CN1460718A - 表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白的转基因马铃薯生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了传染性支气管炎病毒纤突蛋白转基因马铃薯的生产方法。传染性支气管炎病毒纤突蛋白基因插入到植物表达载体pBI121上，经三亲交配的方法把重组表达载体导入农杆菌中，外源基因经农杆菌介导法转化马铃薯茎段，通过再生植株的抗生素抗性筛选和PCR、Southern blot及Northern blot等分子分析，获得表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白的转基因植株。用这些表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白的转基因植物直接饲喂鸡或用转基因植物中纯化出的传染性支气管炎病毒纤突蛋白作为注射剂注射给药的方式免疫鸡，引起了鸡对该抗原蛋白的免疫应答反应，说明转基因表达产物具有良好的免疫原性，为转基因植物生产传染性支气管炎疫苗打下基础。

Description

表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白的转基因马铃薯生产方法

                            技术领域

本发明涉及一种表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白的转基因马铃薯生产方法。

                            背景技术

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，英文简写IB)具有急性、高度接触性传染特点，是危害全球养鸡业最严重的传染病之一，由感染传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus，英文简写IBV)引起。尽管常规疫苗对控制病害的毁灭性流行发挥了重要作用，但在疫苗接种范围愈来愈广，防疫密度愈来愈高(90％以上)，免疫接种量不断加大的今天，并没有使上述疾病得到根本控制。但IB的流行形式发生了改变，已由大规模发生转变为地区性散发，病变类型也由典型或单一病变型转成非典型或多病变型，甚至在免疫动物群体中也屡屡发生。目前，该疾病每年经济损失仍达数十亿美元，由此可见，IB仍是当今危害全球养鸡业最严重的传染病，是全球鸡病防治的重中之重。

有效控制IB的流行，选择疫苗进行。目前广泛使用的传染性支气管炎疫苗依制作工艺不同分弱毒疫苗和灭活疫苗两类。在控制传染性支气管炎的流行起了非常重要的作用。但是，应该指出，在使用弱毒疫苗或灭活疫苗过程中还存在着一些问题有待解决：

1)安全性问题弱毒活疫苗存在免疫不全、疫苗外源性或垂直传播性病原污染以及疫苗接种动物后毒力返强的危险。

2)灭活疫苗价格昂贵灭活疫苗由于抗原需要量大，制备成本高，造成价格长期居高不下。

3)灭活疫苗接种较麻烦，需注射，且引起局部疼痛和其它不适等。

IBV属冠状病毒科冠状病毒属，为单股正链RNA病毒、核苷酸总长约27.6kb。病毒在复制过程中以RNA(-)为模板合成A、B、C、D、E、F六种mRNA，这些mRNA具有相同的聚腺苷酸化的3’末端形成的巢状结构，在基因组的5’端存在一个由60bp组成的先导序列；mRNA A、mRNA C、mRNA E分别编码病毒的N蛋白、M蛋白、S蛋白三种主要的结构蛋白。IBV的致病性、抗原性主要与S蛋白相关。S蛋白可进一步裂解为S1和S2蛋白。IBV的致病性及抗原性主要由S1蛋白的功能来体现。不同IBV病毒株因S基因，尤其是S1基因的变异，造成IBV致病特性发生改变。IBV毒株抗原性变异的氨基酸替换大都发生在S1蛋白；S1蛋白存在可被中和性McAb识别的结构依赖性抗原表位。IBV的致病性及抗原性主要由S1蛋白的功能来体现。

在IB新型疫苗研究方面，Tomley等用痘苗病毒表达IBV的S1蛋白免疫小鼠后，用ELISA和气管环中和试验证实其表达产物具有反应原性和免疫原性；Song等用昆虫杆状病毒表达的IBV S1蛋白免疫鸡后可良好的免疫应答反应。

基因工程研究领域的最新进展使植物表达外源基因成为可能。含有外源基因的植物细胞可再生出完整植株。并将外源基因稳定地遗传给后代。迄今有些单子叶和双子叶植物都已进行了成功的转化。例如烟草、马铃薯、番茄、大豆和玉米等。

农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的双子叶植物转化已有众多报道。农杆菌介导的叶盘转化法可有效地进行基因转移、选择和再生。

单子叶植物经农杆菌介导转化比较困难，但也可以利用其它的转化方法如PEG和电融合法。有人成功地将外源基因导入玉米、水稻和小麦的原生体质体中。然后从转化的原生质体再生出完整的植株。一些新的转化方法如微管注射法和基因枪法在单子叶植物转化和再生中可能更加有效。

植物是一种多样化、低成本和可再生的材料资源，而生物技术的迅速发展则进一步拓宽了植物的使用范围，国外在植物中采用这种“分子农业”的方法，已经成功地生产了越来越多的有用物质，其中包括一些高价值药用蛋白多肽，如人的细胞生长因子、促红细胞生成素、干扰素、生长激素、单克隆抗体和可作为疫苗用的抗原蛋白等，一些研究机构和公司已经开始从这些药物蛋白的生产中获得巨大的经济效益。

特别值得指出的是，1998年4月，美国国家过敏症和传染病研究所(NationalInstitute of Allergy and Infectious Diseases，NIAID)首次报道了人食用转基因马铃薯后体内能够产生针对大肠杆菌热不稳定毒素B亚基的特异性抗体。这一研究结果清楚地表明：

(1)在植物中高效表达一些病原蛋白基因是可行的。

(2)病原蛋白在植物中可完成翻译后加工过程，如糖基化和高级结构的空间折叠，从而使这些重组蛋白多肽与天然蛋白具有相同的免疫原性，这是原核生物表达系统无法比拟的，后者无法对源自真核生物的蛋白进行糖基化。

(3)植物中产生的抗原蛋白可安全地通过动物的消化道而不会被胃蛋白酶降解，原因是它们能够与肠粘膜细胞膜表面上的糖蛋白分子受体结合并刺激动物机体产生免疫应答。这类蛋白也被称谓粘膜性抗原(mucosal immunogen)，但并不是所有的蛋白都具有这种能力，现仅发现少数病毒和细菌含有这种抗原。

(4)研究也证实了粘膜性抗原只需要少量蛋白，就可以产生良好的免疫应答反应，并不比肌肉注射所需要量大。

这些研究结果预示植物将成为继微生物发酵系统和动物细胞培养系统之后又一个新的蛋白表达系统。

                            发明内容

本发明的目的是提供一种表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白的转基因马铃薯生产方法。

一种表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白的转基因马铃薯生产方法，其特征在于它的的步骤如下：

