CN103509761A - 表达猪圆环病毒ⅱ型orf2基因的重组猪伪狂犬病毒毒株及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的重组猪伪狂犬病毒毒株，重组猪伪狂犬病毒（Herpesviridae）毒株，CCTCCNO：V201315。本发明将PCV2ORF2基因插入到通用载体PG中，构建了转移质粒PGO。PRVTK^-/gG^-/gE^-病毒接种80-90%融合的单层ST细胞，吸附2h，将质粒PGO转染ST细胞，利用蚀斑纯化技术获得重组病毒PGO株，免疫小鼠。结果显示，商品化PCV2灭活疫苗与重组病毒PGO株免疫组均能诱导鼠产生特异性的体液免疫应答，二者抗体效价明显高于DMEM培养液免疫组且差异显著（p<0.05)。小鼠淋巴细胞增殖实验表明PGO重组病毒免疫组特异性的细胞免疫应答高于PCV2灭活疫苗和DMEM培养液免疫组且差异显著（p<0.05)，并且其能抵抗PCV2强毒的攻击，表明该重组病毒有作为PCV2新型疫苗的潜力。

Description

表达猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的重组猪伪狂犬病毒毒株及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种表达猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因重组猪伪狂犬病毒PGO株的制备方法。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属，是目前为止发现的最小的脊椎动物病毒。PCV根据致病性、抗原性及核苷酸序列的不同分为PCV1和PCV2两种基因型。其中PCV1广泛存在于猪群但对其无致病性，基因组长度为1759bp。PCV2具有致病性，基因长度为1767bp或者1768bp，PCV2不仅是世界各国普遍存在的仔猪断奶后多系统衰竭征(PMWS)的致病病原，而且与猪皮炎和肾病综合征(PDNS)、母猪流产、猪繁殖障碍、肥猪炎性呼吸道病综合征(PRDC)及死亡综合征（SAMA）的发生具有重要关系。另外PCV2能够侵害淋巴系统从而引起猪体免疫抑制，继发感染猪流感、猪伪狂犬、猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟等病毒性传染病及多种细菌性传染病，从而使疫情变得更加严重，现阶段该病毒的广泛存在已给我国及全球其他国家的养猪业造成了严重的经济损失。目前国内外能有效防制本病的疫苗较少，因此，PCV2安全有效疫苗的研究对PCV2相关性疾病控制及根除具有重要意义。

PRV为疱疹病毒科α疱疹病毒亚科，基因组DNA庞大，为150 kbp，具有分子量大、宿主范围广、易于建立潜伏感染、可插入基因多等特性，具有以下优点：①病毒遗传背景清楚。②安全性好，现有的活疫苗株HB98及Bartha-K61等疫苗已应用多年且安全有效。⑤生产方法简单，成本较低，接种相对方便。③免疫期较长：PRV作为活病毒载体接种机体后主要以细胞免疫为主，故外源基因能够在体内进行持续表达。④宿主范围较广，猪、山羊、牛、绵羊、狗、猫、等多种动物均能感染PRV，故能够针对不同动物的研制不同的活载体疫苗以便控制该病的流行。⑥PRV对人无感染性，这些优点决定了PRV可以成为优良的活病毒载体。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组猪伪狂犬病毒毒株，分类命名：重组猪伪狂犬病毒，拉丁文学名：Herpesviridae。保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称：CCTCC，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学，保藏日期：2013年5月28日, 保藏编号CCTCC NO：V201315。

本发明的技术方案是：一种表达猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的重组猪伪狂犬病毒毒株，重组猪伪狂犬病毒（Herpesviridae）毒株，CCTCC NO：V201315。

所述的表达猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的重组猪伪狂犬病毒毒株的制备方法，包括设计与合成引物，增殖伪狂犬病毒，提取伪狂犬病毒DNA，转染，纯化，所述转染步骤如下：

（1）取100 μLTCID50为10^-6.125/0.1ml的PRV TK^-/gG^-/gE^-病毒接种到六孔板中并用DMEM培养液补至350μL，置细胞培养箱中吸附2h，每隔30min摇晃一次；

（2）将240 μl无血清培养基OPTI-MEM和10 μl  Lipofectamine 2000于EP管中混合均匀，得到溶液A；

（3）将4 μg去内毒素质粒PGO补OPTI-MEM至总体积250 μL并于EP管中混合均匀，孵育5min，得到溶液B；

（4）将溶液A和溶液B混合后在室温下静置20-30min，得到溶液C；

（5）将步骤（1）中六孔板中的细胞用无血清培养基冲洗两遍后，加入2 ml无血清培养基；

（6）将步骤（4）中溶液C逐滴加入六孔板中，摇动培养板，轻轻混匀，在37℃，体积浓度为5%的CO₂中保温5-6h；

（7）6h后，更换有血清的全培养基，37℃，5%CO₂中48-72h检测转染水平。

本发明的有益效果是：本发明将 PCV2 ORF2基因插入到通用载体PG中，构建了转移质粒PGO。PRV TK^-/gG^-/gE^-病毒接种80-90%融合的单层ST细胞，吸附2h，将质粒PGO转染ST细胞，利用蚀斑纯化技术获得重组病毒PGO株，免疫小鼠。结果显示，商品化PCV2灭活疫苗与重组病毒PGO株免疫组均能诱导鼠产生特异性的体液免疫应答，二者抗体效价明显高于DMEM培养液免疫组且差异显著（p<0.05)。小鼠淋巴细胞增殖实验表明PGO重组病毒免疫组特异性的细胞免疫应答高于PCV2灭活疫苗和DMEM培养液免疫组且差异显著（p<0.05)，并且其能抵抗PCV2强毒的攻击，表明该重组病毒有作为PCV2新型疫苗的潜力。

