CN105693827A - 一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了猪伪狂犬病病毒gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段，该gB蛋白片段表达量高，其制备的亚单位抗原免疫效果较gB蛋白更好，本发明还提供了使用该gB蛋白片段、该gB蛋白片段和gD蛋白制备的亚单位疫苗，该疫苗制备方法简单，针对猪伪狂犬病毒引起的伪狂犬病有着较好的保护作用。

Description

一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及猪伪狂犬病毒的亚单位疫苗及其制备方法，以及用于制备预防和/或治疗与猪伪狂犬病毒相关疾病和由猪伪狂犬病毒导致的感染的组合物的应用。
背景技术
伪狂犬病，又称Aujeszky氏病，是由疱疹病毒科(Herpesviridae)α亚科中的猪疱疹病毒Ⅰ型(Suidherpesvirus1strain)所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生动物的一种以发热、奇痒(除猪外)及脑脊髓炎为主要症状的急性传染病。猪的伪狂犬病在我国广泛存在，危害严重，是制约规模化猪场生产的主要疫病之一。它能引起妊娠母猪流产、死胎或木乃伊胎和仔猪出现神经症状、麻痹，死亡率高。PRV具有较强的泛嗜性、神经嗜性及潜伏感染特性，在外周神经系统可以长期潜伏感染，当潜伏病毒被激活变成有感染力的病毒，被潜伏感染的宿主就会发病。
本领域存在表达量高、有效免疫的抗伪狂犬病病毒感染的亚单位疫苗的现实需要。
发明内容
本发明首次通过将猪伪狂犬病毒gB蛋白取其片段进行融合表达，制备亚单位疫苗，针对猪伪狂犬病毒引起的伪狂犬病有着较好的保护作用，而且意外发现，制备的gB蛋白片段表达量显著提高，大大降低了免疫成本。
本发明的涉及一种猪伪狂犬病病毒gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段，其中，所述gB蛋白片段能保持与所述gB蛋白的抗原活性；所述变异体或其活性片段的氨基酸序列中与所述gB蛋白片段的氨基酸序列相比存在一个或多个保守性氨基酸替换、添加或删除而仍能保持与所述gB蛋白片段的抗原活性。
本发明的另一方面涉及编码本发明所述猪伪狂犬病病毒gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段的核苷酸序列。
本发明的又一方面涉及一种猪伪狂犬病病毒gB-gD蛋白，其中，所述gB-gD蛋白包括本发明的所述的gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段以及gD蛋白。
本发明的再一方面涉及一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗，其中，所述亚单位疫苗包含免疫量的本发明的所述gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段和药学上可接受的载体。
本发明还涉及一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗，其中，所述亚单位疫苗包含免疫量的本发明的所述gB-gD蛋白片段和药学上可接受的载体。
本发明还涉及一种制备亚单位疫苗的方法，其中，所述方法包括：1)克隆本发明所述gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段的核苷酸序列的步骤；2)表达所述步骤1)的克隆核苷酸序列的步骤，得到所述gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段，以及3)使用所述步骤2)获得的gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段，添加药学上可接受的载体以及佐剂，制备所述亚单位疫苗的步骤。
本发明还涉及一种制备亚单位疫苗的方法，其中，所述方法包括：1)克隆本发明所述gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段的核苷酸序列，克隆所述gD蛋白核苷酸序列的步骤；2)串联表达或融合表达所述步骤1)的克隆核苷酸序列的步骤，得到所述gB-gD蛋白，以及3)使用所述步骤2)获得的gB-gD蛋白，添加药学上可接受的载体以及佐剂，制备所述亚单位疫苗的步骤。
本发明还涉及本发明所述的gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段、所述的gB-gD蛋白、以及所述的猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗在制备预防和/或治疗猪伪狂犬病病毒相关疾病或由猪伪狂犬病病毒导致的感染的药物中的应用。
附图说明
图1是猪伪狂犬病病毒HN1201株、Bartha株、Kaplan株、Becker株gB蛋白的氨基酸序列同源性比较，图1A显示各gB蛋白氨基酸序列1～约480位氨基酸残基间序列的比较，图1B显示各gB蛋白氨基酸序列约481位及剩余的氨基酸残基间序列的比较。
序列表中：
序列1为PRVHN1201株gB蛋白的核苷酸序列；
序列2为PRVHN1201株gB蛋白的氨基酸序列；
序列3为PRVHN1201株gB蛋白片段的核苷酸序列；
序列4为PRVHN1201株gB蛋白片段的氨基酸序列；
序列5为PRVBartha株gB蛋白片段的核苷酸序列；
序列6为PRVBartha株gB蛋白片段的氨基酸序列；
序列7为PRVKaplan株gB蛋白片段的核苷酸序列；
序列8为PRVKaplan株gB蛋白片段的氨基酸序列；
序列9为PRVBecker株gB蛋白片段的核苷酸序列；
序列10为PRVBecker株gB蛋白片段的氨基酸序列；
序列11为PRVHN1201株gD蛋白的核苷酸序列；
序列12为PRVHN1201株gD蛋白的氨基酸序列；
序列13为PRVHN1201株gB蛋白片段和gD蛋白的融合蛋白核苷酸序列；
序列14为PRVHN1201株gB蛋白片段和gD蛋白的融合蛋白氨基酸序列。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
术语“gB蛋白”又称“gB糖蛋白”，在疱疹病毒成员中属于最保守的糖蛋白，其大小约2.8kb。
本发明的一个方面涉及一种猪伪狂犬病病毒gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段，其中，所述gB蛋白片段氨基酸包括位点以SEQIDNO：2所示的猪伪狂犬病病毒HN1201株gB蛋白序列为基准，gB蛋白约第62位至148位氨基酸所示序列和/或约第546位至700位氨基酸所示序列，所述gB蛋白片段能保持与所述gB蛋白的抗原活性；所述变异体或其活性片段的氨基酸序列中与所述gB蛋白片段的氨基酸序列相比存在一个或几个保守性氨基酸替换、添加或删除而仍能保持与所述gB蛋白片段的抗原活性。
不同猪伪狂犬病病毒株gB蛋白序列可能因氨基酸位点的插入、缺失，造成本发明所述gB蛋白片段序列位置在不同猪伪狂犬病病毒株gB蛋白序列中存在差异，比如在猪伪狂犬病病毒Bartha株对应氨基酸位置为gB蛋白第62位至150位以及第548位至702位，在猪伪狂犬病病毒Kaplan株对应氨基酸位置为gB蛋白第62位至154位以及第552位至706位，在猪伪狂犬病病毒Becker株对应氨基酸位置为gB蛋白第62位至147位以及第545位至699位，其可通过与SEQIDNO：2所示的猪伪狂犬病病毒HN1201株gB蛋白序列进行比对，与猪伪狂犬病病毒HN1201株gB蛋白第62位至148位氨基酸所示序列以及第546位至700位氨基酸所示序列对应的序列即为本发明所述gB蛋白片段序列。
