CN109517044A - 一种猪流行性腹泻病毒基因工程抗原和抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒基因工程抗原和抗体，以该病毒经典毒株和变异毒株为基础材料，经试验验证，将原有的遗传基因序列进行了系统的改造、优化、人工从头合成，分别得到了源自经典毒株的三条保护性抗原基因，以及源自变异毒株的三条保护性抗原基因，将六条基因分别与原核表达载体连接，筛选鉴定后得到重组表达菌株；经IPTG诱导得目的蛋白；将六种蛋白纯化，按照质量比为1:1:(2‑4):1:1:(2‑4)的比例混合，加入白油或其他免疫增强剂，制备成油包水型的免疫原。免疫蛋鸡，收集鸡蛋，从卵黄中提取卵黄抗体。新生哺乳仔猪口服该抗体制剂，能够预防猪流行性腹泻经典毒株和变异毒株的感染，大大提高了临床使用范围，提高了治疗和预防效果。
Description
技术领域
本发明属于基因工程制备抗原和抗体技术领域，具体涉及一种猪经典毒株和变异毒株主要保护性抗原和卵黄抗体及其制备方法。
背景技术
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的以水样呕吐、腹泻、脱水为主要特征的肠道传染病，死亡率高达100％。经典PEDV毒株感染，传播速度慢，以地方性流行为主要流行特点，而自2010年以来，我国陆续出现新的PEDV变异流行毒株，凸显传播快、高发病率和高死亡率等特点。自2013年4月PED疫情在北美洲爆发并迅速传播，给猪业造成巨大的经济损失。我国新流行的变异毒株无论是在致病性还是流行特点方面都与以往的经典毒株有所不同，其基因水平差异甚大，美国新流行毒株与我国2011～2012间的流行部分毒株同源性达99％以上，韩国也分离得到同源性高度相似的毒株。尽管不同国家和地区的分离毒株在基因序列有所差异，但它们都处在一个遗传分支上，而以往的经典PEDV毒株处在另外一个遗传分支；相对经典毒株，新流行毒株的主要抗原基因出现较大范围的插入、缺失和点突变，这表明，新流行毒发生较大变异，给PEDV的防治提出了新的挑战。
PEDV属于冠状病毒科成员，其基因组为单股正链RNA，具有感染性，编码4种结构蛋白，纤突(S)蛋白、膜(M)蛋白、小膜(E)蛋白和核衣壳(N)蛋白，其中S蛋白位于病毒粒子的表面,与病毒的吸附和抗药性相关；S蛋白可以划分为两个功能区即S1(第1-789位氨基酸)和S2(第790-1383位氨基酸)，其S1结构不仅含有介导病毒侵入机体细胞的受体结合结构域，还拥有介导机体产生中和抗体的抗原表位，在病毒与宿主细胞膜融合入侵和诱导中和抗体产生的过程中起关键作用，因此，S1蛋白被认为是诊断、治疗性抗体和亚单位疫苗开发的候选蛋白。
卵黄抗体(IgY)具有产量高、特异性强、成本低、符合动物福利等优点，目前，IgY技术和产品已被广泛用于医药卫生、生物技术、食品保鲜、保健食品开发以及人和动物疾病的诊断与防治等领域。食品安全、抗生素滥用和细菌耐药性问题被日益受到人们严正关注，随着农业部对部分抗生素的禁用和取缔，抗生素替代品成为绿色兽药发展的方向之一。相对于抗生素，卵黄抗体在抗菌药物替代及饲料添加剂中具有很多天然的优势，如无毒、无害、无残留，而且特异性的IgY对于感染性疾病的预防和治疗针对性更强、防治效率更高、成本更低。
近年来，PEDV感染所造成的严重损失不可估量，尤其是，截止目前，商品化疫苗使用和改善各种管理措施的情况下，却没有得到有效控制。在着眼于新流行毒株新型疫苗开发的同时，针对紧急预防性抗体如IgY研究也受到重视。目前，一些处于实验阶段的IgY制剂多采用传统的全病毒灭活疫苗制备免疫原免疫蛋鸡提取制备，这种方法成本高，抗原纯度不高，有效抗原含量得不到保障，最后导致免疫效果差，IgY产量低，最终导致防治效果差等突出问题。
发明内容
本发明的目的是为解决上述现有技术问题的不足，提供一种猪流行性腹泻病毒的抗原和抗体。该抗原是将原有的遗传基因序列进行了系统的改造、优化，得到的源自毒株的多条保护性抗原基因表达的蛋白。蛋白免疫蛋鸡后，获得抗体，作为一种被动免疫的方式给新生仔猪提供保护，在初步的临床应用中有较好的效果，为临床PEDV防控提供了一种技术产品支撑。
猪流行性腹泻病毒基因工程免疫原，包含六种蛋白中的一种或几种，六种蛋白的氨基酸序列如：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQID No.6所示。
所述的六种蛋白的核苷酸序列如：SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12所示。
所述的六种蛋白还包括通过碱基的删减，增加或者替换之后表达的具有相似免疫原功能的蛋白。
所述的猪流行性腹泻病毒基因工程免疫原，优选包含六种蛋白，六种蛋白的氨基酸序列如：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6所示。
所述的猪流行性腹泻病毒基因工程免疫原，六种蛋白优选按照质量比为1:1:(2-4):1:1:(2-4)的比例混合。
所述的猪流行性腹泻病毒基因工程免疫原，优选将六种蛋白纯化，按照质量比为1:1:2:1:1:2的比例混合。加入白油或其他免疫增强剂，使每一种蛋白的终浓度含量在50μg/mL～300μg/mL之间，随后进行乳化，制备成油包水型的免疫原。
猪流行性腹泻病毒基因工程抗体，是由上述的猪流行性腹泻病毒基因工程免疫原免疫动物后获得的抗体。具体是将所述的猪流行性腹泻病毒基因工程免疫原免疫动物免疫蛋鸡，然后从鸡蛋中提取该抗体。更具体的是采用免疫原对蛋鸡进行免疫，共进行三次免疫，首次免疫后间隔21d做第二次免疫，第二次免疫后30d做第三次免疫；提取第3次免疫后的鸡蛋的IgY抗体。
进一步的，抽取第3次免疫后的鸡蛋，检测蛋白的特异性卵黄抗体效价，当蛋白的抗体中和效价达到1:128倍以上时，大量提取制备出IgY抗体。
本发明优选的一种猪流行性腹泻经典毒株和变异毒株两种毒株的复合IgY抗体的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、采用从临床病例中分离得到的猪流行性腹泻经典毒株和变异毒株为基础材料，经试验验证和分子生物学技术配合验证，将原有的遗传基因序列进行了系统的改造、优化，分别得到了源自经典毒株的三条保护性抗原基因SEQ ID No.7、SEQ ID No.8和SEQID No.9，以及源自变异毒株的三条保护性抗原基因SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ IDNo.12。
步骤二、将六条基因分别克隆至原核表达载体pET28a，转化至表达菌株Rosetta(DE3)，用诱导物IPTG诱导重组菌株表达目的蛋白，收集菌体，采用超声破碎法分离纯化得到融合蛋白；所得蛋白的氨基酸序列依次如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。
步骤三、将六种蛋白纯化，按照质量比为1:1:(2-4):1:1:(2-4)的比例混合，将混合好的蛋白与白油或其他佐剂混合乳化，制成油包水型免疫原A；采用免疫原对蛋鸡进行免疫，共进行三次免疫，首次免疫后间隔21d做第二次免疫，第二次免疫后30d做第三次免疫。抽取第3次免疫后的鸡蛋采用病毒中和试验方法检测每种蛋白的特异性卵黄抗体效价，当每种蛋白的抗体效价达到1:128倍以上时，大量提取制备出猪流行性腹泻经典毒株和变异毒株两种毒株的复合IgY抗体。
所制备的复合IgY抗体在猪流行性腹泻发病猪场的使用方法为：新生仔猪出生后未吃初乳前口服适当剂量。
进一步的，一种猪流行性腹泻经典毒株和变异毒株两种毒株的复合IgY抗体的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、猪流行性腹泻经典毒株和变异毒株两种毒株的序列进行基因工程表达条件的优化设计：
1、病毒原始序列的获取：以分别将猪流行性腹泻经典毒株和变异毒株两种毒株接种非洲绿猴肾细胞(vero细胞)，加入胰酶培养产生病变后，提取总RNA，采用随机引物合成第一链cDNA，采用RT-PCR方法扩增得到猪流行性腹泻经典毒株和变异毒株两种毒株的S1基因片段。将PCR产物纯化克隆至T载体，经双酶切和序列测定鉴定核酸序列。
2、序列的优化：将得到的猪流行性腹泻经典毒株和变异毒株两种毒株的S1基因分成多个片段，分别克隆至表达载体中构建重组表达菌株，进行表达反复试验验证各个片段的表达效率，然后利用Lasergen7.1和Mega5.0等生物学软件对序列密码子优化、对片段大小、表位分布进行优化，最终得到一套最优的设计方案。具体优化过程如下：
通过我们的研究发现：
(1)对于经典毒株而言，位于S1蛋白中的“55SMNSSSWYCGTGIE68”(SEQ ID No.13)、“223YYEPCTANCTGYAANVFATDS243”(SEQ ID No.14)、“515SAAFGGLSSANLV527”(SEQ ID No.15)、“594GACTIDLFGYPAFGSGVKL612”(SEQ ID No.16)和“659IITLTNSSI667”(SEQ ID No.17)表位均能刺激机体产生特异性抗体，且对病毒的吸附和感染均有不同程度的阻断作用，尤其以“515SAAFGGLSSANLV527”和“594GACTIDLFGYPAFGSGVKL612”特异性抗体阻断效果最为显著。
根据表位的分布进行核苷酸序列优化设计和人工改造，分别得到氨基酸序列：SEQID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3，其对应的核苷酸序列依次为：SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9。
(2)对于变异毒株而言，位于S1蛋白中的“55IGENQGVNSTWYCAGQHP72”(SEQ IDNo.18)、“226SYQPCTANCIGYAANVFATEP246”(SEQ ID No.19)、“518AASFGGHSGAHLI530”(SEQ IDNo.20)、“597SACTIDLFGYPEFGSGVKF615”(SEQ ID No.21)和“662VITLTNSSF670”(SEQ ID No.22)表位均能刺激机体产生特异性抗体，且对病毒的吸附和感染均有不同程度的阻断作用，尤其以“518AASFGGHSGAHLI530”和“597SACTIDLFGYPEFGSGVKF615”特异性抗体阻断效果最为显著。
根据表位的分布进行核苷酸序列优化设计和人工改造，分别得到氨基酸序列：SEQID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6，其对应的核苷酸序列依次为：SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11、SEQ ID No.12。
