CN111632137A - 猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于兽用生物制品技术领域，特别是指一种猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗及其制备方法和应用。所述三联疫苗包括抗原组分和冻干保护剂，其中抗原组分包括猫杯状病毒BJ株灭活抗原、猫传染性鼻气管炎病毒SH株灭活抗原和猫泛白细胞减少症病毒SY株灭活抗原。本发明采用全悬浮技术制备的猫杯状病毒、猫传染性鼻气管炎病毒和猫泛白细胞减少症病毒抗原，经灭活、浓缩及冻干等工艺制成猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联灭活冻干疫苗，一针免三病，减少了动物的免疫次数，降低了动物应激次数，大大降低了饲养人的经济成本。

Description

猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联 疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，特别是指一种猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)是杯状病毒科杯状病毒属的重要成员之一，可引起猫及猫科动物呼吸道传染病，该病主要侵害6-84日龄幼猫，多发于56-84日龄，1岁以下的猫最易感，日龄越小的猫感染后死亡率越高。其主要临床症状表现为鼻炎、结膜炎、急性口腔溃疡、肺炎、慢性胃炎和跛行等。自1957年Fastier首次分离鉴定FCV以来，在欧洲、美洲、亚洲均发现FCV，其已呈世界性分布。近年来，由于FCV高度的变异性产生的强毒株可引起严重、急性、致死性全身性疾病(Virulent Systemic Disease，VSD)，对猫及猫科动物的健康造成严重威胁。

猫传染性鼻气管炎，是由猫疱疹病毒Ⅰ型(Feline herpesvirus 1，FHV-1)引起的，在幼猫和成年猫中均可发生。主要表现为发热、眼部及鼻部黏膜损伤和明显上呼吸道感染症状，发病率高达100％，死亡率可达50％，是目前已知最严重的猫呼吸道疾病之一。1957年Crandell R.A于美国首次在患病幼猫体内分离得到FHV-1。随后在越南、荷兰、英国、日本、匈牙利等地分离到此病。之后我国多次检测并分离到该病毒。该病在我国呈上升趋势。

猫泛白细胞减少症(Feline panleukopenia virus，FPV)，又称猫瘟、猫传染性肠炎病毒。是由猫细小病毒引起的一种急性高度接触性传染病。主要症状为高热、呕吐、腹泻、脱水，循环障碍及白细胞大量减少。该病具有高度传染性，主要感染1岁以内幼猫，发病率和死亡率均很高。1928年Verge首次鉴定出该病毒，之后在加拿大、美国、日本等许多国家都有发现，我国在1984年首次分离到该病毒，之后张振兴和李刚等人报道在河北、河南、浙江等地均有猫细小病毒病的发生。该病在世界上广泛存在，被认为是猫重要的传染病之一。

现市面上疫苗生产多采用转瓶或纸片载体生长，因此生产的抗原有限。随着兽用疫苗生产发展自动化、规模化的需求，无载体全悬浮细胞培养技术成为新的发展趋势。生物反应器细胞全悬浮培养技术中，细胞生长不再受载体限制，省掉了载体培养消化等步骤，细胞培养更为简单，更有先行化放大的优选，适于工业化大规模生产。专利CN200810154578.7中公开了猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒的三联疫苗，将已长成90％单层的宿主细胞系分别接种猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒，并加入细胞维持液，在37℃下培养；该专利所用的宿主细胞为贴壁细胞，而贴壁细胞生长时间有限，所能制备的抗原也受限，且滴度不稳定，造成疫苗的稳定性差。