附图说明

图1为PGO重组质粒构建流程图；

图2为重组质粒PGO中ORF2基因的PCR扩增，M. DNA Marker DL2000; 1.PCR产物C.阴性对照；

图3为重组质粒PGO的酶切鉴定图，M. DNA Marker λ-EcoT 14 Ⅰdigest; 1.BamHⅠ酶切产物; m. DNA marker DL2000；

图4为重组质粒PGO的酶切鉴定图，M. DNA Marker λ-EcoT 14 Ⅰdigest; 1. BspT104Ⅰ和KpnⅠ酶切; m. DNA marker DL2000；

图5为三轮空斑筛选后得到的单克隆；

图6为单克隆重组病毒传代15次后观察到的绿色荧光照片；

图7为重组病毒的PCR鉴定，M. DNA Marker DL2000; 1-10.PCR产物; C.阴性对照；

图8为PCV2攻毒后三组小鼠内脏PCR检测结果，1-5:PGO重组病毒免疫组；6-10：DMEM培养液免疫组组；11-15:PCV2灭活苗免疫组C:阴性对照。

具体实施方式

一种表达猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的重组猪伪狂犬病毒毒株，重组猪伪狂犬病毒（Herpesviridae）毒株，CCTCC NO：V201315。

所述的表达猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的重组猪伪狂犬病毒毒株的制备方法，包括设计与合成引物，增殖伪狂犬病毒，提取伪狂犬病毒DNA，转染，纯化，所述转染步骤如下：

（1）取100 μLTCID50为10^-6.125/0.1ml的PRV TK^-/gG^-/gE^-病毒接种到六孔板中并用DMEM培养液补至350μL，置细胞培养箱中吸附2h，每隔30min摇晃一次；

（2）将240 μl无血清培养基OPTI-MEM和10 μl  Lipofectamine 2000于EP管中混合均匀，得到溶液A；

（3）将4 μg去内毒素质粒PGO补OPTI-MEM至总体积250 μL并于EP管中混合均匀，孵育5min，得到溶液B；

（4）将溶液A和溶液B混合后在室温下静置20-30min，得到溶液C；

（5）将步骤（1）中六孔板中的细胞用无血清培养基冲洗两遍后，加入2 ml无血清培养基；

（6）将步骤（4）中溶液C逐滴加入六孔板中，摇动培养板，轻轻混匀，在37℃，体积浓度为5%的CO₂中保温5-6h；

（7）6h后，更换有血清的全培养基，37℃，5%CO₂中48-72h检测转染水平。

一、猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因重组猪伪狂犬病毒活载体的构建

1 材料与方法

1.1 试验材料

质粒pGEMT-ORF2和PG质粒（载体）购自河南省动物性食品安全重点实验室，伪狂犬弱毒株购自武汉科前生物制品公司。DNA Marker DL2000、Premix Ex Taq DNA聚合酶、T₄ DNA连接酶、BamHI、HindⅢ、BglⅡ限制性内切酶等购自宝生物工程（大连）有限公司；BIOMIGA无内毒素质粒提取试剂盒购自郑州赛斯生物科技有限公司；AXYGEN DNA凝胶回收试剂盒购自郑州天驰生物科技有限公司；Lipofectamine^TM 2000 Reagent 购自Invitrogen公司；胎牛血清、无双抗DMEM培养液、OPTI-MEM无血清培养液购自Hyclone公司。

1.2.1重组质粒PGO的构建技术示意图（图1）

1.2.1.1  引物设计与合成

根据重组质粒pGEMT-ORF2中ORF2基因阅读框架设计1对ORF2全基因引物，上、下游引物的5’包含有BamHI酶切位点(下划线部分)，扩增目的基因片段长度约0.7 kb。由上海生物工程有限公司合成该引物。

上游引物序列：5’- GAGGATCCATGACGTATCCAAGG-3’，

下游引物序列：5’-GCGGATCCCATTCATTAAGGGTTA-3’

1.2.1.2 PG质粒的酶切和去磷酸化

PG质粒用BamHⅠ进行酶切并用CIAP对酶切产物进行去磷酸化处理，体系如下：10× buffer  5 μL；酶切后的PG溶液  30 μL； CIAP  1 μL；ddH₂O  14 μL；总体积50 μL，上述混合物振荡均匀，在37℃水浴锅中作用30 min后置4℃冰箱过夜，之后用凝胶回收试剂盒回收载体（PG）。

1.2.1.3 外源片段(ORF2)的制备

体系如下：BamH I  1 μL；10×K Buffer  1 μL；质粒  5 μL；ddH₂O  3 μL，总体积10 μL，混合物瞬时离心后置于37℃水浴锅酶切3h，之后用凝胶回收试剂盒对ORF2目的片段进行胶回收。

1.2.1.4 载体(PG)与外源片段(ORF2)的连接

在10 μL体系中加入：Ligation buffer 1.0 μL；去磷酸化PG载体2.0  μL；外源ORF2基因 6.0 μL；T₄ DNA ligase  1.0 μL，总体积10 μL，混匀并于16℃连接槽中过夜。