1)传染性支气管炎病毒S1或S蛋白抗原基因的植物表达载体pBIibv/S1或pBIibv/S构建：以传染性支气管炎病毒毒株核酸为模板，PCR扩增获得传染性支气管炎病毒S1或S基因被直接定向插入到质粒pBlueScriptSK(+)中的相应位点内，得到质粒pBS IBV/S1或pBS IBV/S，然后pBS IBV/S1或pBS IBV/S用限制性内切酶Xba I和BamH I双酶切可将S1或S基因切下来，通过琼脂糖凝胶电泳分离获得该DNA片段，随后插入到质粒pBI 121 GUS基因位点上(Xba I和BamH I双酶切)便构建成双元表达载体pBIibv/S1或pBIibv/S。

2)表达载体pBIibv/S1或pBIibv/S经三亲交配法导入到具有较强感染能力的农杆菌菌株EHA105中；

3)农杆菌介导的植物遗传转化：农杆菌介导的植物遗传转化是将经过预培养的马铃薯无菌苗外植体与含有表达载体pBIibv/S1或pBIibv/S的农杆菌EHA105共培养后在抗性愈伤组织诱导的培养基上诱导形成抗性愈伤组织，抗性愈伤组织在分化培养基上分化出抗性芽，抗性芽生根培养基上生根发育成完整的再生植株。

4)用PCR、Southern-blot、Northern-blot确定转基因植株；

5)不同转基因马铃薯植株传染性支气管炎病毒纤突蛋白含量的测定：用ELISA方法测定转基因马铃薯植株传染性支气管炎病毒纤突蛋白含量，获得表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白转基因植株；

6)表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白转基因植物的田间繁殖和培育。

根据权利要求1所述一种表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白的转基因马铃薯生产方法，其特征在于所说的马铃薯的遗传转化方法的步骤如下：1)预培养：

在无菌条件下取无菌苗，用手术刀把马铃薯切成0.3-0.5cm长度的茎段，接种到愈伤诱导固体培养基即MS培养基无机成分加B5培养基的有机成分组成的基础培养基上添加2，4-D 2mg/l，6-BA 0.3mg/l，蔗糖3％，琼脂0.7-1.2％，pH5.8的平板上面，在光照强度为2000Lx，光照时间为16h/天，温度为24±2℃条件下预培养2-3天。2)含表达载体的农杆菌转化：

从平板上挑取农杆菌单菌落，接种到5ml含抗生素Km50-100μg/ml YEP液体培养基中，在28℃条件下振荡培养16-24h，取100μL含抗生素Km50-100μg/ml菌液接种到5ml液体培养基中，继续振荡培养到OD₆₀₀为0.4-0.5，大约3-4h。无菌条件下把菌液转移到1.5mleppendorf中，12000rpm离心20sec，去除上清夜，菌体用液体的MS基础培养基重新悬浮到OD₆₀₀为0.1-0.3。3)共培养：

将经过预培养的外植体进入菌体悬液中作用5min，取出外植体，用灭菌滤纸吸干，立即放置在铺有一层灭菌滤纸的愈伤组织诱导培养基即MS培养基无机成分加B5培养基的有机成分组成基础培养基添加2，4-D 2mg/l，6-BA 0.3mg/l和蔗糖3％，琼脂0.7-1.2％，pH5.7上于黑暗中共培养2-3天。4)洗涤和抗性愈伤组织的诱导：

将已共培养的马铃薯外植体用无菌水漂洗3-5次，用灭菌滤纸吸干，接种到含抗性愈伤组织诱导的培养基即MS培养基无机成分加B5培养基的有机成分组成基础培养基添加2，4-D 2mg/l，6-BA 0.3mg/l和蔗糖3％，琼脂0.7-1.2％，Km50-100mg/l，Carb250-500mg/l，pH5.7-5.8平板上。在温度为24±2℃，光照强度2000Lx，光照时间为16h/天下培养7-9天。基本上外植体可见明显的愈伤组织生长。5)植株再生：

将愈伤组织连同外植体一起转移到芽分化培养基即MS培养基无机成分加B5培养基的有机成分组成基础培养基+ZT 2mg/l+NAA 20μg/l+GA3 20μg/l+蔗糖3％，琼脂0.7-1.2％，，pH5.7-5.8，Km50-100mg/l+Carb250-500mg/l，上，隔2周换一次培养基，20天左右分化才出小芽，待抗性芽生长到2-3厘米时，将其切下转接到含Kan 50-100mg/l，Carb 250-500mg/l生根的固体培养基上，7天左右开始生根，20天左右成为完整的植株。

本发明专提供了一种利用植物表达系统生产传染性支气管炎病毒纤突蛋自(S1蛋白和S蛋白)抗原的方法，具有以下优点：

(1)更安全：转基因植物中除只增加了传染性支气管炎病毒重组抗原蛋白外，没有改变植物其它的遗传组成，因此，它绝不会含有对动物有害的成份，也完全排除了污染其它病毒的可能性。

(2)价格更低廉：因为它不需要纯化和冷藏，抗原蛋白的生产可能只是简单地种植农作物，因此可大大降低生产成本。

(3)使用更方便：接种方式只是简单地饲喂含有该抗原蛋白的植物组织，这种接种方式非常适用于中国或其它国家。

本发明专提供了一种高效的马铃薯遗传转化方法，其外植体愈伤形成率达成100％，愈伤外植体分化率达90％以上，比国内外报道的马铃薯再生体系高得多，且再生周期短。这为转基因马铃薯的获得奠定良好的基础。

本发明提供了表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白的转基因植株。用这些表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白的转基因植物直接饲喂鸡或用转基因植物中纯化出的传染性支气管炎病毒纤突蛋白作为注射剂注射给药的方式免疫鸡，引起了对该抗原蛋白的免疫应答反应，说明转基因表达产物具有良好的免疫原性，为转基因植物生产传染性支气管炎疫苗打下基础。

                            附图说明

图1是转基因植株传染性支气管炎病毒S1基因的PCR鉴定M：1kb DNAMarker；CK：非转基因马铃薯；2，3，5，7，8，10：转化马铃薯植株示意图；

图2是转基因植株传染性支气管炎病毒S1基因的Southern Blot鉴定CK：非转基因马铃薯；2，3，5，7，8，9：转化马铃薯植株示意图，S1：IBV S1基因；

图3是S1蛋白转基因马铃薯的RNA分析CK：未转基因马铃薯；1，2，3，5，77，8，C1，D1：转基因马铃薯示意图；

图4是转基因植株传染性支气管炎病毒S基因的PCR鉴定M：1kb DNAMarker；14：非转基因马铃薯；1-13：转化马铃薯植株示意图；

图5是转基因植株传染性支气管炎病毒S基因的Southern Blot鉴定CK+：IBV S基因；CK-：非转基因马铃薯；1-6：转化马铃薯植株示意图；

图6是S蛋白转基因马铃薯的RNA分析CK：未转基因马铃薯；1，2，3，4，5：转基因马铃薯示意图；

图7是转基因马铃薯在田间的生长示图；

图8是转基因马铃薯示意图。

                          具体实施方式

已有传染性支气管炎病毒弱毒活疫苗和灭活疫苗可供利用的情况下，有必要寻找其它新的更加安全和廉价的抗原蛋白生产途径。利用转基因植物生产疫苗用抗原重组蛋白是一种较好的选择，它可能为人类和动物抵御各种传染性疾病提供了一条新途径。本发明提供一种表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白的植物遗传转化及生产方法和表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白的转基因马铃薯，为利用转基因植物生产动物疫苗打下基础。