目前临床上，猫只多发生这三种疾病混合感染，混合感染后症状较重，主要采用注射疫苗进行预防。由于近年来多出现病毒变异株，市面上的疫苗不能很好的起到保护作用，急需新的流行毒株疫苗的产生。而现有用于制备疫苗的毒株毒力弱、抗原TCID₅₀值低，抗原水平低肯定影响疫苗的免疫效果，因为灭活疫苗接种到动物体内后，需要靠抗原来刺激机体产生免疫反应，最终形成抗体，抗原含量不够直接影响免疫反应的强弱，最终导致产生抗体少，水平低。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出一种猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗及其制备方法和应用。本发明从临床发病猫体内分离得到的对猫安全、免疫原性好、病毒增殖稳定的猫杯状病毒、猫传染性性鼻气管炎病毒和猫泛白细胞减少症病毒三联疫苗株，分别命名为：猫杯状病毒BJ株、猫传染性鼻气管炎病毒SH株和猫泛白细胞减少症病毒SY株。

本发明的技术方案是这样实现的：

猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗，所述三联疫苗包括抗原组分和冻干保护剂，其中抗原组分包括猫杯状病毒BJ株灭活抗原、猫传染性鼻气管炎病毒SH株灭活抗原和猫泛白细胞减少症病毒SY株灭活抗原。

所述猫杯状病毒BJ株灭活抗原由猫杯状病毒BJ株制备，命名为：猫杯状病毒BJ株，保藏蝙号为：CCTCC NO：V202002，保藏日期为：2020年6月10日。

所述猫传染性鼻气管炎病毒SH株灭活抗原由猫传染性鼻气管炎病毒SH株制备，命名为：猫传染性鼻气管炎病毒SH株，保藏蝙号为：CCTCC NO：V202003，保藏日期为：2020年6月10日。

所述猫泛白细胞减少症病毒SY株灭活抗原由猫泛白细胞减少症病毒SY株制备，命名为猫泛白细胞减少症病毒SY株，保藏蝙号为：CCTCC NO：V202004，保藏日期为：2020年6月10日。

上述的猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗的制备方法，步骤如下：

(1)分别将猫杯状病毒BJ株、猫传染性鼻气管炎病毒SH株和猫泛白细胞减少症病毒SY株接种于悬浮F81S细胞培养液中，培养一段时间后，分别收集三种毒株的毒液即为三种毒株的抗原液；

(2)将步骤(1)的三种毒株的抗原液中分别加入灭活剂灭活后，再等比例混匀得混匀液，再加入冻干保护剂冷冻真空干燥即得猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗。

所述步骤(1)中的悬浮F81S细胞的培养方法为：

①将全悬浮F81S细胞接种于含有2％血清悬浮培养液的专用悬浮培养摇瓶中，在36.5-37.5℃培养60-72h进行扩增，细胞培养液细胞密度不低于5×10⁵个/mL，且细胞活力≥90％，按照1:(3-5)的比例传代放大培养，得F81S细胞悬浮液；

②将步骤①培养得到的F81S细胞悬浮液接种入生物反应器中，接种体积为1-2L，补加2％血清悬浮培养液至5L，培养72-96h后的细胞培养液细胞密度不低于2×10⁶个/mL，且细胞活力≥90％；

③取步骤②得到的细胞培养液3.5L转移至生物反应器中，补加含2％血清悬浮培养液至10L，继续培养72-96h后，细胞培养液细胞密度不低于2×10⁶个/mL，且细胞活力≥90％。即得到可用作接毒的悬浮F81S细胞培养液。

所述步骤(1)中猫杯状病毒BJ株的接毒量为悬浮F81S细胞培养液体积的2-5％，猫传染性鼻气管炎病毒SH株的接毒量为悬浮F81S细胞培养液体积的2-5％，猫泛白细胞减少症病毒SY株的接毒量为悬浮F81S细胞培养液体积的5-15％；猫杯状病毒BJ株、猫传染性鼻气管炎病毒SH株和猫泛白细胞减少症病毒SY株的培养时间分别为24-48小时、24-48小时和72-96小时，当细胞活率﹤30％时收获病毒液，收获的毒液于-20℃以下保存。