优化后的抗原片段特征描述如下：
SEQ ID No.1：含有两个相同的表位：“55SMNSSSWYCGTGIE68”和“207SMNSSSWYCGTGIE220”，且“207SMNSSSWYCGTGIE220”位于该片段的-COOH末端。
SEQ ID No.2：含有两个相同的表位：“32YYEPCTANCTGYAANVFATDS52”和“202YYEPCTANCTGYAANVFATDS222”。
其中“202YYEPCTANCTGYAANVFATDS222”位于该片段的-COOH末端。
SEQ ID No.3：-COOH末端含有三个串联表位：“120SAAFGGLSSANLV132”、“133GACTIDLFGYPAFGSGVKL151”和“152IITLTNSSI160”。
SEQ ID No.4:含有两个相同的表位：“55IGENQGVNSTWYCAGQHP72”和“210IGENQGVNSTWYCAGQHP227”，其中“210IGENQGVNSTWYCAGQHP227”位于该片段的-COOH末端。
SEQ ID No.5:含有两个相同的表位：“32SYQPCTANCIGYAANVFATEP52”和“202SYQPCTANCIGYAANVFATEP222”且分别位于-NH2端和-COOH末端。
SEQ ID No.6:其-COOH末端含有三个串联表位：“120AASFGGHSGAHLI132”、“133SACTIDLFGYPEFGSGVKF151”和“152VITLTNSSF160”。
(3)将经典毒株和变异毒株采用vero细胞培养，按照现有商品疫苗，达到106.5TCID50/mL经甲醛灭活，两种毒株等量混合后与佐剂乳化，分别制备免疫原A。
(4)将经典毒株和变异毒株S1基因原始序列按照具体实施方式中步骤12中所述的经典毒株S1截短片段表达蛋白rcS1-1p、rcS1-2p、rcS1-3-1p和变异毒株S截短片段表达蛋白rvS1-1p、rvS1-2p、rvS1-3p按照1:1:2:1:1:2比例混合后，与佐剂乳化制备免疫原B。
(5)根据步骤(2)中的原始序列和表位分析，将原始序列进行优化、人工改造，得到改造后的经典毒株S1基因序列三条：SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9，得到改造后的变异毒株S1基因序列三条：SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12。按照步骤(4)方法构建原核表达体系，制备蛋白按照1:1:2:1:1:2混合，与佐剂乳化制备免疫原C。
(6)将上述三种免疫原分别免疫蛋鸡，首次免疫后第21d做二次免疫，再间隔30d后做第三次免疫，第三次免疫后第10d收集鸡蛋提取IgY，采用病毒中和试验测定中和效价。
(7)结果显示：A组全病毒免疫后的病毒中和效价最低，为1:4；B组经典毒株和变异毒株的原始S1蛋白片段免疫组中和效价为1:32；C组人工改造后的免疫原免疫组的中和效价为1:128～1:256(对经典毒株的中和效价为1:128，对变异毒株的中和效价为1:256)，中和效价相对未改造基因工程蛋白抗原中和效价提高了4～8倍，中和效价是三个免疫组中最好的一组。
表明，经过本发明人工改造后的S1抗原能够更为高效地刺激机体产生中和抗体，一方面，提高了抗体的中和效率和临床治疗效果，同时也降低了生产成本。
表1抗原改造前后刺激中和抗体效价差异对比
3、表达条件的优化：将重组表达菌株的表达温度、抗生素浓度、表达时间、诱导剂的浓度等进行优化，得到蛋白表达量最高的最优组合条件。
步骤二、重组蛋白的配伍优化
将得到相应的六种蛋白(其氨基酸序列依次为：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6)纯化，按照质量比为1:1:2:1:1:2的比例混合，加入白油或其他免疫增强剂，使每一种蛋白的终浓度含量在50μg/mL～300μg/mL之间，随后进行乳化，制备成油包水型的复合免疫原。
步骤三、将制备好的免疫原免疫蛋鸡提取IgY获得复合型的猪流行性腹泻抗体制剂：
以0.5-1mL/羽的剂量鸡胸部肌肉注射免疫蛋鸡，分别与第1天、第21天、第51天各免疫一次，免疫三次后，收集鸡蛋，从卵黄中提取卵黄抗体。采用紫外分光光度计测定浓度，并用SDS-PAGE方法鉴定分离的抗体纯度。利用Western blot技术和病毒中和试验分析抗体效价。新生哺乳仔猪口服该抗体制剂，能够预防猪流行性腹泻经典毒株和变异毒株的感染，大大提高了临床使用范围，提高了治疗和预防效果。
有益效果：
1、本发明所优化设计的核酸序列能够在多种表达系统中进行大量表达，适应范围广，尤其是突破了原有的基因序列不能在原核表达系统中表达的难点。序列优化设计后，通过基因工程技术在原核表达系统中的表达量大大提高，而且保持了很好的免疫原性，这种基因工程抗原的获得，大幅降低了生产成本，提高生产效率。
2、本发明在序列优化中，考虑到了中和表位的分布，并将中和表位进行了重叠设计，达到强化刺激中和抗体的目的，以提高中和效价和实际治疗效果。
3、本发明所设计的猪流行性腹泻经典毒株和变异毒株两种毒株的基因工程抗原蛋白复合物，经过反复的优化配伍实验，得到了1:1:(2-4):1:1:(2-4)的比例配伍，这种配比混合物与佐剂乳化后制备的免疫原能够刺激鸡体产生高滴度的有效的IgY抗体，能够大大提高产品原料的产量，降低成本，高效价的抗体保障了后续的治疗效果。
4、本发明所制备的猪流行性腹泻经典毒株和变异毒株两种毒株的复合IgY抗体制剂能够同时对抗两种毒株的感染，拓宽了使用范围，提高了治疗效率。
5、在发病猪场的临床试验数据表明，使用本发明所制备的猪流行性腹泻经典毒株和变异毒株两种毒株的复合IgY抗体制剂，新生仔猪的腹泻率由原来的90-100％降低至30-40％，新生仔猪的存活率由0-40％提高到83％以上。显著减少了因猪流行性腹泻感染引起的损失，提高了养殖经济效益和社会效益。
附图说明
图1：PEDV-HuN14和PEDV-C14的RT-PCR扩增；
图2：重组载体pMD19-T-EDV-HuN14-S1和pMD19-T-PEDV-C14-S1的双酶切鉴定；
图3：重组载体pET28a-EDV-HuN14-S1和pET28a-PEDV-C14-S1的双酶切鉴定；
图4：SDS-PAGE和Western blot鉴定重组菌株BL21(DE3)-pET28a-EDV-HuN14-S1和BL21(DE3)-pET28a-PEDV-C14-S1的目标蛋白的表达；
图5：SDS-PAGE和Western blot鉴定重组菌株Rosetta(DE3)-pET28a-EDV-HuN14-S1和Rosetta(DE3)-pET28a-PEDV-C14-S1的目标蛋白的表达；
图6：高保真PCR截短扩增PEDV S1基因三个片段S1-1、S1-2和S1-3；
图7：重组菌株中BL21(DE3)-pET28a-S1-1、BL21(DE3)-pET28a-S1-2和BL21(DE3)-pET28a-S1-3的双酶切鉴定；
图8：SDS-PAGE鉴定重组菌株BL21(DE3)-pET28a-S1-1、BL21(DE3)-pET28a-S1-2和BL21(DE3)-pET28a-S1-3的目标蛋白的表达；
其中M:蛋白标准分子量；1：BL21(DE3)-pET28a-S1-1诱导上清；2：BL21(DE3)-pET28a-S1-1未诱导上清；3：BL21(DE3)-pET28a-S1-1诱导包涵体；4：BL21(DE3)-pET28a-S1-1未诱导包涵体；5：BL21(DE3)-pET28a-S1-2诱导上清；6：BL21(DE3)-pET28a-S1-2未诱导上清；7：BL21(DE3)-pET28a-S1-2诱导包涵体；8：BL21(DE3)-pET28a-S1-2未诱导包涵体；9：BL21(DE3)-pET28a-S1-3诱导上清；10：BL21(DE3)-pET28a-S1-3未诱导上清；11：BL21(DE3)-pET28a-S1-3诱导包涵体；12：BL21(DE3)-pET28a-S1-3未诱导包涵体；
图9：经典毒株第三个片段的进一步截短片段S1-3-1的表达；
其中M：蛋白Marker；1：BL21(DE3)-pET28a-S1-3-1诱导包涵体；2：BL21(DE3)-pET28a-S1-3-1诱导上清；3：BL21(DE3)-pET28a诱导包涵体；2：BL21(DE3)-pET28a诱导上清；
图10：变异毒株S1基因的三个截短片段(rvS1-1、rvS1-2、rvS1-3)的表达；
其中M:蛋白标准分子量；1：BL21(DE3)-pET28a-rvS1-1诱导包涵体；2：BL21(DE3)-pET28a-rvS1-1诱导上清；3：BL21(DE3)-pET28a-rvS1-2诱导包涵体；4：BL21(DE3)-pET28a-rvS1-2诱导上清；5：BL21(DE3)-pET28a-rvS1-3诱导包涵体；6：BL21(DE3)-pET28a-rvS1-3诱导上清；7：BL21(DE3)-pET28a诱导上清；8：BL21(DE3)-pET28a诱导包涵体；
图11：SDS-PAGE鉴定PEDV经典毒株三个主要抗原蛋白：SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3的表达；
图12：SDS-PAGE鉴定PEDV变异毒株三个主要抗原蛋白：SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6的表达；
图13：Western blot测定PEDV复合二价抗体的滴度；
图14：免疫过氧化物酶每单层细胞染色法测定PEDV复合二价抗体与病毒的反应活性；
图15：猪流行性腹泻病毒基因工程二价卵黄抗体的制剂在流行性腹泻病变异毒株大流行规模化猪场的使用效果。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
本发明具体制备方法包括：
1.PEDV培养、RNA提取与第一链cDNA的合成
1.1将非洲绿猴肾细胞Vero细胞，使用含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养基，在37℃，5％CO2培养箱中培养。
1.2待Vero细胞生长至80％左右密度时，用pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，加入无血清的MEM培养基，补充胰蛋白酶至最终质量浓度为6μg/mL，摇匀，处理30min。
1.3将猪流行性腹泻变异毒株PEDV-HuN14或经典毒株PEDV-C14以5MOI接种传Vero细胞，轻轻摇匀，置于37℃、体积分数5％CO2培养箱培养24～72h。