本发明提供了一种转传染性支气管炎病毒纤突蛋白基因的转基因植物的生产方法，它包括以下步骤：1.构建一个质粒载体或者一段DNA序列，其中都含有编码病毒抗原的基因，而且该基因被置于一个植物启动子操纵之下；2.用质粒载体或上述DNA片段转化植物细胞；3.从转基因植物细胞中再生出完整的转基因植物；4.不同转基因马铃薯植株传染性支气管炎病毒纤突蛋白含量的测定；5.食用一定量的这种转基因植物或注射提纯的表达产物，以达到预防疾病的效果。按照一个优先的实施方案，含有抗原蛋白的完整转基因植物或其某些食用部分可直接进行冷冻、干燥和粉碎，以便加工成其它制剂，并确定其中含有的抗原蛋白数量。

本发明提供了一种马铃薯的遗传转化体系，其抗性愈伤组织诱导的培养基为基础培养基添加2，4-D 2mg/l，6-BA 0.3mg/l和蔗糖3％，琼脂0.7-1.2％，Km50-100mg/l，Carb250-500mg/l，pH5.7，其分化培养基为基础培养基+ZT2mg/l+NAA 20μg/l+GA3 20μg/l+蔗糖3％，琼脂0.7-1.2％，Km50-100mg/l+Carb250-500mg/l

实施例1

1.传染性支气管炎病毒S1蛋白抗原植物表达载体pBIibv/S1构建

如图1所示，以传染性支气管炎病毒ZJ971毒株核酸为模板，根据已知的传染性支气管炎病毒cDNA核酸序列^[26]合成特定的引物，并通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得了传染性支气管炎病毒S1基因。因为在5’端和3’端引物中分别引入了Xba I和BamH I位点，所以扩增片段经Xba I和BamH I双酶切后，被直接定向插入到质粒pBlueScriptSK(+)中的相应位点内。得到质粒pBSIBV/S1，然后通过核苷酸测序，其序列见文后。

质粒pBS IBV/S1含有传染性支气管炎病毒S1蛋白抗原基因，用限制性内切酶Xba I和BamH I双酶切可将S1基因切下来，通过琼脂糖凝胶电泳分离获得该DNA片段，随后插入到质粒pBI 121 GUS基因位点上(Xba I和BamH I双酶切)便分别构建成双元表达载体pBIibv/S1。

质粒pBI 121购自美国Clonetech公司，它的Xba I和BamH I限制性内切酶位点分别位于花椰菜花叶病毒35S启动子和GUS基因起始密码之间以及GUS基因终止序列和NOS终止子之间。选用质粒pBI 121是因为用Xba I和BamH I双酶切可将GUS基因删除，而随后可插入另外一个蛋白基因。新基因将能够在植物细胞内表达。质粒pBI 121还含有新霉素磷酸转移酶II基因(NPT II)，它编码的酶可为植物细胞提供卡那霉素抗性，从而可将含有T-DNA的细胞和组织筛选出来。NPT II基因有自己的启动子和多聚腺酸信号序列，它们源自胭脂碱(Nopaline)合成酶(NOS)基因。

质粒pBIibv/S1含有：1)新霉素合成酶基因II(NPT II)，它提供给植物细胞卡那霉素抗性；2)传染性支气管炎病毒S1抗原基因及操纵该基因的花椰菜花叶病毒35S启动子；3)T-DNA左右边界序列，它可将NPT II基因和传染性支气管炎病毒S1、S抗原蛋白抗原基因转移到植物体内并整合到植物染色体中。pBIibv/S1的结构如图2所示。

2.将表达载体pBIibv/S1导入根癌农杆菌(A.tumefaciens)

含有传染性支气管炎病毒S1蛋白抗原基因的质粒pBIibv/S1通过三亲交配的方式转移到根癌农杆菌EHA105菌株中，该菌株购自美国Clonetech公司。菌株EHA105现已被广泛应用是因为它是一改造后的农杆菌，它含有完整Vir基因，但T-DNA已经被删除。Vir基因可反式调节T-DNA自质粒pSS2L向植物细胞内的转移。

农杆菌在含有25mg/L链霉素50ml YEP培养基中振荡培养，在OD_600nm值达到0.4-0.7时，4000g离心收集细菌细胞，将农杆菌细胞重新悬浮在1ml不含任何抗生素的YEP培养基中待用。含有表达载体pBIibv/S1的DH5α和含有辅助质粒pRK2013的HB101分别接种在含有500mg/L卡那霉素50ml LB培养基中振荡培养，在OD_600nm值达到0.4-0.7时，4000g离心收集细菌细胞，然后将细胞重新悬浮在1ml不含任何抗生素的LB培养基中待用。取上述三种细胞悬浮液各200μL，置于同一1.5ml离心管中，28℃静置培养过夜，取该培养物5-10μL，均匀涂抹在YEP固体培养基平板上，该培养基中同时含有25mg/L链霉素和50ml/L卡那霉素，28℃培养2天后，含有质粒pBIibv/S1质粒的农杆菌菌落开始产生。

用碱裂解法从农杆菌中提取质粒DNA，并用限制性内切酶酶切可检测pBIibv/S1质粒DNA是否存在。

3.农杆菌介导的植物遗传转化

植物的遗传转化首先是植物组织器官或细胞与农杆菌共培养，在培养约2天后，将植物外植体移置相应的选择培养基中。植物外植体可以是原生质体、愈伤组织或其它器官组织，因植物而异。选用带叶子的器官是最常用的方法。

叶片转化主要依据Horsch等人的方法。马铃薯无菌苗[品种为东农3号]，浙江省种子公司提供]保存在24±2℃光照培养箱中，辅之以2000Lx光照强度，每隔2个星期剪取顶端幼芽，重新扦插在不含任何抗生素的MS固体培养基中，生长2星期的叶片最适于转化。

马铃薯均以茎段进行转化为最好。含有表达载体pBIibv/S1的农杆菌EHA105接种在5ml YEP培养基(含100μg/ml卡那霉素)中28℃培养16-24h，取100μL菌液接种到5ml(抗生素Km 100μg/ml)液体培养基中，继续振荡培养到OD₆₀₀为0.4-0.5(大约3-4h)。无菌条件下把菌液转移到1.5mleppendorf中，12000rpm离心20sec，去除上清夜，菌体用液体的MS基础培养基重新悬浮到OD₆₀₀为0.1-0.3。

