodos para uma descrição detalhada do método de clarificação) . A Figura 15A (faixas 1-4) apresenta um gel revelado com Azul de Coomassie que compara o teor de proteína nos vários passos de clarificação. Uma comparação do teor de proteína no extrato em bruto (faixa 1) e no extrato clarificado (faixa 4) revela a capacidade dos passos de clarificação para reduzir o teor global de proteína e remover a maior parte do contaminante principal 124 visível a 50 kDa em extratos de folhas em bruto. A banda a 50 kDa corresponde à subunidade grande RuBisCO, que representa até 30% das proteínas totais da folha.
As VLPs de H5 da gripe foram purificadas a partir destes extratos clarificados por cromatografia de afinidade sobre uma coluna de fetuína. Uma comparação da fração de carga (Figura 15A, faixa 5) com a não retida (Figura 15A, faixa 6) e as VLPs eluídas (Figure 15A, faixa 7) demonstra a especificidade da coluna de afinidade de fetuína para as VLPs de H5 da gripe no extrato vegetal clarificado. O procedimento de purificação resultou em mais de 75% de pureza em H5, como determinado por densitometria no gel de SDS-PAGE revelado com Azul de Coomassie (Figura 15A, faixa 7) . A fim de avaliar a qualidade estrutural do produto purificado, a H5 purificada foi concentrada numa unidade de filtração centrífuga 100 NMWL (limite nominal de peso molecular) e examinada sob EM após revelação negativa. A Figura 15B mostra um setor representativo que mostra a presença de VLPs abundantes. Um exame mais minucioso confirmou a presença de pontas nas VLPs (figura 15C).
Como se mostra na Figura 15D, as VLPs de H5 foram purificadas até aproximadamente 89% de pureza a partir de extratos de folhas clarificados utilizando cromatografia de afinidade numa coluna de fetuína, com base na densidade da hemaglutinina H5 revelada com Azul de Coomassie e na determinação do teor total de proteína pelo método BCA. A bioatividade das VLPs de HA foi confirmada através da sua capacidade para aglutinar os glóbulos vermelhos de peru (dados não apresentados). 125 A Figura 20B confirma também a identidade da VLP purificada visualizada por transferência de Western e imunodeteção com um soro policlonal anti-H5 (A/Vietname/1203/2004). É detetada uma única banda de aproximadamente 72 kDa e corresponde em tamanho à forma HAO não dissociada da hemaglutinina da gripe. A Figura 15c mostra a estrutura da VLP da vacina com as pontas de hemaglutinina a cobrir a sua estrutura.
As VLPs foram formuladas para imunização de ratos por filtração através de um filtro de 0,22 ym; o teor de endotoxina foi medido utilizando o kit de deteção de endotoxina de LAL (Lisado de Limulus Amebocyte) (Lonza, Walkserville, MS, EUA). A vacina filtrada continha 105,8 ±11,6% de EU/mL (unidades de endotoxina/mL).
Exemplo 5: Localização das VLPs da gripe nas plantas A fim de localizar as VLPs e confirmar a sua origem na membrana do plasma, secções finas de folhas de plantas produtoras de H5 foram fixadas e examinadas sob TEM após revelação positiva. A observação de células de folhas indicou a presença de VLPs em cavidades extracelulares formadas pela invaginação da membrana do plasma (Figura 19) . A forma e posição das VLPs observadas demonstrou que, apesar da aposição das suas membranas do plasma na parede celular, as células vegetais têm a plasticidade necessária para produzir VLPs da gripe derivadas da sua membrana do plasma e acumulá-las no espaço apoplástico.
Exemplo 6: Análise de Lipidos da Membrana do Plasma
Uma confirmação adicional da composição e origem das VLPs da gripe de planta foi obtida a partir das análises do 126 conteúdo de lípidos. Os lípidos foram extraídos de VLPs purificadas e a sua composição foi comparada com a de membranas do plasma de tabaco altamente purificadas por cromatografia em camada fina de alta eficiência (HP-TLC). Os padrões de migração de lipidos polares e neutros a partir de VLPs e de membranas de plasma de controlo foram semelhantes. A VLPs purificadas continham os fosfolípidos (fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina) e esfingolipidos (glucosil-ceramida) principais presentes na membrana do plasma (Figura 27A), e ambas continham esteróis livres como os únicos lipidos neutros (Figura 27B). No entanto, a imunodeteção de um marcador proteico da membrana do plasma (ATPase) em extratos de VLP purificados mostrou que a bicamada lipídica da VLP não contém uma das proteínas principais associada a membranas do plasma vegetal, sugerindo que as proteínas do hospedeiro podem ter sido excluídas das membranas durante o processo de germinação das VLPs a partir das células vegetais (Figura 27C).
Exemplo 7: Imunogenicidade das VLPs de H5 e efeito da via de administração
Os ratos foram administrados com as VLPs de H5 feitas em plantas por injeção intramuscular ou intranasal (inalação). Foram injetados 0,1 a 12 ug de VLPs por via intramuscular em ratos, com alúmen como um adjuvante, de acordo com os métodos descritos. Os títulos de anticorpo máximos foram observados com a quantidade menor de antigénio, numa grandeza semelhante à de 5 ug de hemaglutinina (HA) solúvel, recombinante (Figura 20A). A administração de 0,1 a ug de VLPs de H5 feitas em plantas por via intranasal com um adjuvante de quitosano proporcionou uma resposta de anticorpos maior do que aquela 127 do HA solúvel recombinante com um adjuvante de alúmen (Figura 20B).
Foi observada conversão sérica em todos os ratos testados para ambas as vias de administração e ao longo de uma gama de quantidades de antigénio. 0 antigénio de H5 solúvel, recombinante conferiu títulos de Hl baixos (<1/40) ou insignificantes (Kl/10 para a H5 recombinante não adjuvada).
Exemplo 8: VLP de H5 titulo de anticorpo de inibição da hemaglutinação (HAI) A Figura 21A, B ilustra a resposta de inibição da hemaglutinação (HAI) de anticorpos 14 dias após um "reforço" com VLP de H5 feita em plantas ou HA solúvel recombinante. A dose mais baixa de antigénio (0,1 ug) quando administrada por via intramuscular produziu uma resposta HAI superior a uma administração 10 vezes maior (5 ug) de HA solúvel recombinante. Doses crescentes de VLP de H5 proporcionaram um aumento modesto na HAI relativamente à dose mais baixa. A resposta HAI após administração intranasal foi significativamente maior em ratos administrados com VLPs de H5 feitas em plantas (1,0 ou 0,1 ug) em comparação com aqueles administrados com 1 ug de HA solúvel recombinante, a qual foi semelhante ao controlo negativo. Todos os ratos imunizados por injeção intramuscular de VLPs de H5 (desde 0,1 a 12 yg) tiveram títulos de HAI mais elevados do que os ratos imunizados com o antigénio de HA de controlo (Figura 4a - agora 21A) . Para a mesma dose de 5 yg, as VLPs induziram títulos de HAI 20 vezes superiores à dose correspondente do antigénio de HA de controlo. As VLPs 128 também induziram títulos significativamente maiores de HAI do que o antigénio de HA de controlo quando administradas através da via intranasal (Figura 21b). Para uma dada dose de VLP de H5 os níveis de títulos de HAI foram inferiores em ratos imunizados por via intranasal do que para ratos imunizados por via intramuscular; 1 yg de VLP induziu um título médio de HAI de 210 quando administrado i.m. enquanto a mesmo dose induziu um título médio de HAI de 34 administrado i.n..
Quando administradas por via intramuscular, todas as doses de VLPs induziram um nível alto de anticorpos capazes de ligar vírus inteiros inativados homólogos (Figuras 20b e 24). Não foi encontrada qualquer diferença significativa entre a vacina de VLP feita em planta e o antigénio de HA de controlo (exceto o grupo de 12 yg de VLP, 14 dias após reforço), já que ambas as preparações de antigénio induzem altos títulos de anticorpo de ligação contra a estirpe homóloga. No entanto, quando administradas por via intranasal, as VLPs induziram títulos de anticorpo de ligação mais elevados do que o antigénio de HA de controlo (Figura 20b). Quando misturado com Quitosano, a imunização com um micrograma de VLP induziu um título médio recíproco de Ab de 5 500, 8,6 vezes superior ao nível encontrado em ratos imunizados com 1 yg do antigénio de HA de controlo (título médio recíproco de Ab de 920). A imunogenicidade das VLPs da gripe derivadas de planta foi então investigada através de um estudo de variação de dose em ratos. Grupos de cinco ratos BALB/c foram imunizados por via intramuscular duas vezes em intervalos de 3 semanas com 0,1 yg a 12 yg de VLPs contendo HA da gripe Indonésia/5/05 (H5N1) formuladas em alúmen (proporção 1:1). Os títulos de inibição da hemaglutinação (Hl), utilizando antigénio de 129 vírus inteiro inativado (A/Indonésia/5/05 (H5N1)), foram medidos em soros recolhidos 14 dias após a segunda imunização. A imunização com doses de VLP tão baixas quanto 0,1 yg induziu a produção de anticorpos que inibiram o vírus de aglutinar eritrócitos a altas diluições (Figura 21A). A imunização paralela de ratos com 5 yg de antigénio de H5 de controlo não VLP adjuvado com alúmen (também de A/Indonésia/5/05) induziu uma resposta Hl que foi 2-3 logaritmos inferior à conseguida com a dose mais baixa de VLP.
Para ambas as vias de administração, e ao longo de uma gama de quantidades de antigénio, a resposta de HAI é superior em ratos administrados com VLPs.
Exemplo 9: Efeito do adjuvante na imunogenicidade de VLPs de H5
As VLPs de H5 feitas em plantas têm origem na membrana do plasma (Figura 19, Exemplo 5). Sem pretender ficar limitado pela teoria, os vírus com envelope ou as VLPs de vírus com envelope geralmente adquirem o seu envelope a partir da membrana através da qual eles germinam. As membranas do plasma da planta têm um complemento de fitosterol que é raramente, se é que alguma vez, encontrado em células animais e foi demonstrado que vários destes esteróis exibem efeitos imunoestimuladores.
As VLPs de H5 feitas em plantas foram administradas por via intramuscular (Figura 22A) ou por via intranasal (Figura 22B) em ratos na presença ou ausência de um adjuvante, e determinada a HAI (resposta de anticorpos de inibição da hemaglutinação). As VLPs, na presença ou ausência de um adjuvante adicionado (alúmen ou quitosano, como nestes 130 exemplos) em qualquer um dos sistemas de administração demonstraram uma inibição de hemaglutinina HAI significativamente maior do que a HA solúvel recombinante. Mesmo na ausência de um adjuvante adicionado (isto é, alúmen ou quitosano) , as VLPs de H5 feitas em plantas exibem uma HAI significativa, indicativa de uma resposta imunológica sistémica à administração do antigénio. 0 alúmen melhorou o nivel médio dos titulos de HAI por um fator de 5 para a administração intramuscular de VLP (Figura 22a) e por um fator de 3,7 para o antigénio de HA de controlo. Quando administrados i.m., 5 yg de VLPs induziram um titulo médio de HAI 12 vezes superior à dose correspondente do antigénio de HA de controlo. O quitosano não fortaleceu o nivel médio de HAI do antigénio de HA de controlo (Figura 22b) enquanto aumentou o nivel médio de HAI de ratos imunizados com 1 yg de VLP administrada i.n. por um fator de 5 vezes.
Exemplo 10: Isotipos de anticorpo
Os ratos administrados com VLPs de H5 feitas em plantas ou HA solúvel recombinante na presença ou ausência de alúmen como um adjuvante adicionado demonstram uma variedade de isotipos de imunoglobulina (Figura 23A) .
Na presença de um adjuvante adicionado, os perfis de isotipos de anticorpos das VLPs e da HA são semelhantes, com a IgGl a ser o isotipo dominante. Quando as VLPs ou HA são administradas sem um adjuvante adicionado, a resposta de IgGl é reduzida, mas permanece a resposta de isotipo dominante às VLPs, com as IgM, IgG2a, IgG2B e IgG3 a manter titulos semelhantes àqueles na presença de um adjuvante adicionado. Os titulos de IgGl, IgG2a e IgG2b são 131 acentuadamente reduzidos quando a HA é administrada sem um adjuvante adicionado.
Por conseguinte, estes dados demonstram que as VLPs feitas em plantas não requerem um adjuvante adicionado para desencadear uma resposta de anticorpos num hospedeiro.
Os titulos de anticorpo contra virus inteiros inativados da estirpes de gripe (A/Indonésia/5/05; A/Vietname/1203/04)I em ratos administrados com VLPs feitas em plantas ou HA solúvel recombinante por via intramuscular na presença de um antigénio adicionado são ilustrados na Figura 23B. Não é observada qualquer diferença significativa nos titulos de anticorpo para estas estirpes de gripe em ratos administrados com 1 ug ou 5 ug de VLPs ou 5 ug de HA solúvel.
Exemplo 11: Reatividade cruzada de anticorpos séricos induzida pela vacina de VLP de H5 A reatividade cruzada de anticorpos séricos induzida pela VLP de H5 foi avaliada contra virus da gripe inteiros inativados de diferentes estirpes. Todas as doses de VLP (desde 0,1 a 12 yg) bem como 5 yg de antigénio de HA de controlo induziram titulos de anticorpos de ligação altos contra uma estirpe do ciado 1 (A/Vietname/1194/04), a estirpe homóloga A/Indonésia/5/05 do ciado 2.1 e uma estirpe do ciado 2.2 A/peru/Turquia/1/05 (Figura 25A).
No entanto, apenas a VLP feita em plantas induziu um titulo de HAI contra a estirpe A/peru/Turquia/1/05 (Figura 25b). Os titulos de HAI para a A/Indonésia/5/05 foram altos para as VLPs. 132
Exemplo 12: Proteção cruzada conferida por imunização com VLP de H5 feita em plantas
Ratos que foram previamente administrados com um regimen de duas doses de VLPs de H5 de A/Indonésia/5/05 como descrito, foram subsequentemente desafiados por via intranasal com o virus infeccioso da gripe A/Turquia/582/06 (H5N1) ("H5N1 da Turquia") e observados. A dose administrada, por animal, foi 10 LDso (4,09 x 105 CCID50) .
Aos 7 dias após desafio, apenas 37,5% dos ratos administrados com o controlo de vacina de PBS tinha sobrevivido à exposição ao H5N1 da Turquia (Figura 2 6A) . 100% dos animais administrados com o antigénio de controlo (HA) ou 1, 5 ou 15 ug de VLPs de H5 da Indonésia sobreviveram até 17 dias após desafio, quando a experiência foi finalizada. A massa corporal dos ratos foi também seguida durante a experiência e a massa média dos ratos sobreviventes representada graficamente (Figura 26B). Os ratos administrados com 1, 5 ou 15 ug das VLPs de H5 da Indonésia antes do desafio não perderam qualquer massa apreciável durante o decorrer da experiência e, em particular, os ratos administrados com 5 ug das VLPs pareciam ter ganho uma massa significativa. Os ratos de controlo negativo (sem desafio com H5N1 da Turquia) não ganharam ou perderam apreciavelmente massa corporal. Os ratos de controlo positivo (sem VLPs administradas, mas sujeitos a desafio com H5N1 da Turquia) exibiram perda significativa de massa corporal durante o decorrer da experiência, e três destes ratos morreram. Como a massa corporal é uma média de todos os ratos na coorte, a remoção dos ratos 'mais doentes' (os 3 que morreram) pode levar a um aumento global aparente na 133 massa, contudo refira-se que a massa corporal média da coorte de controlo positivo é ainda significativamente abaixo daquele das coortes negativa ou tratada com VLP.
Por conseguinte, estes dados demonstram que as VLPs da gripe feitas em plantas compreendendo a proteína virai hemaglutinina H5 induzem uma resposta imunológica específica para as estirpes patogénicas da gripe e que as partículas semelhantes a vírus podem germinar a partir da membrana do plasma de uma planta.
Por conseguinte, estes dados demonstram que as plantas são capazes de produzir partículas semelhantes ao vírus da gripe e também, pela primeira vez, que as partículas semelhantes a vírus podem germinar a partir da membrana do plasma de uma planta.
Além disso, utilizando a tecnologia de expressão transitória atual foi produzido um primeiro lote de antigénio apenas 16 dias depois de a sequência da HA alvo ter sido obtida. Com os rendimentos atuais das VLPs de H5, e a uma dose ilustrativa de 5 yg por indivíduo, cada kg de folhas infiltradas pode produzir ~20 000 doses de vacina. Esta combinação única de simplicidade de plataforma, capacidade fortemente aumentada e imunogenicidade potente proporciona, entre outras formas de realização, um novo método de resposta no contexto de uma pandemia.
Exemplo 13: Caracterização de estruturas contendo hemaglutinina em extratos vegetais utilizando cromatografia de exclusão molecular A associação de hemaglutinina da gripe produzida em plantas de diferentes subtipos em estruturas de alto peso molecular 134 foi avaliada por filtração em gel. Os extratos proteicos em bruto ou concentrados de plantas infiltradas com AGL1/650, AGL1/540, AGLl/783, AGL1/780 e AGL1/785 (1,5 mL) foram fracionados por cromatografia de exclusão molecular (SEC) em colunas de Sephacryl™ S-500 HR (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ, EUA). Como se mostra na Figura 46, a eluição de Dextrano Azul (2 MDa) atingiu um máximo cedo na fração 10. Quando as proteínas de 200 yL de cada fração de eluição da SEC foram concentradas (5 vezes) por precipitação com acetona e analisadas por transferência de Western (Figura 46) , as hemaglutininas estavam principalmente presentes nas frações 7 a 14, e são indicativas da incorporação de HA nas VLPs. Sem pretender ficar limitado pela teoria, isto sugere que a proteína HA tinha sido reunida em superestruturas maiores ou que tinha-se ligado a um estrutura de alto peso molecular, independentemente do subtipo produzido.
Exemplo 14: Expressão transitória de hemaglutinina do vírus da gripe sazonal por agroinfiltração em plantas de N. Benthamiana A aptidão do sistema de expressão transitório para produzir hemaglutininas da gripe sazonal foi determinado através da expressão do subtipo Hl das estirpes A/Brisbânia/59/2007 (H1N1) (plasmídeo #774), A/Nova Caledónia/20/1999 (H1N1) (plasmídeo #540) e A/Ilhas Salomão/3/2006 (H1N1) (plasmídeo #775). As sequências de codificação do gene da hemaglutinina foram primeiro reunidas na cassete de expressão de plastocianina - sequências promotora, UTR 5', UTR 3' e de finalização da transcrição do gene de plastocianina de luzerna - e as cassetes montadas foram inseridas num plasmídeo binário pCAMBIA. Os plasmídeos foram em seguida transfetados em Agrobacterium (AGLl), 135 produzindo as estirpes de Agrobacterium AGL1/774, AGL1/540 e AGL1/775, respetivamente.
Plantas de N. benthamiana foram infiltradas com AGL1/774, AGL1/540 e AGL1/775, e as folhas foram colhidas após um periodo de incubação de seis dias. Para determinar se a Hl se tinha acumulado nas folhas de agroinfiltrado, as proteínas foram primeiro extraídas do tecido das folhas de infiltrado e analisadas por transferência de Western utilizando anticorpos anti-Hl. Foi detetada uma única banda de aproximadamente 72 kDa nos extratos (Figura 47), correspondente em tamanho à forma HAO não dissociada da hemaglutinina da gripe. Isto demonstrou que a expressão de diferentes estirpes epidémicas anuais de hemaglutinina em folhas infiltradas resulta na acumulação do produto de tradução não dissociado.
Exemplo 15: Expressão transitória de hemaglutinina de potenciais vírus de gripe pandémica por agroinfiltração em plantas de N. benthamiana A aptidão do sistema de expressão transitório para produzir hemaglutininas de gripes potenciais foi determinada através da expressão do subtipo H5 das estirpes A/Anhui/1/2005 (H5N1) (plasmídeo #781), A/Indonésia/5/2005 (H5N1) (plasmídeo #660) e A/Vietname/1194/2004 (H5N1) (plasmídeo #782). As sequências de codificação do gene da hemaglutinina foram primeiro reunidas na cassete de expressão de plastocianina - sequências promotora, UTR 5', UTR 3' e de finalização da transcrição do gene de plastocianina de luzerna - e as cassetes montadas foram inseridas num plasmídeo binário pCAMBIA. Os plasmídeos foram em seguida transfetados em Agrobacterium (AGL1). 136
Plantas de N. benthamiana foram infiltradas com AGL1/781, AGL1/660 e AGL1/782, e as folhas foram colhidas após um período de incubação de seis dias. Para determinar se a H5 se tinha acumulado nas folhas de agroinfiltrado, as proteínas foram primeiro extraídas do tecido das folhas do infiltrado e analisadas por transferência de Western utilizando anticorpos anti-H5. Foi detetada uma única banda de aproximadamente 72 kDa nos extratos (Figura 48), correspondente em tamanho à forma HAO não dissociada de hemaglutinina da gripe. Isto demonstrou que a expressão de diferentes estirpes pandémicas potenciais de hemaglutinina em folhas infiltradas resulta na acumulação do produto de tradução não dissociado.