1.2.1.5 连接产物的转化

取 DH5α感受态细胞50 μL，加入连接产物5 μL，冰浴30 min后，42℃热激90-120 s，再冰浴15 min，加950 μL不含抗生素的LB液体培养基，37℃ 250 r/min 振荡1 h，8000 rpm离心5 min后无菌弃去上清液，用100 μL液体重悬沉淀，均匀涂布在含Amp（50 μg/mL）的LB固体平板上，再涂上20 μL X-gal和4 μLIPTG混匀液，37℃培养箱中正放培养3h后倒置培养16 h。

1.2.1.6 重组质粒PGO的提取

从上述转化培养的平板中挑取单个白色菌落，接种于3 mL Amp+ LB液体培养基内，在37℃摇床培养过夜，用质粒提取试剂盒按照说明书进行质粒提取，提取的质粒其命名为PGO。

1.2.1.7 重组质粒PGO的鉴定

按质粒提取试剂盒按照说明书进行提取重组质粒，以重组质粒PGO为模板进行ORF2基因的PCR扩增检测，反应条件为：预变性94 ℃5min；95 ℃1 min，58 ℃1 min，72℃1 min，30个循环；最后72℃再延伸10min。用BamHI酶对质粒PGO进行酶切鉴定。用KpnⅠ酶和BspT104Ⅰ酶对重组质粒PGO中ORF2基因插入方向进行鉴定。将PCR和酶切鉴定均为阳性并且插入方向也正确的PGO质粒送至华大基因有限公司进行测序。

1.2.2 PRV的增殖及病毒DNA的提取

ST细胞长至单层后，弃去营养液并用清洗两遍，加入100μL PRV病毒液和0.5mLD’Hanks液，放至37℃温箱吸附作用1h，其间每隔15min轻摇使病毒吸附均匀，倾去瓶内液体后加入2%DMEM维持液，置于37℃温箱继续培养；待80％左右的细胞发生病变(CPE)时弃去维持液，

加1 mL细胞裂解液和50μL蛋白酶K(10μg/mL)，摇振混匀后置55℃作用1～3 h，其间摇匀数次以消化均匀，之后将混合液转入至1.5mL Eppendorf管，按常规方法抽提PRV基因组。

取2μL DNA用紫外分光光度计测量PRV病毒DNA浓度直至为1μg/μL。

1.2.3 转染

用BIOMIGA无内毒素质粒小提试剂盒提取质粒PGO至1 μg/μL备用。复苏细胞，转染前24 h按常规方法将ST细胞传至第三代，将细胞悬液加到6孔板中，待细胞长至90％左右时进行转染。

参照脂质体Lipofectamine^TM 2000试剂盒转染说明书进行共转染，优化条件后按以下步骤进行：

（1）取100 μLTCID50为10^-6.125/0.1ml的PRV TK^-/gG^-/gE^-病毒接种到六孔板中并用DMEM培养液补至350μL，置细胞培养箱中吸附2h，每隔30min摇晃一次；

（2）将240 μl无血清培养基OPTI-MEM和10 μl  Lipofectamine 2000于EP管中混合均匀，得到溶液A；

（3）将4 μg去内毒素质粒PGO补OPTI-MEM至总体积250 μL并于EP管中混合均匀，孵育5min，得到溶液B；

（4）将溶液A和溶液B混合后在室温下静置20-30min，得到溶液C；

（5）将步骤（1）中六孔板中的细胞用无血清培养基冲洗两遍后，加入2 ml无血清培养基；

（6）将步骤（4）中溶液C逐滴加入六孔板中，摇动培养板，轻轻混匀，在37℃，体积浓度为5%的CO₂中保温5-6h；

（7）6h后，更换有血清的全培养基，37℃，5%CO₂中48-72h检测转染水平。

1.2.4 重组病毒的空斑筛选与纯化

ST细胞长至单层后，收获重组病毒后反复冻融3次，吸取100 μL，用DMEM培养液作10倍梯度稀释，分别将10^-1、l0^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀释度的病毒液取400μL接种到六孔板中，置于37℃细胞培养箱内吸附1.5h，吸弃孔内培养液，用PBS液清洗三次，每孔加入低溶点营养琼脂琼脂糖2 mL，琼脂糖凝固后放入细胞培养箱中培养2天，在荧光显微镜的蓝光(波长420-490 nm)下能观察到绿色和无特殊荧光颜色的两种病毒蚀斑，在荧光显微镜下用巴氏吸管小心吸取绿色蚀斑，加入少量DMEM维持液并在无菌操作台中捣碎琼脂块，-20℃反复冻融三次后收毒。将收获的病毒液接种到含单层ST细胞的24孔细胞培养板内，置于细胞培养箱中至90％以上的细胞发生病变，收获24孔板放于-20°C并反复冻融3次。提取冻融后的病毒液DNA，进行PCR扩增，选择PCR阳性的病毒空斑进行下一轮的蚀斑纯化。

1.2.5 重组病毒在ST、VERO、lBRS-2、PK细胞上的培养特性

待ST、VERO、lBRS2、PK细胞长成单层后，按1%的接毒量分别接种四种细胞，吸附1.5h后，换成2%的维持液，放至细胞培养箱中培养，在接毒后8h、12h、24h、36h、48h用倒置荧光显微镜观察细胞形态及病毒感染细胞后的荧光情况。