1.4待80％的细胞出现细胞病变(CPE)时，反复冻融3次，使细胞裂解释放病毒粒子。
1.5采用Trizol试剂提取总RNA，利用PrimeScriptTMII 1st StrandcDNASynthesis Kit中的随机引物进行第一链cDNA合成，具体操作参照说明书进行。
2.引物的设计与合成根据GenBank中PEDV基因组序列(GenBank登录号：JQ282909)，设计S1基因全长PCR扩增引物：PEDV-S1F：5＇-ATGAAGTCTTTAACTTACTTCTGGTTG-3＇SEQ ID No.23和PEDV-S2079R：5＇-AGCACCACTAGTGACATTCTTAAAG-3＇SEQ ID No.24。
3.S1基因的PCR扩增与重组载体的构建
3.1以第一链cDNA为模板利用上述特异性引物，进行PCR扩增，反应组分为：ddH2O31.0μL，5×primerSTAGXLBuffer 10.0μL，dNTP Mixture(2.5mm each)4.0μL，Primer-F 1#(10μM)1.0μL，Primer-R2#(10μM)1.0μL，Prime STAR GXLDNApolymerase 1.0μL，TemplatecDNA 2.0μL，总体积50.0μL。PCR反应程序为：(1)95℃预变性4min；(2)98℃变性10s；(3)62℃退火30s；(4)68℃延伸3min；(注意：退火温度是68℃，延伸时间按照1min/kb)(5)重复步骤(2)～(4)，35个循环；(6)68℃延伸7min；(7)4℃for ever。
3.2 PCR产物经琼脂糖电泳检测，结果如图1所示，猪流行性腹泻变异毒株PEDV-HuN14或经典毒株PEDV-C14在2000bpb左右有特异性条带。用Axygen PCR清洁试剂盒纯化，克隆至pMD19-T载体，构建重组载体，经双酶切鉴定为阳性(图2)。将阳性质粒采用3730法序列测定得到猪流行性腹泻变异毒株PEDV-HuN14或经典毒株PEDV-C14的原始序列。
4.核酸序列分析
利用DNAstar、MEGA5.0及在线分析软件对原始序列进行分析，研制其序列特征及其进化地位，确定了经典毒株与变异毒株分类。
5.S1全基因的表达及Western blot鉴定
5.1将所克隆的经典毒株与变异毒株S1基因分别克隆至pET28a载体，转化BL21(DE3)感受态建立阳性重组表达菌株，采用双酶切鉴定，结果如图3所示。
5.2将阳性重组表达菌株接种至LB培养基中，于37℃下230r/min培养过夜，日，按1：5(体积比)进行转接扩大培养3h，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃下200r/min诱导6h。
5.3收集蛋白：12000r/min，30s，收集菌体，用PBS将菌体悬起，12000r/min，30s，洗涤菌体，去掉上清。往离心管中分别加入PBS(200μL/5mL菌体)，用移液枪将菌体悬起，均匀后漩涡振荡1min，进行超声波破碎，超声参数为：每次超声5s，间隔5s，时长为20min。12000r/min，10min；分离上清和包涵体蛋白，用移液枪将上清蛋白液吸取到一个新的1.5mLEP管中，-80℃保存备用；管底沉淀即为包涵体蛋白，每管用PBS(200μL/5mL菌体)悬起，-80℃保存备用。
5.4蛋白表达鉴定：分别取上清和沉淀，进行SDS-PAGE检测后，转印到PVDF膜上，用20g/L的脱脂奶粉于37℃封闭1h，PBST漂洗3次后与PEDV阳性血清(1:100稀释)孵育1h，PBST漂洗3次，与HRP-SPA(1：6 000稀释)孵育1h，PBST漂洗后，用DAB显色试剂盒显色。蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定目标蛋白没有得到表达，说明原始序列难以在该系统中表达(图4)
6.经典毒株和变异毒株PEDV整段S1基因原始序列在Rosetta(DE3)系统中无法得到目的蛋白表达。
由于BL21(DE3)不能提高稀有密码子，而Rostta(DE3)菌株能够提供稀有密码子，为了能够得到全长S1基因的表达，本发明将重组的阳性质粒pET28a-EDV-HuN14-S1和pET28a-PEDV-C14-S1转化到Rostta(DE3)菌株感受态，构建重组表达菌株Rostta(DE3)-pET28a-EDV-HuN14-S1和Rostta(DE3)-pET28a-PEDV-C14-S1，采用IPTG进行诱导表达，表达产物经SDS-PAGE和Western blot检测表明，使用Rostta(DE3)菌株，目的蛋白也没有表达(图5)。
7.采用PCR技术将原始PEDV整段S1基因截短表达
根据PEDV变异毒株和经典毒株的保守区的基因组序列，用Primer 5.0软件设计S1基因截短引物，截短片段依次命名为：S1-1、S1-2、S1-3引物序列信息见表2。
表2 PEDV S1基因截短片段的PCR扩增引物
注：CCATGG为NcoⅠ，AAGCTT为HindⅢ限制性酶切位点
采用高保真PCR扩增得到经典毒株三个相应的片段，如图6所示，三个片段大小分别为600、600、879bp。
将得到的经典毒株三个片段分别克隆至pET28a载体中，转化BL21(DE3)，得到重组表达菌株BL21(DE3)-pET28a-S1-1、BL21(DE3)-pET28a-S1-2和BL21(DE3)-pET28a-S1-3。采用酶切鉴定，结果显示，三个重组菌株为阳性菌株(图7)。
将阳性重组表达菌株按照1:1000的比例接种至含卡那霉素(终浓度50μg/mL)的LB培养基中，于37℃下230r/min培养过夜，次日，按1：10(体积比)进行转接扩大培养2.5h，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃下200r/min诱导6h。收集菌体，往离心管中分别加入PBS，用移液枪将菌体悬起，均匀后漩涡振荡混匀，进行超声波破碎。12000r/min，10min；分离上清和包涵体蛋白，用移液枪将上清蛋白液吸取到一个新的1.5mL EP管中，-80℃保存备用；管底沉淀即为包涵体蛋白，每管用PBS(200μL/5mL菌体)悬起，-80℃保存备用。分别取上清和沉淀，进行SDS-PAGE检测后，转印到PVDF膜上进行Western blot检测。
蛋白经SDS-PAGE鉴定，对比为诱导的对照组可以看出，S1-1和S1-2成功表达，目的蛋白分子约为26kDa，S1-3诱导和未诱导蛋白条带没有明显差异，说明没有表达(图8)。
8.经典毒株S1基因的截短片段S1-1和S1-2的免疫效果评估试验
将上述纯化后S1-1、S1-2蛋白分别与免疫佐剂(用MONTANIDETMISA206)混合后充分乳化制成免疫原，采用胸部肌肉注射方式免疫蛋鸡，每只鸡免疫蛋白量为300μg，分别于首免后的21d和51d，采用同样的免疫原以同样的方式进行第2次和第3次免疫。设未免疫鸡作为阴性对照。三免后7d收集鸡蛋提取复合卵黄抗体IgY，采用病毒中和试验测定抗体的中和效价。结果显示，S1-1对应的抗体对病毒的中和效价为1∶4，而S1-2对应的抗体对病毒的中和效价为1∶2，但western blot效价就能达到1∶12800倍以上，说明抗体一般的识别效价较高，但中和效价偏低，对抗病毒感染效果不理想。
9.经典毒株S1基因的截短片段S1-1和S1-2蛋白的卵黄抗体制剂有效防治剂量评估
提取上述制备的卵黄抗体制剂，S1-1和S1-2蛋白的卵黄抗体制剂等量混合，测定western blot效价为1∶12800倍，开展防治效果的动物实验研究。新生仔猪30头，随机分为五个组：A、B和C组，每组10头；C组为不处理对照组；B组为不给抗体制剂的攻毒对照组；A为试验组，分别在出生后给2h第一次口服S1-1和S1-2蛋白的卵黄抗体制剂混合物，随后在第12h、24、48、60和72h各口服S1-1和S1-2蛋白的卵黄抗体混合制剂一次，每次用量7mL。在第二次给药后4h，A组和B组每头仔猪口服PDEV变异毒株103TCID50，进行攻击、感染，C组为不感染健康对照，隔离饲养。连续观察10日，统计腹泻率、死亡率。
经过实验观察统计，由表3看出：C组无腹泻和死亡。B组腹泻率和死亡率均100％，且病毒攻击后第2天都全部死亡。A组的腹泻率60％，死亡率80％。由此可以看出，该抗体制剂有一定的防治效果，但腹泻率和死亡率依然很高，效果不是很理想，品质有待提高。
表3经典毒株PEDV基因工程二价卵黄抗体制剂有效防治剂量
基于上述试验，分三个片段，其中第三个片段不能有效表达，而前面两个片段表达蛋白后虽然抗体的Western blot效价较高，但中和效价和试剂的防治效果均不是特别理想。理论研究表明：中和效价即体现了抗体对病毒感染性消除作用，中和效价越高表明抗病毒效果越明显，对应的临床效果也越好。因此，在后续的序列优化中，我们考虑到了中和表位的分布，并将中和表位进行了重叠设计，达到强化刺激中和抗体的目的，以提高中和效价和实际治疗效果。
10.经典毒株第三个片段的进一步截短、表达：
采用Primer软件设计一对截短引物：PEDV-S1-3F2:5ˊ-CATGGATCCACCAAGTATGGTGATGTTTATGTCA-3ˊSEQ ID No.31(下划线序列为BamHI内切酶识别位点)；PEDV-S1-3R2:5ˊ-CATCTCGAGGTAATCATTAACAGATTGCAAGGTG-3ˊSEQ ID No.32(下划线序列为XhoI内切酶识别位点)；将上述的第三个片段进行截短PCR扩增，扩增后得到相应PCR产物命名为S1-3-1，按照上述方法克隆至pET28a载体中，转化BL21(DE3)，得到重组表达菌株BL21(DE3)-pET28a-S1-3-1，按照上述方法进行IPTG诱导表达。由图9可以看出，重组表达菌株BL21(DE3)-pET28a-S1-3-1经IPTG诱导后的包涵体蛋白在接近26kDa分子量处有目的表达条带，表明，截短后的S1-3-1片段得到成功表达。因此，将经典毒株S1截短片段S1-1、S1-2、S1-3、编码的蛋白依次命名为：rcS1-1p、rcS1-2p、rcS1-3-1p。
11.变异毒株S1基因的三个片段的截短扩增与原核表达
采用上述设计的引物PEDV-S1-1F/R、PEDV-S1-2F/R、PEDV-S1-3F2/R2扩增变异毒株S1基因三个片段，扩增后得到相应PCR产物命名为rvS1-1、rvS1-2、rvS1-3，按照上述方法克隆至pET28a载体中，转化BL21(DE3)，得到重组表达菌株BL21(DE3)-pET28a-rvS1-1、BL21(DE3)-pET28a-rvS1-2、BL21(DE3)-pET28a-rvS1-3，按照上述方法进行IPTG诱导表达。由图10可以看出，重组表达菌株BL21(DE3)-pET28a-rvS1-1、BL21(DE3)-pET28a-rvS1-2、BL21(DE3)-pET28a-rvS1-3，经IPTG诱导后的包涵体蛋白在接近26kDa分子量处有目的表达条带，而上清中无目的蛋白表达。表明，截短后的变异毒株的rvS1-1、rvS1-2、rvS1-3片段均成功得到表达，将其编码的蛋白依次命名为：rvS1-1p、rvS1-2p、rvS1-3p。