Exemplo 16: Expressão transitória de H5 por agroinfiltração em plantas de N. Tabacum A aptidão do sistema de expressão transitório para produzir hemaglutinina da gripe em folhas de Nicotiana tabacum foi analisada através da expressão do subtipo H5 da estirpe A/Indonésia/5/2005 (H5N1) (plasmídeo #660). As sequências de codificação do gene da hemaglutinina foram primeiro reunidas na cassete de expressão de plastocianina sequências promotora, UTR 5', UTR 3' e de finalização da transcrição do gene de plastocianina de luzerna e as cassetes montadas foram inseridas num plasmídeo binário pCAMBIA. Os plasmídeos foram em seguida transfetados em Agrobacterium (AGL1).
Plantas de N. tabacum foram infiltradas com AGL1/660 e as folhas foram colhidas após um período de incubação de seis dias. Para determinar se a H5 se tinha acumulado nas folhas do agroinfiltrado, as proteínas foram primeiro extraídas do tecido das folhas do infiltrado e analisadas por 137 transferência de Western utilizando anticorpos anti-H5. Foi detetada uma única banda de aproximadamente 72 kDa nos extratos (Figura 49), correspondente em tamanho à forma HAO não dissociada de hemaglutinina da gripe. Isto demonstrou que a expressão de hemaglutinina em folhas de N. tabacum infiltradas resulta na acumulação do produto de tradução não dissociado.
Exemplo 17: Imunogenicidade da vacina de VLP de H5N1 de A/Indonésia/5/05 (H5N1) feita em plantas nos furões
Foi realizado um estudo de aumento de dose em furões para avaliar a imunogenicidade das VLPs derivadas de plantas. A reatividade cruzada in vitro de anticorpos séricos induzidos pela vacina de VLP de H5 a 3 doses (1, 5 e 15 ug) foi avaliada por inibição da hemaglutinação de três outras estirpes de H5N1 - A/peru/Turquia/1/05 (ciado 2.2), A/Vietname/1194/04 (ciado 1) e A/Anhui/5/05 (todos virus inteiros, inativados), utilizando soro colhido 14 dias após a primeira dose de vacina (Figura 50A) e 14 dias após a 2a dose (Figura 50 B) . É observada reatividade cruzada para todas as 3 concentrações de dose.
Exemplo 17: Análise dos resultados da imunogenicidade de acordo com os critérios da CHMP. 0 Comité de Produtos Medicinais para Utilização Humana (CHMP) da EMEA (http://www.emea.europa.eu/htms/general/ contacts/CHMP/CHMP.htmL) estabelece três critérios (aplicados após a segunda dose) para a eficácia da vacina: 1 - Número de seroconversão ou aumento significativo nos
titulos de Hl (4 vezes) >40%; 2 - Aumento médio geométrico de pelo menos 2,5; 3 - Proporção de indivíduos que atinge um titulo e Hl de 1/40 deve ser pelo menos de 70%. A 138 análise destes critérios no modelo de furão é mostrada nos Quadros 8-11. (*) é indicativo se satisfazer ou exceder os critérios do CHMP. Um sumário da análise da imunogenicidade cruzada relativamente aos critérios do CHMP para licenciamento é mostrado no Quadro 12.
Os animais foram avaliados diariamente quanto ao peso corporal, temperatura e condição global. Durante o estudo não foi registado qualquer sinal de doença ou desconforto. Durante o estudo o peso e temperatura corporais estavam dentro das gamas normais. A vacina era segura e tolerada pelos animais do estudo.
Quadro 8: Dados para a estirpe homóloga (A/Indonésia/5/05)
Grupo de estudo Dia Critérios 1 1 pg 5 5 pg 7,5 15 15 pg 30 5 pg adjuvado pg adjuvado pg pg adjuvado pg yg ITC % aumento de 4 vezes no título de Hl Aumento 0% 100% 0% 100% * 20% 20% 80% * 0% 0% 14 (após médio 0% 7,6 0% 15,6 * 1,3 1,2 11,2 * 0% 0% Ia inj.) geométrico % de títulos de 0% 60% 0% 100% * 20% 0% 80% * 0% 0% Hl de 1/40 Título médio de Hl 38 78 56 139
Grupo de estudo Dia Critérios 1 1 yg 5 5 yg 7,5 15 15 yg 30 5 yg adjuvado yg adjuvado yg yg adjuvado yg ITC % aumento de 4 vezes no título de Hl 0% 100% * 0% 60% * 0% 0% 40% * 0% 0% 35 (14 Aumento dias médio 0% 10,8 * 0% 5,9 * 0,7 0% 4 * 0% 0% após geométrico reforço) % de títulos de 0% 100% * 0% 100% * 0% 0% 100% * 0% 0% Hl de 1/40 Título médio de Hl 411 4 65 21 7
Quadro 9: Dados para a estirpe heteróloga (A/Vietname/1194/04)
Grupo de estudo Dia Critérios 1 1 yg 5 5 yg 7,5 15 15 yg 30 5 yg adj uvado yg adj uvado yg yg adj uvado yg ITC % aumento 14 (após Ia inj.) de 4 vezes no título de Hl Aumento 0% 0% 0% médio 1,2 1,2 1,3 geométrico 140
Dia Critérios Grupo de estudo 1 pg 1 yg adjuvado 5 yg 5 yg adjuvado 7,5 yg 15 yg 15 yg adjuvado 30 yg 5 yg ITC % de títulos de Hl de 1/40 0% 0% 0% 35 (após reforço) % aumento de 4 vezes no título de Hl Aumento médio geométrico % de títulos de Hl de 1/40 60% 2,3 0% 80%* 5,1* 80%* 60% 1,78 20%
Quadro 10: Dados para a estirpe heteróloga (A/peru/Turquia/1/05)
Dia Critérios Grupo de estudo 1 yg 1 yg adj uvado 5 yg 5 yg adj uvado 7,5 yg 15 yg 15 yg adj uvado 30 yg 5 yg ITC 14 (após Ia inj.) % aumento de 4 vezes no título de Hl 40% 20% 60% 141
Dia Critérios Grupo de estudo 1 yg 1 yg adjuvado 5 yg 5 yg adjuvado 7,5 yg 15 yg 15 yg adjuvado 30 yg 5 yg ITC Aumento médio geométrico % de títulos de Hl de 1/40 1,9 40% 1,7 20% 2,8 40% 35 (após reforço) % aumento de 4 vezes no título de Hl Aumento médio geométrico % de títulos de Hl de 1/40 80% * 10,6 * 100% * 100% * 20,8 * 100% * 80% * 7,7 * 100% *
Quadro 11: Dados para a estirpe heteróloga (A/Anhui/5/05)
Dia
Critérios 1μ g
Grupo de estudo 5 1 yg 5 5 yg 7,5 15 15 yg 30 yg ITC adj uvado yg adj uvado yg yg adj uvado yg 142
Dia Critérios Grupo de estudo 1 pg 1 pg adjuvado 5 pg 5 pg adjuvado 7,5 pg 15 pg 15 pg adjuvado 30 pg 5 pg ITC 14 (após Ia inj.) % aumento de 4 vezes no título de Hl Aumento médio geométrico % de títulos de Hl de 1/40 40% 1,8 20% 20% 1,3 20% 80% * 6,4 * 80% * 35 (após reforço) % aumento de 4 vezes no título de Hl Aumento médio geométrico % de títulos de Hl de 1/40 100% * 11,8 * 100% * 100% * 14,4 * 80% * 60% * 3 * 80% * 143
Quadro 12: Sumário da análise da imunogenicidade cruzada em relação aos critérios de licenciamento do CHMP.
Grupo de estudo Estirpe Critérios 1 yg 5 yg 15 yg adj uvado adjuvado adjuvado % aumento de 4 vezes no título 80% * 100% * 80% * A/peru/Turquia/1/05 (ciado 2.2) de Hl Aumento médio geométrico 10,6 * 20,8 * 7,7 * % de títulos de Hl de 1/40 100% * 100% * 100% * % aumento de 4 vezes no título 100% * 100% * 60% * A/Anhui/1/05 (ciado 2.3) de Hl Aumento médio geométrico 11,8 * 14,4 * 3 * % de títulos de Hl de 1/40 100% * 80% * 80% * % aumento de 4 vezes no título 60% 80% * 60% A/Vietname/1194/04 (ciado 1) de Hl Aumento médio geométrico 2,3 7,1 * 1,78 % de títulos de Hl de 1/40 0% 80% * 20%
Exemplo 18: Seleção de sequências de nucleótidos de hemaglutinina
As sequências de nucleótidos da HA foram recuperadas a partir de uma base de dados de sequências da gripe (ver URL: flu.lanl.gov) ou os recursos sobre o virus da gripe do NCBI (ver URL: ncbi.n.m.hih.gov/genomes/FLU/FLU.htmL). Para várias sequências de ácido nucleico da HA encontram-se listadas entradas múltiplas nas bases de dados (Quadro 13). Alguma variação está associada principalmente ao sistema de cultura (Origem - MDCK, ovo, desconhecida, ARN 144 viral/isolado clínico); por exemplo, o sítio de glicosilação na posição 194 (numeração da proteína madura) da HA está ausente quando o vírus da gripe de tipo B é expressado no fluido alantoide de ovos (ver também Chen et al., 2008). Para algumas sequências podem existir domínios em falta (por exemplo clones incompletos, artefactos de sequenciação, etc.). A sequência da hemaglutinina pode ser dividida em 5 domínios: péptido sinal (SP), HA1, HA2, transmembranar (DTm) e cauda citoplasmática. Os domínios de uma primeira sequência podem ser combinados com um domínio de uma segunda sequência existente, por exemplo o péptido sinal da uma sequência de uma primeira estirpe pode ser combinado com a porção complementar da sequência de codificação da hemaglutinina de uma segunda estirpe para proporcionar uma sequência de codificação completa.
Quadro 13: Variação nos subtipos da Gripe para sequências de codificação de HA selecionadas
Estirpe N° de referência da base de dados de sequências Origem SP HA1 HA2 DTm Divergência Hl A/Ilhas Salomão/3/2 006 ISDN231 558 (Vacina rec. ) MDCK Y Y Y Y 189: R ou G, 220: K (MDCK) T(Ovo), 249: Q (MDCK) R(Ovo), 550: L (MDCK) R (Ovo) A/Ilhas Salomão/3/2 006 ISDN238 190 Ovo Y Y Y Y 189: R ou G, 220: K (MDCK) T(Ovo), 249: Q (MDCK) R(Ovo), 550: L (MDCK) R (Ovo) 145
Estirpe N° de referência da base de dados de sequências Origem SP HA1 HA2 DTm Divergência A/ Ilhas Salomão/3/2 006 EU 10072 4 9 Y Y Y Y 189: R ou G, 220: K (MDCK) T(Ovo), 249: Q (MDCK) R(Ovo), 550: L (MDCK) R (Ovo) A/ Ilhas Salomão/3/2 006 ISDN220 951 MDCK Y Y N N 189: R ou G, 220: K (MDCK) T(Ovo), 249: Q (MDCK) R(Ovo), 550: L (MDCK) R (Ovo) A/ Ilhas Salomão/3/2 006 ISDN220 953 Ovo Y Y N N 189: R ou G, 220: K (MDCK) T(Ovo), 249: Q (MDCK) R(Ovo), 550: L (MDCK) R (Ovo) A/ Ilhas Salomão/3/2 006 EU12413 7 Ovo Y Y N N 189: R ou G, 220: K (MDCK) T(Ovo), 249: Q (MDCK) R(Ovo), 550: L (MDCK) R (Ovo) A/ Ilhas Salomão/3/2 006 EU12413 5 MDCK Y Y N N 189: R ou G, 220: K (MDCK) T(Ovo), 249: Q (MDCK) R(Ovo), 550: L (MDCK) R (Ovo) A/ Ilhas Salomão/3/2 006 EU12417 7 MDCK Y Y Y Y 189: R ou G, 220: K (MDCK) T(Ovo), 249: Q (MDCK) R(Ovo), 550: L (MDCK) R (Ovo) 146
Estirpe N° de referência da base de dados de sequências Origem SP HA1 HA2 DTm Divergência Hl A/Brisbânia/ 59/2007 ISDN282 676 MDCK Y Y Y 203: D/I/N D é a ma is abundante entre as Hl A/Brisbânia/ 59/2007 ISDN285 101 Ovo Y Y N N 203: D/I/N D é a ma is abundante entre as Hl A/Brisbânia/ 59/2007 ISDN285 777 Ovo Y Y Y Y 203: D/I/N D é a mais abundante entre as Hl A/Brisbânia/ 59/2007 ISDN282 677 Ovo Y Y Y Y 203: D/I/N D é a mais abundante entre as Hl H3 A/Brisbânia /10/2007 ISDN274 893 Ovo Y Y Y Y 202: V/G, 210:L/P, 215: sup Ala, 242: S/I A/Brisbânia/ 10/2007 ISDN257 648 MDCK N Y Y Y n 202: V/G, 210:L/P, 215: sup Ala, 242: S/I A/Brisbânia/ 10/2007 ISDN256 751 Ovo Y Y Y Y 202: V/G, 210:L/P, 215: sup Ala, 242: S/I A/Brisbânia/ 10/2007 ISDN273 757 Ovo Y Y Y Y 202: V/G, 210:L/P, 215: sup Ala, 242: S/I A/Brisbânia/ 10/2007 ISDN273 759 Ovo Y Y Y Y 202: V/G, 210:L/P, 215: sup Ala, 242: S/I 147
Estirpe N° de referência da base de dados de sequências Origem SP HA1 HA2 DTm Divergência A/Brisbânia/ 10/2007 EU 19924 8 Ovo N Y Y Y 202: V/G, 210:L/P, 215: sup Ala, 242: S/I A/Brisbânia/ 10/2007 EU19936 6 Ovo Y Y Y Y 202: V/G, 210:L/P, 215: sup Ala, 242: S/I A/Brisbânia/ 10/2007 ISDN257 043 Ovo N Y Y Y 202: V/G, 210:L/P, 215: sup Ala, 242: S/I A/Brisbânia/ 10/2007 EU19925 0 MDCK N Y Y Y 202: V/G, 210:L/P, 215: sup Ala, 242: S/I A/Brisbânia/ 10/2007 ISDN275 357 Ovo N Y N N 202: V/G, 210:L/P, 215: sup Ala, 242: S/I A/Brisbânia/ 10/2007 ISDN260 430 Ovo N Y Y Y 202: V/G, 210:L/P, 215: sup Ala, 242: S/I Η3 A/Wisconsin/ 67/2005 ISDN131 464 (vacina rec. ) 9 N Y Y N 138: A/S 156: H/Q 186: G/V 196: H/Y A/Wisconsin/ 67/2005 DQ86594 7 9 N Y parcial N 138: A/S 156: H/Q 186: GN 196: H/Y A/Wisconsin/ 67/2005 EF473424 9 N Y Y N 138: A/S 156: H/Q 186: G/V 196: H/Y 148
Estirpe N° de referência da base de dados de sequências Origem SP HA1 HA2 DTm Divergência A/Wisconsin/ 67/2005 ISDN138 723 Ovo N Y Y Y 138: A/S 156: H/Q 186: G/V 196: H/Y A/Wisconsin/ 67/2005 EF473455 Ovo N Y Y Y 138: A/S 156: H/Q 186: G/V 196: H/Y A/Wisconsin/ 67/2005 ISDNÍ38 724 9 N Y Y Y 138: A/S 156: H/Q 186: G/V 196: H/Y Β B/Malásia /2506/2004 ISDN126 672 (vacina rec. ) Ovo Y Y N N 120 K/N 210 T/A B/Malásia/ 2506/200 4 EF566433 Ovo Y Y N N 120 K/N 210 T/A B/Malásia/ 2506/200 265 4 ISDN231 265 Ovo Y Y Y Y 120 K/N 210 T/A B/Malásia/ 2506/200 4 ISDN231 557 MDCK Y Y Y Y 120 K/N 210 T/A B/Malásia/ 2506/200 4 EF566394 MDCK Y Y N N 120 K/N 210 T/A B/Malásia/ 2506/200 4 EU12427 4 Ovo Y Y Y Y 120 K/N 210 T/A B/Malásia/ 2506/200 4 EU12427 5 MDCK Y Y Y Y 120 K/N 210 T/A B/Malásia/ 2506/2004 ISDN124 776 MDCK Y Y N N N 120 K/N 210 T/A Β B/Flórida/4 /2006 ISDN261 649 Ovo Y Y Y N carece do sitio de glicosilação na posição 211; 10 aminoácidos de DTm/cauda citoplasmática 149
Estirpe N° de referência da base de dados de sequências Origem SP HA1 HA2 DTm Divergência Β/Flórida/ 4/2006 EU10060 4 MDCK N Y N N Β/Flórida/ 4/2006 ISDN218 061 MDCK N Y N N Β/Flórida/ 4/2006 ISDN285 778 Ovo Y Y Y Y Inclui cauda citoplasmática Β B/Brisbânia/ 3/2007 ISDN256 628 Ovo N Y N N carece do sitio de glicosilação na posição 211 B/ Brisbânia/ 3/2007 ISDN263 782 Ovo Y Y Y Y carece do sitio de glicosilação na posição 211 B/ Brisbânia/ 3/2007 ISDN263 783 MDCK Y Y Y Y Η5 A/Vietname/1194 /2004 ISDN3 86 (Vacina rec. ) p Y Y Y Y A/Vietname/1194 /2004 AY65133 3 p Y Y Y Y A/Vietname/1194 /2004 EF541402 p Y Y Y Y Η5 A/Anhuil/1/2005 DQ37928 (vacina rec. ) p Y Y Y Y A/Anhuil/1/2005 ISDN131 465 Ovo Y Y Y Y Η7 A/Galinha/ Itália/13474 /1999 AJ91720 ARN gen Y Y Y Y 150
Estirpe N° de referência da base de dados de sequências Origem SP HA1 HA2 DTm Divergência Η7 A/Equina/Praga/ 56 AB29827 7 (Recomb. Lab. ) ? Y Y Y Y 152 (R/G) 169 (T/I) 208 (N/D) (sitio de glicosilação anulado) A/Equina/ Praga/56 X62552 7 Y Y Y Y Η9 A/Hong Kong/1073 /1999 AJ404626 7 Y Y Y Y A/Hong Kong/1073 /1999 AB08022 6 7 N Y N N Η2 A/Singapura/ 1/1957 AB29607 4 7 Y Y Y Y A/Singapura/ 1/1957 L20410 ARN Y Y Y Y A/Singapura/ 1/1957 L11142 7 Y Y Y Y Η2 A/Japão/30 5/1957 L20406 7 Y Y Y Y A/Japão/3 05/1957 L20407 7 Y Y Y Y A/Japão/3 05/1957 CY01497 6 7 Y Y Y Y A/Japão/3 05/1957 AY20995 3 7 Y Y N N A/Japão/3 05/1957 J02127 7 Y Y Y Y A/Japão/3 05/1957 DQ50884 1 7 Y Y Y Y A/Japão/3 05/1957 AY64308 6 7 Y Y Y N A/Japão/3 05/1957 AB28933 7 7 Y Y Y Y A/Japão/3 05/1957 AY64308 5 7 Y Y Y Y 151
Estirpe N° de referência da base de dados de sequências Origem SP HA1 HA2 DTm Divergência A/Japão/3 05/1957 AY64308 7 Resistente a fármaco Y Y Y N H6 A/Cerceta/Hong Kong/W312/1997 (H6N1) AF25047 9 Ovo Y Y Y Y Y, N - Sim, Não, respetivamente SP - presença da sequência do péptido sinal Y/N HA1 - domínio HA1 completo Y/N HA2 - domínio HA2 completo Y/N DTm - domínio transmembranar completo Y/N
Estirpe: Hl de A/Ilhas Salomão/3/2006
Foram comparadas oito sequências de aminoácidos e identificadas as variações. (Quadro 14) A posição 171 exibiu uma variação de glicina (G) ou arginina (R) em algumas sequências.