gB蛋白片段的在gB蛋白序列上的氨基酸位点可通过DNAStar进行比对，以确定在不同猪伪狂犬病病毒株中本发明所述的gB蛋白片段氨基酸序列对应的位点，通过比对猪伪狂犬病病毒HN1201株、Bartha株、Kaplan株和Becker株gB蛋白片段的氨基酸位点，结果见图1。也可通过其他的生物学软件进行序列比对，以确定本发明所述的gB蛋白片段在不同猪伪狂犬病病毒株中氨基酸位点，例如MEGA、DNAman、clustalX、bioedit、VectorNTI以及NCBI中的blast功能。
本发明所用术语“保守性变异体”是指基本上保留了其母本的特性，如基本的免疫学生物特性、结构特性、调节特性或生化特性的变异体。一般的，多肽的保守性变异体的氨基酸序列不同于母本多肽。但是差异是有限的，以使母本多肽序列与保守性变异体总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。保守性变异体和母本多肽氨基酸序列的差异可以是例如：一个或几个氨基酸残基及其任一组合的替换、添加和删除。替换或插入的氨基酸残基可由遗传密码编码，也可由不遗传密码编码。多肽的保守性变异体可以自然产生，或者它可以是非自然产生的变异体。多肽非自然产生的保守性变异体可通过诱变技术或直接合成而产生。
本发明所述变异体或其活性片段的氨基酸序列中与所述gB蛋白片段的氨基酸序列相比存在一个或几个保守性氨基酸替换、添加或删除而仍能保持与所述gB蛋白片段的抗原活性，其中，所述一个或几个保守性氨基酸替换、添加或删除意指一个至10个保守性氨基酸替换、添加或删除，优选一个至5个保守性氨基酸替换、添加或删除。所述保守性氨基酸替换、添加或删除意指性质相似、大小相当的替换、添加或删除，包括但不限于甘氨酸与丙氨酸之间的替换，丝氨酸与苏氨酸之间的替换，精氨酸与赖氨酸之间的替换。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述猪伪狂犬病病毒gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段，其中，所述gB蛋白片段氨基酸包括位点以SEQIDNO：2所示的猪伪狂犬病病毒HN1201株gB蛋白序列为基准，gB蛋白第62位至148位氨基酸所示序列和/或第546位至700位氨基酸所示序列，所述gB蛋白片段能保持与所述gB蛋白的抗原活性；所述变异体或其活性片段的氨基酸序列中与所述gB蛋白片段的氨基酸序列相比存在一个或几个保守性氨基酸替换、添加或删除而仍能保持与所述gB蛋白片段的抗原活性。
作为本发明的一种实施方式，在本发明的疫苗组合物中，所述gB蛋白片段来自包括猪伪狂犬病病毒JS-2012株、猪伪狂犬HeN1株、NVDC-PRV-BJ株、NVDC-PRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株、PRVTJ株、猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJ01、猪伪狂犬病毒变异株HN1201株、猪伪狂犬病毒变异株HN1202株、猪伪狂犬病病毒Fa株、猪伪狂犬病病毒Bartha株、猪伪狂犬病病毒Kaplan株、猪伪狂犬病病毒Becker株。
猪伪狂犬病病毒株JS-2012株公开于免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定[J].童武，张青占，郑浩等，中国动物传染病学报2013,21(3):1-7)；猪伪狂犬HeN1株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCCNO.6656，公开于专利申请CN102994458A；NVDC-PRV-BJ株、NVDCPRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株公开于PathogenicPseudorabiesVirus,XiulingYu,ZhiZhou,DongmeiHu,etal.China,2012EmergingInfectiousDiseases，www.cdc.gov/eidol.20,No.1,January2014；PRVTJstrain(PRVTJ)株，公开于ChinaChun-HuaWangJinYuan1,Hua-YangQin1，etal，AnovelgE-deletedpseudorabiesvirus(PRV)providesrapidandcompleteprotectionfromlethalchallengewiththePRVvariantemerginginBartha-K61-vaccinatedswinepopulationinChinaVaccine32(2014)3379–3385中；猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJ01，其保藏号为CGMCCNo.8170公开于CN103627678A；猪伪狂犬病毒HN1201株(Pseudorabiesvirus,strainHN1201)保藏号为CCTCCNO.V201311；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年5月20日；猪伪狂犬病毒HN1202株(Pseudorabiesvirus,strainHN1202)保藏号为CCTCCNO.V201335；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年8月26日；猪伪狂犬病病毒Fa株公开于伪狂犬病毒Fa株gB_gC_gD基因的克隆与序列分析[J].陈振海等，福建农业学报2007，22(2)：120-125；猪伪狂犬病病毒Bartha株及猪伪狂犬病病毒Becker株公开于Awideextentofinter-straindiversityinvirulentandvaccinestrainsofalphaherpesviruses，Szpara,M.L.,etal.，PLoSPathog.2011Oct；7(10):e1002282；猪伪狂犬病病毒Kaplan株公开于Analysisofviralandcellularfactorsinfluencingherpesvirus-inducednuclearenvelopebreakdown，Grimm,K.S.,etal，JVirol.2012Jun；86(12):6512-6521。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述猪伪狂犬病病毒gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段中，所述gB蛋白片段包含所述猪伪狂犬病病毒HN1201株gB蛋白第62位至148位氨基酸所示序列和/或第546位至700位氨基酸所示序列。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述猪伪狂犬病病毒gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段中，所述gB蛋白片段氨基酸序列为SEQIDNO：4所示氨基酸序列。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述猪伪狂犬病病毒gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段中，所述gB蛋白片段氨基酸序列为SEQIDNO：3所示核苷酸序列所编码。