12.经典毒株和变异毒株原始序列表达蛋白免疫制备IgY的中和效价评估
将上述步骤1-11得到经典毒株S1截短片段表达蛋白rcS1-1p、rcS1-2p、rcS1-3-1p和变异毒株S截短片段表达蛋白rvS1-1p、rvS1-2p、rvS1-3p按照1:1:2:1:1:2比例混合后，与佐剂乳化制备免疫原了，免疫蛋鸡，首次免疫后第21d做二次免疫，再间隔30d后做第三次免疫，第三次免疫后第10d收集鸡蛋提取IgY，采用病毒中和试验测定中和效价。结果显示：经典毒株和变异毒株的原始S1编码原始6个蛋白片段刺激机体产生的中和抗体效价为1:32。与步骤8结果对比(S1-1对应的抗体对病毒的中和效价为1∶4，而S1-2对应的抗体对病毒的中和效价为1∶2)，混合后的抗原(同时增加了截短的)的效果显著提高。
为了得到更为优秀的IgY抗体中和效价、提高治疗效果、降低生产成本，通过对经典毒株S1和S2蛋白中表位的生物信息学解析和试验摸索，分别对经典毒株和变异毒株的S1序列进行如下优化并进行实验验证：
13.S1基因序列的优化与表位的分布设计
13.1采用http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/和http://people.mbi.ucla.edu/sumchan/caltor.html等在线生物学软件，结合实验室的实验验证，将原有的遗传基因序列进行了系统的改造、优化，经从头合成技术分别得到了源自经典毒株的三条保护性抗原基因SEQ ID No.7、SEQ ID No.8和SEQ ID No.9，以及源自变异毒株的三条保护性抗原基因SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12。
14.优化后分片段表达菌株的构建
14.1分别采用酶切和重组技术将SEQ ID No.7～SEQ ID No.12分别克隆至pET28a载体，转化BL21(DE3)菌株构建重组质粒BL21(DE3)-pET28a-SEQ IDNo.7～BL21(DE3)-pET28a-SEQ ID No.12。
14.2分别吸取重组蛋白表达菌株菌液和转化空载的菌液各5μL分别接种于5mL含有卡那霉素(Kanr)(卡那霉素终浓度为100ng/mL)的LB培养基中，于37℃，230r/min振荡培养18h。
14.3二次活化：次日，按照1:5的接种比例接种：分别将上述菌液1mL菌液分别接种于5mL含有卡那霉素(卡那霉素终浓度为,200ng/mL)的LB培养基中，37℃，230r/min振荡培养2.5h；
14.4 IPTG诱导：加入终浓度为0.25mmol/L的IPTG，37℃，230r/min诱导4h；
14.5收集菌体：取诱导好的菌液1mL，加入到一个1.5mLEP管中，12000r/min，30s，弃掉上清，往管中再加入菌液1mL，12000r/min，30s，弃掉上清，如此重复，将5.5mL菌液中的菌体浓缩到一个1.5mL EP管中。
14.6菌体洗涤：用500μL的PBS将菌体悬起，12000r/min，30s。用移液枪吸净上清。
14.7超声破碎：往离心管中分别加入200μL的PBS，用移液枪将菌体悬起，均匀后漩涡振荡1min，进行超声，超声参数为：每次超声5s，间隔5s，时长为20min。要随时观察，如果溶液出现透亮即停止超声。
14.8离心分离：12000r/min，10min；收集蛋白：分离上清和包涵体蛋白，-80℃保存备用。
14.9分别取上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳后，用考马斯亮蓝染色3h，在进行脱色，如图11和图12所示，目标蛋白SEQ ID No.1-aa、SEQ ID No.2-aa、SEQ ID No.3-aa、SEQID No.4-aa、SEQ ID No.5-aa和SEQ ID No.6-aa得到表达，说明优化后的序列在改进的表达体系的包涵体中大量表达。
15.免疫原的制备：
15.1蛋白纯化：将第一次超声后的沉淀，用20mL含终浓度为1％的TritonX-100的包涵体洗涤缓冲液(在包涵体洗涤液中加入终浓度为1％的TritonX-100)将菌体悬起，漩涡振荡1min，进行冰上超声，每次超声5s，间隔5s，合计1h。4℃，10000r/min离心15min，弃掉上清，沉淀即为要收集的包涵体蛋白。采用适量包涵体溶解液将上述包涵体蛋白溶解，以完全溶解(可以借助适当超声，加速溶解；或4℃过夜溶解)，至液体清亮为宜。放置在-80℃保存。UV法测定每个蛋白样品的浓度。
16.六种蛋白配比实验
将得到相应的六种蛋白(其氨基酸序列依次为：SEQ ID No.1-aa、SEQ ID No.2-aa、SEQ ID No.3-aa、SEQ ID No.4-aa、SEQ ID No.5-aa、SEQ ID No.6-aa)纯化，分别以A、B、C、D、E、F和G组七种比例混合的方法进行配伍：A组为1:1:1:1:1:1，B组为2:1:1:2:1:1，C组为1:2:1:1:2:1，D组为1:1:2:1:1:2，E组为1:1:4:1:1:4，F组为1:1:6:1:1:6的质量比例混合，G组为不免疫对照，加入白油或其他免疫增强剂，使每一种蛋白的终浓度含量在50μg/mL～300μg/mL之间，随后进行乳化，制备成油包水型的复合免疫原。
分别于首免后的21d和51d，采用同样的免疫原以同样的方式进行第2次和第3次免疫。设未免疫鸡作为阴性对照。三免后7d收集鸡蛋提取复合卵黄抗体IgY，采用病毒中和试验测定抗体的中和效价。结果显示，所有配伍组的中和效价均在1∶16以上，A组～D组，以D组效果最好，SEQ ID No.3-aa和SEQ ID No.6-aa的比例较高，因此在D组～G组中逐步增加SEQID No.3-aa和SEQ ID No.6-aa的比例。由表4可以看出，D组和E组免疫效果相当，随着SEQID No.3-aa和SEQ ID No.6-aa的比例增加，复合抗体制剂对变异毒株和经典毒株的中和效价下降。这可能是该片段的增加降低其他片段的比例，造成其他片段相应中和效价下降的主要原因。
由此可以看出D组和E组效果最好，但中和效价相当，结合成本考虑，D组的配伍最为经济有效。
该领域的专业认识都知晓，中和效价即体现了抗体对病毒感染性消除作用，中和效价越高表明抗病毒效果越好。
表4六种蛋白不同配伍比例刺激的中和抗体效价
17.蛋白配伍：将六种蛋白纯化，按照质量比为1:1:2:1:1:2(SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6)的比例混合，使每一种蛋白的终浓度含量在50μg/mL～300μg/mL之间。
18.免疫原的制备与检验：抗原蛋白与佐剂乳化与免疫原制备先取7份4℃预冷的白油或其他佐剂置于冰上，采用乳化机乳化，乳化条件为：6000r/min～9000r/min，在将混合好的蛋白缓缓加入油相中，持续乳化10min。制成油包水型免疫原A。取所制备的免疫原1mL，4000g，离心10min，不分层即合格。
19.动物免疫：
采用肌肉注射方式免疫蛋鸡，免疫剂量为0.5～1mL/羽，分别于首免后的21d和51d，采用同样的免疫原以同样的方式进行第2次和第3次免疫。
20.抗体制剂的大量提取和制备
20.1将收集的免疫蛋用75％的乙醇溶液擦拭蛋的表面进行消毒，分离蛋清和蛋黄，将所得卵黄收集于烧杯中充分乳化分散均匀。
20.2将卵黄与无菌水1：9混合，充分搅拌后用盐酸调整pH为5.0-5.2，然后在4℃下静置过夜。
20.3 4℃、10000r/min离心30min，收集上清液，加入硫酸铵，至终浓度为19％，混匀，静置1h；10000r/min，15min，离心，收集沉淀；
20.4将沉淀用15ml PBS溶液(0.01mol/L，PH＝7.4)溶解；加入硫酸铵至终浓度为14％，混匀，静置1h；10000r/min，10min，离心，收集沉淀；
20.5用适量PBS溶解；-20℃保存备用。
实施例
实施例1猪流行性腹泻病毒基因工程二价卵黄抗体的制剂免疫活性鉴定
将上述本发明制备的多克隆抗体按初始1:2000倍稀释，在此基础上按2倍比例倍比稀释直到1:64 000倍，采用Western blot技术测定多克隆抗体的效价。如图13所示，IgY抗体效价达到1:16 000倍。
实施例2猪流行性腹泻病毒基因工程二价卵黄抗体的制剂对病毒的反应性和中和效价评估
培养Vero细胞，待其长至60％～80％汇合度时，分别接种猪流行性腹泻变异毒株PEDV-HuN14或经典毒株PEDV-C14，感染48h后弃培养基，用体积分数为33％丙酮-PBS固定30min，干燥后加入多克隆抗体(1:100稀释)，设立未免疫阴性血清作为对照组，37℃孵育1h，PBS洗涤3次，加入HRP-SPA(1:3000稀释)，37℃孵育1h，PBS洗涤3次，加入AEC显色液，37℃孵育30min，弃去显色液加入去离子水终止反应，于倒置显微镜下观察、判定结果。
如图14所示，猪流行性腹泻病毒基因工程二价卵黄抗体与变异毒株和经典毒株的病毒反应活性良好，抗体与细胞中的病毒结合，经显色反应细胞质呈棕红色，而阴性血清IgY跟病毒感染的细胞没有任何显色反应，表明抗体对病毒的识别是有效的、特异性的。
病毒中和试验表明，该复合型抗体制剂对经典毒株的中和效价为1:128、对变异毒株的中和效价高达1:256，相对全病毒和未改造的S1蛋白抗原刺激的中和效价大大提高，表明，经过本发明人工改造后的S1抗原能够更为高效地刺激机体产生中和抗体，一方面，提高了抗体的中和效价和临床治疗效果，同时也降低了生产成本，增加了临床应用的范围。
实施例3本发明制备PEDV基因工程二价卵黄抗体制剂有效防治剂量评估
新生仔猪35头，随机分为五个组：A、B、C、D、E、F和G组，每组5头；F组为不处理对照组；A、B、C、D和E组为试验组，分别在出生后给2h口服本发明制备的PEDV基因工程二价卵黄抗体制剂第一次，随后在第12、24、48、60和72h各口服本发明PEDV基因工程二价卵黄抗体制剂一次，具体给药剂量见表5。在第二次给药后4h，A、B、C、D、E和F组每头仔猪口服PDEV变异毒株103TCID50，进行攻击、感染，G组为不感染健康对照(表5)，隔离饲养。连续观察10日，统计腹泻率、死亡率。