将经过预培养的外植体进入菌体悬液中作用5min，取出外植体，用灭菌滤纸吸干，立即放置在铺有一层灭菌滤纸的愈伤组织诱导培养基上于黑暗中共培养2天。

将已共培养的马铃薯外植体用无菌水漂洗3-5次，用灭菌滤纸吸干，接种到含抗性愈伤组织诱导的固体培养基平板上。在温度为24±2℃，光照强度2000Lx，光照时间为16h/天下培养7天。基本上外植体可见明显的愈伤组织生长。

将愈伤组织连同外植体一起转移到芽分化培养基上，隔2周换一次培养基，20天左右分化才出小芽，待抗性芽生长到2-3厘米时，将其切下转接到生根的固体培养基上(Kan 100mg/l，Carb 500mg/l)，7天左右开始生根，20天左右成为完整的植株。

植株再生：将愈伤组织连同外植体一起转移到芽分化培养基即基础培养基+ZT2mg/l+NAA 20μg/l+GA3 20μg/l+蔗糖3％，琼脂0.7-1.2％，pH5.7-5.8，Km50-100mg/l+Carb250-500mg/l上，隔2周换一次培养基，20天左右分化才出小芽，待抗性芽生长到2-3厘米时，将其切下转接到含Kan 50-100mg/l，Carb250-500mg/l生根的固体培养基上，7天左右开始生根，20天左右成为完整的植株。

4.表达传染性支气管炎病毒S1蛋白基因工程植株的PCR筛选和Sorthern杂交印迹转基因植物传染性支气管炎病毒S蛋白基因的PCR检测

0.1g植物组织用液氮于研钵中快速研磨呈粉末。将粉末转入一小离心管中，加入3倍体积(W/V)的提取缓冲液(500mM NaCl，50mM Tris.HCl pH8.0，50mMEDTA，1％(V/V)2-巯基乙醇)。解冻后放置于冰上，加入冰冷的20％存贮液聚乙烯吡咯烷酮(PVP)至终浓度为6％，加入固体SDS至终浓度为2％(W/V)，轻轻混匀之后于65℃水浴10分钟。加入1/10的5M醋酸钾(Kac)于冰上反应30分钟，4℃15000rpm离心10分钟。取上相转入一新的离心管，加入0.6倍体异丙醇，倒管混匀3次，再置于冰上10分钟。4℃15000rpm离心10分钟，去上相。沉淀物抽真空或室温吹干后，溶解于500μL 1×TE(PH8.0)。用1倍体积的饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，重复三次。离心(12000rpm，10分钟，20℃)，取上相，转入一新离心管。加入1倍体积的异丙醇(20℃，5分钟)，并将管至少颠倒5次，4℃15000rpm离心10分钟，用70％乙醇冲洗沉淀物，65℃干燥30分钟最后溶于20μL TE中。以提取的基因组DNA为模板，进行PCR检测。结果发现再生植株均能扩增出1.6kb左右的带子，如图1.传染性支气管炎病毒S1蛋白基因的Sorthern杂交印迹检测

采用CTAB法，参照F.奥斯伯著，颜子颖等译《精编分子生物学实验指南》，并略作改进，在CTAB提取液中加入PVP至终浓度为3％，操作步骤：

1)称取5g叶片材料，在液氮中将组织研磨成粉末；

2)将粉末组织转移到一个50ml的离心管中，加入20ml的CTAB提取缓冲液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0，0.7mol/L NaCl，10mmol/L EDTA，1％CTAB，20mmol/L的2-巯基乙醇)，温和混匀；

3)65℃保温10～60min，间或轻弹管底，使其充分混匀；

4)用等体积的24∶1氯仿/异戊醇抽提匀浆液，颠倒使充分混合，于4℃7500rpm离心10min，回收上(水)相；

5)在回收的上层相中，加入1/10体积的65℃的CTAB/NaCl的溶液，颠倒混匀；

6)用等体积的氯仿/异戊醇抽提，混匀，离心，回收上(水)相；

7)加入正好1倍体积的沉淀液，颠倒混匀，如果沉淀可见，继续做步骤8，否则于65℃温育30min；

8)于4℃，2500rpm离心5min；

9)移出上清，但不要丢弃，用高盐的TE缓冲液重悬沉淀(每克起始材料0.5-1ml)，如果沉淀难于重悬，于65℃温育30min，重复直至所有的或大部分沉淀溶解；

10)加入0.6体积的异丙醇沉淀核酸，充分混匀，于4℃，7500rpm离心15min；

11)用80％乙醇洗涤沉淀物，干燥，用尽可能少的缓冲液重悬(每克起始材料0.1-0.5ml)。

用限制性内切酶EcoRI酶切植物基因组DNA，于37℃水浴中反应2，电泳分离DNA片段，在转移到尼龙膜上后，以α-³²P标记的S1蛋白核酸编码序列作为探针进行杂交。结果发现，外源基因已转入植物基因组内，拷贝数为1-3，如图2.

5.S1蛋白转基因马铃薯的RNA分析

剪取马铃薯植株100mg在液氮中磨成粉末，加入1ml Trizol抽提液，放置5分钟；加入200μl的氯仿，室温放置2-3分钟4℃，12000rpm离心15分钟，取上清液。加入600μl的异丙醇，室温放置10分钟；4℃，12000rpm离心10分钟，弃去上清液；加1ml 75％酒精轻洗RNA沉淀；4℃，12000rpm离心5分钟弃去上清，沉淀溶解在30μl DEPC处理的水中。RNA的浓度通过测定OD₂₆₀和OD₂₈₀值予以估算。

将0.2g琼脂糖熔于12.42ml DEPC水，熔化后加入4ml 5×甲醛凝胶电泳缓冲液和3.58ml 37％甲醛溶液，混匀后倒胶；凝胶预电泳5min，5μl RNA提取液中加入20μl灭菌的并经DEPC处理的甲醛凝胶加样缓冲液(含溴化乙锭)，70℃处理10min后将样品加至凝胶加样孔；3-4V/cm电压下电泳。DEPC处理水漂洗凝胶数次，核酸通过毛细管法转移到尼龙膜上，转膜16-20小时。

将含有靶DNA的硝酸纤维素滤膜漂浮于6×SSC的液面上，湿润膜装入杂交炉中，按每平方厘米的硝酸纤维素滤膜加入0.2ml的预杂交液，68℃旋转保温1-2h；将标记好的探针于100℃加热变性5min加入预杂交液中，68℃杂交16-20h；杂交结束后，取出膜并随即将其置于盛有200ml 2×SSC(含0.5％SDS)盘内，于室温浸泡5min；膜转移至200ml 2×SSC(含0.1％SDS)，室温保温15min。更换新配的0.1×SSC(含0.5％SDS)溶液，37℃保温30至60分钟，68℃的水浴温育60min。手提式小型探测器检测膜上的放射性活度。用0.1×SSC于室温短暂漂洗滤膜后，将滤膜置于一叠纸巾上以除去大部分液体；放射自显影和Typhoon检测仪(Apharmacia公司)检测放射信号。结果发现，外源基因均能转录，但转录水平不一样，如图3.