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述猪伪狂犬病病毒gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段中，所述gB蛋白片段包含猪伪狂犬病病毒Bartha株gB蛋白第62位至150位氨基酸所示序列和/或第548位至702位氨基酸所示序列。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述猪伪狂犬病病毒gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段中，所述gB蛋白片段氨基酸序列为SEQIDNO：6所示氨基酸序列。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述猪伪狂犬病病毒gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段中，所述gB蛋白片段氨基酸序列为SEQIDNO：5所示核苷酸序列所编码。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述猪伪狂犬病病毒gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段中，所述gB蛋白片段包含猪伪狂犬病病毒Kaplan株gB蛋白第62位至154位氨基酸所示序列和/或第552位至706位氨基酸所示序列。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述猪伪狂犬病病毒gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段中，所述gB蛋白片段氨基酸序列为SEQIDNO：8所示氨基酸序列。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述猪伪狂犬病病毒gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段中，所述gB蛋白片段氨基酸序列为SEQIDNO：7所示核苷酸序列所编码。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述猪伪狂犬病病毒gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段中，所述gB蛋白片段包含猪伪狂犬病病毒Becker株第62位至147位氨基酸所示序列和/或第545位至699位氨基酸所示序列。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述猪伪狂犬病病毒gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段中，所述gB蛋白片段氨基酸序列为SEQIDNO：10所示氨基酸序列。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述猪伪狂犬病病毒gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段中，所述gB蛋白片段氨基酸序列为SEQIDNO：9所示核苷酸序列所编码。
术语“gD蛋白”又称“gD糖蛋白”，是猪伪狂犬病病毒进行感染必需的结构蛋白，是成熟的病毒粒子囊膜表面的主要糖蛋白之一，也称为“gp50蛋白”。
本发明的一个方面涉及一种猪伪狂犬病病毒gB-gD蛋白，其中，所述gB-gD蛋白包括本发明所述的gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段以及gD蛋白。
作为本发明的一种实施方式，所述gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段与gD蛋白串联表达或融合表达。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述猪伪狂犬病病毒gB-gD蛋白中，gD蛋白氨基酸序列为SEQIDNO：12所示氨基酸序列。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述猪伪狂犬病病毒gB-gD蛋白中，所述gD蛋白氨基酸序列为SEQIDNO：11所示核苷酸序列所编码。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述猪伪狂犬病病毒gB-gD蛋白中，所述gB蛋白片段氨基酸序列为SEQIDNO：4所示氨基酸序列，所述gD蛋白氨基酸序列为SEQIDNO：12所示氨基酸序列。
作为本发明的一种最优选实施方式，本发明所述猪伪狂犬病病毒gB-gD蛋白中，所述gB蛋白片段和gD蛋白为融合蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：14所示。
作为本发明的一种最优选实施方式，本发明所述猪伪狂犬病病毒gB-gD蛋白中，所述gB蛋白片段和gD蛋白为融合蛋白，其核苷酸序列如SEQIDNO：13所示。
本发明的另一方面涉及一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗，其中，所述亚单位疫苗包含免疫量的本发明所述gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段和药学上可接受的载体。
作为本发明的一种实施方式，所述亚单位疫苗中，所述gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段含量为25-100μg/ml。
作为本发明的一种实施方式，所述亚单位疫苗包括佐剂。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗包含含量为25-100μg/ml的本发明的SEQIDNO：4所示氨基酸序列的gB蛋白片段。
作为本发明的实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗中可选择本发明的SEQIDNO：6、或SEQIDNO：8、或SEQIDNO：10所示氨基酸序列的gB蛋白片段替换SEQIDNO：4所示氨基酸序列的gB蛋白片段。
本发明提供的预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的亚单位疫苗组合物包含的gB蛋白片段和gD蛋白还可以是与其功能衍生物基本相同的氨基酸序列的多肽。
术语“功能衍生物”指具有与完整蛋白/肽序列的生物活性基本类似的功能生物活性的蛋白/肽序列。换言之，其优选地指当将所述功能衍生物施用于动物时，基本上保留了激发免疫应答，如针对猪伪狂犬病毒株攻击的保护性反应的能力的多肽或其片段。
术语“核苷酸片段”指这样的多核苷酸序列，其是人工构建(例如通过化学合成)或通过将天然产物裂解成多个小片段(使用限制性内切酶，或机械剪切)构建的本发明核酸的分离的部分，或通过PCR、DNA聚合酶或本领域公知的任何其他聚合技术合成的核酸的部分，或通过本领域技术人员公知的重组核酸技术在宿主细胞中表达的核酸部分。
如本文一般理解和使用，“功能性片段”指编码与完整核酸序列的生物活性基本相似的功能生物活性的核酸序列。换言之，在本发明的上下文中，其优选地指基本上保留了编码这样的多肽/蛋白质能力的核酸或其片段，所述多肽/蛋白质当施用于动物时，激发针对猪伪狂犬病毒攻击的免疫应答，和更优选地保护性反应。