1.2.6 重组病毒在多种细胞上毒价的测定

用ST细胞增殖的重组病毒进行TCID50测定，将ST细胞、IBRS-2细胞、PK细胞和VERO细胞接种到96孔微量培养板中，待细胞长至90%单层时进行试验。方法如下：将重组病毒用DMEM培养液在无菌Ep管中作l0倍梯度稀释，即从10^-1-10^-10。将各个稀释梯度的病毒接种到96孔微量培养板，每个稀释度作8孔重复，每孔接种100μL，病毒吸附2h后，每孔再加入100μLDMEM培养液。同时将两纵排孔做为正常细胞对照，置细胞培养箱中培养，逐同观察并且记录结果，数据按照Reed-Muench两氏法进行TCID50效价评定。

1.2.7 重组病毒PGO株的安全性研究 

注射小鼠：选30只PRV、PCV2血清学检测均为阴性的6-8周龄健康昆明小鼠分别用重组病毒0.2ml(含毒量：2×10⁵PFU)肌肉注射，隔离后人工饲养。逐日观察小鼠的精神、食欲。

1.2.8 重组病毒的理化特性研究

取3ml重组病毒平均分成6份（每份500μL）分别用氯仿、胰蛋白酶处理10min、5%石碳酸处理2min、1%氢氧化钠处理10min、平摊到无菌培养皿中用紫外线照射30min，剩余的1份不做任何处理作为阳性对照，各取100μL接种到长满ST细胞的细胞培养瓶中，并逐日观察细胞病变情况。

1.2.9 RT-PCR检测mRNA含量

将纯化的重组病毒液接种到致密ST细胞单层细胞中，待80%以上细胞出现病变时收毒，-20度与常温反复冻融3次后，按照DNA提取方法进行DNA提取，并按照RNA提取试剂盒方法进行细胞总RNA的抽提，反转录后进行PCR扩增以检测猪圆环病毒2型ORF2基因在ST细胞中的转录。

1.2.10 细胞中ORF2蛋白表达的检测

采用免疫过氧化物酶单层细胞试验（Immunoperoxidase monolayer assay，IPMA）进行检测。将ST细胞传至96孔板上，待细胞长至90%左右每孔接10倍稀释的重组病毒100μL，同时设未接毒细胞对照。细胞培养箱中吸附2h后加入含2%胎牛血清的DMEM维持液。24h后吸弃培养液并用PBS液清洗三遍，置37℃温箱干燥10min。再用4℃预冷的4%甲醛液固定10min，PBS清洗三遍。将阳性血清用PBST-BSA液按1:50稀释，并设阴性血清对照孔，每孔加液100 μL，37℃湿盒孵育1h，再用PBST洗5次。加入用PBST-BSA 1:200稀释的HRP-SPA，同样每孔加100 μL，再置37℃湿盒孵育1h，取出后用PBST洗5次。每孔加入50 μL AEC显色液避光作用15min，用PBST洗涤两次后用显微镜进行结果观察。

1.2.11 遗传稳定性评价

将获得的单克隆重组病毒在ST细胞中传至第15代，观察其在细胞中绿色荧光表达情况，待细胞出现80%病变时进行收毒，反复冻融3次后，提取重组病毒DNA，用猪圆环病毒2型ORF2基因PCR扩增条件进行PCR扩增鉴定，并对PCR产物进行基因克隆，测序工作由华大基因科技有限公司完成。

2 结果与分析

2.1 重组质粒PGO的鉴定

用ORF2特异性引物对重组质粒PGO进行PCR扩增，电泳检测结果显示在约0.7kb处有清晰条带，与预期结果相符（图2）。重组质粒PGO用BamH I酶切后，出现了2条带，其中1条为插入的目的条带，位置约为0.7kb，另外1条为载体条带，位置约为7.1kb，与预期结果相符（图3）。重组质粒PGO用KpnⅠ酶和BspT104Ⅰ酶双酶切后会出现3条带，若方向正确则第三条条带大小约为1.1 kb（图4），若方向错误则在1.5 kb出现一条亮带。测序报告序列为702bp，与以前本实验室登陆的序列相比（HQ693093），完全序列一致。

2.2 重组病毒绿色荧光鉴定及空斑筛选

将重组病毒液按10倍系列稀释后接种ST细胞，覆盖营养琼脂以进行蚀斑筛选。转染16后，重组转移质粒PGO与PRV发生同源重组，重组病毒带有EGFP基因，表达绿色荧光蛋白，在荧光显微镜下能观察到绿色荧光。试验表明条件优化前转染效率较低，荧光量较少，优化条件后转染效率大大提高，能观察到大量绿色荧光。 

将PCR阳性病毒液按10系列稀释后接种六孔板并覆盖营养琼脂，进行蚀斑筛选纯化，通过3轮蚀斑纯化后获得单克隆空斑（图5）。

2.3 重组病毒PGO株在不同细胞上的培养增殖特性观察

2.3.1 重组病毒PGO株在ST细胞上的培养增殖特性观察

将PRV PGO株接种到长满ST单层细胞，8h后观察无明显病变，倒置荧光显微镜下不能观察到绿色荧光，12h后能观察到细胞圆缩，在倒置荧光显微镜下能观察到轻微的绿色荧光，24h后细胞明显圆缩，在倒置荧光显微镜视野内能观察到大量绿色荧光，36h后大量细胞脱落，此时倒置荧光显微镜内能观察到许多漂浮状的绿色荧光，48h后细胞脱落85%左右，仅能观察到少量的绿色荧光。