Quadro 14: Variação de aminoácidos de A/Ilhas
Salomão/3/2006 # Aminoácido MDCK Ovo 212 K T 241 Q R 542 L R Numeração desde o M de partida
Estirpe: Hl de A/Brisbânia/59/2007 A posição 203 exibiu uma variação de ácido aspártico (D), isoleucina (I) ou asparagina (N). 152
Estirpe: H3 de A/Brisbânia/10/2007
Foram observadas variações de sequência em 5 posições (Quadro 15) . Na posição 215, observa-se uma supressão em duas sequências amostradas.
Quadro 15: Variação A/Brisbânia/10/2007 de aminoácidos da H3 de Origem 202, 210, 215, 235 242* ISDN274893 Ovo V L - Y I ISDN273759 Ovo G P A S I EU199248 Ovo G P A S I EU199366 Ovo G P A S I ISDN273757 Ovo V L - S S ISDN257 043 Ovo G P A S I EU199250 MDCK G L A S I ISDN375357 Ovo G P A S I ISDN2 60430 Ovo G P A S I ISDN256751 Ovo G P A S I ISDN257648 MDCK G L A S I *Numeração desde o M de partida
Estirpe: H3 de A/Wisconsin/67/2005
Nesta estirpe foram observadas variações de sequência em 4 posições (Quadro 16).
Quadro 16: Variação de aminoácidos da H3 de A/Wisconsin/67/2005
Origem 138, 156, 186, 196 ISDN13 8 72 4 Desconhecida A H G H DQ8 65 94 7 Desconhecida S H V Y EF473424 Desconhecida A H G H 153
Origem 138, 156, 186, 196 ISDN138723 Ovo S Q V Y ISDN1314 64 Desconhecida A H G H EF473455 Ovo A H G H *Numeração da proteina madura
Estirpe: B de BfMalásia/2506/2004 É observada variação em duas posições (Quadro 17). A posição 120 não é um sitio de glicosilação; a posição 210 está envolvida na glicosilação; esta glicosilação é anulada após cultura em ovos.
Quadro 17: Variação de aminoácidos na hemaglutinina de B/Malásia/2506/2004
# Aminoácido MDCK Ovo 120 K N 210 T A * Numeração a partir do meio de SP
Estirpe: hemaglutinina de B/Flórida/4/2006; ISDN261649
As variações observadas incluem variações da sequência de aminoácidos na posição 211, dependendo do sistema de cultura. A asparatina (N) é encontrada em sequências isoladas de células MDCK, enquanto o ácido glutâmico (D) é encontrado em sequência isoladas de ovos. A posição 211 é um sitio de glicosilação e é anulada após cultura em ovos.
Estirpe: H2 de A/Singapura/1/1957
Foram observadas variações de sequência em 6 posições (Quadro 18). 154
Quadro 18: Variação de aminoácidos da H2 A/Singapura/1/1957
Origem N° 166 de aminoácido 168 199X236 238 358 L20410 ARN Virai K E T L S V L11142 Desconhecida E G K L S I AB296074 Desconhecida K G T Q G V Consenso A/Japão/305/1957 K G T Q/L G V 'Numeração da proteína madura
Estirpes: H5 de A/Vietname/1194/2004 e H5 de A/Anhui/1/2005 Não existem quaisquer variações observadas na sequência de aminoácidos ao alinhar as sequências primárias de quaisquer destas estirpes de H5.
Estirpe: H6 de A/Cerceta/Hong Kong/W312/1997
Estava disponível apenas uma entrada para a estirpe (AF25017 9) .
Estirpe: H7 de A/Equina/Praga/56
Foi encontrado um total de 2 entradas de sequências nas bases de dados. A entrada AB298877 foi excluída uma vez que é um recombinante laboratorial.
Estirpe: H9 de A/Hong Kong/1073/1999: AJ404626
Foi encontrado um total de 2 entradas de sequências nas bases de dados. Apenas uma estava completa. 155 A presente invenção foi descrita no que diz respeito a uma ou mais formas de realização. No entanto, será evidente para os especialistas na técnica que pode ser feito um número de variações e modificações sem se sair do âmbito da invenção como definido nas reivindicações.
Referências:
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<130> V81270WO <160> 76 <170> Patentln versão 3.5
<210> 1 <211> 1556 <212> ADN <213> Virus da Gripe <400> 1 160 agatcttcgc tgacacaata tgtataggct accatgccaa caactcaacc gacacfcgttg 60 acacagtact tgagaagaat gtgacagtga cacactctgt caacctacfcfc gaggacagtc 120 acaatggaaa actatgtcta ctaaaaggaa tagccccact acaattgggt aatcgcagcg 180 ttgccggatg gatcttagga aacccagaat gcgaattact gatttccaag gaatcatggt 240 cctacattgc agaaacacca aatcctgaga atggaacatg ttacccaggg tatttcgccg 300 actatgagga actgagggag caattgagtc cagtaccttc atttgagaga ttcgaaatat 360 tccccaaaga aagctcatgg cccaaccaca ccgtaaccgg agtatcagca tcatgctccc 420 ataatgggaa aagcagtttt tacagaaatt tgctatggct gacggggaag aatggtttgt 480 acccaaacct gagcaagecc tacgtaaaea acaaagagaa agaagtcctt gtactatggg 540 gtgttcatca cccgcctaac atagggaacc aaagggcact ctatcacaca gaaaatgcct 600 afcgtctctgt agtgtcttca cattatagca gaagattcac cccagaaata gccaaaágac 660 ccaaagtaag agatcaggaa ggaagaatca aceactactg gaccctgctg gaacctgggg 720 atacaataat atttgaggca aatggaaatc taatagcgcc atggtatgct tttgcactga 780 gtagaggctt tggaccagga accatcacct caaatgcacc aatggatgaa tgcgatgcga 840 agtgtcaaac acctcaggga gctaeaaaca gcagtccccc ttcccagaat gtacacccag 900 tcacaatagg agagtgtcca aagtatgtca ggagtgcaaa attaaggatg gttacaggac 960 taaggaacat cccatccact caacccagag gtttgtttgg agccattgcc ggtttcattg 1020 aaggggggtg gactggaatg gtagatgggt ggtatggtta tcatcatcag aatgagcaag 1080 gafcctggeta tgctgcagac caaaaaagta cacaaaatgc cattaacggg attacaaaca 1140 aggecaaecc tgtaattgag aaaatgaaca ctcaattcac agctgtgggc aaagagttca 1200 acaaattgga aagaaggatg gaaaacttaa ataaaaaagt tgatgatggg tttctagaca 1260 tttggacata taatgcagaa ttgttggttc tactggaaaa tgaaaggact ttggatttcc 1320 atgactccaa tgtgaagaat ctgtatgaga aagtaaaaag ccaattaaag aataatgcca 1380 aagaaatagg aaacgggtgt tttgagttct atcacaagtg taacaatgaa tgcatggaga 1440 gtgtgaaaaa tggtacctat gacfcatccaa aatattccga agaatcaaag ttaaacaggg 1500 agaaaattga tggagfcgaaa ttggaatcaa tgggagtata ctaagagctc aggcct 1556
<210> 2 <211> 219 <212> ADN <213> Vírus da Gripe <400> 2 161 ggtacctatg actaCccaaa atattccgaa gaatcaaagt taaacaggga gaaaattgat 50 ggagtgaaat tggaatcaat gggagtatac cagattctgg cgatctactc aactgtcgcc 120 agttccctgg ttcttttggt ctccctgggg gcaatcagct tctggatgtg ttccaatggg 180 tctttgcagt gtagaatatg catctaagag ctcaggcct 219
<210> 3 <211> 1719 <212> ADN <213> Vírus da Gripe <400> 3 aagcttatgg agaaaatagt gcttcttctt gcaatagtca gtcttgttaa aagtgatcag 60 atttgcattg gttaccatgc aaacaattca acagagcagg ttgacacaat catggaaaag 120 aacgttactg ttacacatgc ccaagacata ctggaaaaga cacacaacgg gaagctctgc 180 gatctagatg gagcgaagcc tctaatttta agagattgta gtgtagccgg atggctcctc 240 gggaacccaa tgtgtgacga attcatcaat gtaccggaat ggtcttacat agtggagaag 300 gccaatccaa ccaatgacct ctgttaccca gggagtttca acgactatga agaactgaaa 360 cacctattga gcagaacaaa ccattttgag aaaattcaaa tcatccccaa aagttcctgg 420 tccgatcatg aagcctcatc aggagttagc tcagcatgtc catacccggg aagtccctcc 480 ttttttagaa acgtggtatg gcttatcaaa aagaacagta catacccaac aataaagaaa 540 agctacaata ataccaacca agaggatctt ttggtactgt ggggaattca ccatcctaat 600 gatgcggcag agcagacaag gctatatcaa aacccaacca cctatatttc cattgggaca 660 tcaacactaa accagagatt ggtaccaaaa atagctacta gatccaaagt aaacgggcaa 720 162 ageggaagga tggagttctt ctggacaatt ttaaaaccta atgatgcaat caacttcgag 780 agtaatggaa atttcattgc tccagaatat gcatacaaaa ttgtcaagaa aggggactca 840 gcaattatga aaagcgaatt ggaatatggt aactgcaaca ccaagtgtca aactccaatg 900 ggggcgataa actctagtat gccattccac aacatacacc ctctcaccat cggggaatgc 960 cccaaatatg tgaaatcaaa cagattagtc cttgcaacag ggctcagaaa tagccctcaa 1020 agagagagca gaagaaaaaa gagaggacta tttggagcta tagcaggttt tatagaggga 1080 ggaCggcagg gaatggtaga tggttggtat gggtaccacc atagcaatga gcaggggagt 1140 gggtacgctg cagacaaaga atccactcaa aaggcaatag atggagtcac caataaggtc 1200 aactcaatca ttgacaaaat gaacactcag tttgaggccg ttggaaggga atttaataac 1260 ttagaaagga gaatagagaa tttaaacaag aagatggaag acgggtttct agatgtctgg 1320 acttataatg ccgaacttct ggttctcatg gaaaacgaga gaactctaga ctttcatgac 1380 tcaaatgtta agaacctcta cgacaaggtc cgactacagc ctagggataa tgcaaaggag 1440 ctgggcaacg gttgtttcga gttctatcac aaatgtgata atgaatgtat ggaaagtata 1500 agaaacggaa cgtacaacta tccgcagtat tcagaagaag caagattaaa aagagaggaa 1560 ataagtgggg taaaattgga atcaatagga acttaccaaa tactgtcaat ttattcaaca 1620 gtggcgagtt ccctagcact ggcaatcatg atggctggtc tatctttatg gatgtgctcc 1680 aatggatcgt tacaatgcag aatttgcatt taagagctc 1719
<210> 4 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 4 gtattagtaa ttagaatttg gtgtc 25
<210> 5 <211> 44 <212> ADN <213> Sequência Artificial 163 <22 0> <223> Iniciador <4 0 0> 5 gcaagaagaa gcactatttt ctccattttc tctcaagatg atta 44
<210> 6 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <4 0 0> 6 ttaatcatct tgagagaaaa tggagaaaat agtgcttctt cttgc 45 <210> 7 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <4 0 0> 7 actttgagct cttaaatgca aattctgcat tgtaacga 38 <210> 8 <211> 1471 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Cassete de Expressão 164 <4Ο0> 8 agaggtaccc cgggctggta tatttatatg ttgtcaaata actcaaaaac cataaaagtt 60 taagttagca agtgtgtaca tttttacttg aacaaaaata ttcacctact actgttataa 120 atcattatta aacattagag taaagaaata tggatgataa gaacaagagt agtgatattt 180 tgacaacaat tttgttgcaa catttgagaa aattttgttg ttctctcttt tcattggtca 240 aaaacaatag agagagaaaa aggaagaggg agaataaaaa cataatgtga gtatgagaga 300 gaaagttgta caaaagttgt accaaaatag Ctgtacaaat atcattgagg aatttgacaa 360 aagctacaca aataagggtt aattgctgta aataaacaag gatgacgcat tagagagatg 420 taccattaga gaatttttgg caagtcacta aaaagaaaga ataaattact tttaaaatta 480 aaagttgagt catttgatta aacatgtgat tatttaatga attgatgaaa gagttggatt 540 aaagttgtat tagtaattag aatttggtgt caaatttaac ttgacatttg atcttttcct 600 atatatcgcc ccatagagec agtcaactca tttttatatt tcatagatca aataagagaa 660 ataacggtat attaatccct ccaaaaaaaa aaaacggtat atttactaaa aaatctaagc 720 cacgtaggag gataacagga tccccgtagg aggataacat ccaatccaac caatcacaac 780 aatcctgatg agacaaccca ctttaagccc acgcatctgt ggcacatcta cattatctaa 840 atcacacatt cttccacaca tctgagccac acaaaaacca atccacatct ttatcaccca 900 ttctataaaa aatcacactt tgtgagtcta cactttgatt cccttcaaac acatacaaag 960 agaagagact aattaattaa ttaatcatct tgagagaaaa tggcgaaaaa cgttgcgatt 1020 ttcggcttat tgttttctct tcttgtgttg gttccttctc agatctgagc tctaagttaa 1080 aatgcttctt cgtctcctat ttataatatg gtttgttatt gttaattttg ttcttgtaga 1140 agagcttaat taatcgttgt tgttatgaaa tactatttgt atgagatgaa ctggtgtaat 1200 gtaattcaCt tacataagtg gagtcagaat cagaatgttt cctccataac taactagaca 1260 tgaagacctg ccgcgtacaa ttgtcttata tttgaacaac taaaattgaa catcttttgc 1320 cacaacttta taagtggtta atatagctca aatatatggt caagttcaat agattaataa 1380 tggaaatatc agttatcgaa attcaccaac aatcaactta acgttattaa ctactaattt 1440 tatatcatcc cctttgataa atgatagtac a 1471
<210> 9 <211> 565 <212> PRT <213> Vírus da Gripe <4Ο0> 9 165
Het Lys Ala Lys Leu Leu Vai Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr 1 S 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30
Vai Asp Thr Vai Leu Glu Lys Asn Vai Thr vai Thr His Ser Vai Asn 35 40 45
Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly Ile 50 55 60
Ala Pro Leu Gin Leu Gly Asn Cys Ser Vai Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Leu Leu Ile Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95
Vai Glu Thr Pro Asn Pro Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Tyr Phe 100 105 110
Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gin Leu Ser Ser Vai Ser Ser Phe 115 120 125
Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr 130 135 140
Vai Thr Gly Vai Ser Ala Ser Cys Ser His Asn Gly Lys Ser Ser Phe 145 150 155 160
Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Gly Lys Asn Gly Lee Tyr Pro Asn.