当指氨基酸序列时，“基本上相同”可以理解为本发明的多肽优选地具有这样的氨基酸序列，其与SEQIDNO：4，12中所示的序列的部分或全部具有至少70％同源性，或甚至优选地80％同源性，或甚至更优选地90％同源性，或最优选地95％同源性。
在本文中术语“同源性”还包括与参比序列相同或类似，同时提供任何氨基酸的简单替换/修饰。可以用BLAST-P(基本局部排比检索工具)，本领域技术人员公知的程序进行该方面的同源性检索。对于相应的核酸序列，同源性涉及在本领域中已知的BLASTX和BLASTN程序。
无论是氨基酸序列同源性，抑或是核苷酸序列同源性，其同源性高低以序列的改变不影响自身免疫原性为限定。
术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂包括，但不限于：油佐剂，水溶性佐剂，铝盐佐剂，细胞因子佐剂。
本发明所用术语“油佐剂”又称“油性佐剂”或“油乳佐剂”，是由包括植物油、动物油、矿物油中的一种或几种组成，用于延缓免疫原在机体内的存留时间，使之持续缓慢释放，增强巨噬细胞的吞噬与杀菌能力。
本发明所用术语“水溶性佐剂”又称“水基佐剂”或“水佐剂”，是一种聚合物水溶性分散体，用于提高水溶性疫苗的功效和安全性，可以由高分子量聚丙烯酸类合成聚合物组成。
本发明所用术语“铝盐佐剂”，又称“铝胶佐剂”或“铝佐剂”，包括氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂，其主要功能为缓释，但同时具有对免疫细胞的激活作用。将抗原和氢氧化铝或磷酸铝混合注射，能够使抗原保存在注射部位，具有抗原缓释和非特异免疫刺激作用。
本发明所用术语“细胞因子佐剂”，包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、INF-γ、GM-CSF、TNF-α、TNF-β、TCA-3等，又称“细胞因子”或“细胞素”，是活体宿主细胞分泌的通过扩散、细胞间接触或血液循环到达宿主其他细胞，在体液中以极低浓度发挥作用的一类非免疫球蛋白、局部天然蛋白或糖蛋白，也是一类由机体活化的免疫细胞和某些非免疫细胞产生、分泌，能调节细胞生长、分化，与造血、炎症反应、免疫应答反应和创伤愈合等密切相关的高活性多功能小分子蛋白的统称，可以刺激或抑制免疫功能，在免疫应答中促进细胞发育分化、调节细胞生理功能和细胞间信息传递，在免疫系统中起着非常重要的调控作用。
本发明实施例中使用了油佐剂中的一种206佐剂。
适用于本发明的组合物的佐剂的量优选地是有效量。所述“有效量”是指佐剂在同本发明抗原联合施用时在宿主中发挥它们的免疫学作用而言必须或足够的而不导致过度副作用所必需量。待施用的佐剂的精确的量将根据因素如所用的成分和治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
本发明的另一方面涉及一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗，其中，所述亚单位疫苗包含免疫量的本发明所述的gB-gD蛋白和药学上可接受的载体。
作为本发明的一种实施方式，所述亚单位疫苗中，所述gB-gD蛋白含量为25-100μg/ml。
作为本发明的一种实施方式，所述亚单位疫苗包括佐剂。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗包含串连表达的本发明的SEQIDNO：4所示氨基酸序列的gB蛋白片段和SEQIDNO：12所示氨基酸序列的gD蛋白，所述蛋白抗原含量为25-100μg/ml。
作为本发明的实施方式，本发明所述的串连表达的猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗中可选择SEQIDNO：6、或SEQIDNO：8、或SEQIDNO：10所示氨基酸序列的gB蛋白片段替换SEQIDNO：4所示氨基酸序列的gB蛋白片段。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗包含融合表达的本发明的SEQIDNO：4所示氨基酸序列的gB蛋白片段和SEQIDNO：12所示氨基酸序列的gD蛋白，所述蛋白抗原含量为25-100μg/ml。
作为本发明的实施方式，本发明所述的融合表达的猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗中可选择SEQIDNO：6、或SEQIDNO：8、或SEQIDNO：10所示氨基酸序列的gB蛋白片段替换SEQIDNO：4所示氨基酸序列的gB蛋白片段。
本发明还涉及一种制备亚单位疫苗的方法，其中，所述方法包括：1)克隆本发明所述gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段的核苷酸序列的步骤；2)表达所述步骤1)的克隆核苷酸序列的步骤，得到所述gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段，以及3)使用所述步骤2)获得的gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段，添加药学上可接受的载体以及佐剂，制备所述亚单位疫苗的步骤。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述制备亚单位疫苗的方法中，所述gB蛋白片段氨基酸序列为SEQIDNO：4、或SEQIDNO：6、或SEQIDNO：8、或SEQIDNO：10所示氨基酸序列。
本发明还涉及一种制备亚单位疫苗的方法，其中，所述方法包括：1)克隆本发明所述gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段的核苷酸序列，克隆所述gD蛋白核苷酸序列的步骤；2)串联表达或融合表达所述步骤1)的克隆核苷酸序列的步骤，得到所述gB-gD蛋白，以及3)使用所述步骤2)获得的gB-gD蛋白，添加药学上可接受的载体以及佐剂，制备所述亚单位疫苗的步骤。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述制备亚单位疫苗的方法中，表达的gB-gD蛋白为串连表达的SEQIDNO：4、或SEQIDNO：6、或SEQIDNO：8、或SEQIDNO：10所示氨基酸序列的gB蛋白片段和SEQIDNO：12所示氨基酸序列的gD蛋白。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述制备亚单位疫苗的方法中，表达的gB-gD蛋白为融合表达的SEQIDNO：4、或SEQIDNO：6、或SEQIDNO：8、或SEQIDNO：10所示氨基酸序列的gB蛋白片段和SEQIDNO：12所示氨基酸序列的gD蛋白。
本发明的另一方面涉及本发明所述的gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段在制备预防和/或治疗猪伪狂犬病病毒相关疾病或由猪伪狂犬病病毒导致的感染的药物中的应用。
本发明还涉及本发明所述的gB-gD蛋白在制备预防和/或治疗猪伪狂犬病病毒相关疾病或由猪伪狂犬病病毒导致的感染的药物中的应用。
本发明还涉及本发明所述的猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗在制备预防和/或治疗猪伪狂犬病病毒相关疾病或由猪伪狂犬病病毒导致的感染的药物中的应用。
术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制猪伪狂犬感染或推迟疾病发作的所有行为。术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使猪伪狂犬病病毒感染引起的症状减轻或转好的所有行为。