6.不同转基因马铃薯植株传染性支气管炎病毒S1蛋白含量的测定

转基因和非转基因马铃薯块茎用液氮研磨成粉末，加可溶性总蛋白提取液(1.0g块茎/ml)再研磨5min，4℃放置20分钟后把匀浆倒入离心管中，12000rpm，离心5min，上清即为马铃薯块茎提取物。Bradford和ELISA方法测定蛋白质的含量。结果发现，传染性支气管炎病毒S1蛋白含量占转基因马铃薯块茎可溶性总蛋白的0.08-0.22％.

7.表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白转基因植物的繁殖和培育

在筛选出稳定表达传染性支气管炎病毒S1蛋白的转基因马铃薯植株后，为生产该抗原蛋白必须大量繁殖该转基因植株。马铃薯是通过营养繁殖的，因此，可通过扦插的方法，在短时间内便可获得大量幼苗和微型薯。然后用这些幼苗或微型薯在田间大量繁殖，得转基因马铃薯。如图7-8.

8.转基因马铃薯传染性支气管炎病毒S1基因表达产物对动物的保护

不同剂量的转基因马铃薯分别接种SPF鸡，分离接种后不同时间的鸡血清，气管中和试验测定血清中和抗体效价，免疫鸡用传染性支气管炎病毒强毒攻击后可获得优良的保护。表2

                 表2.雏鸡免疫后的中和抗体效价和有效保护率

接种途径	组别a	剂量(g)	动物数量	血清中和效价		保护数/攻毒数
							首免后1周	三免后1周
				口服	转基因土豆				5	6	1∶11.4	1∶1650	6/6
2.5	6	1∶10.4	1∶1270			5/6
							IB弱毒疫苗	1 dose	6	1∶13.0	1∶1412	6/6
非转基因土豆	5	6	0		0	0/6
							缓冲液	5	6	0	0	0/6
肌注	转基因土豆	5	6		1∶16.9	1∶2187							6/6
				2.5			6	1∶12.6	1∶1357	5/6

实施例2

1.传染性支气管炎病毒纤突蛋白抗原植物表达载体pBIibv/S构建如图所示，以传染性支气管炎病毒(H52毒株)核酸为模板，根据已知的传染性支气管炎病毒cDNA核酸序列⁽²⁶⁾合成特定的引物，并通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得了传染性支气管炎病毒S蛋白基因。因为在5’端和3’端引物中分别引入了Xba I和BamH I位点，所以扩增片段经Xba I和BamH I双酶切后，被直接定向插入到质粒pBlueScriptSK(+)中的相应位点内。得到质粒pBS IBV/S，然后通过核苷酸测序，其序列见文后。

质粒pBS IBV/S分别含有传染性支气管炎病毒S蛋白抗原基因，用限制性内切酶Xba I和BamH I双酶切可将S基因切下来，通过琼脂糖凝胶电泳分离获得该DNA片段，随后插入到质粒pBI 121原GUS基因位点上(Xba I和BamH I双酶切)便分别构建成双元表达载体pBIibv/S。2.将表达载体pBIibv/S导入根癌农杆菌(A.tumefaciens)

含有传染性支气管炎病毒S蛋白抗原基因的质粒pBIibv/S被通过三亲交配的方式转移到根癌农杆菌EHA105菌株中，该菌株购自美国Clonetech公司。菌株EHA105现已被广泛应用是因为它是一改造后的农杆菌，它含有完整Vir基因，但T-DNA已经被删除。Vir基因可反式调节T-DNA自质粒pBIibv/S向植物细胞内的转移。

农杆菌在含有25mg/L链霉素50ml YEP培养基中振荡培养，在OD_600nm值达到0.5时，4000g离心收集细菌细胞，将农杆菌细胞重新悬浮在1ml不含任何抗生素的YEP培养基中待用。含有表达载体pBIibv/S的DH5α和含有辅助质粒pRK2013的HB101分别接种在含有500mg/L卡那霉素50ml LB培养基中振荡培养，在OD_600m值达到0.5时，4000g离心收集细菌细胞，然后将细胞重新悬浮在1ml不含任何抗生素的LB培养基中待用。取上述三种细胞悬浮液各200μL，置于同-1.5ml离心管中，28℃静置培养过夜，取该培养物5-10μL，均匀涂抹在YEP固体培养基平板上，该培养基中同时含有25mg/L链霉素和50ml/L卡那霉素，28℃培养2天后，含有质粒pBIibv/S质粒的农杆菌菌落开始产生。

用碱裂解法从农杆菌中提取质粒DNA，并用限制性内切酶酶切可检测pBIibv/S质粒DNA是否存在。3.农杆菌介导的植物遗传转化

从平板上挑取农杆菌单菌落，接种到5ml YEP液体培养基(抗生素Km100μg/ml)中，在28℃条件下振荡培养16-24h，取1000μL菌液接种到100ml(抗生素Km 100μg/ml)液体培养基中，继续振荡培养到OD₆₀₀为0.4-0.5。无菌条件下把菌液转移到50ml eppendorf中，12000rpm离心20秒，去除上清夜，菌体用液体的MS基础培养基重新悬浮到OD₆₀₀为0.2-0.3。

在无菌条件下，取无菌苗，用手术刀把马铃薯切成0.3-0.5cm长度的茎段，接种到愈伤诱导固体培养基(在基础培养基基础上添加2，4-D 2mg/l，6-BA0.3mg/l，蔗糖3％，pH5.8)平板上面，在光照强度为2000Lx，光照时间为16h/天，温度为24±2℃条件下预培养2天。将经过预培养的外植体浸入菌体悬液中作用5-8min，取出外植体，用灭菌滤纸吸干，立即放置在铺有一层灭菌滤纸的愈伤组织诱导培养基上(基础固体培养基添加2，4-D 2mg/l，6-BA 0.3mg/l和蔗糖3％，pH5.7)于黑暗中共培养48小时，使农杆菌在与外植体接触的过程中，将Ti质粒所带的外源基因引入植物细胞内。将已共培养的马铃薯外植体用无菌水漂洗3-5次，用灭菌滤纸吸干，接种到含抗性愈伤组织诱导的固体培养基平板上(基础固体培养基添加2，4-D 2mg/l，6-BA 0.3mg/l和蔗糖3％，Km100mg/l，Carb 500mg/l，pH5.7)。在温度为24±2℃，光照强度2000Lx，光照时间为16h/天下培养7天。转化的外植体可见明显的愈伤组织生长。

植株再生：将愈伤组织连同外植体一起转移到芽分化培养基即基础培养基+ZT 2mg/l+NAA 20μg/l+GA3 20μg/l+蔗糖3％，琼脂0.7-1.2％，pH5.7-5.8，Km50-100mg/l+Carb250-500mg/l上，隔2周换一次培养基，20天左右分化才出小芽，待抗性芽生长到2-3厘米时，将其切下转接到含Kan 50-100mg/l，Carb250-500mg/l生根的固体培养基上，7天左右开始生根，20天左右成为完整的植株。4.表达传染性支气管炎病毒S蛋白基因工程植株的筛选