165 170 17S
Leu Ser Lys Ser Tyr vai Asn Asn Lys Glu Lys Glu Vai Leu Vai Leu 180 185 1^0
Trp Gly vai His His Pro Pro Asn Ile Gly Asn Gin Arg Ala Leu Tyr 195 200 20S
His Thr Glu Asn Ala Tyr Vai Ser Vai Vai Ser Ser His Tyr Ser Arg 210 215 220
Arg Phe Thr Pro Glu ile Ala Lys Arg Pro Lys Vai Arg Asp Gin Glu 225 230 235 240 166
Gly Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr Ile 245 250 255
Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe Ala 260 265 270
Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Pro Met 275 280 285
Asp Glu Cys Asp Ala Lys Cys Gin Thr Pro Gin Gly Ala Ile Asn Ser 290 295 300
Ser Leu Pro Phe Gin Asn Vai His Pro Vai Thr Ile Gly Glu Cys Pro 305 310 315 320
Lys Tyr vai Arg ser Ala Lys Leu Arg Met vai Thr Gly Leu Arg Asn 325 330 335
Ile Pro Ser Ile Gin Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala ile Ala Gly Phe 340 345 350
Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Vai Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His 355 360 365
His Gin Asn Glu Gin Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gin Lys Ser Thr 370 375 380
Gin Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Vai Asn Ser vai Ile Glu 385 390 395 400
Lys Met Asn Thr Gin Phe Thr Ala Vai Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu 405 410 415
Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Vai Asp Asp Gly Phe Leu 420 425 430
Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Vai Leu Leu Glu Asn Glu 435 440 445
Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Vai Lys Asn Leu Tyr Glu Lys 450 455 460 167
Vai Lys Ser Gin Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu lie Gly Asn Gly Cys 465 470 475 480
Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Vai Lys 485 490 495
Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn 500 505 510
Arg Glu Lys Xle Asp Gly Vai Lys Leu Glu Ser Met Gly Vai Tyr Gin 515 520 525
Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Vai Ala Ser Ser Leu Vai Leu Leu Vai 530 535 540
Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gin 545 550 555 560
Cys Arg Xle Cys Ile 565 <210> 10 <211> 568 <212> PRT <213> Vírus da Gripe <4 0 0> 10
Met Glu Lys ile Vai Leu Leu Leu Ala xle Vai Ser Leu vai Lys Ser 15 10 15
Asp Gin Xle Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asm Ser Thr Glu Gin Vai 20 25 30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Vai Thr Vai Thr His Ala Gin Asp Ile 35 40 45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Vai Lys 50 55 60
Pro Leu 65
Ile Leu Arg Asp Cys Ser Vai Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 70 75 80 168
Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Vai Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Vai 85 90 95
Glu Lys Ala Asn. Pro Thr Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn 100 105 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg ile Asn His Phe Glu 115 120 125
Lys Ile Gin Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser 130 135 140
Ser Gly Vai Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Ser Pro Ser Phe Phe 145 150 155 160
Arg Asn vai Vai Trp Leu ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile 165 170 175
Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gin Glu Asp Leu Leu Vai Leu Trp 180 185 190
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gin Thr Arg Leu Tyr Gin 195 200 205
Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Ile Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gin Arg 210 215 220
Leu Vai Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys vai Asn Gly Gin Ser Gly 225 230 235 240
Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 245 250 255
Phe Glu ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys ile 260 265 270
Vai Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 275 280 285
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gin Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser 290 295 300 169
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 305 310 315 320
Tyr Vai Lys Ser Asn Arg Leu Vai Leu Ala Thr Gly Leu Arg As» Ser 325 330 335
Pro Gin Arg Glu Ser Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile 340 345 350
Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gin Gly Met Vai Asp Gly Trp Tyr 355 360 365
Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gin Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys 370 375 380
Glu Ser Thr Gin Lys Ala Ile Asp Gly Vai Thr Asn Lys Vai Asn Ser 385 390 395 400
Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gin Phe Glu Ala Vai Gly Arg Glu Phe 405 410 415
Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp 420 425 430
Gly Phe Leu Asp Vai Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Vai Leu Met 435 440 445
Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Vai Lys Asn Leu 450 455 460
Tyr Asp Lys Vai Arg Leu Gin Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly 465 470 475 480
Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu 485 490 495
Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Gin Tyr Ser Glu Glu Ala 500 505 510
Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Vai Lys Leu Glu Ser Ile Gly 515 520 525 170
Thr Tyr Gin lie teu Ser Xle Tyr Ser Thr Vai Ala Ser Ser Leu Ala 530 535 540
Leu Ala Ile Met Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly 545 550 555 560
Ser Leu Gin Cys Arg Xle Cys Xle 565
<210> 11 <211> 1629 <212> ADN <213> Vírus da Gripe A <400> 11 gacaaaacat gtcttgggca ccatgctgtg gcaaatggaa caaaagtgaa cacattaaca 60 gagaggggga ttgaagtagt gaacgccaca gagacggtgg aaactgcgaa tatcaagaaa 120 atatgtactc aagggaaaag gccaacagat ctgggacaaC gtggacttct aggaacccta 180 ataggacctc cccaatgtga tcaattcctg gagttttact ctgatttgat aattgagcga 240 agagaaggaa ccgatgtgtg ctatcccggt aaattcacaa atgaagaatc actgaggcag 300 atccttcgag ggtcaggagg aattgataag gagtcaatgg gtttcaccta tagtggaata 360 agaaccaatg gagcgacaag tgcctgcaaa agatcaggtt cttctttcta tgcagagatg 420 aagtggttgc tgtcgaattc agacaatgcg gcattccctc aaatgacaaa gtcgtataga 480 aatcccagaa acaaaccagc tctgataatt tggggagttc atcactctgg atcggttagc 540 gagcagacca aactctatgg aagtggaaac aagttgataa cagtaggaag ctcaaaatac 600 cagcaatcat tcaccccaag tccgggagca cggccacaag tgaatggaca atcagggaga 660 atcgattttc actggctact ccttgatccc aatgacacag tgaccttcac tttcaatggg 720 gcattcatag cccctgacag ggcaagtttc tttagaggag aatcactagg agtccagagt 780 gatgttcctc tggattctag ttgtggaggg gattgctttc acagtggggg tacgatagtc 840 agttccctgc cattccaaaa catcaaccct agaactgtgg ggagatgccc tcggtatgtc 900 aaacagacaa gcctcctttt ggctacagga atgagaaatg ttccagagaa tccaaagccc 960 agaggccttt ttggagcaat tgctggattc atagagaacg gatgggaggg tctcatcgat 1020 1080 ggatggtatg gtttcagaca tcaaaatgca caaggggaag gaactgcagc tgactacaaa 171 agcacccaat ctgcaataga tcagatcaca ggcaaattga atcgtctgat cgacaaaaca 1140 aatcagcagt ttgagctgat agacaatgag ttcaatgaga tagaacaaca aataggaaat 1200 gtcattaatt ggacacgaga cgcaatgact gaggtatggt cgtataatgc tgagctgttg 1260 gtggcaatgg aaaatcagca tacaatagat cttgcggact cagaaatgaa caaactttat 1320 gagcgtgtca gaaaacaact aagggagaat gccgaagaag atggaactgg atgttttgag 1380 atattccata agtgtgatga tcagtgcatg gagagcataa ggaacaacac ttatgaccat 1440 actcaataca gaacagagtc attgcagaat agaatacaga tagacccagt gaaatcgagt 1500 agtggataca aagacataat cttatggttt agcttcgggg catcatgttt tcttcttcta 1560 gccgttgtaa tgggattggt tttcatttgc ataaagaatg gaaacatgcg gtgcaccatt 1620 tgtatataa 1629 <210> 12 <211> 1773 <212> ADN <213> Vírus da Gripe A <4 0 0> 12 agcaaaagca ggggttatac catagacaac caaaggcaag acaatggcca tcatttatct 60 aattcttctg ttcacagcag tgagagggga ccaaaCatgc atcggatacc atcccaacaa 120 ttccacagaa aaggttgaca caatcccaga gagaaatgtc actgcgaccc acgctgagga 180 cattcttgag aagactcaca atgggaagtt atgcaaacta aatggaatcc ctccacttga 240 attaagggat tgcagcattg ccggatggct cctcgggaat ccagaatgtg atatacttct 300 aactgtgcca gaatggtcat acataataga aaaagaaaat ccaaggaacg gcttgtgcta 360 cccaggcagt ttcaatgatt atgaagaatt gaagcatctt atcagcagcg tgacacattt 420 tgagaaagta aagattctgc ccagaaatga atggacacag catacaacaa ctggaggttc 480 acaggcttgc gcagactatg gtggtccgtc attcttccgg aacatggtct ggttgacaaa 540 gaaagggtcg aattatccaa ttgccaaaag atcttacaac aatacaagtg gggaacaaat 600 gctgatcatt tgggggatac atcaccccaa tgatgaaagt gaacaaagag cattgtatca 660 gaatgtgggg acctatgtgt cagtaggaac atcaacactg aacaaaagat catccccaga 720 aatagcaaca agacctaaag tgaatggaca aggaggcaga atggaattct cgtggactat 780 cttagatata tgggacacaa taaattttga gagtactggc aatctaattg caccagaata 840 tggtttcaaa atatccaaac gaggtagttc agggatcatg aaaacagaag gaaaactcga 900 aaactgcgag accaagtgcc aaactccttt gggagcaata aatacaacat taccctttca 960 caatatccac ccactgacca ttggtgagtg ccccaaatat gCaaaatcgg aaagattagt 1020 172 cttagcaaca ggactaagaa acgtccctca gattgagtca aggggattgt ttggggcaat 1080 agctggtttt atagagggtg gatggcaagg aatggttgat ggttggtatg ggtatcatca 1140 cagcaatgac cagggatctg ggtatgcagc agacaaagaa tccactcaaa aggcaattga 1200 tggaaecacc aacaaggtaa attctgtgat cgaaaagatg aacacccaat tcggagctgt 1260 tggaaaagaa ttcagtaact tggagagaag accggagaac ttgaataaaa agatggagga 1320 cggatttcta gatgtgtgga catacaatgc cgagctccta gttctaatgg aaaatgagag 1380 gacacttgac tttcatgatt ctaatgtcaa gaatctatat gataaagtca gaatgcaact 1440 gagagacaat gcaaaagaac tagggaatgg atgttttgaa ttttatcaca aatgtgatga 1500 tgaatgcatg aacagtgtga agaatgggac atatgattat tccaagtatg aagaggagtc 1560 taaactaaac aggactgaaa tcaaaggggt taaattgagc aatatggggg tttatcaaat 1620 ccttgccatc tatgctacag tagcaggttc cctgtcactg gcaatcatga tagctgggat 1680 ttctatatgg atgtgctcca acgggtctct gcaatgcaga atctgcatat gatcatcagt 1740 cattttgtaa ttaaaaacac ccttgtttct act 1773
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<210> 27 <211> 2073 <212> ADN <213> Vírus da Gripe A <400> 27 187 agcagaagca gggggttaat aatgtttttc tcattactct tggtgttggg cctcacagag 60 gctgaaaaaa taaagatatg ccttcaaaag caagtgaaca gtagcttcag cctacacaat 120 ggcttcggag gaaatttgta tgccacagaa gaaaaaagaa tgtttgagct tgttaagccc 180 aaagctggag cctctgtctt gaatcaaagt acatggattg gctttggaga ttcaaggact 240 gacaaaagca attcagcttt tcctaggtct gctgatgttt cagcaaaaac tgctgataag 300 tttcgttttt tgtctggtgg atccttaatg ttgagtatgt ttggcccacc tgggaaggta 360 gactaccttt accaaggatg tggaaaacat aaagtttttt atgaaggagt taactggagt 420 ccacatgctg ctataaattg ttacagaaaa aattggactg atatcaaact gaatttccag 480 aaaaacattt atgaattggc ttcacaatca cattgcatga gcttggtgaa tgccttggac 540 aaaactattc ctttacaagt gactgctggg actgcaggaa attgcaacaa cagcttctta 600 aaaaatccag cattgtacac acaagaagtc aagccttcag aaaacaaatg tgggaaagaa 660 aatcttgctt tcttcacact tccaacccaa tttggaacct atgagtgcaa actgcatctt 720 gtggcttctt gctatttcat ctatgatagt aaagaagtgt acaataaaag aggatgtgac 780 aactactttc aagtgatcta tgattcattt ggaaaagtcg ttggaggact agataacagg 840 gtatcacctt acacagggaa ttctggagac accccaacaa tgcaatgtga catgctccag 900 ctgaaacctg gaagatattc agtaagaagc tctccaagat tccttttaat gcctgaaaga 960 agttattgct ttgacaegaa agaaaaagga ccagtcactg ctgtccaatc catttgggga 1020 aaaggcagag aatctgacta tgcagtggat caagcttgct tgagcactcc agggtgcatg 1080 ttgatccaaa agcaaaagcc atacattgga gaagctgatg atcaccatgg agatcaagaa 1140 atgagggagt tgctgtcagg actggactat gaagctagat gcatatcaca atcagggtgg 1200 gtgaatgaaa ccagtccttt tacggagaaa tacctccttc ctcccaaatt tggaagatgc 1260 cctttggctg caaaggaaga atccattcca aaaatcccag atggccttct aattcccacc 1320 agtggaaccg ataceactgt aaccaaacct aagagcagaa tttttggaat cgatgacctc 1380 attattggtg tgctctttgt tgcaatcgtt gaaacaggaa ttggaggcta tctgcttgga 1440 agtagaaaag aatcaggagg aggtgtgaca aaagaatcag ctgaaaaagg gtttgagaaa 1500 attggaaatg acatacaaat tttaaaatct tctataaata tcgcaataga aaaactaaat 1560 gacagaattt ctcatgatga gcaagccatc agagatctaa ctttagaaat tgaaaatgca 1620 agatctgaag ctttattggg agaattggga ataataagag ccttattggt aggaaatata 1680 agcataggat tacaggaatc tttatgggaa ctagcttcag aaataacaaa tagagcagga 1740 gatctagcag ttgaagtctc cccaggttgc tggacaattg acaataacat ttgtgatcaa 1800 agctgtcaaa attttatttt caagttcaac gaaactgcac Ct^ttCCââC cattccccct 1860 cttgacacaa aaattgatct gcaaccagat cctttttact ggggaagcag cttgggctta 1920 gcaataaceg ctactatttc attggcagct ttggtgatct. ctgggatcgc catctgcaga 1980 actaaatgat tgagacaatt tcgaaaaatg gataatgtgt tggtcaatat tttgtacagt 2040 tttataaaaa acaaaaatcc ccttgctact gct 2073 <210> 28 <211> 1670 <212> ADN <213> Virus da Gripe <400> 28 agatcttcgc tgacacaata tgtataggct accatgccaa caactcaacc gacactgtcg 60 acacagCact tgagaagaat gtgacagtga cacactctgt caacctactt gaggacagCc 120 acaatggaaa accatgtcta ctaaaaggaa tagccccact acaattgggt aattgcagcg 180 ttgccggatg gatcttagga aacccagaat gcgaattact gatttccaag gaatcatggt 240 cctacattgt agaaacacca aatcctgaga atggaacatg ttacccaggg tatttcgccg 300 actatgagga actgagggag caattgagtt cagtatcttc atttgagaga ttcgaaatat 360 tccccaaaga aagctcatgg cccaaccaca ccgtaaccgg agtatcagca tcatgctccc 420 ataatgggaa aagcagtttt tacagaaatt tgctatggct gacggggaag aatggtttgt 480 acccaaacct gagcaagCcc tatgtaaaca acaaagagaa agaagtcctt gtactatggg 540 gtgttcatca cccgcctaac atagggaacc aaagggcact cEatcataca gaaaatgctt 600 atgtctctgt agtgtcttca catcatagca gaagatccac cccagaaata gccaaaagac 660 ccaaagtaag agatcaggaa ggaagaatca actactactg gactctgctg gaacctgggg 720 atacaataat atttgaggca aatggaaatc taatagcgcc atggtatgct tfcfcgcactga 780 gtagaggctt tggatcagga atcatcacct caaatgcacc aatggatgaa tgtgatgcga 840 agtgtcaaac acctcaggga gctataaaca gcagtcttcc ttcccagaat gtacacccag 900 tcacaatagg agagtgteca aagtatgtca ggagtgcaaa attaaggatg gttacaggac 960 taaggaacat cccatccatt caatccagag gtttgtttgg agccattgcc ggtttcattg 1020 aaggggggtg gactggaatg gtagatgggt ggtatggtta tcatcatcag aatgagcaag 1080 gatctggcta tgctgcagat caaaaaagca cacaaaatgc cattaacggg attacaaaca 1140 aggtcaatte tgtaattgag aaaatgaaca ctcaattcac agctgtgggc aaagagttca 1200 acaaattgga aagaaggatg gaaaactcaa ataaaaaagt tgatgatggg tttctagaca 1260 tttggacata taatgcagaa ttgttggttc tactggaaaa tgaaaggact ttggatttcc 1320 189 atgactccaa tgtgaagaat ctgiatgaga aagtaaaaag ccaattaaag aataatgcca 1380 aagaaatagg aaacgggcgt ttcgagttct atcacaagtg taacaatgaa tgcatggaga 1440 gtgtgaaaaa tggtacctat gaetatccaa aatattccga agaatcaaag ttaaacaggg 1S00 agaaaattga tggagtgaaa ttggaatcaa tgggagtata ccagattctg gcgatctacc. 1560 caactgtcgc cagttccctg gttetttcgg tctccctggg ggcaatcagc ttctggatgt 1620 gttccaatgg gtcttCgcag tgtagaatat gcatctaaga gctcaggcct 1670
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<210> 33 <211> 1711 <212> ADN <213> Virus da Gripe <400> 33 atgaaagcaa aactactggt cctgttatgt acatt.tacag ctacatafcgc agacacaata 60 tgtataggct accatgccaa caactcaacc gacactgttg acacagtact tgagaagaat 120 gtgacagtga cacactctgt caacccactt gaggacagte acaatggaaa actatgtcta 180 ctaaaaggaa tagccccact acaattgggt aattgcagcg ttgccggatg gatcttagga 240 aacccagaat gcgaafctact gatttccaag gaatcatggt cctacattgt agaaacacca 300 aatcctgaça atggaacatg ttacccaggg tatttcgcçg aetatgagga actgagggag 360 caattgagtt cagtatcttc atttgagaga ttcgaaatat tccccaaaga aagctcatgg 420 cccaaccaca ccgtaaccgg agtatcagca tcatgctccc ataatgggaa aagcagtttt 480 tacagaaatc tgctatggct gacggggaag aatggtttgt acccaaacct gagcaagtcc 540 tatgtaaaca acaaagagaa agaagtcctt gtactatggg gtgttcacca cccgcctaac 600 atagggaacc aaagggcccC ctaccataca gaaaatgctt atgtctctgt agtgtcttca 660 cattatagca gaagattcac cccagaaata gccaaaagac ccaaagtaag agatcaggaa 720 191 ggaagaatca actactactg gactctgctg gaacctgggg acacaataat atttgaggca 780 aatggaaatc taatagcgcc atggtatgct tttgcactga gtagaggctt tggatcagga 840 atcatcâcet eaaatgcacc aatggatgaa tgtgatgcga agtgtcaaac acctcaggga 900 gctataaaca gcagccttcc tccccagaat gtacacccag tcacaatagg agagcgtcoa 960 aagtatgtca ggagtgcaaa attaaggatg gttacaggac taaggaacat cccatccatc 1020 caatccagag gtttgtttgg agccattgcc ggtttcattg aaggggggtg gactggaatg 1080 gtagatgggt ggtatggtta tcatcatcag aatgagcaag gatctggcta tgctgcagat 1140 caaaaaagta cacaaaatgc cattaacggg attacaaaca aggtgaattc tgtaattgag 1200 aaaatgaaca ctcaattcac agctgtgggc aaagaattca acaaattgga aagaaggatg 1260 gaaaacttaa ataaaaaagt tgatgatggg tttctagaca tttggacata taatgcagaa 1320 ttgttggttc tactggaaaa tgaaaggact ttggatttcc atgactccaa tgtgaagaaC 1380 ctgtatgaga aagtaaaaag ccaattaaag aataatgcca aagaaatagg aaacgggtgt 1440 tttgaattct atcacaagtg taacaatgaa tgcatggaga gtgtgaaaaa tggaacttat 1500 gactatccaa aatattccga agaatcaaag ttaaacaggg agaaaattga tggagtgaaa 1560 ttggaatcaa tgggagtcta tcagattctg gcgatctact caactgtcgc cagttccctg 1620 gttcttttgg tctccctggg ggcaatcagc ttctggatgt gttccaatgg gtctttgcag 1680 tgtagaatat gcatctgaga ccagaatttc a 1711