所述步骤(2)中灭活剂为BEI灭活剂，BEI灭活剂为0.4mol/L BEA和0.4mol/L NaOH以体积比1:1比例混合制备，每种毒株的抗原液中加入灭活剂后毒株的终浓度为3mM，灭活时间为36-40小时。

所述步骤(2)中冻干保护剂为脱脂奶粉；混匀液与冻干保护剂的体积比为1:(1-5)。

上述的三联疫苗在制备联合预防猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症药物中的应用。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明选用全悬浮F81S株细胞系代替传统贴壁F81细胞制备猫杯状病毒、猫传染性鼻气管炎病毒和猫泛白细胞减少症病毒，自动化程度高，不需要载体介入，可以在无血清或低血清培养基中悬浮培养，解决病毒培养大规模生产化的要求。本发明采用生物反应器细胞全悬浮培养技术，结合国内新分离的三种流行毒株，生长的抗原水平高且抗原量稳定，制备的三联疫苗免疫效果好。

(2)本发明采用了冻干工艺，保证了产品质量的同时，稳定了剂型，降低了因灭活剂或佐剂导致的临床副反应的发生。

(3)本发明采用全悬浮技术制备的猫杯状病毒、猫传染性鼻气管炎病毒和猫泛白细胞减少症病毒抗原，经灭活、浓缩及冻干等工艺制成猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联灭活冻干疫苗，一针免三病，减少了动物的免疫次数，降低了动物应激次数，大大降低了饲养人的经济成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为F5代病毒的细胞培养物CPE照片；其中A.FCV的细胞培养物CPE；B.FHV的细胞培养物CPE图；C.FPV的细胞培养物CPE图；D.为细胞对照图。

图2为病毒液第5代细胞培养物的PCR和RT-PCR扩增结果图；A.FCV RT-PCR扩增结果图；B.FHV PCR扩增结果图；C.FPV PCR扩增结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：三种毒株的获取

一株适应全悬浮培养的猫肾细胞系F81S，命名为F81S，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201799，分类命名为：猫肾细胞悬浮适应株F81S，保藏日期为：2017年6月29日，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学。

悬浮细胞生长培养基：HyClone公司HYC-RDMP-28培养基，添加2％新生牛血清，细胞生长培养基即是F81S细胞悬浮株摇瓶培养与生物反应器全悬浮培养所用的营养液。

贴壁细胞生长培养基：Gibco公司DMEM培养基，添加10％新生牛血清，细胞生长培养基即是F81细胞贴壁培养所用的营养液。

贴壁培养病毒培养维持培养基：Gibco公司DMEM培养基，添加2％新生牛血清，病毒培养维持培养基即是贴壁培养的F81细胞培养病毒所用的营养液。

生物反应器：工业化搅拌式7L、10L生物反应器。

1、毒株的来源

1.1猫杯状病毒BJ株

采集北京某宠物医院发病猫咽试子液，经RT-PCR检测为猫杯状病毒抗原阳性的病料，将试子液经0.22μm滤膜过滤，过滤液于-20℃保存备用。

将长满致密单层的F81细胞，按照10％剂量接种过滤液，吸附1h后加入含2％新生牛血清的DMEM维持液，在37℃5％CO₂下培养，同时设置空白细胞作为阴性对照。培养24-48h时出现明显细胞病变。主要表现为细胞圆缩，折光性强，呈鱼籽样散在的CPE现象。对照细胞100％单层，无CPE，生长良好。传5代后病变基本稳定(图1A)。

应用Primer Premier 5.0基因分型软件，参照Genbank中FCV F9的ORF2和ORF3基因序列设计检测引物对：上游引物FCV-F：5-TTTGAGCATGTGCTCAACCT-3下游引物FCV-R：5-CCCTGGGGTTAGGCGC-3。PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃15s，52℃15s，72℃15s，进行35个循环后，72℃5min延伸。FCV扩增目的片段长度为2366bp。