本发明涉及的猪伪狂犬病毒多肽，其有利地激发动物中的保护性反应。具体地，本发明涉及的多肽包含与其功能衍生物基本相同的氨基酸序列。
术语“保护性反应”意为在动物中预防猪伪狂犬病毒相关疾病或由猪伪狂犬病毒导致的感染的发作或减轻存在的这样的疾病的严重性。
本文所用的术语“猪伪狂犬病病毒相关疾病”用于指由猪伪狂犬病毒感染引起的疾病。它的例子包括发病仔猪表现出明显的神经症状、昏睡、呜叫、呕吐、拉稀、体温升高，一旦发病，怀孕母猪可发生流产、产木乃伊胎儿或死胎或繁殖障碍，但不限于此。
本文所用的术语“猪伪狂犬病病毒相关疾病”可以进一步用于指表现为任何年龄的猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短(1～2天)，发病率在10％～100％之间，发病猪死亡率在10％～100％之间(仔猪死亡率可高达100％)，感染后可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流产(高达35％)，早产，死胎，弱仔(弱仔14日龄前全部死亡)等繁殖障碍症状，但不限于此。以及感染后会造成成年猪(体重在50kg以上猪)高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死；新生及4周龄以内的仔猪突然发病，发生大批死亡，死亡率达90％以上；发病仔猪主要表现为体温上升达41℃以上，食欲废绝，伴有明显的神经症状和腹泻；断奶前后仔猪主要为呼吸系统症状，表现呼吸困难、咳嗽、流鼻涕等。
本发明具有以下突出的优点：
(1)本发明疫苗组合物可通过基因工程手段或人工合成手段对疫苗组合物的组分进行大量合成表达，不仅耗时短，还可便于大规模生产；
(2)本发明猪伪狂犬病毒疫苗组合物中多免疫原性抗原的组合可诱导产生协同的免疫效果，不仅免疫效果良好，还进一步降低了免疫使用量，降低了免疫成本；
(3)本发明疫苗组合物可有效保护猪只抵抗猪伪狂犬病毒的感染，提供了一种完善预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的途径，避免了传统活疫苗毒力返强及散毒风险的发生，对于净化猪伪狂犬病毒有着积极的现实意义。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1猪伪狂犬病毒gB蛋白片段的制备
1.猪伪狂犬病毒gB蛋白片段基因的扩增
在生长良好的PK15细胞上接种PRVHN1201病毒，取200μL收获的病毒液，参照用geneaid公司viralnucleicacidextractionkitII试剂盒说明书提取PRV基因组DNA。利用引物gBF1和gBR1扩展gB基因62-148aa，利用引物gBF2和gBR2扩展gB基因546-700aa，利用OverlappingPCR将二者扩增在一起，并利用引物的设计，在两者中间加入GGSG连接氨基酸。引物见表1，PCR体系见表2，PCR反应条件见表3。
表1gB蛋白片段基因扩增引物
表2PCR体系
2×PrimeSTAR GC buffer 25μL
PRV基因组DNA 1μL
primers(10pM) 1μL/1μL
dNTPs(2.5mM) 4μL
PrimeSTAR(2.5U/μL) 0.5μL
ddH2O 17.5μL
表3PCR反应条件
2.供体质粒的构建
将步骤1扩增的PCR产物按照OMEGA凝胶回收试剂盒进行回收，回收产物进行EcoRⅠ和HindⅢ双酶切。同时，将含有信号肽的pFastBacI进行EcoRⅠ和HindⅢ双酶切。将酶切后的pFastBacI载体和PCR产物进行连接。
按照常规化学转化方法将连接产物转化DH5α，涂布含有amp抗性的LB平板上，37℃培养过夜。挑取单个菌落于3-5ml含有amp抗性的液体LB中，37℃，220rpm，培养12-16h，参照天根质粒小提试剂盒说明书进行质粒抽提，利用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切进行鉴定，鉴定正确的命名为pFastBac-HNgBΔ148～546。
3重组Bacmid的构建
将1-2μLpFastBac-HNgBΔ148～546质粒加入DH10Bac感受态细胞，轻弹混匀，冰上孵育30min，42℃热激60s，冰上孵育5min后加入400μl的SOC培养基于37℃、200rpm培养4h，取100微升菌液涂布于含有IPTG/X-gal/卡那/四环/庆大三抗平板，37℃培养至少48h，待蓝白菌落明显时挑取白色单一菌落至5ml卡那/四环/庆大三抗液体LB培养基摇菌过夜。次日取1μl作为模板进行菌液PCR鉴定，PCR产物大小为2300bp+目的片段大小，使用天根质粒小提试剂盒中试剂进行重组Bacmid的提取，命名为Bac-HNgBΔ148～546。
4.重组杆状病毒的获得及传代
将重组BacmidBac-HNgBΔ148～546转染昆虫细胞sf9。参照IIRegent说明书进行转染，转染后72h待细胞病变后，收获细胞上清标记为rBac-HNgBΔ148～546P1。
将对数生长期的sf9细胞按照0.9×106cell/dish接种10cm细胞培养皿，待细胞完全贴壁后，将P1代重组杆状病毒按1:20-1:40的体积比加入铺好sf9的细胞培养皿中，27℃培养继续培养，直到72h左右细胞病变明显时，收获上清标记为P2代重组杆状病毒，用锡箔纸包裹避光保存在4℃冰箱备用。重复此步骤接种比例按照1:100-1:200获得P3、P4代重组杆状病毒。
5.蛋白的表达
将传至P4的重组病毒按照1:5～1:10的体积比接种Hi5细胞1L，接种48h左右收获细胞，离心获得的上清进行WesternBlot确认目的蛋白得到表达。经过His亲和层析和分子筛纯化，参照碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法进行蛋白定量，结果1L细胞可以表达获得HNgBΔ148～546蛋白10mg。
实施例2猪伪狂犬病毒gB蛋白的制备
1.猪伪狂犬病毒gB基因的扩增
利用实施例1中抽提的PRV基因组DNA作为模板，利用引物gBF和gBR扩增HNgB基因62-752aa。引物见表4，PCR体系依据表2，反应条件依据表3。
表4gB基因扩增引物
2.供体质粒的构建
参照实施例1中供体质粒的构建方法，将步骤1中扩增的PCR产物进行回收构建供体质粒，经鉴定正确的命名为pFastBac-HNgB。
3.重组Bacmid的构建
参照实施例1中重组Bacmid的构建方法，将步骤2获得的供体质粒转化DH10Bac，PCR鉴定正确的重组Bacmid命名为Bac-HNgB。
4.重组杆状病毒的获得及传代
参考实施例1中重组杆状病毒获得及传代的方法，将步骤3鉴定正确的重组BacmidBac-HNgB转染细胞，制备重组杆状病毒。
5.蛋白的表达
将步骤4得到的重组杆状病毒传至P4代，按照1:5～1:10的体积比接种Hi5细胞2L，接种48h左右收获细胞，离心获得的上清进行WesternBlot确认目的蛋白得到表达。经过His亲和层析和分子筛纯化，参照碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法进行蛋白定量，结果1L细胞可以表达获得HNgB蛋白5mg。
实施例3猪伪狂犬病毒gB蛋白片段与gB蛋白表达量比较
通过实施例1和实施例2中两个蛋白的表达数据进行比较，发现gB蛋白片段的表达量比gB蛋白表达量在相同培养环境及条件下提高了1倍，说明本发明选取的gB蛋白片段更易于表达，可有效降低免疫成本，利于工业化大规模的投入应用。
实施例4猪伪狂犬病毒亚单位疫苗的制备