<210> 34 <211> 1781 <212> ADN <213> Medicago Sativa <400> 34 ccaaatcctt aacattcttt caacaccaac aatggcgaaa aacgfcfcgcga ttttcggttt 60 attgttttct cttcttctgt tggttccttc tcagatcttc gctgaggaat catcaactga 120 egccaaggaa tttgttctta cattggataa cactaatttc catgacactg ttaagaagca 180 cgatttcatc gtcgttgaat tctacgcacc ttggtgtgga cactgtaaga agetagcccc 240 agagtatgag aaggctgctt ctatcttgag cactcacgag ccaccagttg ttttggctaa 300 agttgatgcc aatgaggagc acaacaaaga cctcgcatcg gaaaatgatg ttaagggatt 360 cccaaccact aagatttfcta ggaatggtgg aaagaacatc caagaataca aaggtccccg 420 tgaagctgaa ggtattgttg agtatttgaa aaaacaaagt ggccctgcat ccacagaaat 480 taaatctget gatgatgega ccgcttttgt tggtgacaac aaagtfcgtta tcgtcggagt 540 192 ettccetaaa fctfctstggtg aggagtacga taacttc&tt gcatcagcag agaagttgegf €00 £C.ctgâôtat gactttgctc acacEttgaa fcgeesaa.eãc cttccaaagg gagacteatâ 660 agtgtctggg cctgtggtta ggttstfcfcaa g-ocatttgac gagcfcctttg ttqactcaaa 730 ggatttcaat gbagaagctc tagagaaatt eaJttgaagaa tccageaccc caactgtgãc 780 tgtatfceaae aatgageeta gesateacec ttttgttgt-e aaafctefcfcta aetctceeaa 040 cgcaaaggct atgttgttca tcaacfcttac taccgaaggt gccgaatctt tcaaaaeaaa 900 ataccatgaa gtggctgagc aaeacaaaca acagggagtt agctttcttg tcggagatgt 960 cgagtcfcagt eaaggtgcct tccagCattt tggactgaag gaagaacaag tacctctaat 1020 tattattcag cataatgatg gcaagaagtt tttcaaaccc aatttggaac ttgabcaact 1080 cceaacttgg ttgaaggcat acaaggatgg caaggt&gaa ccatttgtca agtetgaacc 1140 tattcctgaa actaacaacg agcctgttaa agtggtggtt gggcaaactc ttgaggacgt 1200 tgttfctcaag tctgggaaga atgttttgat agagttttat gctCCttggt gtggfccactg 1260 eaagcagttg gctccaatct tggatgaagt tgctgtctca ttccaaagcg atgctgatgc 1320 cgttaCtgca aaactggatg caactgccaa cgatatccea accgacaccc ttgacgtcca 1380 aggctatcca accttgtact tcaggtcagc aagtggaaaa ctatcacaat acgacggtgg 1440 caggacaaag gaagacatca tagaattcat tgaaaagaac aaggataaaa ctggtgctgc 1500 tcatcaagaa gtagaacaac caaaagccgc tgctcagcca gaagcagaac aaccaaaaga 1560 tgagctttga aaagttccgc ctggaggata tcggcacaca gtcatctgcg ggctttacaa 1620 ctcttttgta tctcagaatc agaagfctagg aaatcttagt gccaatctat ctafcttttgc 1690 gfcttcatttt atctttctgg ttfcactcfcaa tgtattactg aataatgtga gttttggcgg 1740 agtttagtac tggaactttt gtttctgtaa aaaaaaaaaa a 1781
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<210> 36 <211> 1788 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Clone <400> 36 194 cactttgtga gtctacactt tgattccctt caaacacata caaagagaag agactaatta 60 attaattaat catcttgaga gaaaatgaaa gtaaaactac tggtcctgtt atgcacattt 120 acagctacat atgcagacac aatatgtata ggctaccatg ctaacaactc gaccgacact 180 gttgacacag tacttgaaaa gaatgtgaca gtgacacact ctgtcaacct gcttgagaac 240 agtcacaatg gaaaactatg tctattaaaa ggaatagccc cactacaatt gggtaattgc 300 agegttgccg ggtggatctt aggaaaccca gaatgcgaat tactgatttc caaggagtca 360 tggtcctaca tegeagaaaa accaaaccct gagaatggaa catgttaccc agggcatttc 420 gccgaccatg aggaactgag ggagcaattg agttcagtat cctcatttga gaggttcgaa 480 acattcccca aagaaagctc atggcccaac cacaccgtaa ccggagtgtc agcatcatgc 540 tcccataatg gggaaagcag tttttacaga aatttgctat ggctgacggg gaagaatggt 600 ttgtacccaa acccgagcaa gCccCatgca aacaacaaag aaaaagaagt ccttgtacta 660 tggggtgttc atcacccgcc aaacataggt gaccaaaagg ccctctatca tacagaaaat 720 gcttatgect ccgtagtgtc Ctcacattat agcagaaaat tcaccccaga aatagccaaa 780 agacccaaag taagagatca agaaggaaga atcaaccact actggactct gcttgaaccc 840 ggggatacaa taatatttga ggcaaatgga aatctaatag cgccaagata tgctttcgca 900 ctgagtagag gctttggatc aggaatcatc aactcaaatg caccaatgga taaatgtgat 960 gcgaagtgcc aaacacctca gggagccata aacagcagtc ttcctttcca gaacgtacac 1020 ccagtcacaa taggagagtg tccaaagtat gtcaggagtg caaaattaag gatggttaca 1080 ggactaagga acatcccatc cattcaatcc agaggtttgt ttggagccat tgccggtttc 1140 atCgaagggg ggtggactgg aatggcagat ggttggtatg gttatcatca tcagaatgag 1200 caaggatctg gctatgctgc agatcaaaaa agcacacaaa atgccattaa Cgggattaca 1260 aacaaggtca attctgtaat Cgagaaaatg aacactcaat tcacagcagt gggcaaagag 1320 ttcaacaaat tggaaagaag gatggaaaac ttgaataaaa aagttgatga tgggtttata 1380 gacatttgga catataatgc agaactgttg gttctactgg aaaatgaaag gactttggat 1440 ttccatgact ccaatgtgaa gaatctgtat gagaaagtaa aaagccagtt aaagaataat 1500 gctaaagaaa taggaaatgg gtgttttgag ttctatcaca agtgtaacga tgaatgcatg 1560 gagagtgtaa agaatggaac ttatgactat ccaaaatatt ccgaagaatc aaagttaaac 1620 agggagaaaa ttgatggagt gaaattggaa tcaatgggag tctatcagat tctggcgatc 1680 tactcaacag tcgccagttc tctggttctt ttggtctccc tgggggcaat cagcttctgg 1740 atgtgttcca atgggtcttt acagtgtaga atatgcatct aagagctc 1788 <210> 37 <211> 1788
<212> ADN 195 <213> Sequência Artificial <220> <223> Clone <400> 37 cacttfcgtga gtctacactt tgattccctt caaacacata caaagagaag agactaatta 60 attaafctaat catcttgaga gaaaatgaaa gtaaaactac tggtcctgtt acgcacactt 120 acagctacat atgcagacac aatatgtata ggctaccatg ccaacaactc aaccgaeaet 180 gttgacacag cacttgagaa gaatgtgaca gtgacacact ctgtcaacct gcttgaggac 240 agtcacaatg gaaaattatg tctettaaaa ggaatagccc cactaeaatt gggtaattgc 300 agcgttgccg gatggatctt aggaaaccca gaatgcgaafc tactgatttc cagggaatca 360 tggtcctaca ttgtagaaaa accaaatcct gagaatggaa catgttaccc agggcacttc 420 gccgactatg aggaactgag ggagcaattg agttcageat cttcatttga gagattcgaa 480 atattcccca aagaaagctc atggcccaac cacaccacaa ccggagtatc agcatcatgc 540 ccccataatg gggaaagcag ttcccacaaa aatttgctat ggctgacggg gaagaatggt 600 ttgtacccaa acctgagcaa gtcctatgca aacaacaaag agaaagaagt ccctgtacta 660 tggggtgttc atcacccgcc taacataggt gaccaaaggg ctctctatca taaagaaaat 720 gcttatgtet ctgtagtgtc ttcacattat agcagaaaat ccaecccaga aatagccaaa 780 agacccaaag taagagacca agaaggaaga atcaactacE actggactct acttgaaccc 840 ggggatacaa taatatctga ggcaaatgga aatctaacag cgccaagata tgctttcgca 900 ccgagtagag gctttggatc aggaatcatc aacccaaatg caccaatgga tgaatgtgat 960 gcgaagtgcc aaacacctca gggagctata aacagcagtc ttcctttcca gaatgtacac 1020 cctgtcacaa taggagagtg tccaaagtat gtcaggagtg caaaattaag gatggttaca 1080 ggactaagga acatcccatc cattcaatcc agaggtttgt ttggagccat tgccggtttc 1140 attgaagggg ggtggactgg aatggtagat ggttggtatg gttatcatca tcagaatgag 1200 caaggatctg gctatgctgc agatcaaaaa agcacacaaa atgccattaa tgggattaca 1260 aaeaaggtca attctgtaat tgagaaaatg aacactcaat tcacagccgt gggcaaagag 1320 ttcaacaaat tggaaagaag gatggaaaac ttaaataaaa aagttgatga tgggtttata 1380 gacatttgga catataatgc agaattgttg gttctactgg aaaatgaaag gactttggat 1440 ttccatgact ccaatgtgaa gaatctgtat gagaaagtaa aaagccaatt aaagaataat 1S00 gccaaagaaa taggaaatgg gtgttttgag ttctatcata agtgtaacga tgaatgcatg 1S60 196 gagagfcgtaa aaaatggaac ttafcgactat ccaaaatatt ccgaagaatc aaagttaaac 1620 agggagaaaa Ctgatggagt gaaattggaa tcaatgggag tctatcagat tctggcgatc 1680 tactcaacag tcgccagttc fcctggttctt ttggtetccc tgggggcaat cagcttetgg 1740 atgtgttcca atgggtcttt gcagcgtaga atatgcatct gagagctc 1788
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<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Clone <400> 42 cactttgtga gtctacactt tgattccctt caaacacata caaagagaag agactaatta 60 attaattaat catcttgaga gaaaatggcc atcatttatc taattctcct gttcacagca 120 gtgagagggg accaaatatg cattggatac catgccaata attccacaga gaaggtcgac 180 acaattctag agcggaacgt cactgcgact catgccaagg acattcttga gaagacccat 240 aacggaaagt tatgcaaact aaacggaacc cctccacttg aactagggga ctgtagcatt 300 gccggatggc tccttggaaa tccagaatgt gataggcttc taagtgtgcc agaatggccc 360 tatataatgg agaaagaaaa ccegagagac ggtttgtgtt atccaggcag cttcaatgat 420 tatgaagaac tgaaacatct cctcagcagc gtgaaacact tcgagaaagt aaagatCctg 480 cccaaagaca gacggacaca gcatacaaca actggaggcc cacgggcctg cgcggtgtct 540 ggtaatccat caccctccag gaacatggtc tggcegacaa agaaagaatc aaattatccg 600 gttgccaaag gatcgtacaa caatacaagc ggagaacaaa tgctaataat ttggggggtg 660 caccatccca atgatgagac agaacaaaga acattgtacc agaatgtggg aacctatgtt 720 tccgtaggca catcaacaCC gaacaaaagg tcaaccccag acatagcaac aaggcctaaa 780 gtgaatggac taggaagtag aatggagttc tcttggaccc tattggatat gtgggacacc 840 ataaattttg agagtactgg taatctaatt gcaccagagt atggattcaa aatatcgaaa 900 agaggtagtt cagggatcat gaaaacagaa ggaacacttg agaactgcga gaccaaatgc 960 caaactcctt tgggagcaat aaatacaaca ttgccttttc acaatgtcca cccactgaca 1020 ataggtgagt gccccaaata tgtaaaatcg gagaagttgg tcttagcaac aggactaagg 1080 aatgttcccc agattgaatc aagaggattg tttggggcaa tagctggttt tatagaagga 1140 ggatggcaag gaatggttga tggttggtat ggataccatc acagcaatga ceagggatca 1200 202 gggtatgcag cagacaaaga atccactcaa aaggcatttg atggaaccac caacaaggta 1260 aattctgtga ttgaaaagat gaacacccaa tttgaagctg ttgggaaaga gttcagtaac 1320 ttagagagaa gactggagaa cttgaacaaa aagatggaag acgggtttet agatgtgtgg 1380 acatacaatg ctgagcttct agttctgatg gaaaatgaga ggacacttga ctttcatgat 1440 cctaatgtca agaatctgta tgataaagtc agaatgcagc tgagagacaa cgtcaaagaa 1500 ctaggaaátg gatgttttga attttatcac aaatgtgatg atgaatgcat gaatagtgtg 1560 aaaaacggga cgtatgatta tcccaagtat gaagaagagt ctaaactaaa tagaaatgaa 1620 atcaaagggg taaaattgag cagcatgggg gtttatcaaa tccttgccat ttatgctaca 1680 gtagcaggtt ctctgtcact ggcaatcatg atggctggga tctctttctg gatgtgctcc 1740 aacgggtctc tgcagtgcag gatctgcata tgagagctc 1779
<210> 43 <211> 1794 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Clone <400> 43 cactttgtga gtctacactt tgattccctt caaacacata caaagagaag AÇ&C CddCtíA 60 attaattaat catcttgaga gaaaacggag aaaatagtgc ttcttcttgc aatagtcagc 120 cttgttaaaa gtgatcagat ttgcattggt taccatçcaa acaactcgac agagcaggtt 180 gacacaataa tggaaaagaa cgttactgtt acacatgccc aagacatact ggaaaagaca 240 cacaacggga agctctgcga tctagatgga gtgaagcctc tgatttcaag agattgtagt 300 gtagctggat ggctcctcgg aaacccaatg tgtgacgagt tcatcaatgt gccggaatgg 360 tctfcacafcag tggagaaggc caacccagcc aatgacctct gttacccagg gaattccaac 420 gactatgaag aactgaaaca cctattgagc agaataaacc attttgagaa aattcagatc 480 atccccaaaa gttcttggtc cgaccatgaa gcctcatcag gggtcagctc agcatgccca 540 taecagggaa cgccctcctt tCtcagaaat gtggtatggc ccatcaaaaa gaacaataca 600 tacccaacaa taaagagaag ctacaataat accaaccagg aagatctttt gatactgtgg 660 gggattcatc attctaatga tgcggcagag cagacaaagc tctatcaaaa cccaaccacc 720 tatatttccg ttgggacatc aacactaaac cagagattgg taccaaaaat agctactaga 780 203 tccaaagtaa acgggcaaag tggaaggatg gatttcttct ggacaatttt aaaaccgaat 840 gatgcaatca acttcgagag taatggaaat ttcattgctc cagaatatgc atacaaaatt 900 gtcaagaaag gggactcagc aattgttaaa agtgaagtgg aatatggcaa ctgcaataca 960 aagtgtcaaa ctccaatagg ggcgataaac tctagtatgc cattccacaa catacaccct 1020 ctcaccatcg gggaatgccc caaatatgtg aaatcaaaca aattagtcct tgcgactggg 1080 ctcagaaata gtcctctaag agaaagaaga agaaaaagag gactatttgg agctatagca 1140 gggtttatag agggaggatg gcagggaatg gtagatggtt ggtatgggta ccaccatagc 1200 aatgagcagg ggagtgggta cgctgcagac aaagaatcca ctcaaaaggc aatagatgga 1260 gtcaccaata aggccaactc gatcattgac aaaatgaaca ctcagtttga ggccgttgga 1320 agggaattta ataacttaga aaggagaata gagaatttaa acaagaaaat ggaagacgga 1380 ttcctagatg tctggactta taatgctgaa cttctggtte tcatggaaaa tgagagaact 1440 ctagacttcc atgattcaaa tgtcaagaac cteeacgaca aggtccgact acagcccagg 1500 gataatgcaa aggagctggg taacggttgt ttcgagttct atcacaaatg tgataatgaa 1560 tgtatggaaa gtgtaagaaa cggaacgtat gactacccgc agtattcaga agaagcaaga 1620 ttaaaaagag aggaaataag tggagtaaaa ttggaaCcaa taggaaccta ccaaatactg 1680 tcaatttatt caacagttgc gagttctcta gcactggcaa tcatggtggc tggtctatct 1740 ttgtggatgt gctccaatgg gtcgttacaa tgcagaattt gcatttaaga gctc 1794
<210> 44 <211> 1797 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Clone <400> 44 204 cactttgtga gtctacactt tgattccctt caaacacata caaagagaag agactaatta 60 attaattaat catcttgaga gaaaatggag aaaatagtgc ttctttttgc aatagtcagt 120 cttgttaaaa gtgatcagat ttgcattggt taccatgcaa acaactcgac agagcaggtt 180 gacacaataa Cggaaaagaa cgttactgtt acacatgccc aagacatact ggaaaagaca 240 cacaatggga agctctgcga tctagatgga gtgaagcctc taattttgag agattgtagt 300 gtagctggat ggctcetcgg aaacccaatg tgtgacgagt tcatcaatgt gccggaatgg 360 tcttacatag tggagaaggc caatccagtc aatgacctct gttacccagg ggatttcaat 420 gactatgaag aattgaaaca cctattgagc agaataaacc attttgagaa aattcagatc 480 atccccaaaa gttcttggtc cagtcatgaa gcctcattgg gggtcagctc agcatgtcca 540 taccagggaa agtcctcctt tttcagaaat gtggtatggc ttatcaaaaa gaacagtaca 600 tacccaacaa taaagaggag ctacaataat accaaccaag aagatctttt ggtaccgtgg 660 gggattcacc atcctaatga tgcggcagag cagacaaagc tctatcaaaa cccaaccacc 720 tatatttccg ttgggacatc tacactaaac cagagattgg taccaagaat agctactaga 780 tccaaagtaa acgggcaaag tggaaggatg gagttcttct ggacaatttt aaaaccgaat 840 gatgcaatca acttcgagag taatggaaat ttcattgctc cagaatatgc atacaaaatt 900 gtcaagaaag gggactcaac aattatgaaa agcgaattgg aatatggtaa ctgcaatacc 960 aagtgtcaaa ctccaatggg ggcgataaac tctagcatgc cattccacaa tatacaccct 1020 ctcaccatcg gggaatgccc caaatatgtg aaatcaaaca gattagtcct tgcgactggg 1080 ctcagaaata gccctcaaag agagagaaga agaaaaaaga gaggattatt tggagctata 1140 gcaggtttta tagagggagg atggcaggga atggtagatg gttggtatgg gtaccaccat 1200 agcaacgagc aggggagtgg gtacgctgca gacaaagaat ccactcaaaa ggcaatagat 1260 ggagtcacca ataaggtcaa ctcgattatt gacaaaatga acactcagtt tgaggccgtt 1320 ggaagggaat ttaacaactt agaaaggaga atagagaatt caaacaagaa gatggaagac 1380 gggttcccag atgtctggac tcataacgct gaacttctag ttctcatgga aaacgagaga 1440 actctagact ttcatgactc aaatgtcaag aacctttacg acaaggtccg actacagctt 1500 agggataatg caaaggagct gggtaacggt tgtttcgagt tctatcataa atgtgataat 1560 gaatgtatgg aaagtgtaag aaacggaacg tatgactacc cgcagtattc agaagaagca 1620 agactaaaaa gagaggaaat aagtggagta aaattggaat caataggaat Ctaccaaata 1680 ttgtcaattt attctacagt ggccagctcc ctagcactgg caatcatggt agctggtcta 1740 tccttatgga tgtgctccaa tgggtcgtta caatgcagaa tttgcattta agagctc 1797
<210> 45 <211> 1791 <212> ADN 205 <213> Sequência Artificial <220> <223> Clone <400> 45 cactttgtga gtccacacCt tgattccctt caaacacata caaagagaag agactaatta 60 attaattaaC catcttgaga gaaaatgatt gcaatcattg taacagcaat actggcagca 120 gccggaaagt cagacaagat ctgcateggg catcatgcca acaattcaac aacacaggta 180 gatacgatac ttgagaagaa tgtgactgtc acacactcaa ttgaattgct ggaaaatcag 240 aaggaagaaa gattctgcaa gatattgaac aaggcccccc tcgacttaag ggaatgtacc 300 atagagggtt ggatcttggg gaatccccaa tgcgacctat bgcttggtga tcaaagctgg 360 tcatacattg tggaaagacc tactgctcaa aacgggatct gctacccagg aaccttaaat 420 gaggtagaag aactgagggc acttattgga tcaggagaaa gggtagagag atttgagatg 480 tttccccaaa gcacctggca aggagttgao accaacagtg gaacaacaag atcctgccct S40 tattetactg gtgcgtcttt ctacagaaac ctcctatgga taataaaaac caagacagca 600 gaatatceag caattaaggg aatctacaac aaeactggaa cccagccaat cctctatttc 660 tggggtgtgc accatcctcc taacaccgac gagcaagata ctctgtatgg ctctggcgat 720 cgatacgtta gaatgggaac tgaaagcatg aattttgcca agagtccgga aatcgcggca 780 aggectgctg tgaatggaca aagaggcaga attgattatt attggtcggt tctaaaacca 840 ggggaaacct tgaatgtgga atctaatgga aatctaatcg ccccttggta tgcatacaaa 900 tttgtcaaca caaatagtaa aggagccgtc ttcaggtcag atttaccaac cgagaactgc 960 gatgccacat gccagaceat tgcaggggtt ctaaggacca ataaaacatt tcagaacgtg 1020 agtcccctgt ggataggaga atgtcccaaa tacgtgaaaa gtgaaagcct gaggcttgca 1080 actggactaa gaaatgttcc acagatcgaa actagaggac tcttcggagc tattgcaggg 1140 tttattgaag gaggatggac tgggatgaca gatgggtggt atggctatca ccatgaaaat 1200 tctcaagggt caggatatgc agcagacaga gaaagcactc aaaaggctgt aaacagaatt 1260 acaaataagg tcaattccat catcaacaaa atgaacacac aatttgaagc tgtcgatcac 1320 gaattttcaa acctggagag gagaattgac aatctgaaca aaagaatgca agatggattt 1380 ctggatgttt ggacatacaa tgctgaaetg ttggctcttc ttgaaaacga aagaacacta 1440 gacatgcatg acgcaaatgt gaagaaceta catgaaaagg ccaaatcaca actaagggac 1500 aatgctacga tcttagggaa tggttgcttt gaattttggc ataagtgtga caatgaatgc 1560 206 atagagtctg teaaaaatgg tacatatgac tatcccaaac accagaetga aagcaaatta 1620 aacaggctaa aaatagaatc agtaaagcta gagaaccttg gfcgtgtatca aattcttgcc 1680 atttatagta cggtatcgag cagcctagtg ttggtaggge tgatcatggc aatgggfcctt 1740 tggatgtgtt caaatggttc aatgcagtgc aggatatgta tataagagct c 1791 <210> 46 <211> 1803 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Clone <4 0 0> 46 cactttgtga gtctacactt tgattccctt caaacacata caaagagaag agactaatta 60 attaattaat eatcttgaga gaaaatgaac actcaaattc taatattagc cacttcggca 120 ttcttctatg tacgtgcaga taaaatctgc ctaggacatc atgccgtgtc taatggaacc 180 aaagtagaca cccttactga aaaaggaata gaagttgcca atgcaacaga aacagtcgaa 240 caaacaaaca tccctaagat ctgctcaaaa ggaaaacaga ctgttgacct tggtcaacgt 300 ggattactag ggaccgttat tggtcctccc caatgtgacc aatttcttga gttctctgct 360 aatttaatag ttgaaagaag ggaaggtaat gacatttgtt atccaggcaa atttgacaat 420 gaagaaacat tgagaaaaat actcagaaaa tccggaggaa ttaaaaagga gaatatggga 480 ttcacatata ccggagtgag aaccaatgga gagactagcg catgtagaag gtcaagatct 540 tccttttatg cagagatgaa atggcfcfccta tccagcacag acaatgggac atttceacaa 600 atgacaaagt cctacaagaa cactaagaag gtaccagctc tgataatctg gggaatccac 660 cactcaggat caactactga acagactaga ttatatggaa gtgggaataa attgataaca 720 gtttggagtt ccaaatacca acaatctttt gtcccaaatc ctggaccaag accgcaaatg 780 aatggtcaat caggaagaat tgsctttcac tggctgatgc tagatcccaa tgatactgtc 840 actttcagtt ttaatggggc ctttatagca cctgaccgcg ccagttttct aagaggtaaa 900 tctctaggaa tccaaagtga tgcacaactt gacaataatc gtgaaggtga atgctatcat 960 attggaggta ctataattag caacttgccc tttcaaaaca ttaatagtag ggcaatcgga 1020 aaatgcccca gatacgtgaa gcagaagagc ttaatgctag caacaggaat gaaaaatgtt 1080 