经过实验观察统计，由表6看出：G组不做任何处理，均无腹泻和死亡情况。F组，没有口服抗体制剂，则腹泻率和死亡率均100％，且病毒攻击后第3天全部死亡。A～E组采用不同剂量防治结合，均有一定的效果，但D和E组效果最佳、C组死亡率为0，腹泻率40％；A、B组效果较差(表6)。总体效果表明，随着治疗剂量的加大，效果越好，具有剂量依赖性，但剂量大到饱和度，则效果区别不明显(D和E组)，因此，该制剂对于变异毒株的感染，综合考虑成本，最佳使用剂量是5mL/头份，最低剂量不能低于3mL/头份。
表5动物分组与口服PEDV基因工程二价卵黄抗体制剂
表6 PEDV基因工程二价卵黄抗体制剂有效防治剂量
实施例4
本发明制备PEDV基因工程二价卵黄抗体制剂对健康猪群的存活率影响南阳某规模化猪场，存栏521头母猪，无病毒性腹泻历史，健康状况正常。选取新生仔猪240头，随机分为两组：实验组和对照组，每组120头。
实验组仔猪出生后灌服2mL本发明复合抗体制剂(效价为6400倍)，2次/d，连用3d；对照组仔猪出生后不做任何处理。两组基础日粮和生产条件完全相同。连续观察10天，统计两组小猪腹泻率、平均日增重，评价口服卵黄抗体在提高哺乳仔猪健康水平方面的效果。
结果表明：结果实验组腹泻率为15.0％，死亡率为2.59％，平均日增重为145g；对照组腹泻率为33.2％，死亡率为18.5％，平均日增重为97g。
该实验充分说明：(1)在没有猪流行腹泻病毒感染的情况下，使用该抗体制剂是安全的；(2)使用该抗体制剂能够提高新生仔猪的肠道免疫力，减少腹泻，促进消化吸收，提高日增重，提升生产效益。
实施例5：本发明制备的猪流行性腹泻病毒基因工程二价卵黄抗体的制剂在流行性腹泻病变异毒株大流行规模化猪场的临床疗效评估
2018年3月份湖南衡阳某规模化猪场存栏母猪2200头，发生大面积的由猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染引起的哺乳仔猪腹泻，猪群腹泻率死亡率达到70～100％，造成巨大的经济损失。经实验室检验、确诊，该次疫病是由猪流行性腹泻病毒变异毒株引起的，致死率高，传播速度快。
实验猪的分组及处理
将新生仔猪600头，随机分为三组：口服本发明PEDV-IgY试验组、安慰剂对照组、和空白对照组，每组200头；试验组出生后、吃初乳前灌服本发明卵黄抗体5mL/次(效价为6400倍)，1次/12h，连用1d；使用一天后，灌服本发明卵黄抗体3mL/次(效价为6400倍)，1次/12h，再连用2天。安慰剂对照组灌服0.85％(w/v)NaCl，3mL/次，1次/12h，连用3d；空白对照组不做任何处理。所有仔猪饲养条件相同。连续观察10天，统计腹泻率、死亡率和存活率。
通过对断奶时仔猪存活率统计，结果显示，口服PEDV-IgY试验组的平均存活率为85.7％，而安慰剂对照组的平均存活率为43.5％，空白对照组的平均存活率为41.8％(图15)。由此可以看出所研制的复合抗体制剂能够显著提升PEDV感染仔猪的存活率，具有很好的预防和治疗效果。
实施例6：本发明制备的猪流行性腹泻病毒基因工程二价卵黄抗体制剂在流行性腹泻病经典毒株流行感染规模化猪场的临床疗效评估
2016年12月份河北某规模化猪场存栏母猪1500头，发生大面积的腹泻，腹泻率70％～85％，腹泻率死亡率达到33％～43％，造成较大的经济损失。经实验室检验、确诊，该次疫病是由猪流行性腹泻病毒经典毒株引起的。
实验猪的分组及处理
将新生仔猪336头，随机分为三组：口服本发明PEDV-IgY试验组、安慰剂对照组、和空白对照组，每组112头；试验组出生后、吃初乳前灌服本发明卵黄抗体3mL/次(效价为6400倍)，1次/12h，连用3d；安慰剂对照组灌服0.85％NaCl(w/v)，3mL/次，1次/12h，连用3d；空白对照组不做任何处理。所有仔猪饲养条件相同。连续观察10天，统计腹泻率、死亡率和存活率。
通过对断奶时仔猪存活率统计，结果显示，口服PEDV-IgY试验组的平均存活率为88％，而安慰剂对照组的平均存活率为66％，空白对照组的平均存活率为65％。由此可以看出本发明所研制的复合抗体制剂能够显著提升PEDV感染仔猪的存活率。口服PEDV-IgY试验组的腹泻率(26％)显著低于安慰剂对照组(77％)和空白对照组(81％)(表7)，对于降低腹泻率、降低死亡率，疗效显著。
表7本发明研制的抗体制剂在PEDV经典毒株流行猪场的使用效果
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 衡阳师范学院
南阳市天华制药有限公司
广州格雷特生物科技有限公司
<120> 一种猪流行性腹泻病毒基因工程抗原和抗体
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 220
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
Met Arg Ser Leu Ile Tyr Phe Trp Leu Leu Leu Pro Val Leu Pro Thr
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Gln Asp Val Thr Arg Cys Gln Ser Thr Thr Asn Phe
20 25 30
Arg Arg Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val
35 40 45
Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Ser Met Asn Ser Ser Ser Trp Tyr Cys Gly
50 55 60
Thr Gly Ile Glu Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile Phe Leu Ser Tyr
65 70 75 80
Ile Asp Ser Gly Gln Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser Gln Glu Pro Phe
85 90 95
Asp Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala Thr Asn Gly Asn
100 105 110
Thr Asn Ala Ile Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe Pro Asp Asn Lys
115 120 125
Thr Leu Gly Pro Thr Val Asn Asp Val Thr Thr Gly Arg Asn Cys Leu
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Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala Tyr Met Arg Asp Gly Lys Asp Ile Val
145 150 155 160
Val Gly Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe Ala Asp Lys
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Ile Tyr His Phe Tyr Leu Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val Ala Thr Arg
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Cys Tyr Asn Arg Arg Ser Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr Thr Ser Met
195 200 205
Asn Ser Ser Ser Trp Tyr Cys Gly Thr Gly Ile Glu
210 215 220
<210> 2
<211> 222
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
Arg Cys Tyr Asn Arg Arg Ser Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr Thr Pro
1 5 10 15
Thr Tyr Tyr Met Leu Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp Gly Ile Tyr
20 25 30
Tyr Glu Pro Cys Thr Ala Asn Cys Thr Gly Tyr Ala Ala Asn Val Phe
35 40 45
Ala Thr Asp Ser Asn Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe Asn Asn
50 55 60
Trp Phe Leu Leu Ser Asn Asp Ser Thr Leu Leu His Gly Lys Val Val
65 70 75 80
Ser Asn Gln Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu Leu Ala Ile Pro Lys Ile
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Tyr Gly Leu Gly Gln Phe Phe Ser Phe Asn His Thr Met Asp Gly Val
100 105 110
Cys Asn Gly Ala Ala Val Asp Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg Phe Asn
115 120 125
Ile Asn Asp Thr Ser Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val Leu His
130 135 140
Thr Ala Leu Gly Thr Asn Leu Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser Ser Asp
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Pro His Leu Ala Ile Phe Ala Ile Pro Leu Gly Ala Thr Glu Val Pro
165 170 175
Tyr Tyr Cys Phe Leu Lys Val Asp Thr Tyr Asn Ser Thr Val Tyr Lys