分别取实施例1和实施例2制备的gB蛋白片段和gB蛋白，缓缓加入到佐剂中，加的过程中不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀，4℃保存，即为猪伪狂犬病毒的疫苗组合物。具体配比见表5。
表5猪伪狂犬病毒亚单位疫苗成分配比
疫苗1 疫苗2 疫苗3 疫苗4
gBΔ148～546(μg/ml) 25 50 100 0
gB(μg/ml) 0 0 0 100
206佐剂(V/V％) 50 50 50 50
实施例5猪伪狂犬病毒亚单位疫苗的免疫原性试验
将21日龄PRV抗体阴性仔猪24头随机分成6组，4头/组，即1-4组分别为本发明实施例4制备的疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4，第5组和第6组注射等量的PBS，单次免疫。免疫后28日后攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株2×108.0TCID50/头，攻击后7天内每天固定时间观察临床状况并测量体温。
结果在该攻毒剂量下第1-4免疫组4只仔猪均获得保护，出现短暂临床体征在5天后逐步恢复正常，最终存活；第5组在攻毒后2天死2头，3天全部死亡，有明显的临床体征；第6组存活，无异常现象发生。攻毒保护结果见表6。
表6猪伪狂犬病毒亚单位疫苗免疫仔猪后的攻毒保护结果
对于动物进行判断，评估疾病的临床体征是在不清楚所有个体免疫情况下进行的，体温升高情况见表7。临床猪只体温升高天数统计，使用ANOVA分析来比较疫苗对仔猪体温变化的作用。结果显示疫苗1、疫苗2、疫苗3免疫组之间体温升高差异不显著(P＞0.05)，而疫苗1、疫苗2、疫苗3同疫苗4之间差异极显著(P＜0.01)。通过比较免疫仔猪体温升高天数平均值，结果显示疫苗4免疫仔猪的体温升高天数平均值与疫苗1、疫苗2、疫苗3免疫仔猪的体温升高天数平均值相比由3天下降到1-1.25天，平均下降了58.3％-66.7％。通过比较各疫苗的免疫效力临床评判结果相关性，可以看出疫苗1、疫苗2和疫苗3的免疫效果要显著高于疫苗4。证明了本发明包含gB蛋白片段的亚单位疫苗免疫效果要优于gB蛋白的亚单位疫苗，而且还发现，本发明包含gB蛋白片段的亚单位疫苗具有更低的抗原含量，却能达到更好的免疫效果，在通过比较疫苗对临床疾病的影响，本发明疫苗组合物临床疾病显著少于gB蛋白的亚单位疫苗。
表7猪伪狂犬病毒亚单位疫苗免疫仔猪后的体温升高情况
组别 A(天) B(天) C(天) D(天) 平均值(天)
1 2 1 1 1 1.25
2 1 1 1 1 1
3 1 1 1 1 1
4 3 3 3 3 3
6 0 0 0 0 0
进一步对各试验组仔猪采食情况进行统计，结果见表8。临床猪只7天采食量统计，使用ANOVA分析来比较疫苗对仔猪采食量变化的作用。结果显示疫苗1、疫苗2、疫苗3免疫组之间采食量差异不显著(P＞0.05)，而疫苗1、疫苗2、疫苗3同疫苗4之间差异极显著(P＜0.01)。通过比较免疫仔猪采食量平均值，结果显示疫苗4免疫仔猪的采食量平均值与疫苗1、疫苗2、疫苗3免疫仔猪的采食量平均值相比由210.86g上升到285.60g-290.58g，平均上升了35.45％-37.81％。通过比较各疫苗的免疫效力临床评判结果相关性，可以看出疫苗1、疫苗2和疫苗3的免疫效果要显著高于疫苗4。进一步证明了本发明包含gB蛋白片段的亚单位疫苗免疫效果要优于gB蛋白的亚单位疫苗。
表8猪伪狂犬病毒亚单位疫苗免疫仔猪后采食情况
组别 A(g) B(g) C(g) D(g) 平均值(g)
1 291.12 288.81 292.04 287.43 289.85
2 280.44 275.30 298.38 288.28 285.60
3 295.22 289.28 287.36 290.46 290.58
4 215.80 210.12 208.00 209.52 210.86
6 288.44 290.56 287.94 296.34 290.82
实施例6猪伪狂犬病毒Bartha株、Kaplan株及Becker株gB蛋白片段的制备
为了证明本发明猪伪狂犬病毒gB蛋白片段选取的抗原位点免疫原性是否具有普遍意义，以猪伪狂犬病毒Bartha株gB蛋白序列(登录号：AEM63980.1)、Kaplan株gB蛋白序列(登录号：AFI70792.1)、Becker株gB蛋白序列(登录号：AEM64118.1)所示基因全长由生工生物(上海)股份有限公司合成。所合成的基因片段全长分别为2748bp、2760bp、2739bp。由此人工合成的基因片段的基础上制备本发明猪伪狂犬病毒Bartha株、Kaplan株及Becker株gB基因模板。
分别设计引物扩增Bartha株gB基因62-150aa和548-702aa、Kaplan株gB基因62-154aa和552-706aa、Becker株gB基因62-147aa和545-699aa，利用OverlappingPCR将二者扩增在一起，并利用引物的设计，在两者中间加入GGSG连接氨基酸。按照实施例的制备方法制备gB蛋白片段，经过His亲和层析和分子筛纯化，参照碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法进行蛋白定量，结果1L细胞可以表达获得BarthagBΔ150～548蛋白10mg、KaplangBΔ154～552蛋白10mg、BeckergBΔ147～545蛋白10mg。
实施例7猪伪狂犬病毒Bartha株、Kaplan株及Becker株亚单位疫苗的制备
分别取实施例6制备的猪伪狂犬病毒Bartha株、Kaplan株及Becker株gB蛋白片段，参照实施例4的制备方法制备亚单位疫苗。具体配比见表9。
表9Bartha株、Kaplan株及Becker株亚单位疫苗成分配比
疫苗5 疫苗6 疫苗7
Bartha(μg/ml) 50 0 0
Kaplan(μg/ml) 0 50 0
Becker(μg/ml) 0 0 50
206佐剂(V/V％) 50 50 50
实施例8猪伪狂犬病毒Bartha株、Kaplan株及Becker株亚单位疫苗的免疫原性试验
将21日龄PRV抗体阴性仔猪20头随机分成5组，4头/组，即1-3组分别为本发明实施例7制备的疫苗5、疫苗6、疫苗7，第4组和第5组注射等量的PBS，单次免疫。免疫后28日后攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株2×108.0TCID50/头，攻击后7天内每天固定时间观察临床状况并测量体温。
结果在该攻毒剂量下第1-3免疫组4只仔猪均获得保护，出现短暂临床体征在5天后逐步恢复正常，最终存活；第4组在攻毒后2天死2头，3天全部死亡，有明显的临床体征；第5组存活，无异常现象发生。攻毒保护结果见表10。
表10Bartha株、Kaplan株及Becker株亚单位疫苗免疫仔猪后攻毒保护结果
组别 免疫方式 免疫剂量 仔猪数 攻毒剂量 存活数 保护率(％)
1 皮下免疫 2mL 4 2×108.0TCID50 4 100
2 皮下免疫 2mL 4 2×108.0TCID50 4 100
3 皮下免疫 2mL 4 2×108.0TCID50 4 100
4 皮下免疫 2mLPBS 4 2×108.0TCID50 0 0
5 皮下免疫 2mLPBS 4 — 4 —
体温升高情况见表11，疫苗免疫组体温升高天数平均为1-1.25天，低于通常gB蛋白免疫后攻毒体温升高天数平均值3天。通过比较各疫苗的免疫效力临床评判结果相关性，可以看出疫苗5、疫苗6和疫苗7具有良好的免疫效果，也同时证明了本发明选取的猪伪狂犬病毒gB蛋白片段抗原位点具有良好的免疫原性具有普遍意义。
表11Bartha株、Kaplan株及Becker株亚单位疫苗免疫仔猪后体温升高情况