cctgaagctc ctgcacataa acaactaact catcacacgc gcaaaaaaag aggtttattt 1140 207 ggtgcaatag caggattcat tgaaaatggg tgggaaggat taatagacgg atggtatgga 1208 tataagcatc agaatgcaca aggagaaggg actgctgcag actacaaaag tacacaatct 1260 gctatcaacc aaataaccgg aaaattgaac agactaatag aaaaaaceaa ccagcaattc 1320 gaactaatag ataatgagtt caatgaaata gaaaaacaaa ttggcaatgt tattaactgg 1380 aetagagafct ctatcafccga agtafcggtca tataatgcag agttcctcgt agcagtggag 1440 aatcaacaca ctattgattt aactgactca gaaatgaaea aactatatga aaaggtaaga 1500 agaeaactga gagaaaatgc tgaggaagat ggtaatggct gttttgaaat attccaccaa 1560 tgtgacaatg attgcatggc cagcattaga aacaacacat atgaccataa aaaatacaga 1620 aaagaggcaa tacaaaacag aatccagatt gacgcagtaa agt tgagcag tggttacaaa 1680 gatataatac tttggtttag cttcggggca tcatgtttct tatttcttgc cattgcaatg 1740 ggtcttgttt tcatatgtat aaaaaatgga aacatgcggt gcactatttg tatataagag 1800 Ctc 1803 <210> 47 <211> 1773 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Clone <400> 47 cactttgtga gtctacactt tgattccctt caaacacata caaagagaag agactaatta 60 attaattaat catcttgaga gaaaacggaa acaatatcac taataactat actactagta 120 gtaacagcaa gcaatgcaga taaaatctgc atcggccacc agtcaacaaa ctccacagaa 180 actgtggaca cgctaacaga aaccaatgtt cctgtgacac atgccaaaga attgctccac 240 acagagcata atggaatgct gtgtgcaaca agcctgggac atcccctcat tctagacaca 300 tgcactattg aaggactagt ctatggcaac ccttcttgtg acctgctgtt gegaggaaga 360 gaatggtect acatcgtcga aagateatea gctgtaaatg gaacgtgtta ccctgggaat 420 gtagaaaacc tagaggaact caggacactt tttagttccg ctagttccta ccaaagaatc 480 caaatcttcc cagacacaac ccggaatgtg acttacactg gaacaagcag agcatgttca 540 ggttcattct acaggagtat gagatggctg actcaaaaga gcggttttta ccctgttcaa 600 gacgcccaat acacaaataa caggggaaag ageattettt tcgtgtgggg catacatcac 660 208 ccacccacct ataccgagca aacaaatttg tacataagaa acgacacaac aacaagcgtg 720 acaacagaag atttgaatag gaccctcaaa ccagtgatag ggccaaggcc ccttgtcaat 780 ggtctgcagg gaagaattga ttattattgg tcggtactaa aaccaggcca aacattgcga 840 gtacgatcca atgggaacct aattgctcca tggtatggac acgttcttte aggagggagc 800 catggaagaa tcctgaagac tgatttaaaa ggtggtaatc gtgtagtgca atgtcagact 960 gaaaaaggtg gcttaaacag tacattgcca ttccacaata tcagtaaata tgcatttgga 1020 acctgçecca aatatgtaag agttaatagt ctcaaactgg cagtcggtct gaggaacgtg 1080 cctgctagat caagtagagg aetatttgga gccatagctg gactcataga aggaggttgg 1140 ccaggactag tcgctggctg gtatggttte cagcattcaa atgatcaagg ggttggtatg 1200 gctgcagata gggattcaac Ccaaaaggca attgataaaa taacatccaa ggtgaataat 1260 atagtcgaca agatgaacaa gcaatatgaa ataattgatc atgaatttag tgaggttgaa 1320 actagactca atatgatcaa taataagatt gacgaccaaa tacaagacgt atgggcatat 1380 aatgcagaat tgctagtact acttgaaaat caaaaaacac tcgatgagca tgatgcgaac 1440 gtgaacaatc tatataacaa ggtgaagagg gcactgggct ccaatgctat ggaagatggg 1500 aaaggctgtt tcgagctata ccataaatgt gatgatcagt gcatggaaac aattcggaac 1560 gggacctata ataggagaaa gtatagagag gaaccaagac tagaaaggca gaaaatagag 1620 ggggttaagc tggaaectga gggaacCtac aaaatcccca ccatttattc gactgtcgcc 1680 tcatctcttg tgcttgcaat ggggtttgct gccttcctgt tctgggccat gtccaatgga 1740 tcttgcagat gcaacatttg tatataagag etc 1773
<210> 48 <211> 565 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Clone <400> 48 209
Met Lys Vai Lys Leu Leu Vai Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr 15 10 15
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Vai Asp Thr Vai Leu Glu Lys Asn Vai Thr Vai Thr His Ser Vai Asn 35 40 45
Leu Leu Glu Asn Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly Ile 50 55 60
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Asn Pro Glu Cys Glu Leu Leu Ile Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95
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Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gin Leu Ser Ser Vai Ser Ser Phe 115 120 125
Glu Arg Phe Glu ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr 130 135 140
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Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Gly Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn 165 170 175 210
Leu Ser Lys Ser Tyr Ala Asn Asn Lys Glu Lys Glu Vai Leu Vai Leu 180 185 190
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Gly Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr Ile 245 250 255
Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Tyr Ala Phe Ala 250 255 270
Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly He He Asn Ser Asn Ala Pro Met 275 280 285
Asp Lys Cys Asp Ala Lys Cys Gin Thr Pro Gin Gly Ala Ile Asn Ser 290 295 300
Ser Leu Pro Phe Gin Asn Val His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro 305 310 315 320
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Ile Pro Ser Ile Gin Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 340 345 350
Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His 355 360 365
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Lys Met Asn Thr Gin Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu 405 410 415 211
Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Vai Asp Asp Gly Phe Ile 420 425 430
Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Vai Leu Leu Glu Asn Glu 435 440 445
Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Vai Lys Asn Leu Tyr Glu Lys 450 455 460
Vai Lys Ser Gin Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys 465 470 475 480
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Met Lys Val Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Vai Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly Ile 50 55 60 Ala Pro Leu Gin Leu Gly Asn Cys Ser Val Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Glu Leu Leu lie Ser Arg Glu Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Vai Glu Lys Pro Asn Pro Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly His Phe 100 105 110
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Artificial
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<210> 62 <211> 3088 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Cassete de Expressão <400> 62 247 ctggtatatt tatacgtcgc caaataactc aaaaaccata aaagtttaag ttagcaagtg 60 tgtacaettt tacttgaaca aaaatattca cctactactg ttataaatca ttattaaaca 120 ttagagtaaa gaaatatgga tgataagaac aagagtagtg atattttgac aacaattctg 180 ttgcaacatt tgagaaaatt ttgttgtcct ctcttttcat tggtcaaaaa caatagagag 240 agaaaaagga agagggagaa taaaaacata atgtgagtat gagagagaaa gttgtacaaa 300 agttgtacca aaatagttgt acaaatatca ttgaggaatt tgacaaaagc tacacaaata 360 agggttaatc gctgtaaata aataaggatg acgcattaga gagatgtacc attagagaat 420 ttttggcaag tcaccaaaaa gaaagaataa attattttta aaattaaaag ttgagtcatt 480 Cgattaaaca tgtgattact taatgaattg atgaaagagC tggattaaag ttgtattagt 540 aattagaatt tggtgtcaaa cctaatttga catttgatct tttcctatat attgccccat 600 agagtcagtt aactcatctt tatatttcat agatcaaaca agagaaataa cggtatatta 660 atccctccaa aaaaaaaaaa cggtatattt actaaaaaat ctaagccacg taggaggata 720 acaggatccc cgtaggagga caacatccaa tccaaccaat cacaacaatc ctgatgagat 780 aacccacttt aagcccacgc atctgtggca catctacatt atctaaatca cacattcttc 840 cacacatctg agccacacaa aaaccaatcc acatccttat cacccattct ataaaaaacc 900 acactttgtg agtctacact ttgattccct tcaaacacat acaaagagaa gagactaatt 960 aattaattaa tcatcttgag agaaaatgaa agtaaaacta ctggtcctgt tatgcacatt 1020 tacagccaca tatgcagaca caatatgtat aggctaccat gctaacaact cgaccgacac 1080 tgttgacaea gtacttgaaa agaatgtgac agtgacacac tctgtcaacc tgcttgagaa 1140 cagCcacaat ggaaaactat gtctattaaa aggaatagcc ccactacaat tgggtaattg 1200 cagcgttgcc gggtggatct taggaaaccc agaa&gcgaa ttactgattt ccaaggagtc 1260 atggtcctac attgtagaaa aaccaaatcc tgagaatgga acatgttacc cagggcattt 1320 cgctgaetat gaggaactga gggagcaatt gagttcagta tcttcatttg agaggttcga 1380 aatattcccc aaagaaagct catggcccaa eeacaccgta aceggagtgt cagcatcatg 1440 ctcccataat ggggaaagca gtctctacag aaatttgcta tggctgacgg ggaagaatgg 1500 tttgtaccca aacctgagca agtcctatgc aaacaacaaa gaaaaagaag tccttgtact 1560 atggggtgtt catcacccgc caaacatagg tgaccaaaag gccctctatc atacagaaaa 1620 tgctcatgtc tctgtagtgt cttcacatta tagcagaaaa ttcaccccag aaatagccaa 1680 aagacccaaa gtaagagatc aagaaggaag aatcaattac tactggactc tgcttgaacc 1740 cggggataca ataatatttg aggcaaatgg aaatctaata gcgccaagat atgctttcgc 1800 actgagtaga ggctttggat caggaatcat caactcaaat gcaccaatgg ataaatgtga 1860 tgcgaagtgc caaacacccc agggagctat aaacagcagt cttcctttcc agaacgtaca 1920 cccagtcaca ataggagagt gtccaaagta tgtcaggagt gcaaaattaa ggatggttac 1980 248 aggactaagg aacatcccat ccattcaatc cagaggtttg tttggagcca ttgccggttt 2040 cattgaaggg gggtggactg gaatggtaga tggttggcat ggttatcatc atcagaatga 2100 gcaaggatcC goctatgetg cagatcaaaa aagcacaeaa aatgccatta atgggattac 2160 aaacaaggtc aattctgtaa ttgagaaaat gaacactcaa cccacagcag tgggcaaaga 2220 gttcaacaaa ttggaaagaa ggatggaaaa cttgaataaa aaagtcgatg atgggtttat 2280 agacatttgg acatacaacg cagaactgct ggttctactg gaaaatgaaa ggactttgga 2340 tttccatgac tccaatgtga agaatctgta tgagaaagta aaaagccagt taaagaataa 2400 tgctaaagaa ataggaaatg ggtgttttga gttctatcac aagtgtaacg atgaatgcat 2460 ggagagtgta aagaatggaa cttatgacta tccaaaatac tccgaagaat caaagttaaa 2520 cagggagaaa attgatggag tgaaafctgga atcaatggga gtctatcaga ttctggcgat 2580 ctactcaaca gtcgccagCt cecfcggttet tttggtctcc ctgggggcaa tcagctfcctg 2640 gatgtgttcc aatgggtctt tacagtgcag aatatgcatc taagagccct aagttaaaat 2700 gcttcttegt ctectattta taatatggtt tgttattgtt aattttgtte ttgtagaaga 2760 gctcaattaa tcgttgttgt tatgaaatac tatttgtatg agatgaactg gtgtaatgta 2820 attcatttac ataagtggag ccagaatcag aatgtttcct ccataactaa ctagacatga 2880 agacotgccg cgtacaattg tcttacattt gaacaactaa aatcgaacat cttttgceac 2940 aactttataa gtggttaata tagctcaaat atatggtcaa gttcaataga ctaataatgg 3000 aaatatcagt tatcgaaatt cattaacaat caacttaacg ttattaacta ctaattttat 3060 atcatcccct ttgataaatg atagtaca 3088
<210> 63 <211> 3102 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Cassete de expressão <400> 63 249 agaggtaccc cgggctggta tatttatatg ttgtcaaata actcaaaaac cataaaagtt 60 taagttagca agtgtgtaca tttttacttg aacaaaaata ttcacctact actgttataa 120 atcattatta aacattagag taaagaaata tggatgataa gaacaagagt agtgatattt 180 tgacaacaat tttgttgcaa catttgagaa aattttgttg ttctctcttt tcattggtca 240 aaaacaatag agagagaaaa aggaagaggg agaataaaaa cataatgtga gtatgagaga 300 gaaagttgta caaaagttgt accaaaatag ttgtacaaat atcattgagg aatttgacaa 360 aagctacaca aataagggtt aattgctgta aataaataag gatgacgcat tagagagatg 420 taccattaga gaatttttgg caagtcatta aaaagaaaga ataaattatt tttaaaatta 480 aaagttgagt catttgatta aacatgtgat tatttaatga attgatgaaa gagttggact 540 aaagttgtat tagtaattag aatttggtgt caaatteaat ttgacatttg atcttttcct 600 atatattgcc ccatagagtc agttaactca tttttatatt tcatagatca aataagagaa 660 ataacggtat attaatccct ccaaaaaaaa aaaacggtat atttactaaa aaatctaagc 720 cacgtaggag gataacagga tccccgtagg aggataacat ccaatccaac caatcacaac 780 aatcctgatg agataaccca ctttaagccc acgcatctgt ggcacatcta cattatctaa 840 atcacacatt cttccacaca tctgagccac acaaaaacca atccacatct ttatcaccca 900 ttctataaaa aatcacactt tgtgagtcta cactttgatt cccttcaaac acatacaaag 960 agaagagact aattaattaa ttaatcatct tgagagaaaa tgaaagtaaa actactggtc 1020 ctgttatgca catttacagc tacatatgca gacacaatat gtataggcta ccatgccaac 1080 aactcaaccg acactgttga cacagtactt gagaagaatg tgacagtgac acactctgtc 1140 aacctgcttg aggacagtca caatggaaaa ttatgtctat taaaaggaat agccccacta 1200 caattgggta attgcagcgt tgccggatgg atcttaggaa acccagaatg cgaattactg 1260 atttccaggg aatcatggtc ctacattgta gaaaaaccaa atcctgagaa tggaacatgt 1320 tacccagggc atttcgccga ctatgaggaa ctgagggagc aattgagttc agtatettea 1380 tttgagagat tcgaaatatt ccceaaagaa agctcatggc ccaaccacac cacaaccgga 1440 gtatcagcat catgctceca taatggggaa agcagtfcttt acaaaaattt gctatggctg 1500 acggggaaga atggtttgta cccaaacctg agcaagtcet atgcaaacaa caaagagaaa 1560 gaagtccttg tactatgggg tgttcatcac ccgcctaaca taggtgacca aagggctctc 1620 tatcataaag aaaatgctta tgtctctgta gtgtcttcac atcatagcag aaaattcacc 1680 ccagaaatag ccaaaagacc caaagtaaga gatcaagaag gaagaatcaa ctactactgg 1740 actctacttg aacccgggga tacaataata tttgaggcaa atggaaatct aatagcgcca 1800 agatatgctt tcgeactgag tagaggcttt ggatcaggaa tcatcaactc aaatgcacca 1860 atggatgaat gtgacgcgaa gtgccaaaca cctcagggag ctataaacag cagtcttcct 1920 250 ttccagaatg tacaccctgt cacaatagga gagtgtccaa agtatgtcag gagtgcaaaa 1980 ttaaggatgg ttacaggact aaggaacatc ccatccattc aatccagagg tttgtttgga 2040 gccattgccg gtttcattga aggggggtgg actggaatgg tagatggttg gtatggttac 2100 catcateaga atgagcaagg atctggctat gctgcagafcc aaaaaagcac acaaaatgcc 2160 attaatggga ttacaaacaa ggtcaattct gtaattgaga aaatgaacac tcaattcaca 2220 gctgtgggca aagagttcaa caaattggaa agaaggatgg aaaacttaaa taaaaaagtt 2280 gatgacgggt tcatagacat ttggacacat aatgcagaat tgttggttct aetggaaaat 2340 gaaaggactt tggatttcca tgactccaat gcgaagaatc tgtatgagaa agtaaaaagc 2400 caattaaaga ataatgccaa agaaatagga aatgggtgtt tegagtecEa tcacaagtgt 2460 aacgatgaat gcatggagag tgtaaaaaat ggaacttatg actatccaaa atattccgaa 2520 gaatcaaagt caaacaggga gaaaactgat ggagtgaaat tggaatcaafc gggagtctat 2580 cagattCLgg cgatctaotc aacagecgcc agttctctgg ttcttttggt ctccctgggg 2640 gcaatcagct tctggatgtg ttccaatggg tctttgcagt gtagaatatg catctgagag 2700 ctctaagtta aaatgcttcc tcgtctccta tttataatat ggcttgttat tgttaatttt 2760 gttcttgtag aagagectaa ttaatcgttg ttgctatgaa atactatttg tatgagatga 2820 actggtgtaa tgcaattcat ttacataagt ggagtcagaa tcagaatgtt tcctccataa 2880 ctaactagac acgaagacct gccgcgtaca attgtettat atctgaacaa ctaaaattga 2940 acatctfcttg ccacaacttt aeaagtggtc aatatagctc aaatatatgg tcaagttcaa 3000 tagattaata atggaaatat cagttatcga aattcattaa caatcaactt aacgctatta 3060 accactaatt ttatatcatc ccctttgata aatgatagta ca 3102
<210> 64 <211> 3093 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Cassete de Expressão <400> 64 251 agaggtaccc cgggctggta tatttatatg ttgtcaaata actcaaaaac cacaaaagtc 60 taagttagca agtgtgtaca CCtCtacttg aacaaaaata ttcacctact actgtCataa 120 atcattatta aacattagag taaagaaata tggatgataa gaacaagagt agtgatattt 180 tgacaacaat tttgttgcaa catttgagaa aatcttgttg ttctctcttt tcattggtca 240 aaaacaatag agagagaaaa aggaagaggg agaataaaaa cataatgtga gtatgagaga 300 gaaagttgta caaaagttgt accaaaatag ttgtacaaat atcattgagg aatttgacaa 360 aagctacaca aataagggtt aattgctgta aataaataag gatgacgcat tagagagatg 420 taccactaga gaattcttgg caagtcatta aaaagaaaga ataaattatt tttaaaatta 480 aaagttgagt catttgatta aacatgtgat tatttaatga attgatgaaa gagttggatt 540 aaagttgtat tagtaattag aatttggtgt caaatttaat ttgacatttg atcttttcct 600 atatattgcc ccatagagtc agttaactca tttttatatt tcatagatca aataagagaa 660 ataacggtat attaatccct ccaaaaaaaa aaaacggtat atttactaaa aaatctaagc 720 cacgtaggag gataaeagga tccccgtagg aggataacat ccaatccaae caatcacaac 780 aatcctgatg agataaccca ctttaagccc acgcatctgt ggcacatcta cattatctaa 840 atcacacatt cttccacaca tctgagccac acaaaaacca atccacatct ttatcaccca 900 ttctataaaa aatcacactt tgtgagtcta cactttgatt cccttcaaac acatacaaag 960 agaagagact aattaattaa ttaatcatct tgagagaaaa tggccatcat ttatctaatt 1020 ctcctgttca cagcagtgag aggggaccaa atatgcattg gataccatgc caataattcc 1080 acagagaagg tcgacacaat Cctagagcgg aacgtcactg tgactcatgc caaggacatt 1140 cttgagaaga cccataacgg aaagtcatgc aaactaaacg gaatccctcc acttgaacta 1200 ggggactgta gcattgccgg atggctcctt ggaaatccag aatgtgatag gcttctaagt 1260 gcgccagaat ggtcctacat aatggagaaa gaaaacccga gagacggttt gtgttatcca 1320 ggcagcttea atgatcatga agaattgaaa catctcctca gcagcgtgaa acatttcgag 1380 aaagtaaaga ttctgcccaa agacagatgg acacagcata caacaactgg aggttcacgg 1440 gcctgcgcgg tgtctggtaa tccatcattc ttcaggaaca tggtctggct gacaaagaaa 1500 gaatcaaatt atccggttgc caaaggatcg tacaacaata caagcggaga acaaatgcta 1560 252 ataatttggg gggtgcacca tcccaatgat gagacagaac aaagaacatt gtaccagaat 1620 gtgggaacct atgtttccgt aggcacatca acattgaaca aaaggtcaac cccagacata 1680 gcaacaaggc ctaaagtgaa tggactagga agtagaatgg agttctcttg gaccctattg 1740 gatacgtggg acaccataaa ttttgagagt aceggtaatc taatcgcacc agagtatgga 1800 ttcaaaatat cgaaaagagg tagttcaggg atcatgaaaa cagaaggaac acttgagaac 1860 cgtgagacca aatgccaaac tcctttggga gcaataaata caacattgcc ttttcacaat 1920 gtccacccac tgacaatagg tgagtgcccc aaatatgtaa aatcggagaa gttggtctta 1980 gcaacaggac taaggaatgt tccccagatt gaatcaagag gattgtttgg ggcaatagct 2040 ggttttatag aaggaggatg gcaaggaatg gttgatggtt ggcacggaca ccatcacagc 2100 aatgaccagg gatcagggta tgcagcagac aaagaatcca ctcaaaaggc atttgatgga 2160 atcaccaaca aggtaaattc tgtgattgaa aagatgaaca cccaatttga agctgttggg 2220 aaagagttca gtaacttaga gagaagactg gagaacttga acaaaaagat ggaagacggg 2280 tttctagatg tgtggacata caaegctgag cttctagttc tgacggaaaa tgagaggaca 2340 cttgactttc atgaccctaa tgtcaagaat ctgtaegaca aagtcagaat gcagctgaga 2400 gacaacgtca aagaactagg aaatggatgt tttgaatttt atcacaaatg cgatgatgaa 2460 tgcatgaata gtgtgaaaaa cgggacgcat gattatccca agtatgaaga agagtctaaa 2520 ctaaatagaa atgaaatcaa aggggtaaaa ctgagcagca tgggggttta tcaaatcctt 2580 gccatttatg ctacagtagc aggttctctg tcactggcaa tcatgatggc tgggatctct- 2640 ttctggacgt gctccaacgg gtcCctgcag tgcaggatct gcatatgaga gctctaagtt 2700 aaaatgcttc ttcgtctcct atttataata tggtttgtta ttgctaactt cgttcttgta 2760 gaagagctta attaatcgtt gttgttatga aatactattt gtatgagatg aactggtgta 2820 atgtaattca tttacataag tggagtcaga atcagaatgt ttcctccata actaactaga 2880 catgaagacc tgccgcgtac aattgtctta tatttgaaca actaaaattg aacatctttt 2940 gccacaactt tataagtggt taatatagct caaatatatg gtcaagctca atagattaat 3000 aatggaaata tcagttatcg aaattcatta acaatcaact taacgttatc aactactaac 3060 tttatatcat cccctttgat aaatgatagt aca 3093