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Phe Leu Ala Val Leu Pro Pro Thr Val Tyr Tyr Glu Pro Cys Thr Ala
195 200 205
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<210> 3
<211> 160
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
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1 5 10 15
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20 25 30
Thr Asp Asp Asp Val Ser Gly Phe Trp Thr Ile Ala Ser Thr Asn Phe
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Val Asp Ala Leu Ile Glu Val Gln Gly Thr Ser Ile Gln Arg Ile Leu
50 55 60
Tyr Cys Asp Asp Pro Val Ser Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe
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Asp Leu Asp Asp Gly Phe Tyr Pro Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser
85 90 95
His Glu Gln Pro Ile Ser Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His
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Ser Phe Val Asn Ile Thr Val Ser Ala Ala Phe Gly Gly Leu Ser Ser
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Ala Asn Leu Val Gly Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Ala
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Phe Gly Ser Gly Val Lys Leu Ile Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Ile
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<210> 4
<211> 227
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
Met His Ser Leu Thr Tyr Phe Trp Leu Phe Leu Pro Val Leu Ser Thr
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Gln Asp Val Thr Arg Cys Ser Ala Asn Thr Asn Phe
20 25 30
Arg His Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val
35 40 45
Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr
50 55 60
Trp Tyr Cys Ala Gly Gln His Pro Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile
65 70 75 80
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100 105 110
Thr Asn Gly Asn Thr Asn Ala Thr Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe
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Gly Arg Asn Cys Leu Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala His Met Ser Glu
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His Ser Val Val Gly Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe
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Ala Thr Lys Cys Tyr Asn Ser Gly Gly Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr
195 200 205
Glu Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr Trp Tyr Cys Ala Gly
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Gln His Pro
225
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<211> 222
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
Lys Cys Tyr Asn Ser Gly Gly Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr Glu Pro
1 5 10 15
Thr Tyr Tyr Met Leu Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp Gly Ile Ser
20 25 30
Tyr Gln Pro Cys Thr Ala Asn Cys Ile Gly Tyr Ala Ala Asn Val Phe
35 40 45
Ala Thr Glu Pro Asn Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe Asn Asn
50 55 60
Trp Phe Leu Leu Ser Asn Asp Ser Thr Leu Val His Gly Lys Val Val
65 70 75 80
Ser Asn Gln Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu Leu Ala Ile Pro Lys Ile
85 90 95
Tyr Gly Leu Gly Gln Phe Phe Ser Phe Asn His Thr Ile Asp Gly Val
100 105 110
Cys Asn Gly Ala Ala Val Gln Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg Phe Asn
115 120 125
Ile Asn Asp Thr Ser Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val Leu His
130 135 140
Thr Ala Leu Gly Thr Asn Phe Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro His Leu Ala Thr Phe Ala Ile Pro Leu Gly Ala Ile Gln Val Pro
165 170 175
Tyr Tyr Cys Phe Leu Lys Val Asp Thr Tyr Asn Ser Thr Val Tyr Lys
180 185 190
Phe Leu Ala Val Leu Pro Pro Thr Val Ser Tyr Gln Pro Cys Thr Ala
195 200 205
Asn Cys Ile Gly Tyr Ala Ala Asn Val Phe Ala Thr Glu Pro
210 215 220
<210> 6
<211> 160
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
Val Ile Thr Lys Tyr Gly Asp Val Tyr Val Asn Gly Phe Gly Tyr Leu
1 5 10 15
His Leu Gly Leu Leu Asp Ala Val Thr Ile Asn Phe Thr Gly His Gly
20 25 30
Thr Asp Asp Asp Val Ser Gly Phe Trp Thr Ile Ala Ser Thr Asn Phe
35 40 45
Val Asp Ala Leu Ile Glu Val Gln Gly Thr Ala Ile Gln Arg Ile Leu
50 55 60
Tyr Cys Asp Asp Pro Val Ser Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe
65 70 75 80
Asp Leu Asp Asp Gly Phe Tyr Pro Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser
85 90 95
His Glu Gln Pro Thr Ser Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His
100 105 110
Ser Phe Val Asn Ile Thr Val Ala Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly
115 120 125
Ala His Leu Ile Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu
130 135 140
Phe Gly Ser Gly Val Lys Phe Val Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Phe
145 150 155 160
<210> 7
<211> 660
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 7
atgcgttctt taatttattt ctggttatta ttaccagttt taccaacttt atctttacca 60
caagatgtta ctcgttgtca atctactact aacttccgtc gtttcttctc taaattcaac 120
gttcaagctc cagctgttgt tgttttaggt ggttatttac catctatgaa ctcttcttct 180
tggtattgtg gtactggtat tgaaactgct tctggtgttc acggtatttt cttatcttat 240
attgattctg gtcaaggttt cgaaattggt atttctcaag aaccattcga tccatctggt 300
tatcaattat atttacacaa agctactaac ggtaacacta acgctattgc tcgtttacgt 360
atttgtcaat tcccagataa caaaacttta ggtccaactg ttaacgatgt tactactggt 420
cgtaactgtt tattcaacaa agctattcca gcttatatgc gtgatggtaa agatattgtt 480
gttggtatta cttgggataa cgatcgtgtt actgttttcg ctgataaaat ttatcacttc 540
tatttaaaaa acgattggtc tcgtgttgct actcgttgtt ataaccgtcg ttcttgtgct 600
atgcaatatg tttatacttc tatgaactct tcttcttggt attgtggtac tggtattgaa 660
<210> 8
<211> 666
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 8
cgttgttata accgtcgttc ttgtgctatg caatatgttt atactccaac ttattatatg 60
ttaaacgtta cttctgctgg tgaagatggt atttattatg aaccatgtac tgctaactgt 120
actggttatg ctgctaacgt tttcgctact gattctaacg gtcacattcc agaaggtttc 180
tctttcaaca actggttctt attatctaac gattctactt tattacacgg taaagttgtt 240
tctaaccaac cattattagt taactgttta ttagctattc caaaaattta tggtttaggt 300
caattcttct ctttcaacca cactatggat ggtgtttgta acggtgctgc tgttgatcgt 360
gctccagaag ctttacgttt caacattaac gatacttctg ttattttagc tgaaggttct 420
attgttttac acactgcttt aggtactaac ttatctttcg tttgttctaa ctcttctgat 480
ccacacttag ctattttcgc tattccatta ggtgctactg aagttccata ttattgtttc 540
ttaaaagttg atacttataa ctctactgtt tataaattct tagctgtttt accaccaact 600
gtttattatg aaccatgtac tgctaactgt actggttatg ctgctaacgt tttcgctact 660
gattct 666
<210> 9
<211> 480
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 9
gttattacta aatatggtga tgtttatgtt aacggtttcg gttatttaca cttaggttta 60
ttagatgctg ttactattaa cttcactggt cacggtactg atgatgatgt ttctggtttc 120
tggactattg cttctactaa cttcgttgat gctttaattg aagttcaagg tacttctatt 180
caacgtattt tatattgtga tgatccagtt tctcaattaa aatgttctca agttgctttc 240
gatttagatg atggtttcta tccaatttct tctcgtaact tattatctca cgaacaacca 300
atttctttcg ttactttacc atctttcaac gatcactctt tcgttaacat tactgtttct 360
gctgctttcg gtggtttatc ttctgctaac ttagttggtg cttgtactat tgatttattc 420
ggttatccag ctttcggttc tggtgttaaa ttaattatta ctttaactaa ctcttctatt 480
<210> 10
<211> 681
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 10
atgcattctt taacttattt ctggttattc ttaccagttt tatctacttt atctttacca 60
caagatgtta ctcgttgttc tgctaacact aacttccgtc atttcttctc taaattcaac 120
gttcaagctc cagctgttgt tgttttaggt ggttatttac caattggtga aaaccaaggt 180
gttaactcta cttggtattg tgctggtcaa cacccaactg cttctggtgt tcacggtatt 240
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gatccatctg gttatcaatt atatttacac aaagctacta acggtaacac taacgctact 360
gctcgtttac gtatttgtca attcccatct attaaaactt taggtccaac tgctaacaac 420
gatgttacta ctggtcgtaa ctgtttattc aacaaagcta ttccagctca catgtctgaa 480
cactctgttg ttggtattac ttgggataac gatcgtgtta ctgttttctc tgataaaatt 540
tattatttct atttcaaaaa cgattggtct cgtgttgcta ctaaatgtta taactctggt 600
ggttgtgcta tgcaatatgt ttatgaaatt ggtgaaaacc aaggtgttaa ctctacttgg 660
tattgtgctg gtcaacaccc a 681
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<211> 666
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 11
aaatgttata actctggtgg ttgtgctatg caatatgttt atgaaccaac ttattatatg 60
ttaaacgtta cttctgctgg tgaagatggt atttcttatc aaccatgtac tgctaactgt 120
attggttatg ctgctaacgt tttcgctact gaaccaaacg gtcacattcc agaaggtttc 180
tctttcaaca actggttctt attatctaac gattctactt tagttcacgg taaagttgtt 240
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ccacacttag ctactttcgc tattccatta ggtgctattc aagttccata ttattgtttc 540
ttaaaagttg atacttataa ctctactgtt tataaattct tagctgtttt accaccaact 600
gtttcttatc aaccatgtac tgctaactgt attggttatg ctgctaacgt tttcgctact 660
gaacca 666
<210> 12
<211> 480
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 12
gttattacta aatatggtga tgtttatgtt aacggtttcg gttatttaca cttaggttta 60
ttagatgctg ttactattaa cttcactggt cacggtactg atgatgatgt ttctggtttc 120
tggactattg cttctactaa cttcgttgat gctttaattg aagttcaagg tactgctatt 180
caacgtattt tatattgtga tgatccagtt tctcaattaa aatgttctca agttgctttc 240
gatttagatg atggtttcta tccaatttct tctcgtaact tattatctca cgaacaacca 300
acttctttcg ttactttacc atctttcaac gatcactctt tcgttaacat tactgttgct 360
gcttctttcg gtggtcactc tggtgctcac ttaatttctg cttgtactat tgatttattc 420
ggttatccag aattcggttc tggtgttaaa ttcgttatta ctttaactaa ctcttctttc 480
<210> 13
<211> 14
<212> PRT