组别 A(天) B(天) C(天) D(天) 平均值(天)
1 1 1 2 1 1.25
2 1 2 1 1 1.25
3 1 1 1 1 1
5 0 0 0 0 0
实施例9猪伪狂犬病毒gB蛋白片段和gD蛋白串联表达
1.gB蛋白片段和gD蛋白串联表达供体质粒的构建
以实施例1抽提的猪伪狂犬病病毒HN1201株核酸为模板，参照实施例1中的PCR体系及条件，利用引物gD18F：AGGAATTCAGGCGGACGTGGACGCCGTGCCCGCG和
gD353R：CCAAGCTTCTAGTGATGGTGATGGTGATGGTGATGGCGGTGGCGCGAGACGCCCGGCG，扩增gD基因，PCR产物利用EcoRI+HindIII进行双酶切，与同样双酶切的pFastBacI进行连接，连接产物转化DH5α，获得的阳性质粒命名为pFastBac-HNgD。
以pFastBac-HNgD为模板，利用引物GP67F(XhoI)和HNgD353R(NheI)进行PCR，PCR体系和条件参照实施例1，回收的PCR产物用XhoI和NheI进行双酶切，与经同样双酶切的pFastBac-Dual载体进行连接，连接获得的阳性克隆标记为pFastBac-gD。
GP67F(XhoI)：ccgctcgagATGCTACTAGTAAATCAGTCACACCAAGGCHNgD353R(NheI)：CTAgctagcCTAGTGATGGTGATGGTGATGGCGGTGGCGC
将实施例1制备的pFastBac-HNgBΔ148～546通过BamHI和HindIII双酶切回收，与经过同样双酶切的pFastBac-gD进行连接，鉴定的阳性质粒为pFastBac-gD-gBΔ148～546。
2.重组Bacmid的构建
将2μlpFastBac-gD-gBΔ148～546质粒加入DH10Bac感受态细胞，轻弹混匀，冰上孵育30min，42℃热激60s，冰上孵育5min后加入400μl的SOC培养基于37℃、200rpm培养4h，取100微升菌液涂布于含有IPTG/X-gal/卡那/四环/庆大三抗平板,37℃培养至少48h，待蓝白菌落明显时挑取白色单一菌落至5ml卡那/四环/庆大三抗液体LB培养基摇菌过夜。次日取1μl作为模板进行菌液PCR鉴定。PCR产物大小为2560bp+，使用天根质粒小提试剂盒中试剂进行重组Bacmid的提取，命名为Bac-HNgD-gBΔ148～546。
3.重组杆状病毒的获得及传代
将重组BacmidBac-HNgD-gBΔ148～546转染昆虫细胞sf9。参照IIRegent说明书进行转染，转染后72h待细胞病变后，收获细胞上清标记为rBac-HNgD-gBΔ148～546P1。
将对数生长期的sf9细胞按照0.9×106cell/dish接种10cm细胞培养皿，待细胞完全贴壁后，将P1代重组杆状病毒按1:20-1:40的体积比加入铺好sf9的细胞培养皿中，27℃培养继续培养，直到72h左右细胞病变明显时，收获上清标记为P2代重组杆状病毒，用锡箔纸包裹避光保存在4℃冰箱备用。重复此步骤按照1:100-200接种获得P3、P4代重组杆状病毒。
4.蛋白的表达
将传至P4的重组病毒按照1:5～1:10的体积比接种Hi5细胞1L，接种48h左右收获细胞，离心获得的上清进行WesternBlot确认目的蛋白得到表达。经过His亲和层析和分子筛纯化，参照碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法进行蛋白定量，结果1L细胞可以表达获得HNgBΔ148～546+gD蛋白15mg。
本发明的HNgBΔ148～546+gD蛋白也可分别表达HNgBΔ148～546蛋白片段和gD蛋白，纯化后按比例将两种蛋白混合制备抗原。
实施例10猪伪狂犬病毒gB蛋白片段和gD蛋白串联表达亚单位疫苗的制备
取实施例9制备的猪伪狂犬病毒gB蛋白片段和gD，参照实施例4的制备方法制备亚单位疫苗。具体配比见表12。
表12猪伪狂犬病毒gB蛋白片段和gD蛋白串联表达亚单位疫苗成分配比
疫苗8 疫苗9 疫苗10
gBΔ148～546+gD(μg/ml) 25 50 100
206佐剂(V/V％) 50 50 50
实施例11猪伪狂犬病毒gB蛋白片段和gD蛋白串联表达亚单位疫苗免疫原性试验
将21日龄PRV抗体阴性仔猪20头随机分成5组，4头/组，即1-3组分别为本发明实施例10制备的疫苗8、疫苗9、疫苗10，第4组和第5组注射等量的PBS，单次免疫。免疫后28日后攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株2×108.0TCID50/头，攻击后7天内每天固定时间观察临床状况并测量体温。
结果在该攻毒剂量下第1-3免疫组4只仔猪均获得保护，出现短暂临床体征在5天后逐步恢复正常，最终存活；第4组在攻毒后2天死2头，3天全部死亡，有明显的临床体征；第5组存活，无异常现象发生。攻毒保护结果见表13。
表13串联表达亚单位疫苗免疫仔猪后的攻毒保护结果
体温情况见表14，疫苗免疫组出现短暂体温升高情况。通过比较各疫苗的免疫效力临床评判结果相关性，可以看出疫苗8、疫苗9和疫苗10具有良好的免疫效果。
表14串联表达亚单位疫苗免疫仔猪后体温情况
组别 A(天) B(天) C(天) D(天) 平均值(天)
1 1 1 1 0 0.75
2 0 1 0 1 0.5
3 0 1 1 0 0.5
5 0 0 0 0 0
实施例12猪伪狂犬病毒gB蛋白片段和gD蛋白融合表达
1.gB蛋白片段和gD蛋白融合表达供体质粒的构建
以实施例1制备的pFastBac-gBΔ148～546和实施例9制备的pFastBac-gD为模板，利用引物gBF和gBDR1、gBDF2和gD353R分别扩增获得gBΔ148～546和gD，利用引物gBF和gD353R将这个两个片段通过overlappingPCR连在一起，PCR产物标记为HNgBΔ148～546/gD；PCR产物通过BamHI和HindIII双酶切后与经同样双酶切的pFastBacI载体相连，构建的阳性质粒命名为pFastBacHNgBΔ148～546/gD。
gBF:AGGAATTCAGACGCGGGCCGCCTCGGCCTCGC
gBDR1:CGTCCACGTCCGCCGTCAGGTTCAGGGTCACCCGCG
gBDF2：CTGAACCTGACGGCGGACGTGGACGCCGTGCCCG
gD353R:CCAAGCTTCTAGTGATGGTGATGGTGATGGTGATGGCGGTGGCGCGAGACGCCCGGCG
2.重组Bacmid的获得
将1-2μLpFastBacHNgBΔ148～546/gD质粒转化DH10Bac，转化方法参照进行，涂布于卡那/四环/庆大三抗LB平板上，37℃培养相中培养48h左右，挑取白色菌落利用引物为M13F:CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG和M13R:AGCGGATAACAATTTCACACAGG进行PCR鉴定。利用天跟生化科技有限公司质粒抽提试剂盒中的试剂抽提Bacmid，命名为Bac-HNgBΔ148～546/gD。
3.重组杆状病毒的获得及传代
将重组BacmidBac-HNgBΔ148～546/gD转染进昆虫细胞sf9。参照IIRegent说明书进行转染，转染后72h待细胞病变后，收获细胞上清标记为vBac-HNHNgBΔ148～546/gDP1。
将对数生长期的sf9细胞按照0.9×106cell/dish接种10cm细胞培养皿，待细胞完全贴壁后，将P1代重组杆状病毒按1:20-1:40的体积比加入铺好sf9的细胞培养皿中，27℃培养继续培养，直到72h左右细胞病变明显时，收获上清标记为P2代重组杆状病毒，用锡箔纸包裹避光保存在4℃冰箱备用。重复此步骤按照1:100-200接种获得P3、P4代重组杆状病毒。