<210> 65 <211> 3108 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Cassete de Expressão 253 <400> 65 agaggtaccc cgggctggta tatttatatg ttgtcaaata actcaaaaac cataaaagtt 60 taagttagca agtgtgtaca tttttacttg aacaaaaata ttcacctact actgttataa 120 atcattatta aacattagag taaagaaata tggatgataa gaacaagagt agtgatattt 180 tgacaacaat tttgttgcaa catttgagaa aattttgttg ttctctcett tcattggtca 240 aaaacaacag agagagaaaa aggaagaggg agaataaaaa cataatgtga gtatgagaga 300 gaaagttgta caaaagttgt accaaaatag tegtacaaat atcattgagg aatttgacaa 360 aagctacaca aataagggtt aattgctgta aataaataag gatgacgcat tagagagatg 420 taccattaga gaatttttgg caagtcatta aaaagaaaga ataaattatt tttaaaatta 480 aaagttgagt catttgatta aacatgtgat tatttaatga attgatgaaa gagttggatt 540 aaagttgtat tagtaattag aatttggtgt caaatttaat ttgacatttg atcttttcct 600 atatattgcc ccatagagtc agttaactca tttttatatt tcatagatca aataagagaa 660 ataacggtat attaatccct ccaaaaaaaa aaaacggtac atttactaaa aaatctaagc 720 cacgCaggag gataacagga tccccgtagg aggataacat ccaatccaac caatcacaac 780 aatcctgatg agataaccca ctttaagccc acgcatctgt ggcacatcta cattatctaa 840 atcacacatt cttccacaca tctgagccac acaaaaacca atccacatct ttatcaccca 900 ttctataaaa aatcacactt tgtgagtcta cactttgatt cccttcaaac acatacaaag 960 agaagagact aattaattaa ttaatcatct tgagagaaaa tggagaaaat agtgcttctt 1020 cttgcaatag tcagccttgt taaaagtgat cagatttgca ttggttacca tgcaaacaac 1080 tcgacagagc aggttgacac aataatggaa aagaacgtta ctgttacaca tgcccaagac 1140 atactggaaa agacacacaa cgggaagctc tgcgatctag atggagtgaa gcctctgatt 1200 ttaagagatt gtagtgtagc tggatggctc ctcggaaacc caatgtgtga cgagttcatc 1260 aatgtgccgg aatggtctta catagtggag aaggccaacc cagccaatga cctctgttac 1320 ccagggaatt tcaacgacta tgaagaactg aaacacctat tgagcagaat aaaccatttt 1380 gagaaaattc agatcatccc caaaagttct tggtccgatc atgaagcctc atcaggggtc 1440 agctcagcat gtccatacca gggaacgccc tcctttttca gaaatgtggt atggcttatc 1500 aaaaagaaca atacataccc aacaataaag agaagctaca ataataccaa ccaggaagat 1560 cttttgatac tgtgggggat tcatcattct aatgatgcgg cagagcagac aaagccctat 1620 caaaacccaa ccacctatat Ctccgtcggg acatcaacac taaaccagag attggtacca 1680 aaaatagcta ccagatccaa agtaaacggg caaagtggaa ggatggattt cttctggaca 1740 attttaaaac cgaatgatgc aatcaacttc gagagtaatg gaaatttcat tgctccagaa 1800 254 tatgcataca aaactgtcaa gaaaggggac tcagcaattg ttaaaagtga agtggaatat 1860 ggtaactgca atacaaagtg tcaaactcca ataggggcga taaactctag tatgccattc 1920 caeaacatac accctctcac catcggggaa tgccccaaat atgtgaaatc aaacaaatta 1980 gtccttgcga ctgggctcag aaatagtcct ctaagagaaa gaagaagaaa aagaggacta 2040 tttggagcta tagcagggtt taCagaggga ggatggcagg gaatggtaga tggttggtat 2100 gggtaccacc atagcaatga gcaggggagt gggtacgctg cagacaaaga atccactcaa 2160 aaggcaatag atggagtcac caataaggtc aactcgatca ttgacaaaat gaacactcag 2220 tttgaggccg ttggaaggga atttaataac ttagaaagga gaatagagaa tttaaacaag 2280 aaaatggaag acggattcct agatgtctgg acttataatg ctgaacttct ggttctcatg 2340 gaaaatgaga gaactctaga cttccatgat tcaaatgtca agaaccttta cgacaaggtc 2400 cgactacagc ttagggataa tgcaaaggag ctgggCaacg gttgtttcga gttctatcac 2460 aaatgtgata atgaatgtat ggaaagtgta agaaacggaa cgtatgacta cccgcagtat 2520 tcagaagaag caagattaaa aagagaggaa ataagtggag taaaattgga atcaatagga 2580 acttaccaaa tactgtcaat ttattcaaca gttgcgagtt ctctagcact ggcaatcatg 2640 gtggctggtc tatctttgtg gatgtgctcc aacgggtcgt tacaatgcag aatttgcatt 2700 taagagctct aagttaaaat gcttcttcgt ctcctattta taatatggtt tgttattgtt 2760 aattttgttc ttgtagaaga gcttaattaa tcgttgttgt tatgaaatac tatttgtatg 2820 agatgaactg gtgtaatgta attcatttac ataagtggag tcagaatcag aatgtttcct 2880 ccataactaa ctagacatga agacctgccg cgtacaattg tcttatattt gaacaactaa 2940 aattgaacat cttttgccac aactttataa gtggttaata tagctcaaat atatggtcaa 3000 gttcaataga ttaataatgg aaatatcagt tatcgaaatt cattaacaat caacttaacg 3060 ttattaacta ctaattttat atcatcccct ttgataaatg atagtaca 3108
<210> 66 <211> 3111 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Cassete de Expressão <400> 6 6 255 agaggtaccc cgggctggta tatttatatg ttgtcaaata actcaaaaac cataaaagtt 60 taagttagca agtgtgtaca tttttacttg aacaaaaata ttcacctact actgttataa 120 atcattatta aacattagag taaagaaata tggatgataa gaacaagagt agtgatattt 180 tgacaacaat tttgttgcaa catttgagaa aattttgttg ttctctcttt tcattggtca 240 aaaacaatag agagagaaaa aggaagaggg agaataaaaa cataatgtga gtatgagaga 300 gaaagttgta caaaagttgt accaaaatag ttgtacaaat atcattgagg aatttgacaa 360 aagctacaca aataagggtt aattgctgta aataaataag gatgacgcat tagagagatg 420 taccattaga gaatttttgg caagtcatta aaaagaaaga ataaattatt tttaaaatta 480 aaagttgagt catttgatta aacatgtgat tatttaatga attgatgaaa gagttggatt 540 aaagttgtat tagtaattag aatttggtgt caaatttaat ttgacatttg atcttttcct 600 atatattgcc ccatagagtc agttaactca tttttatatt teatagatea aataagagaa 660 ataacggtat attaatccct ccaaaaaaaa aaaacggtat atttactaaa aaatctaagc 720 cacgtaggag gataacagga tccccgtagg aggataacat ccaatccaac caatcacaac 780 aatcctgatg agataaccca ctttaagccc acgcatctgt ggcacatcta cattatctaa 840 atcacacatt cttccacaca tctgagccac acaaaaacca atccacatct ttatcaccca 900 ttctataaaa aatcacactt tgtgagtcta cactttgatt cccttcaaac acatacaaag 960 agaagagact aattaattaa ttaatcatct tgagagaaaa tggagaaaat agtgcttctt 1020 tttgcaatag tcagtcttgt taaaagtgat çagatttgca ttggttacca tgcaaacaac 1080 tcgacagagc aggttgacac aataatggaa aagaacgtta ctgttacaca tgcccaagac 1140 atactggaaa agacacacaa tgggaagctc tgcgatctag atggagtgaa gcctctaatt 1200 ttgagagatt gtagtgtagc tggatggctc ctcggaaacc caatgtgtga cgagttcatc 1260 aatgtgccgg aatggtctta catagtggag aaggccaatc cagtcaatga cctctgttac 1320 ccaggggatt tcaatgacta tgaagaattg aaacacctat tgagcagaat aaaccatttt 1380 gagaaaattc agatcatccc caaaagttct tggtccagtc atgaagcctc attgggggtc 1440 agctcagcat gtccatacca gggaaagtcc tcctttttca gaaatgtggt atggcttatc 1500 aaaaagaaca gtacataccc aacaataaag aggagctaca ataataccaa ccaagaagat 1560 cttttggtac tgtgggggat tcaccatcct aatgatgcgg cagagcagac aaagctctat 1620 caaaacccaa ccacctatat ttccgttggg acatetacac taaaccagag attggtacca 1680 agaatagcta ctagatccaa agtaaacggg caaagtggaa ggatggagtt cttctggaca 1740 attttaaaac cgaatgatgc aatcaacttc gagagtaatg gaaatttcat tgctccagaa 1800 tatgcataca aaattgtcaa gaaaggggac tcaacaatta tgaaaagtga attggaatat 1860 ggtaactgca ataccaagtg tcaaactcca atgggggcga taaactctag catgccattc 1920 cacaatatac accctctcac catcggggaa tgccccaaat atgtgaaatc aaacagatta 1980 gtccttgcga ctgggctcag aaatagccct caaagagaga gaagaagaaa aaagagagga 2040 256 ttatttggag ctatagcagg cctcatagag ggaggatggc agggaatggt agatggttgg 2100 tatgggtacc accatagcaa cgagcagggg agtgggtacg ctgcagacaa agaatccact 2160 caaaaggcaa tagatggagt caccaataag gtcaactcga ttatcgacaa aatgaacact 2220 cagtttgagg ccgttggaag ggaatttaac aacttagaaa ggagaataga gaatttaaac 2280 aagaagatgg aagacgggtt cctagatgtc tggacttata atgctgaact tctagttctc 2340 atggaaaacg agagaactct agactttcat gactcaaatg Ccaagaacct ttacgacaag 2400 gtccgactac agcttaggga taatgcaaag gagctgggta acggttgttt cgagttccat 2460 cataaatgtg ataatgaatg tatggaaagt gtaagaaacg gaacgtatga ctacccgcag 2520 tattcagaag aagcaagact aaaaagagag gaaataagtg gagtaaaatt ggaatcaata 2580 ggaatttacc aaatattgtc aatttattct acagtggcca gctccctagc actggcaatc 2640 atggtagctg gtctatcctt atggatgtgc tccaatgggt cgttacaatg cagaatttgc 2700 atttaagagc tctaagttaa aatgcttctt cgtctcctat ttataatatg gtttgttatc 2760 gttaattttg ttcttgtaga agagcttaat taatcgttgt tgttatgaaa tactatttgt 2820 atgagatgaa ctggtgtaat gtaattcatt tacataagtg gagtcagaat cagaatgttt 2880 cctccataac taactagaca tgaagacctg ccgcgtacaa ttgtcttata tttgaacaac 2940 taaaattgaa catcttttgc cacaacttta taagtggtta atatagctca aacatatggt 3000 caagttcaat agattaataa tggaaatatc agttatcgaa attcattaac aatcaactta 3060 acgttattaa ctactaattt tatatcatcc cctttgataa atgatagtac a 3111
<210> 67 <211> 3105 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Cassete de expressão <400> 67 agaggtaccc cgggctggta tatttatatg ttgtcaaata actcaaaaac cataaaagtt 60 taagttagca agtgtgtaca tttttacttg aacaaaaata ttcaeetact actgttataa 120 atcattafcta aacatcagag taaagaaaca tggatgataa gaacaagagt agtgatactt 180 tgacaacaat tttgttgcaa catttgagaa aattttgttg ttctctcfctt teattggtca 240 aaaacaatag agagagaaaa aggaagaggg agaataaaaa cataatgtga gtatgagaga 300 257 gaaagttgta caaaagttgt accaaaatag ttgtacaaat atcattgagg aatttgacaa 360 aagctacaca aataagggtt aattgctgta aataaataag gatgacgcat tagagagatg 420 taccattaga gaatttttgg caagtcatta aaaagaaaga ataaattatc tttaaaatta 4S0 aaagttgagt catttgatta aacatgtgat tatttaatga attgatgaaa gagttggatt 540 aaagttgtat tagtaattag aatttggtgt caaatttaat ttgacatttg atcttttcct 600 atatattgcc ccatagagtc agttaactca tttttatatt tcatagatca aataagagaa 660 ataacggtat attaatccct ccaaaaaaaa aaaacggtat atttactaaa aaatctaagc 720 cacgtaggag gataacagga tccccgtagg aggataacat ccaatccaac 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<210> 71 <211> 3117 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Cassete de Expressão <400> 71 agaggtaccc cgggctggta tatttatatg ttgtcaaata actcaaaaac cataaaagtt 60 taagttagca agtgtgtaca tttttacttg aacaaaaata ttcacctact actgttataa 120 atcattatta aacattagag taaagaaata tggatgataa gaacaagagt agtgatattt 100 tgacaacaat tttgctgcaa catttgagaa aattctgttg ttctctcttt tcattggtca 240 aaaacaatag agagagaaaa aggaagaggg agaataaaaa cataatgtga gtatgagaga 300 gaaagctgta caaaagttgt accaaaatag ttgtacaaat atcattgagg aatttgacaa 360 aagctacaea aataagggtt aattgctgta aataaataag gatgaegcat tagagagatg 420 taccattaga gaattttbgg caagtcatta aaaagaaaga ataaattatt tttaaaatta 480 aaagctgagt catttgatta aacatgtgat tatttaatga attgafcgaaa gagttggate 540 aaagttgtat tagtaattag aatttggtgt caaatttaat ttgacatttg atotfcttcct 600 atatattgcc ccatagagtc agttaactca tttttatatt tcatagatca aataagagaa 660 ataacggtat attaatccct ccaaaaaaaa aaaacggtat atttactaaa aaatctaagc 720 cacgtaggag gacaaeagga tccccgtagg aggataacat ccaatccaac caateacaac 780 aatectgatg agataaecca ctttaagccc acgeatctgt ggcacatcta cattatccaa 840 atcacacatt cttccacaca tctgagccac acaaaaacca atceacatct ttatcaccca 900 ttctataaaa aatcacactt tgtgagtcfca cactttgatt cccfctcaaac acatacaaag 960 agaagagact aattaattaa ttaatcatct tgagagaaaa tgaacactca aattccaata 1020 ttagccactt cggcattctt ctatgtacgt gcagataaaa tctgcctagg acatcatgct 1080 gtgtctaatg gaaccaaagt agacaccctt actgaaaaag gaatagaagt tgtcaatgca 1140 acagaaacag ttgaacaaac aaacatccct aagatctgct caaaaggaaa aeagactgtt 1200 gaccctggtc aatgtggatc actagggacc gttattggtc ctecccaatg tgaccaattt 1260 265 cttgagttct ccgctaattt aatagttgaa agaagggaag gtaacgacat ttgttatcca 1320 ggcaaatttg acaatgaaga aacattgaga aaaatactca gaaaacccgg aggaactaaa 1380 aaggagaata tgggattcac atatacegga gtgagaacca atggagagac tagcgcatgt 1440 agaaggtcaa gatcttcctt ttatgcagag atgaaatggc ttctatccag cacagacaat 1500 gggacatttc cacaaatgac aaagtectac aagaacacca agaaggtacc agctctgata 1560 atctggggaa tccaccactc aggatcaact actgaacaga ctagattata tggaagtggg 1620 aataaattga taacagtttg gagttccaaa taccaacaat cttttgtccc aaatcctgga 1680 ccaagaccgc aaatgaatgg tcaatcagga agaattgact ttcactggct gatgctagat 1740 cccaatgata ctgtcacCtt cagttttaat ggggccttta tagcacctga ccgcgccagt 1800 tttctaagag gtaaatctct aggaatccaa agtgatgcac aacttgacaa taattgtgaa 1860 ggtgaatgct atcatattgg aggtactata attagcaact tgccctttca aaacattaat 1920 agtagggcaa tcggaaaatg ccccagatac gcgaagcaga agagcttaat gctagcaaca 1980 ggaatgaaaa atgttcctga agctcctgca cataaacaac taactcatca catgcgcaaa 2040 aaaagaggtt tatttggtgc aatagcagga ttcattgaaa atgggtggga aggattaaCa 2100 gacggatggt atggatataa gcatcagaat gcacaaggag aagggactgc tgcagactac 2160 aaaagtacac aatctgctat caaccaaata accggaaaat tgaacagact aatagaaaaa 2220 accaaccagc aattcgaact aatagataat gagttcaatg aaatagaaaa acaaattggc 2280 aatgttatta actggactag agattctatc atcgaagtat ggtcatataa tgcagagttc 2340 ctcgtagcag tggagaatca acacactatt gatttaactg actcagaaat gaacaaacta 2400 tatgaaaagg taagaagaca actgagagaa aatgctgagg aagatggtaa tggctgtttt 2460 gaaatattcc accaatgtga caatgattgc atggccagca ttagaaacaa cacatatgac 2520 cataaaaaat acagaaaaga ggcaatacaa aacagaatcc agattgacgc agtaaagttg 2580 agcagtggtt acaaagatat aatactttgg tttagcttcg gggcatcatg tttcttattt 2640 cttgccattg caatgggtct tgttttcata tgtataaaaa atggaaacat gcggtgcacc 2700 atttgtatat aagagctcta agttaaaatg cttcttcgtc tcctatttat aatatggttt 2760 gttattgtta attttgttct tgtagaagag cttaattaat cgttgttgtt atgaaatact 2820 atttgtatga gatgaactgg tgtaatgtaa ttcacttaca taagtggagt cagaatcaga 2880 atgtttcctc cataactaac tagacatgaa gacctgccgc gtacaattgt cttatatttg 2940 aacaactaaa attgaacatc ttttgccaca actttacaag tggttaatat agctcaaaca 3000 tatggtcaag ttcaatagat taataatgga aatatcagtc atcgaaattc attaacaatc 3060 aacttaacgt tattaactac taattttata tcatcccctt tgataaatga tagtaca 3117 <210> 72 <211> 3162 266
<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Cassete de Expressão <400> 72 agaggtaccc cgggctggta tatttatatg txgtcaaata actcaaaaac cataaaagtt 60 taagttagca agtgtgtaca tttttacttg aacaaaaata ttcacctact aefcgttataa 120 atcattatta aacattagag taaagaaata tggatgataa gaacaagagt agtgatafctt 180 tgacaacaat txtgttgcaa catttgagaa aattttgttg ttctctcttt tcattggtca 240 aaaacaatag agagagaaaa aggaagaggg agaataaaaa cataatgtga gtacgagaga 300 gaaagttgta caaaagttgt accaaaatag ttgtacaaat atcattgagg aatttgacaa 360 aagctacaca aataagggtt aattgcfcgta aataaataag gatgacgcat tagagagatg 420 taccattaga gaatttttgg caagtcatta aaaagaaaga ataaattatt tttaaaatta 480 aaagttgagt catetgatca aacatgtgat tattcaatga attgacgaaa gagttggatt 540 aaagttgtat tagtaattag aatxtggtgt caaatttaat ttgacatttg atcttttcct 600 atatattgcc ccatagagtc agttaactca tttttatatt Ccacagatca aataagagaa 660 ataacggtat attaatccct ccaaaaaaaa aaaacggtat acttaccaaa aaatctaagc 720 cacgtaggag gataacaçga tccccgtagg aggataacat ccaatccaac caatcacaac 780 aatcctgatg agataaccca ctttaagccc acgcatctgt ggcacatcta cattatctaa 840 atcacacafct cttccacaca tctgagccac acaaaaacca atceaeatct, ttatcaccca 800 ttctacaaaa aatcacactt tgtgagtcta cactttgatt cccttcaaac acatacaaag 960 agaagagact aattaattaa ttaatcatct tgagagaaaa tgaaggcaat aatcgtacta 1020 ctcatggtag taacatceaa tgeagatcga atctgcactg ggataacatc gtcaaactca 1080 eeacatgttg ccaaaactgc tactcaaggg gaggtcaatg tgactggtgt aataccactg 1140 acaacaacac ccaccaaatc tcattctgca aacctcaaag gaacagaaac cagagggaaa 1200 ctatgcccaa aatgccfccaa ctgeacagac ctggacgtgg ecttgggeag accaaaatgc 1260 acggggaaca taccctcggc aagagtttca atactccacg aagteagacc tgttacatct 1320 gggtgctttc ctataatgca cgacagaaca aaaattagac agctgcctaa acttctcaga 1380 ggatacgaac atatcaggtt atcaactcat aacgtcatca atgcagaaaa tgcaocagga 1440 ggaccctaca aaattggaac ctcagggtct tgccctaacg ttaccaatgg aaacggattt 1500 267 ttcgcaaeaa tggcttgggc cgtcccaaaa aacgacaaca acaaaacagc aacaaattca 1560 ccàacaatag aagtaccata catttgtaca gaaggagaag aceaaattac cgtttggggg 1620 ttccactcfcg ataacgaaae ccaaafcggca aagctctatg gggactcaaa gccccagaag 1680 ttcaccccat ctgccaacgg agtgaccaca cattacgctt cacagattgg tggcttccca 1740 aatcaaacag aagacggagg actaccacaa agcggtagaa ttgtcgttga ttacatggtg 1800 caaaaatctg ggaaaacagg aaeaattaec tatcaaagag gtattttatt gcctcaaaaa 1860 gtgtggtgcg caagtggcag gagcaaggta ataaaaggat cgttgccttt aattggagaa 1920 gcagattgcc tccacgaaaa atacggtgga ttaaacaaaa gcaagcctta ctacacaggg 1980 gaacatgcaa aggccatagg aaattgccca atatgggtga aaacaccctt gaagctggcc 2040 aafcggaacea aatatagacc tectgcaaaa ctattaaagg aaaggggttt cttcggagct 2100 attgctggtt tcfctagaagg aggatgggaa ggaatgattg caggttggea cggatacaca 2160 tcccatgggg cacatggagt agcggtggca gcagacctta agagcactca agaggccata 2220 aacaagataa caaaaaatct eaactctttg agtgagctgg aagtaaagaa tctteaaaga 2280 ctaagcggtg ccatggatga acfcccacaac gaaatactag aactagacga gaaagtggat 2340 gatctcagag ctgafcacaat aagctcacaa atagaactcg cagtcctgct ttccaatgaa 2400 ggaataataa acagtgaaga tgagcatcte ttggcgcttg aaagaaagct gaagaaaatg 2460 ctgggcccct ctgctgtaga gatagggaat ggacgctttg aaaccaaaca caagtgcaac 2520 cagacctgce tcgacagaat agctgctggt acctttgatg caggagaatt ttcfcctcccc 2580 acttttgate caccgaatat eactgctgca tctttaaatg acgacggatt ggataatcat 2640 actatactgc ttfcactacfcc aactgctgec cccagtttgg ctgtaacatt gatgatagct 2700 atcfcttgttg cttatatggt ctccagagac aatgtttctt gctccatctg tctataagag 2760 ctctaagtta aaatgcttct tcgtctccta tttataatat ggtttgttat tgttaatttt 2820 gttctcgtag aagagettaa ttaatcgttg ttgttatgaa atactatttg tatgagatga 2880 accggtgtaa tgtaattcat ttacataagt ggagtcagaa tcagaatgtt tectccataa 2940 ctaactagac atgaagacct gccgcgtaca attgccttat attcgaacaa ctaaaattga 3000 acatcttttg ccacaacttt ataagtggtt aatatagctc aaatacacgg tcaagttcaa 3060 tagattaata atggaaatat cagttatcga aattcattaa caatcaactt aacgtcatta 3120 actactaatt ttatatcatc ccctttgata aatgatagta ca 3162