<213> 猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus)
<400> 13
Ser Met Asn Ser Ser Ser Trp Tyr Cys Gly Thr Gly Ile Glu
1 5 10
<210> 14
<211> 21
<212> PRT
<213> 猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus)
<400> 14
Tyr Tyr Glu Pro Cys Thr Ala Asn Cys Thr Gly Tyr Ala Ala Asn Val
1 5 10 15
Phe Ala Thr Asp Ser
20
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> 猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus)
<400> 15
Ser Ala Ala Phe Gly Gly Leu Ser Ser Ala Asn Leu Val
1 5 10
<210> 16
<211> 19
<212> PRT
<213> 猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus)
<400> 16
Gly Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Ala Phe Gly Ser Gly
1 5 10 15
Val Lys Leu
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus)
<400> 17
Ile Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Ile
1 5
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<211> 18
<212> PRT
<213> 猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus)
<400> 18
Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr Trp Tyr Cys Ala Gly Gln
1 5 10 15
His Pro
<210> 19
<211> 21
<212> PRT
<213> 猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus)
<400> 19
Ser Tyr Gln Pro Cys Thr Ala Asn Cys Ile Gly Tyr Ala Ala Asn Val
1 5 10 15
Phe Ala Thr Glu Pro
20
<210> 20
<211> 13
<212> PRT
<213> 猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus)
<400> 20
Ala Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala His Leu Ile
1 5 10
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<211> 19
<212> PRT
<213> 猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus)
<400> 21
Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu Phe Gly Ser Gly
1 5 10 15
Val Lys Phe
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<211> 9
<212> PRT
<213> 猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus)
<400> 22
Val Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Phe
1 5
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<211> 27
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
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atgaagtctt taacttactt ctggttg 27
<210> 24
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<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 24
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<210> 25
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<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 25
actccatggt gaagtcttta acttacttct ggttg 35
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<211> 35
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 26
actaagcttt tatccactgt tgtaacactt tgtcg 35
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<211> 32
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 27
actccatggg ttgtgctatg caatatgttt ac 32
<210> 28
<211> 32
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 28
actaagcttt tagatgacaa tttccctgac gg 32
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 29
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<210> 30
<211> 37
<212> DNA
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<400> 30
actaagcttt taagcaccac tagtgacatt cttaaag 37
<210> 31
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<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 31
catggatcca ccaagtatgg tgatgtttat gtca 34
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<211> 34
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 32
catctcgagg taatcattaa cagattgcaa ggtg 34
Claims (10)
1.猪流行性腹泻病毒基因工程免疫原，其特征在于，包含六种蛋白中的一种或几种，六种蛋白的氨基酸序列如：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6所示。
2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒基因工程免疫原，其特征在于，所述的六种蛋白的核苷酸序列如：SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11、SEQ ID No.12所示。
3.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒基因工程免疫原，其特征在于，所述的六种蛋白还包括通过碱基的删减，增加或者替换之后表达的具有相似免疫原功能的蛋白。
4.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒基因工程免疫原，其特征在于，包含六种蛋白，六种蛋白的氨基酸序列如：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQID No.5、SEQ ID No.6所示。
5.根据权利要求4所述的猪流行性腹泻病毒基因工程免疫原，其特征在于，六种蛋白按照质量比为1:1:(2-4):1:1:(2-4)的比例混合。
6.根据权利要求5所述的猪流行性腹泻病毒基因工程免疫原，其特征在于，将六种蛋白纯化，按照质量比为1:1:2:1:1:2的比例混合，加入白油或其他免疫增强剂，使每一种蛋白的终浓度含量在50μg/mL～300μg/mL之间，随后进行乳化，制备成油包水型的免疫原。
7.猪流行性腹泻病毒基因工程抗体，其特征在于，是由权利要求1-6任一项所述的猪流行性腹泻病毒基因工程免疫原免疫动物后获得的抗体。
8.根据权利要求7所述的猪流行性腹泻病毒基因工程抗体，其特征在于，将权利要求1-6任一项所述的猪流行性腹泻病毒基因工程免疫原免疫动物免疫蛋鸡，然后从鸡蛋中提取该抗体。
9.根据权利要求8所述的猪流行性腹泻病毒基因工程抗体，其特征在于，采用免疫原对蛋鸡进行免疫，共进行三次免疫，首次免疫后间隔21d做第二次免疫，第二次免疫后30d做第三次免疫；提取第3次免疫后的鸡蛋的IgY抗体。
10.根据权利要求9所述的猪流行性腹泻病毒基因工程抗体，其特征在于，采用免疫原对蛋鸡进行免疫，共进行三次免疫，首次免疫后间隔21d做第二次免疫，第二次免疫后30d做第三次免疫；抽取第3次免疫后的鸡蛋，检测蛋白的特异性卵黄抗体效价，当蛋白的抗体中和效价达到1:128倍以上时，提取IgY抗体。
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