完整的植株可检测转基因植株是否含有传染性支气管炎病毒S蛋白，可用PCR和Southern blot予以确定。

1)转基因植物传染性支气管炎病毒S蛋白基因的PCR检测

0.1g植物组织用液氮于研钵中快速研磨呈粉末。将粉末转入一小离心管中，加入3倍体积(W/V)的提取缓冲液(500mM NaCl，50mM Tris.HCl pH8.0，50mMEDTA，1％(V/V)2-巯基乙醇)。解冻后放置于冰上，加入冰冷的20％存贮液聚乙烯吡咯烷酮(PVP)至终浓度为6％，加入固体SDS至终浓度为2％(W/V)，轻轻混匀之后于65℃水浴10分钟。加入1/10的5M醋酸钾(Kac)于冰上反应30分钟，4℃15000rpm离心10分钟。取上相转入一新的离心管，加入0.6倍体异丙醇，倒管混匀3次，再置于冰上10分钟。4℃15000rpm离心10分钟，去上相。沉淀物抽真空或室温吹干后，溶解于500μL 1×TE(PH 8.0)。用1倍体积的饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，重复三次。离心(12000rpm，10分钟，20℃)，取上相，转入一新离心管。加入1倍体积的异丙醇(20℃，5分钟)，并将管至少颠倒5次，4℃15000rpm离心10分钟，用70％乙醇冲洗沉淀物，65℃干燥30分钟最后溶于20μL TE中。以提取的基因组DNA为模板，进行PCR检测。结果发现再生植株均能扩增出3.5kb左右的带子，如图4。

2)转基因植物传染性支气管炎病毒S蛋白基因的Sothern blot检测

取5g植物材料在液氮中研磨成粉末；将粉末组织转移到一个50ml的离心管中，加入20ml的60℃预热的缓冲液，60℃保温10～60min；加入等体积的24∶1氯仿/异戊醇抽提匀浆液，颠倒使充分混合，轻轻摇晃20min，重复一次。于4℃5000rpm离心15min，取上清液加入等体积的异丙醇，钩出DNA絮状沉淀，吸干，溶于100μLTE。加入5μLRNase A37℃消化(10μg/μL)10min，加入1/10体积的3M的NaAC和2倍体积的冰乙醇，混匀，-20℃放置30min，用玻璃棒钩出DNA沉淀，70％的乙醇漂洗，干净的吸水纸吸干，并将DNA重新溶解于100μLTE中。取2μLDNA样品在0.8％的Agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小，并测定OD260/280数值，确定DNA的含量和质量。

限制性内切酶BamH I酶切植物基因组DNA，0.8％琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，将琼脂糖凝胶放入0.25mol/L HCl中，温和振荡30min，去离子水稍稍漂洗；凝胶在0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl变性液中温和振荡30min，使DNA变性，然后在0.5mol/L Tris·HCl，1.5mol/L NaCl中和液中振荡30min，使之中和。在10×SSC溶液中，通过毛细管法将DNA转移至硝酸纤维素膜上。转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和滤纸，翻转凝胶和硝酸纤维素滤膜，以凝胶的一面在上，置一干滤纸上，用铅笔在滤膜上标记加样孔的位置。以6×SSC室温浸泡滤膜5min，以除去粘着在滤膜上的琼脂糖碎片。从6×SSC溶液中取出滤膜，待滤膜上的溶液滴尽后平放在一张纸巾上，于室温晾干30min，80℃烤膜2h，取出用保鲜膜包好备用。

将含有靶DNA的硝酸纤维素滤膜漂浮于6×SSC的液面上，待其完全湿润，将湿润滤膜装入杂交炉中，加入预杂交液，58℃旋转保温1-2h；将变性好的探针溶液加入预杂交液中，58℃杂交16-20h；杂交结束后，将滤膜转移至200ml 2×SSC中，于室温保温15min，手提式小型探测器检测膜上的放射性活度，滤膜上含正确DNA的部分应发出可检测到的信号；放射自显影和Typhoon检测仪获得传染性支气管炎病毒S蛋白基因信号。结果发现，外源基因已转入植物基因组内，拷贝数为1-3，如图5.5.S蛋白转基因马铃薯的RNA分析

剪取马铃薯植株100mg在液氮中磨成粉末，加入1ml Trizol抽提液，放置5分钟；加入200μl的氯仿，室温放置2-3分钟4℃，12000rpm离心15分钟，取上清液。加入600μl的异丙醇，室温放置10分钟；4℃，12000rpm离心10分钟，弃去上清液；加1ml 75％酒精轻洗RNA沉淀；4℃，12000rpm离心5分钟弃去上清，沉淀溶解在30μl DEPC处理的水中。RNA的浓度通过测定OD₂₆₀和OD₂₈₀值予以估算。

将0.2g琼脂糖熔于12.42ml DEPC水，熔化后加入4ml 5×甲醛凝胶电泳缓冲液和3.58ml 37％甲醛溶液，混匀后倒胶；凝胶预电泳5min，5μl RNA提取液中加入20μl灭菌的并经DEPC处理的甲醛凝胶加样缓冲液(含溴化乙锭)，70℃处理10min后将样品加至凝胶加样孔；3-4V/cm电压下电泳。DEPC处理水漂洗凝胶数次，核酸通过毛细管法转移到尼龙膜上，转膜16-20小时。

将含有RNA的硝酸纤维素滤膜漂浮于6×SSC的液面上，待其完全湿润，将湿润滤膜装入杂交炉中，加入预杂交液，58℃旋转保温1-2h；将变性好的探针溶液加入预杂交液中，58℃杂交16-20h；杂交结束后，将滤膜转移至200ml 2×SSC中，于室温保温15min，手提式小型探测器检测膜上的放射性活度，滤膜上含正确DNA的部分应发出可检测到的信号；放射自显影和Typhoon检测仪获得传染性支气管炎病毒S蛋白信号。结果发现，外源基因均能转录，如图6.