2.3.2 重组病毒PGO株在PK细胞上的培养增殖特性

PRV PGO株接种单层PK细胞8h后，细胞无明显病变且在倒置荧光显微镜下不能观察到绿色荧光，12h后细胞圆缩、变亮且能观察到少量绿色荧光，24h后大量细胞变形、并出现PRV特征性空泡病变，细胞面拉网现象明显，倒置荧光显微镜下能观察到大量绿色荧光，36h后细胞明显融合、约70%的细胞发生脱落，观察到的绿色荧光减少，48h后细胞基本脱落完全，仅能观察到少量绿色荧光。

2.3.3 重组病毒PGO株在VERO细胞上的培养增殖特性

PRV PGO株接种单层VERO细胞8h即出现病变，表现为细胞轮廓模糊、圆缩、变亮，但是倒置荧光显微镜下并不能观察到绿色荧光；12h表现为细胞中等融合并呈多形性，倒置荧光显微镜下能观察到少量绿色荧光。36h细胞表现为大融合，出现多量PRV特征性空泡病变，视野内呈现拉网状，此时用倒置荧光显微镜能够观察到大量的绿色荧光；48h细胞形成岛屿状堆聚，并表现为块状脱落，倒置荧光显微镜下能观察到团块状绿色荧光。

2.3.4 重组病毒PGO株在IBRS-2细胞上的培养增殖特性

PRV PGO株接种IBRS-2细胞单层细胞8h后能观察到细胞呈多形性，但是倒置荧光显微镜下并不能观察到绿色荧光，12h细胞肿胀、变亮、变圆，能观察到少量绿色荧光；24h细胞融合，PRV特征空泡病变，倒置荧光显微镜下能观察到大量绿色荧光；36h细胞出现大面积脱落，倒置荧光显微镜下能观察到零星绿色荧光；48h细胞基本脱落完全，倒置荧光显微镜下仅能观察到少量绿色荧光。

2.4  重组病毒PGO株在多种细胞上TCID50测定结果

重组病毒在ST、PKl5、VERO及IBRS-2细胞上的增殖滴度分别为10^6.125/0.1ml、10^4.125/0.1ml、10^4.625/0.1ml、10^6.25/0.1ml，结果表明重组病毒在IBRS-2细胞和ST细胞上的增殖滴度与疫苗亲本毒株的增殖滴度（10^6.125/0.1ml）相似，而PK细胞和VERO细胞增殖滴度较低，故ST细胞和IBRS-2细胞更适合重组病毒的大量培养。

2.5 重组病毒的理化特性研究

重组病毒用氯仿、胰蛋白酶处理10min、5%石碳酸处理2min、紫外线照射30min、1%氢氧化钠处理10min均能使病毒失去活性，接种ST细胞后不引起任何细胞病变，而对照组接种ST细胞后12h即能观察到绿色荧光并在24h左右出现特征性空泡病变。

2.6 重组病毒PGO株的安全性研究结果

注射后ld和2d有个别发生应激，精神状况和食欲均有所下降，但是注射后3-4d后精神状况、食欲恢复正常，试验结果表明该重组病毒PGO株对小鼠是安全的。

2.7 重组病毒DNA的PCR结果

提取重组病毒DNA并进行PCR扩增、电泳，出现1条长约702bp的特异条带，与预期的目的条带大小一致。

2.8 表达PCV2 ORF2基因的重组病毒的鉴定

2.8.1 RT-PCR结果

从重组病毒感染的病变细胞中提取总RNA，用猪圆环病毒2型ORF2基因的特异性引物进行RT-PCR扩增。结果表明，获得1条约705bp的的特异性带，与预期扩增大小相一致。

2.8.2 IPMA结果 

用重组病毒感染细胞与健康细胞进行IPMA方法检测，结果表明PCV2阳性血清能够与重组病毒感染的细胞发生反应并呈现棕红色，而对照组健康细胞反应则不着色，该实验结果表明重组病毒表达了特异性PCV2 ORF2蛋白。

2.9 遗传稳定性评价

获得的单克隆重组病毒在ST细胞中传15代后依然有绿色荧光存在(如图6），随机挑取10个空斑进行ORF2基因的PCR扩增鉴定，结果10个空斑均扩出了ORF2目的基因片段，证实传代后的重组病毒含有ORF2基因（如图7）。并对PCR产物送至华大基因公司进行测序测定，测序结果与通用质粒中ORF2基因序列一致（Genbank登录号：HQ693092），上述结果表明携带了ORF2基因的重组病毒遗传稳定。重组病毒ORF2基因RT-PCR的核苷酸测序结果如下：