4.蛋白的表达
将传至P4的重组病毒按照1:5～1:10的体积比接种Hi5细胞1L，接种48h左右收获细胞，离心获得的上清进行WesternBlot确认目的蛋白得到表达。经过His亲和层析和分子筛纯化，参照碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法进行蛋白定量，结果1L细胞可以表达获得HNgBΔ148～546/gD蛋白5mg。
实施例13猪伪狂犬病毒gB蛋白片段和gD蛋白融合表达亚单位疫苗的制备
取实施例12制备的猪伪狂犬病毒融合蛋白HNgBΔ148～546/gD，参照实施例4的制备方法制备亚单位疫苗。具体配比见表15。
表15猪伪狂犬病毒gB蛋白片段和gD蛋白融合表达亚单位疫苗成分配比
疫苗11 疫苗12 疫苗13
gBΔ148～546/gD(μg/ml) 25 50 100
206佐剂(V/V％) 50 50 50
实施例14猪伪狂犬病毒gB蛋白片段和gD蛋白融合表达亚单位疫苗免疫原性试验
将21日龄PRV抗体阴性仔猪20头随机分成5组，4头/组，即1-3组分别为本发明实施例13制备的疫苗11、疫苗12、疫苗13，第4组和第5组注射等量的PBS，单次免疫。免疫后28日后攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株2×108.0TCID50/头，攻击后7天内每天固定时间观察临床状况并测量体温。
结果在该攻毒剂量下第1-3免疫组4只仔猪均获得保护，出现短暂临床体征在5天后逐步恢复正常，最终存活；第4组在攻毒后2天死2头，3天全部死亡，有明显的临床体征；第5组存活，无异常现象发生。攻毒保护结果见表16。
表16融合表达亚单位疫苗免疫仔猪后的攻毒保护结果
组别 免疫方式 免疫剂量 仔猪数 攻毒剂量 存活数 保护率(％)
1 皮下免疫 2mL 4 2×108.0TCID50 4 100
2 皮下免疫 2mL 4 2×108.0TCID50 4 100
3 皮下免疫 2mL 4 2×108.0TCID50 4 100
4 皮下免疫 2mLPBS 4 2×108.0TCID50 0 0
5 皮下免疫 2mLPBS 4 — 4 —
体温情况见表17，疫苗免疫组出现短暂体温升高情况。通过比较各疫苗的免疫效力临床评判结果相关性，可以看出疫苗11、疫苗12和疫苗13具有良好的免疫效果。
表17融合表达亚单位疫苗免疫仔猪后体温情况
组别 A(天) B(天) C(天) D(天) 平均值(天)
1 1 0 1 1 0.75
2 1 1 0 0 0.5
3 0 1 0 1 0.5
5 0 0 0 0 0
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种猪伪狂犬病病毒gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段，其中，所述gB蛋白片段氨基酸包括位点以SEQIDNO：2所示的猪伪狂犬病病毒HN1201株gB蛋白序列为基准，gB蛋白约第62位至148位氨基酸所示序列和/或约第546位至700位氨基酸所示序列，所述gB蛋白片段能保持与所述gB蛋白的抗原活性；
所述变异体或其活性片段的氨基酸序列中与所述gB蛋白片段的氨基酸序列相比存在一个或几个保守性氨基酸替换、添加或删除而仍能保持与所述gB蛋白片段的抗原活性。
2.根据权利要求1所述猪伪狂犬病病毒gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段，其中，所述gB蛋白片段包含所述猪伪狂犬病病毒HN1201株gB蛋白第62位至148位氨基酸所示序列和/或第546位至700位氨基酸所示序列；或
所述gB蛋白片段包含猪伪狂犬病病毒Bartha株gB蛋白第62位至150位氨基酸所示序列和/或第548位至702位氨基酸所示序列；或
所述gB蛋白片段包含猪伪狂犬病病毒Kaplan株gB蛋白第62位至154位氨基酸所示序列和/或第552位至706位氨基酸所示序列；或
所述gB蛋白片段包含猪伪狂犬病病毒Becker株第62位至147位氨基酸所示序列和/或第545位至699位氨基酸所示序列。
3.根据权利要求1所述猪伪狂犬病病毒gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段，其中，所述gB蛋白片段氨基酸序列为SEQIDNO：4或SEQIDNO：6或SEQIDNO：8或SEQIDNO：10所示序列。
4.一种猪伪狂犬病病毒gB-gD蛋白，其中，所述gB-gD蛋白包括权利要求1～3所述的gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段以及gD蛋白，其中，优选地，所述gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段与gD蛋白串联表达或融合表达。
5.根据权利要求4所述的猪伪狂犬病病毒gB-gD蛋白，其中，所述gD蛋白氨基酸序列为SEQIDNO：12所示序列。
6.一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗，其中，所述亚单位疫苗包含免疫量的权利要求1～3所述gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段和药学上可接受的载体，优选地，所述gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段含量为25-100μg/ml，优选地，所述亚单位疫苗包括佐剂。
7.一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗，其中，所述亚单位疫苗包含免疫量的权利要求4或5所述gB-gD蛋白和药学上可接受的载体，优选地，所述gB-gD蛋白含量为25-100μg/ml，优选地，所述亚单位疫苗包括佐剂。
8.一种制备亚单位疫苗的方法，其中，所述方法包括：
1)克隆权利要求1～3所述gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段的核苷酸序列的步骤；
2)表达所述步骤1)的克隆核苷酸序列的步骤，得到所述gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段，以及
3)使用所述步骤2)获得的gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段，添加药学上可接受的载体以及佐剂，制备所述亚单位疫苗的步骤。
9.一种制备亚单位疫苗的方法，其中，所述方法包括：
1)克隆权利要求1～3所述gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段的核苷酸序列，克隆所述gD蛋白核苷酸序列的步骤；
2)串联表达或融合表达所述步骤1)的克隆核苷酸序列的步骤，得到所述gB-gD蛋白，以及
3)使用所述步骤2)获得的gB-gD蛋白，添加药学上可接受的载体以及佐剂，制备所述亚单位疫苗的步骤。
10.根据权利要求1-3任一项所述的gB蛋白片段、或其保守性变异体或其活性片段、权利要求4或5所述的gB-gD蛋白、权利要求6或7所述的猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗在制备预防和/或治疗猪伪狂犬病病毒相关疾病或由猪伪狂犬病病毒导致的感染的药物中的应用。
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