6.表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白转基因植物的繁殖和培育

在筛选出稳定表达传染性支气管炎病毒S1蛋白的转基因马铃薯植株后，为生产该抗原蛋白必须大量繁殖该转基因植株。马铃薯是通过营养繁殖的，因此，可通过扦插的方法，在短时间内便可获得大量幼苗和微型薯。然后用这些幼苗或微型薯在田间大量繁殖，得转基因马铃薯。

SEQUENCE LISTING<110>浙江大学

继勇，周<120>  一种传染性支气管炎病毒纤突蛋白基因<130>  无<140>  无<141>  2003-04-08<160>  2<170>  PatentIn version 3.1<210>  1<211>  1596<212>  DNA<213>  chicken<400>  1atgttggtaa cacctctttt actagtgact cttttgtgtg cactatgtag tgctgttttg    60tatgacagta gttcttacgt gtactactac caaagtgcct tcagaccacc tgatggttgg    120catttacatg ggggtgcgta tgcggttgtt aatatttcta gtgaatctaa taatgcaggc    180tcttcatctg ggtgtactgt tggtattatt catggtggtc gtgttgttaa tgcttcttct    240atagctatga cggcaccgtc atcaggtatg gcttggtcta gcagtcagtt ttgtactgca    300tactgtaact tttcagatac tacagtgttt gttacacatt gtcataaaca tgttgggtgt    360cctttaactg gcatgcttca acagcatcct atacctgttt ctgctatgaa aaatggccag    420cttttttata atttaacagt tagtgtagct aagtacccta cttttaaatc atttcagtgt    480gtttataatt taacatccgt atatttaaat ggtgatcttg tttacacctc taatgagacc    540acagatgtta catctgcagg tgtttatttt aaagctggtg gacctataac ttataaagtt    600atgagagaag ttagagccct ggcttatttt gttaatggta ctgcacaaga tgttattttg    660tgtgatgggt cacctagagg cttgttagca tgccagtata atactggcaa tttttcagat    720ggcttttatc cttttactaa tagtagttta gttaagcaga agtttattgt ctatcgtgaa    780aatagtgtta atactacttt tacgttacac aatttcactt ttcataatga gactggcgcc    840aacccaaatc ctagtggtgt ccagaatatt caaacttacc aaacacaaac agctcagagt    900ggttattata attttaattt ttcctttctg agtagttttg tttataagga gtctaatttt    960atgtatggat cttatcaccc aagttgtaat tttagactag aaactattaa taatggtttg   1020tggtttaatt cactttcagt ttcaattgct tacggtcctc ttcaaggtgg ttgcaagcaa   1080tctgtcttta gtggtagagc aacctgttgt tatgcttact catatggagg tcctttgctg   1140tgtaaaggtg tttattcagg tgagttagat cataattttg aatgtggact gttagtttat   1200gttactaaga gcggtggctc tcgtatacaa acagccactg aaccgccagt tataactcaa   1260cacaattata ataatattac tttaaatact tgtgttgatt ataatatata tggcagaatt   1320ggccaaggtt ttattactaa tgtaaccgac tcagctgtta gttataatta tctagcagac   1380gcaggtttgg ctattttaga tacatctggt tccatagaca tctttgtcgt acaaagtgaa   1440tatggtctta attattataa ggttaaccct tgcgaagatg tcaaccagca gtttgtagtt   1500tctggtggta aattagtagg tattcttact tcacgtaatg agactggttc ccagcttctt   1560gagaatcagt tttacatcaa aatcactaat ggaaca                             1596<210>  2<211>  3540<212>  DNA<213>  chicken<400>  2ttagtcttta atttaattaa gtgtggtaag ttactggtaa gagatgttgg taacacctct     60tttactagtg actcttttgt gtgcactatg tagtgctgtt ttgtatgaca gtagttctta    120cgtgtactac taccaaagtg ccttcagacc acctgatggt tggcatttac atgggggtgc    180gtatgcggtt gttaatattt ctagtgaatc taataatgca ggctcttcat ctgggtgtac    240tgttggtatt attcatggtg gtcgtgttgt taatgcttct tctatagcta tgacggcacc    300gtcatcaggt atggcttggt ctagcagtca gttttgtact gcatactgta acttttcaga    360tactacagtg tttgttacac attgttataa acatgttggg tgttctttaa ctggcatgct    420tcaacagcat tctatacgtg tttctgctat gaaaaatggc cagctttttt ataatttaac    480agttagtgta gctaagtacc ctacttttaa atcatttcag tgtgttaata atttaacatc    540cgtatattta aatggtgatc ttgtttacac ctctaatgag accacagatg ttacatctgc    600aggtgtttat tttaaagctg gtggacctat aacttataaa gttatgagag aagttagagc    660cctggcttat tttgttaatg gtactgcaca agatgttatt ttgtgtgatg ggtcacctag    720aggcttgtta gcatgccagt ataatactgg caatttttca gatggctttt atccttttac    780taatagtagt ttagttaagc agaagtttat tgtctatcgt gaaaatagtg ttaatactac    840ttttacgtta cacaatttca cttttcataa tgagactggc gccaacccaa atcctagtgg    900tgtccagaat attcaaactt accaaacaca aacagctcag agtggttatt ataattttaa    960tttttccttt ctgagtagtt ttgtttataa ggagtctaat tttatgtatg gatcttatca   1020cccaagttgt aattttagac tagaaactat taataatggt ttgtggttta attcactttc   1080agtttcaatt gcttacggtc ctcttcaagg tggttgcaag caatctgtct ttagtggtag   1140agcaacctgt tgttatgctt actcatatgg aggtcctttg ctgtgtaaag gtgtttattc   1200aggtgagtta gatcataatt ttgaatgtgg actgttagtt tatgttacta agagcggtgg   1260ctctcgtata caaacagcca ctgaaccgcc agttataact caacacaatt ataataatat   1320tactttaaat acttgtgttg attataatat atatggcgga attggccaag gttttattac   1380taatgtaacc gactcagctg ttagttataa ttatctagca gacgcaggtt tggctatttt   1440agatacatct ggttccatag acatctttgt cgtacaaagt gaatatggtc ttaattatta   1500taaggttaac ccttgcgaag atgtcaacca gcagtttgta gtttctggtg gtaaattagt   1560aggtattctt acttcacgta atgagactgg ttcccagctt cttgagaatc agttttacat   1620caaaatcact aatggaacac gtcgttttag acgttctatt actgaaagtg ttgaaaattg   1680cccttatgtt agttatggta agttttgtat aaaacctgat ggctcaattg ccacaatagt   1740accaaaacaa ttggaacagt ttgtggcacc tttacttaat gttactgaaa atgtgctcat   1800acctaacagt tttaatttaa ctgttaccga tgagtacata caaacgctta tggataaggt   1860ccaaattaat tgcctgcagt atatttgtgg caattctctg gagtgcagaa atttgtttca   1920acaatatggt cctgtttgcg acaacatatt gtctgtagta aatagtgttg gtcaaaaaga   1980agatatggaa cttttgaatt tctattcttc tactaagccg gctggtttta atacaccagt   2040tcttagtaat gttagcactg gtgagtttaa tatttctctt tttttaacaa cgcctagtag   2100tcctagaagg cgttctttta ttgaagacct tctatttaca agtgttgaat ctgttggatt   2160accaacagat gacgcataca aaaattgcac tgcaggtcct ttaggctttc ttaaggacct   2220tgtatgtgct cgtgaatata atggtttgct tgtgttgcct cctattataa cagcagaaat   2280gcaaactttg tatactagtt ctctagtagc ttctatggct tttggtggta ttactgcagc   2340tggtgctata ccttttgcca cacaactgca ggctagaatt aatcacttgg gtattaccca   2400gtcacttctt ttgaagaatc aagaaaaaat tgctgcttcc tttaataagg ccatcggtca   2460tatgcaggaa ggttttagaa gtacatcttt agcattacaa caaattcaag atgttgttaa   2520taagcagagt gctattctta ctgagactat ggcatcactt aataaaaatt ttggtgccat   2580ttcttctgtg attcaagaaa tctaccagca acttgacgcc atacaagcaa atgctcaagt   2640ggatcgtctt ataactggta gattgtcatc actttctgtt ttagcatctg ctaagcaggc   2700ggagtatatt agagtgtcac aacagcgtga gttagctact cagaagatta atgagtgtgt   2760taagtcacag tccattaggt actccttttg tggtaatgga cgacatgttt taaccatacc   2820gcaaaatgca cctaatggta tagtgtttat acacttttct tacactccag atagttttgt   2880taatgttact gcaatagtgg gtttttgtgt aaagccagct aatgctagtc agtatgcaat   2940agtacccgct aatggtaggg gtatttttat acaagttaat ggtagttact acatcactgc   3000acgagatatg tatatgccaa gagctattac tgcaggagat atagttacgc ttacttcttg   3060tcaagtaaat tatgtaagtg taaataagac cgtcattact acattcgtag acaatgatga   3120ttttgatttt aatgacgaat tgtcaaaatg gtggaatgat actaagcatg agctaccaga   3180ctttgacaaa ttcaattaca cagtacctat acttgacatt gatagtgaaa ttgatcgtat   3240tcaaggcgtt atacagggtc ttaatgactc tctaatagac cttgaaaaac tttcaatact   3300caaaacttat attaagtggc cttggtatgt gtggttagcc atagcttttg ccactattat   3360cttcatctta atattaggat gggttttctt catgactggg tgttgtggtt gttgttgtgg   3420atgctttggc attatgcctc taatgagtaa gtgtggtaag aaatcttctt attacacgac   3480ttttgataac gatgtggtaa ctgaacaata cagacctaaa aagtctgttt aatgatccaa   3540