atgacgtatc  caaggaggcg  ttaccggaga  agaagacacc  gcccccgcag  ccatcttggc  60

cagatcctcc  gccgccgccc ctggctcctc cacccccgcc accgttaccg ctggagaagg 120

aaaaatggca tcttcaacac  ccgcctctcc cgcaccttcg gatatactat caagcgaacc 180

acagtcaaaa cgcccccctg ggcggtggac atgatgagat tcaatattaa tgactttctt  240

cccccaggag ggggctcaaa cccccgctct gtgccctttg aatactacag aataagaaag  300

gttaaggttg aattctggcc ctgctccccg atcacccagg gtgacagggg agtgggctcc  360

agtgctgtta ttctagatga taactttgta acaaaggcca cagccctcac ctatgacccc  420

tatgtaaact actcctcccg ccataccata acccagccct tctcctacca ctcccgctac  480

tttaccccca aacctatcct agattccact attgattact tccaaccaaa caacaaaaga  540

aatcagctgt ggctgagact acaaactgct ggaaatgtag accacgtagg cctcggcact  600

gcgttcgaaa acagtatata cgaccaggaa tacaatatcc gtgtaaccat gtatgtacaa  660

ttcagagaat ttaatcttaa agaccccccc cttaaccctt aa                     702

3 结论与讨论

3.1 关于构建猪圆环病毒II型ORF2基因重组猪伪狂犬活载体病毒的思路

猪圆环病毒可引起猪呼吸道综合征、仔猪断奶后多系统衰竭综合征、猪增生和坏死性肺炎、猪皮炎与肾病综合征、先天性震颤、繁殖障碍等多种疾病，其中PMWS最早是1991年由Clark EG首次报道, 随后法国、北爱尔兰、美国、墨西哥等国也确认了该病的存在，并且现阶段我国大多数地区的各类猪群中也普遍存在PCV2感染。PCV2全病毒能够在PK-15细胞上进行增殖，但增殖滴度较低，须借助间接免疫荧光试验（IFA）和免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）进行毒价测定，故使用制备全病毒灭活疫苗技术难度大、操作繁琐、成本较高。所以DNA疫苗、亚单位疫苗及病毒活载体疫苗的研制成为防制猪圆环病毒病的重要方向。亚单位疫苗生产成本较高、DNA疫苗存在安全隐患及嵌合病毒疫苗的滴度较低，本实验所选取的病毒活载体疫苗研究更能满足未来疫苗的发展要求。

3.2  关于PCV2病毒的抗原性基因的利用

PCV2有2个主要的阅读框：ORF1和ORF2。其中ORF1开放阅读框架位于正链（病毒基因组链）上并以顺时针方向排列，该阅读框编码与病毒复制相关的Rep蛋白；ORF2开放阅读框架位于负链( 病毒基因组互补链)上以逆时针方向排列，该阅读框编码病毒的结构蛋白（Cap蛋白），该蛋白为PCV2囊膜的主要成分，目前对ORF2的研究已成为PCV2研究的热点。McNeilly等研究结果表明ORF2表达的蛋白中含有PCV2病毒的中和抗原表位。Nawagitgul等将PCV2的ORF2基因进行克隆并使其在昆虫细胞中表达，电镜观察结果表明其表达产物能够自动组装为病毒核衣壳样粒子，此研究进一步证实了ORF2基因能够编码病毒核衣壳蛋白。故本研究选取了PCV2的ORF2基因作为免疫原性基因并将其克隆到了通用载体PG中。

3.3  关于转移质粒PGO的构建

一个良好的转移质粒必须具有较强的启动子、有效的Poly(A)及两端足够长的同源侧翼。本研究所构建表达绿色荧光蛋白gG 缺失的通用转移载体PG含有伪狂犬病病毒自身晚期基因gG启动子、hCMV、SV40 Poly(A)、上下游侧翼分别为0.8 kb和l.7 kb，完全可以满足同源重组的需要。本研究在gG基因启动子的下游BamHⅠ酶切位点处插入ORF2基因，成功构建了携带绿色荧光蛋白基因（GFP）的伪狂犬病毒基因缺失转移载体(PGO)，并在ST细胞上转染成功。

3.4 关于转染条件的优化

影响转染的因素很多，其中转移载体质粒（PGO）的提取极为重要，因为如果提取的质粒中含有大肠杆菌内毒素及质粒的纯度不高均能会大大降低转染效率，甚至导致转染失败，所以我们使用BIOMIGA无内毒素质粒小提试剂盒进行质粒的提取。目前主要的转染方法有电穿孔法、磷酸钙共沉淀法及脂质体法等，其中脂质体与生物膜有较大的相似性及组织相容性，具有毒性小、高效、操作相对简单、无污染的优点，并且同其它转染方法相比，其转染效率提高了十多倍，故本实验采用脂质体法转染。且由于脂质体对细胞膜有一定的损伤作用，故转染时间不宜太长，以4-6 h为宜，时间过长会导致ST细胞大批脱落和死亡，从而导致转染失败。此外，还要考虑细胞状态及脂质体与转移载体质粒之间的比例等因素，且六孔板转染体系中三者的最优比例为PRV DNA：PGO质粒：Lipofectamine^TM 2000为10μg:4μg:10μL。

3.5 关于重组病毒的空斑筛选

为实现外源ORF2基因的稳定整合表达，本实验利用脂质体和病毒性载体共转染的方式进行同源序列介导的基因重组，即将PRV疫苗株DNA与含有猪圆环病毒ORF2基因的重组质粒PGO在ST细胞上通过脂质体转染系统进行同源序列重组。通过在荧光显微镜下进行的挑斑技术挑取单个绿色荧光蚀斑，通过3轮蚀斑纯化后获得了重组病毒单克隆毒株。单克隆毒株接种24孔板后各孔均能通过PCR扩增出携带的ORF2基因目的条带，结果证实了PCV2 ORF2目的基因己经成功整合到重组病毒基因组中，综上述我们获得了纯化的重组病毒，且PCV2的ORF2基因蛋白在重组病毒中得到了表达，并且具有生物学活性。纯化的重组病毒在ST、PKl5、VERO及IBRS-2细胞上的增殖滴度分别为10^6.125/0.1ml、10^4.125/0.1ml、10^4.625/0.1ml、10^6.25/0.1ml，结果表明重组病毒在IBRS-2细胞和ST细胞上的增殖滴度与疫苗亲本毒株的增殖滴度（10^6.125/0.1ml）相似，而PK细胞和VERO细胞增殖滴度较低，故ST细胞和IBRS-2细胞更适合重组病毒的大量培养。理化特性试验结果表明重组病毒具有PRV通性。