<210> 73 <211> 3159 <212> ADN <213> Sequência Artificial 268 <22 0> <223> Cassete de Expressão <400> 73 agaggtaccc cgggctggta tatttatatg ttgtcaaata actcaaaaac cataaaagCt 60 taagttagca agtgtgtaca tttttacttg aacaaaaata ttcacctact actgttataa 120 atcattatta aacattagag taaagaaata tggatgataa gaacaagagt agtgatattt 180 tgacaacaat tttgttgcaa catttgagaa aactttgttg ttctctcttt tcattggtca 240 aaaacaatag agagagaaaa aggaagaggg agaataaaaa cataatgtga gtatgagaga 300 gaaagtegta caaaagttgt accaaaatag ttgtacaaat atcattgagg aatttgacaa 360 aagctacaca aataagggtt aattgctgta aataaataag gatgacgcat tagagagacg 420 taccattaga gaatttttgg caagtcatta aaaagaaaga ataaattatt tttaaaatta 480 aaagttgagt catttgatta aacatgtgaC tatttaatga attgatgaaa gagttggatt 540 aaagttgtat tagtaattag aatttggtgt caaatttaat ttgacatctg atcttttcct 600 atatattgcc ccatagagtc agttaactca tttttatatt tcatagatca aataagagaa 660 ataacggtat atcaatccct ccaaaaaaaa aaaacggtat atttacCaaa aaacctaagc 720 cacgtaggag gataacagga tccccgtagg aggataacat ccaatccaac caatcacaac 780 aaCcctgatg agataaccca ctttaagccc acgcatctgt ggcacatcta cattatctaa 840 atcacacact cttccacaca tctgagccac acaaaaacca atccacatct ttatcaccca 900 ttctataaaa aatcacactt tgtgagtcta cactttgatt cccttcaaac acacacaaag 960 agaagagact aattaattaa ttaatcatct tgagagaaaa tgaaggcaat aattgtacta 1020 ctcatggtag taacatccaa tgcagatcga atctgcactg gaataacatc ttcaaactca 1080 cctcatgtgg tcaaaacagc cactcaaggg gaggtcaatg tgactggtgt gataccacta 1140 acaacaacac caacaaaatc ttattttgca aatctcaaag gaacaaggac cagagggaaa 1200 ctatgcccag actgtctcaa ctgcacagat ctggatgtgg ctttgggcag accaatgtgt 1260 gtggggacca caccttcggc gaaggcttca atactccacg aagtcaaacc tgttacatcc 1320 gggtgctccc ccataatgca cgacagaaca aaaatcaggc aactacccaa tcttctcaga 1380 ggatatgaaa atatcaggct atcaacccaa aacgtcatcg atgcggaaaa ggcaccagga 1440 ggaccctaca gacttggaac ctcaggatct tgccctaacg ctaccagtaa gagcggattt 1500 ttcgcaacaa tggcttgggc tgtcccaaag gacaacaaca aaaatgcaac gaacccacta 1560 acagtagaag taccatacat ttgCacagaa ggggaagacc aaatcactgt ttgggggttc 1620 cattcagata acaaaaccca aatgaagaac ctctatggag áctcaaatcc tcaaaagttc 1680 acctcatctg ctaatggagt aaccacacac tatgtttctc agattggcag cttcccagat 1740 caaacagaag acggaggact accacaaagc ggcaggaCCg ttgctgatta catgatgcaa 1800 aaacctggga aaacaggaac aattgtctac caaagaggtg ttttgtcgcc tcaaaaggcg 1860 269 tggtgcgcga gtggcaggag caaagtaaca aaagggtcct tgcctttaat tggtgaagca gattgccttc atgaaaaata cggtggatca aacaaaagca agccttacta cacaggagaa 1980 cacgcaaaag ccataggaaa ttgcccaata tgggtgaaaa cacctttgaa gctcgccaat 2040 ggaaccaaat atagacctcc tgcaaaacta ctaaaggaaa ggggtttctt cggagctatt 2100 gctggtttcc tagaaggagg atgggaagga atgattgcag gctggcacgg atacacatct 2160 cacggagcac atggagtggc agtggcggcg gaccttaaga gtacgcaaga agctataaac 2220 aagataacaa aaaatctcaa ttctttgagt gagctagaag taaagaatct tcaaagacta 2280 agtggtgcca tggatgaact ccacaacgaa atactcgagc tggatgagaa agtggatgat 2340 ctcagagctg acactataag ctcgcaaata gaacttgcag tcttgctttc caacgaagga 2400 ataataaaca gtgaagatga gcatctattg gcacttgaga gaaaactaaa gaaaatgctg 2460 ggtccctctg ctgtagagat aggaaatgga tgcttcgaaa ccaaacacaa gtgcaaccag 2S20 acctgcttag acaggatagc tgctggcacc tttaatgcag gagaattttc tctccccact 2580 tttgattcac tgaacattac tgctgcatct ttaaatgatg atggattgga taaccatact 2640 atactgctct attactcaac tgctgcttct agtttggctg taacattgat gctagctatt 2700 tttattgttt atatggtctc cagagacaac gtttcatgct ccatctgtct acaagagccc 2760 taagttaaaa tgcttcttcg tctcctattt ataatatggt ttgttattgt taattttgtt 2820 cttgtagaag agcttaatta atcgttgttg ttatgaaata ctatttgtat gagatgaact 2880 ggtgtaatgt aattcaccca cataagtgga gtcagaatca gaatgtttcc tccataacta 2940 actagacatg aagacctgcc gcgtacaatt gtcttatatt tgaacaacta aaattgaaca 3000 tcttttgcca caactttata agtggttaat atagctcaaa tatatggtca agttcaatag 3060 attaataatg gaaatatcag ttatcgaaat tcattaacaa tcaacttaac gttattaact 3120 actaatttta tatcatcccc tttgataaat gatagtaca 3159
<210> 74 <211> 565 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Consenso <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (3)..(3) 270 <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido natural <22 0> <221> característica_misc <222> (52)..(52) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido natural <22 0> <221> característica_misc <222> (90)..(90) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido natural <22 0> <221> característica_misc <222> (99)..(99) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido natural <22 0> <221> característica_misc <222> (111)..(111) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido natural <22 0> <221> característica_misc <222> (145)..(145) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido natural <22 0> <221> característica_misc <222> (157)..(157) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido natural <22 0> <221> característica_misc <222> (162)..(162) 271 <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido natural <22 0> <221> característica_misc <222> (182)..(182) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido natural <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (203)..(203) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido natural <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (205)..(205) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido natural <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (210)..(210) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido natural <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (225)..(225) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido natural <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (268)..(268) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido natural <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (283)..(283) 272 <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido natural <220> <221> característica_misc <222> (290)..(290) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido natural <22 0> <221> característica_misc <222> (432) .. (432) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido natural <220> <221> característica_misc <222> (489)..(489) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido natural <400> 74
Met Lys Xaa Lys Leu Leu Vai Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr 15 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30
Vai Asp Thr Vai Leu Glu Lys Asn Vai Thr Vai Thr His Ser Vai Asn 35 40 45
Leu Leu Glu Xaa Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly Ile 50 55 60
Ala Pro Leu Gin Leu Gly Asn Cys Ser Vai Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Leu Leu Ile Ser Xaa Glu Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95
Vai Glu Xaa Pro Asn Pro Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Xaa Phe 100 105 no 273
Ala ASp Tyr 115 Glu Glu Leu Arg Glu 120 Gin Leu Ser Ser Vai 125 Ser Ser Phe Glu Arg Phe Glu ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr 130 135 140
Xaa Thr Gly Vai ser Ala Ser Cys Ser His Asn Gly Xaa Ser Ser Phe 145 150 155 160
Tyr Xaa Asn Leu Leu Trp Leu Thr Gly Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn 165 170 175
Leu Ser Lys Ser Tyr Xaa Asn Asn Lys Glu Lys Glu Vai Leu Vai Leu ISO 185 190
Trp Gly Vai His His Pro Pro Asn Ile Gly Xaa Gin Xaa Ala Leu Tyr 195 200 205
His Xaa Glu Asn Ala Tyr Vai Ser Vai Vai Ser Ser His Tyr Ser Arg 210 215 220
Xaa Phe Thr Pro Glu Ile Ala Lys Arg Pro Lys Vai Arg Asp Gin Glu 225 230 235 240
Gly Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr Ile 245 250 255
Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Xaa Tyr Ala Phe Ala 260 265 270
Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Xaa Ser Asn Ala Pro Met 275 280 285
Asp Xaa Cys Asp Ala Lys Cys Gin Thr Pro Gin Gly Ala Ile Asn Ser 290 295 300
Ser Leu Pro Phe Gin Asn Vai His Pro Vai Thr Ile Gly Glu Cys Pro 305 310 315 320
Lys Tyr Vai Arg Ser Ala Lys Leu Arg Met vai Thr Gly Leu Arg Asn 325 330 335 ile Pro Ser Ile Gin Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 340 345 350 274
Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Vai Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His 355 360 365
His Gin Asn Glu Gin Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gin Lys Ser Thr 370 375 380
Gin Asn Ala Ile Asn Gly ile Thr Asn Lys Vai Asn Ser vai Ile Glu 385 390 395 400
Lys Met Asn Thr Gin Phe Thr Ala Vai Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu 405 410 415
Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Vai Asp Asp Gly Phe Xaa 420 425 430
Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Vai Leu Leu Glu Asn Glu 435 440 445
Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Vai Lys Asn Leu Tyr Glu Lys 4S0 455 460
Vai Lys Ser Gin Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys 465 470 475 480
Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Xaa Glu Cys Met Glu Ser Vai Lys 485 490 495
Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn 500 505 510
Arg Glu Lys Ile Asp Gly Vai Lys Leu Glu Ser Met Gly Vai Tyr Gin 515 520 525
Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Vai Ala Ser Ser Leu Vai Leu Leu Vai 530 535 540
Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gin 545 550 555 560
Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 75 275
<211> 565 <212> PRT <213> Vírus da Gripe <4Ο0> 75
Met Lys Ala Lys Leu Leu Vai Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr 1 5 10 15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30
Vai Asp Thr vai Leu Glu Lys Asn Vai Thr Vai Thr His Ser vai Asn 35 40 45
Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly He 50 55 60
Ala Pro Leu Gin Leu Gly Asn Cys Ser Vai Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Leu Leu Ile Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr Ile Θ5 90 95 val Glu Thr Pro Asn pro Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Tyr Phe 100 105 no
Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gin Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe 115 120 125
Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr 130 135 140 val Thr Gly Val Ser Ala Ser Cys Ser His Asn Gly Lys Ser Ser Phe 145 150 155 160
Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Gly Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn 165 170 175
Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu Val Leu ISO 185 190
Trp Gly Val His His Pro Pro Asn lie Gly Asn Gin Arg Ala Leu Tyr 195 200 205 276
HiS Thr Glu Asn Ala Tyr vai Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser Arg 210 215 220 Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gin Glu 225 230 235 240 Gly Arg ile Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr Ile 245 250 255 Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe Ala 260 265 270 Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Pro Met 275 280 285 Asp Glu Cys Asp Ala Lys Cys Gin Thr Pro Gin Gly Ala Ile Asn Ser 290 295 300 Ser Leu Pro Phe Gin Asn val His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro 305 310 315 320 Lys Tyr Vai Arg Ser Ala Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn 325 330 335 ile Pro Ser Ile Gin Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 340 345 350 Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His 355 360 365 His Gin Asn Glu Gin Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gin Lys Ser Thr 370 375 380 Gin Asn Ala Xle Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu 385 390 395 400 Lys Met Asn Thr Gin Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu 405 410 415 Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu 420 425 430 Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Vai Leu Leu Glu Asn Glu 435 440 445 277
Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Vai Lys Asn Leu Tyr Glu Lys 450 455 460
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Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr vai Ala Ser Ser Leu Vai Leu Leu vai 530 535 540
Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gin 545 550 555 560
Cys Arg ile Cys Ile 565 <210> 76 <211> 252 <212> PRT <213> Vírus da Gripe <4 0 0> 76 Met Ser Leu Leu Thr Glu Vai Glu Thr Tyr Vâl Leu Ser Ile Ile Pro 1 5 10 15 Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu lie Ala Gin Arg Leu Glu Asp Vai Phe 20 25 30 Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Vai Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr 35 40 45 Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Vai Phe 55 60
Arg Pro 50 278
Thr Leu Thr Vai Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gin Arg Arg Arg Phe Vai ¢5 70 75 80
Gin Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Lys Ala Θ5 90 95
Vai Lys Leu Tyr Arg Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala 100 105 110
Lys Glu Ile Ser Leu Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met 115 120 125
Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Ala vai Thr Thr Glu Vai Ala Phe 130 135 140
Gly Leu Vai Cys Ala Thr Cys Glu Gin Ile Ala Asp Ser Gin His Arg 145 150 155 160
Ser His Arg Gin Met Vai Thr Thr Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu 165 170 175
Asn Arg Met Vai Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gin Met 180 185 190
Ala Gly Ser Ser Glu Gin Ala Ala Glu Ala Met Glu Vai Ala Ser Gin 195 200 205
Ala Arg Gin Met Vai Gin Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His Pro Ser 210 215 220
Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asn Asp Leu Leu Glu Asn Leu Gin Ala Tyr 225 230 235 240
Gin Lys Arg Met Gly Vai Gin Met Gin Arg Phe Lys 245 250
Lisboa, 27 de Agosto de 2013

Claims (14)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método de produção partículas semelhantes ao vírus da gripe (VLPs) num planta compreendendo: a) introduzir um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica uma hemaglutinina (HA) da gripe operacionalmente ligada a uma região reguladora ativa na planta, na planta ou parte da mesma, b) incubar a planta sob condições que permitem a expressão do ácido nucleico, produzindo deste modo as VLPs, c) colher a planta, e d) purificar as VLPs, em que as VLPs variam em tamanho desde 80-300 nm.
2. Método da reivindicação 1, em que a sequência de nucleótidos é selecionada do grupo consistindo de Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, Hl4, H15 e H16.
3. Método da reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que no passo de introdução (passo a) , o ácido nucleico é transitoriamente expressado na planta.
4. Método da reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que no passo de introdução (passo a) , o ácido nucleico é expressado de forma estável na planta.
5. Partícula semelhante a vírus (VLP) produzida pelo método de qualquer uma das reivindicações 1 a 4 compreendendo uma proteína hemaglutinina (HA) do vírus da gripe e um ou mais do que um lípido derivado de uma planta. 2
6. VLP da reivindicação 5, em que a proteína HA da gripe é H5 da Indonésia.
7. Composição compreendendo uma dose eficaz da VLP da reivindicação 5 ou reivindicação 6 para induzir uma resposta imunológica e um veículo farmaceuticamente aceitável.
8. VLP produzida pelo método de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou a VLP da reivindicação 5 ou reivindicação 6, em que a HA do vírus da gripe compreende N-glicanos específicos da planta ou N-glicanos modificados.
9. VLP de qualquer uma das reivindicações 4 a 6 ou reivindicação 8, ou a composição da reivindicação 7, para ser utilizada na indução de imunidade a uma infeção pelo vírus da gripe num indivíduo.
10. VLP da reivindicação 9, em que a VLP é adequada para administração oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa ou subcutânea.
11. Composição compreendendo uma dose eficaz da VLP da reivindicação 8 para induzir uma resposta imunológica e um veículo farmaceuticamente aceitável.
12. Composição da reivindicação 11 para ser utilizada na indução de imunidade a uma infeção pelo vírus da gripe num indivíduo.
13. Composição da reivindicação 12, em que a composição é adequada para administração oral, intradérmica, 3 intranasal, intramuscular, intravenosa ou subcutânea.
14. Suplemento alimentar compreendendo em qualquer uma das reivindicações Lisboa, 27 de Agosto de 2013 intraperitoneal, VLP como descrita , 6 ou 8.
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