Claims (2)

1.一种表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白的转基因马铃薯生产方法，其特征在于它的的步骤如下：

1)传染性支气管炎病毒S1或S蛋白抗原基因的植物表达载体pBIibv/S1或pBIibv/S构建：以传染性支气管炎病毒毒株核酸为模板，PCR扩增获得传染性支气管炎病毒S1或S基因被直接定向插入到质粒pBlueScriptSK(+)中的相应位点内，得到质粒pBS IBV/S1或pBS IBV/S，然后pBS IBV/S1或pBS IBV/S用限制性内切酶Xba I和BamH I双酶切可将S1或S基因切下来，通过琼脂糖凝胶电泳分离获得该DNA片段，随后插入到质粒pBI 121 GUS基因位点上(Xba I和BamH I双酶切)便构建成双元表达载体pBIibv/S1或pBIibv/S。

2)表达载体pBIibv/S1或pBIibv/S经三亲交配法导入到具有较强感染能力的农杆菌菌株EHA105中；

3)农杆菌介导的植物遗传转化：农杆菌介导的植物遗传转化是将经过预培养的马铃薯无菌苗外植体与含有表达载体pBIibv/S1或pBIibv/S的农杆菌EHA105共培养后在抗性愈伤组织诱导的培养基上诱导形成抗性愈伤组织，抗性愈伤组织在分化培养基上分化出抗性芽，抗性芽生根培养基上生根发育成完整的再生植株。

4)用PCR、Southern-blot、Northern-blot确定转基因植株；

5)不同转基因马铃薯植株传染性支气管炎病毒纤突蛋白含量的测定：用ELISA方法测定转基因马铃薯植株传染性支气管炎病毒纤突蛋白含量，获得表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白转基因植株；

6)表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白转基因植物的田间繁殖和培育。

2.根据权利要求1所述一种表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白的转基因马铃薯生产方法，其特征在于所说的马铃薯的遗传转化方法的步骤如下：1)预培养：

在无菌条件下取无菌苗，用手术刀把马铃薯切成0.3-0.5cm长度的茎段，接种到愈伤诱导固体培养基即MS培养基无机成分加B5培养基的有机成分组成的基础培养基上添加2，4-D 2mg/l，6-BA 0.3mg/l，蔗糖3％，琼脂0.7-1.2％，pH5.8的平板上面，在光照强度为2000Lx，光照时间为16h/天，温度为24±2℃条件下预培养2-3天。

2)含表达载体的农杆菌转化：

从平板上挑取农杆菌单菌落，接种到5ml含抗生素Km 50-100μg/ml YEP液体培养基中，在28℃条件下振荡培养16-24h，取100μL含抗生素Km 50-100μg/ml菌液接种到5ml液体培养基中，继续振荡培养到OD₆₀₀为0.4-0.5，大约3-4h。无菌条件下把菌液转移到1.5mleppendorf中，12000rpm离心20sec，去除上清夜，菌体用液体的MS基础培养基重新悬浮到OD₆₀₀为0.1-0.3。3)共培养：

将经过预培养的外植体进入菌体悬液中作用5min，取出外植体，用灭菌滤纸吸干，立即放置在铺有一层灭菌滤纸的愈伤组织诱导培养基即MS培养基无机成分加B5培养基的有机成分组成基础培养基添加2，4-D 2mg/l，6-BA 0.3mg/l和蔗糖3％，琼脂0.7-1.2％，pH5.7上于黑暗中共培养2-3天。4)洗涤和抗性愈伤组织的诱导：

将已共培养的马铃薯外植体用无菌水漂洗3-5次，用灭菌滤纸吸干，接种到含抗性愈伤组织诱导的培养基即MS培养基无机成分加B5培养基的有机成分组成基础培养基添加2，4-D 2mg/l，6-BA 0.3mg/l和蔗糖3％，琼脂0.7-1.2％，Km50-100mg/l，Carb250-500mg/l，pH5.7-5.8平板上。在温度为24±2℃，光照强度2000Lx，光照时间为16h/天下培养7-9天。基本上外植体可见明显的愈伤组织生长。5)植株再生：

将愈伤组织连同外植体一起转移到芽分化培养基即MS培养基无机成分加B5培养基的有机成分组成基础培养基+ZT 2mg/l+NAA 20μg/l+GA3 20μg/l+蔗糖3％，琼脂0.7-1.2％，，pH5.7-5.8，Km50-100mg/l+Carb250-500mg/l，上，隔2周换一次培养基，20天左右分化才出小芽，待抗性芽生长到2-3厘米时，将其切下转接到含Kan 50-100mg/l，Carb 250-500mg/l生根的固体培养基上，7天左右开始生根，20天左右成为完整的植株。

Images