试验二 猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因重组猪伪狂犬病毒免疫效力观察

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

6周龄雌性昆明小鼠30只，购自河南省试验动物中心。

1.1.2 疫苗及毒种

猪圆环病毒灭活疫苗购自武汉科前生物制品公司；PCV2病毒HZ09保藏编号CCTCC NO：V201312及获得的伪狂犬活载体重组病毒PGO株保藏编号CCTCC NO：V201315。

PCV2病毒HZ09株由河南农业大学于2009年8月采自郑州某猪场疑似断奶后多系统衰竭综合征猪的淋巴结、肺脏和脾脏等组织分离。

1.1.3 主要试剂

海克隆DMEM细胞培养液、四季青胎牛血清购自郑州赛斯生物科技有限公司；淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司、猪圆环病毒II型ELISA检测试剂盒购自武汉科前生物制品公司、辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠IgG抗体购于北京博奥森生物技术发展公司。

1.2 动物分组免疫

将30只6周龄雌性小鼠随机分为3组，10只/组。其中A为重组病毒免疫组，B为PCV2疫苗免疫组，C为DMEM培养液免疫对照组，免疫途径均采用两后肢胫骨前肌多点注射100μl/只。免疫方案见表1。

表1  试验鼠分组及免疫情况

1.3 淋巴细胞增殖实验

1.3.1 淋巴细胞的提取

一免后第八周，三组均取5只小白鼠，脱臼处死，用75%酒精消毒后迅速移至无菌操作台；用剪刀和镊子无菌取脾脏并在研钵中研磨，加入2毫升PBS，用120目尼龙网过滤到小烧杯中；在离心管中加入2ml淋巴细胞分离液，并在其上部沿管壁缓慢加入脾细胞悬液，用水平离心机2000转/分离心10min；将中间层的淋巴细胞转移到干净离心管中；再用PBS液洗两次，1500转/分离心5min，弃去上清即得浓缩的淋巴细胞。

1.3.2 淋巴细胞增殖反应的检测（MTT比色法）

取提取的淋巴细胞用RPMI 1640溶液配成每毫升1×10⁶单细胞悬液，然后于96孔板中每孔加入200 μL，每只小鼠做3个孔，1孔为PCV2紫外灭活病毒刺激组，1孔细胞不添加任何刺激物，剩余的1孔只加培养液作为空白孔，置5% CO₂ 37 ℃培养箱（Thermo，371型）中培养36 h后进行测定。测定前4 h时每孔加入MTT 20 μL（5 mg/mL）继续培养，测定时各孔加入200μL的DMSO，充分震荡10 min（动作要轻柔，使结晶物溶解即可），5min内用酶联免疫检测仪（Thermo）测定OD490nm值。结果用刺激指数(stimulation index，SI)表示。SI=(刺激物OD值一空白OD值)／(细胞OD值一空白OD值)。检验比较各组间的统计学差异。

1.4 间接ELISA检测PCV2抗体水平

1.4.1 血清的制备

一免后3、4周每组随机抽取5只小鼠断尾采血，二次免疫（一免后第四周）后1、2、3、4周及攻毒（一免后第八周）后1、2周每组抽取5只小鼠断尾采血，分离的血清用武汉科前的圆环病毒II型ELISA检测试剂盒检测小鼠的抗体水平。

1.4.2 抗体检测

按照说明书用武汉科前的猪圆环病毒II型ELISA检测试剂盒进行小鼠血清抗体的检测，试剂盒中的酶标二抗用羊抗鼠辣根过氧化物酶标二抗替代。

1.5 攻毒保护试验

二免后第四周各组试验小鼠取五只用LY株PCV2强毒通过腹腔注射途径进行攻击，500μL/只，攻毒后第3周处死小鼠，取肺脏、脾脏组织提取DNA并进行PCV2病毒的PCR检测。

1.6 数据处理

用SPSS18.0 for Windows及Microsoft Excel统计软件将所得数据进行统计学处理，计算其平均值。

2 结果与分析

2.1 淋巴细胞增殖测定结果

二免后第四周每组取5只小鼠处死采集脾脏并分离淋巴细胞，并将经紫外线照射灭活的PCV2作为有丝分裂原，用以检测小鼠体内淋巴细胞的特异性增殖情况。结果表明重组病毒免疫组能够诱导小鼠产生特异性淋巴细胞增殖反应，与PCV2灭活疫苗组及阴性对照组相比，差异显著(p<0.05)（如表2）。

表2  PCV2特异性淋巴细胞增殖效应结果

组别	样本数	刺激指数均值	标准差	变异系数(C.V.)
					PGO重组疫苗组	5	3.30a	0.18	5.45
PCV2灭活苗组	5	1.01b	0.07	6.93
					DMEM培养液组	5	0.98b	0.05	5.10

2.2 ELISA检测结果

如表2所示，灭活疫苗组及重组病毒免疫组在一免后抗体与DMEM免疫组相比无明显变化；二免（第四周）后灭活疫苗组及重组病毒免疫组抗体水平基本一致，都呈现明显的上升趋势，至攻毒后第二周抗体水平升至最高，且显著高于DMEM培养液对照组(p<0.05)。上述结果表明该重组病毒在提高猪圆环病毒抗体水平方面较好的作用，但是起效较慢，需要二次免疫才能达到较好的效果。

表3  方阵滴定的OD值结果

2.3 攻毒保护试验 

攻毒后第三周每组处死5只小鼠，无菌取其脏器进行研磨及反复冻融后离心取上清，提取DNA后进行PCV2 ORF2基因PCR特异性扩增，结果如图8，即：DMEM组中的5只小鼠PCR结果均为阳性，表明其体内存在PCV2病毒；PCV2灭活疫苗免疫组和重组病毒PGO免疫组中均有2只扩出目的基因，每组剩余的3只结果均阴性，表明该重组病毒能够有效抵抗PCV2强毒的攻击。

3 结论与讨论

伪狂犬病毒有不感染人、宿主范围广、分子背景清楚、插入外源基因容量大等特点，因此适合将PRV改造为病毒表达载体。近年来国内己用PRV表达了猪细小病毒的VP2基因、乙脑病毒的NSl基因、猪瘟病毒的E2蛋白、口蹄疫的P1基因等多种基因，目前PRV基因缺失标志疫苗已经是推广应用非常成功的动物标志疫苗，并且其对PRV的根除计划也发挥着很大的作用。这种疫苗免疫动物后，能够利用血清学方法将野毒感染猪和疫苗免疫猪进行区分，这就为PRV的根除提供了有利条件。获得的重组疫苗是在现有的基因缺失标记弱毒疫苗中插入了PCV2 ORF2保护性抗原基因，这为应用基因缺失标记疫苗进行PRV根除的同时达到对PCV2相关疾病的免疫预防，从而达到一针两防的效果。

宋云峰博士将重组转移质粒与PRV TK-/gE-/LacZ+基因组共转染IBRS-2细胞获得了TK-/gE-/ORF2+重组病毒，猪体免疫试验表明，一免后三周内未检出PCV2特异性抗体，之后进行加强免疫，第七周在仔猪体内检测到了较高的PCV2特异性抗体，并且该重组病毒PCV2特异性淋巴细胞增殖效应明显高于另外两组对照组（P<0.05)；在本研究中，用重组病毒PGO株、PCV2灭活苗、DMEM培养液同时免疫小鼠，一免后PGO组四周内没有产生PCV2特异性抗体，产生抗体的时间较宋云峰博士延长，这可能是由于不同的重组病毒ORF2表达时机不同所致；一免后第六周（二免后第二周）PGO组和PCV2灭活苗组均可检测出较高水平的PCV2特异性抗体，这与宋云峰博士的试验结果一致。至一免后第七周（二免后第三周）PCV2灭活苗组抗体水平开始下降但PGO重组病毒免疫组抗体水平持续升高，这可能是有灭活疫苗和弱毒疫苗的免疫学特性决定的，也可能是疫苗剂量的差别引起的，但二者抗体水平始终与DMEM培养液免疫组差异显著（p<0.05)；一免后第八周（二免后第四周）的攻毒试验中PGO重组疫苗组和PCV2灭活苗免疫组抗体均迅速上升，二者抗体水平趋于相同且与DMEM培养液免疫组抗体水平差异显著（p<0.05)；攻毒试验两周后对小鼠组织器官进行病毒DNA提取，PCR结果表明PGO重组病毒和PCV2灭活苗的效力相当，均能有效抵抗PCV2强毒的攻击（保护率为3/5)，且保护率明显高于DMEM培养液组（0/5)，PGO重组病毒和PCV2灭活疫苗均不能达到100%的保护率的原因可能与二者的免疫剂量和时机有关，也可能与PCV2病毒特性有关。另外PGO株在诱导外周血T淋巴细胞亚群数量上要优于PCV2灭活苗免疫组和DMEM培养液免疫组，差异显著(P <0.05)，这与宋云峰博士的研究结果相同。上述实验研究表明重组病毒PGO株既能增强细胞免疫应答也能增强体液免疫应答，是一个非常有潜力的重组疫苗。

<110> 河南农业大学

 

<120> 猪α-干扰素复合制剂的制备方法

 

<160> 3

 

<210> 1

<211>

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(23)

<400> 1

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<210> 2

<211>

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<210> 3

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<400> 3

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Claims (2)

1.一种表达猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的重组猪伪狂犬病毒毒株，其特征在于：重组猪伪狂犬病毒（Herpesviridae）毒株，CCTCC NO：V201315。

2.如权利要求1所述的表达猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的重组猪伪狂犬病毒毒株的制备方法，包括设计与合成引物，增殖伪狂犬病毒，提取伪狂犬病毒DNA，转染，纯化，其特征在于：所述转染步骤如下：

（1）取100 μL TCID50为10^-6.125/0.1ml的PRV TK^-/gG^-/gE^-病毒接种到六孔板中并用DMEM培养液补至350μL，置细胞培养箱中吸附2h，每隔30min摇晃一次；

（2）将240 μl无血清培养基OPTI-MEM和10 μl  Lipofectamine 2000于EP管中混合均匀，得到溶液A；

（3）将4 μg去内毒素质粒PGO补OPTI-MEM至总体积250 μL并于EP管中混合均匀，孵育5min，得到溶液B；

（4）将溶液A和溶液B混合后在室温下静置20-30min，得到溶液C；

（5）将步骤（1）中六孔板中的细胞用无血清培养基冲洗两遍后，加入2 ml无血清培养基；

（6）将步骤（4）中溶液C逐滴加入六孔板中，摇动培养板，轻轻混匀，在37℃，体积浓度为5%的CO₂中保温5-6h；

（7）6h后，更换有血清的全培养基，37℃，5%CO₂中48-72h检测转染水平。

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