取FCV第5代的细胞上清对其进行RT-PCR鉴定，结果显示，该培养物扩增出约2366bp的目的片段，与预期相符(见图2A)。测序结果在NCBI Blast，证明其为FCV。

按照现行《中国兽药典》附录对第5代病毒进行无菌、支原体及外源病毒检验，结果无细菌，霉菌，支原体及外源病毒污染。

将分离的5代种毒命名为FCV BJ株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202002，分类命名为：猫杯状病毒BJ株，保藏日期为：2020年6月10日，保藏单位地址为：中国·武汉·武汉大学。

1.2猫传染性鼻气管炎病毒SH株

采集上海某宠物医院发病猫鼻试子液，经PCR检测为猫传染性鼻气管炎病毒抗原阳性的病料，将试子液经0.22μm滤膜过滤，过滤液于-20℃保存备用。

将长满致密单层的F81细胞，按照10％剂量接种过滤液，吸附1h后加入含2％新生牛血清的DMEM维持液，在37℃5％CO₂下培养，同时设置空白细胞作为阴性对照。培养24-48h时出现明显细胞病变。主要表现为细胞凸出、圆缩，呈火山口状的CPE现象。对照细胞100％单层，无CPE，生长良好。传5代后病变基本稳定(图1B)。

应用Primer Premier 5.0基因分型软件，参照Genbank中FHV-1的TK基因序列设计检测引物对：上游引物FHV-F：5-GACGTGGTGAATTATCAGC-3、下游引物FHV-R：5-CAACTAGATTTCCACCAGGA-3。PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃15s，52℃15s，72℃15s，进行35个循环后，72℃5min延伸。FCV扩增片段为288bp。

取FHV第5代的细胞上清对其进行PCR鉴定，结果显示，该培养物扩增出约288bp的目的片段，与预期相符(见图2B)。测序结果在NCBI Blast，证明其为FHV。

结果见图2。

按照现行《中国兽药典》附录对第5代病毒进行无菌、支原体及外源病毒检验，结果无细菌，霉菌，支原体及外源病毒污染。

将分离的5代种毒命名为FHV SH株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202003，分类命名为：猫传染性鼻气管炎病毒SH株，保藏日期为：2020年6月10日，保藏单位地址为：中国·武汉·武汉大学。

1.3猫泛白细胞减少症病毒SY株

采集沈阳某宠物医院发病猫粪拭子液，经PCR检测为猫泛白细胞综合症病毒抗原阳性的病料，将拭子液经0.22μm滤膜过滤，过滤液于-20℃保存备用。

将长满致密单层的F81细胞，按照10％剂量接种过滤液，吸附1h后加入含2％新生牛血清的DMEM维持液，在37℃5％CO₂下培养，同时设置空白细胞作为阴性对照。培养24-48h时出现明显细胞病变。主要表现为细胞拉长，部分细胞脱落，呈网状的CPE现象。传5代后病变基本稳定(图1C)。

应用Primer Premier 5.0基因分型软件，参照Genbank中FPV的VP2基因序列设计检测引物对：上游引物FPV-F：5-AAAGAGTAGTTGTAAATAATA-3、下游引物FPV-R：5-CCTATATCACCAAAGTTAGTAG-3。PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃15s，55℃15s，72℃15s，进行35个循环后，72℃5min延伸。FCV扩增片段为625bp。

取FPV第5代的细胞上清对其进行PCR鉴定，结果显示，该培养物扩增出约625bp的目的片段，与预期相符(见图2C)。测序结果在NCBI Blast，证明其为FPV。

结果见图2。

按照现行《中国兽药典》附录对第5代病毒进行无菌、支原体及外源病毒检验，结果无细菌，霉菌，支原体及外源病毒污染。

将分离的5代种毒命名为FPV SY株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202004，分类命名为：猫泛白细胞减少症病毒SY株，保藏日期为：2020年6月10日，保藏单位地址为：中国·武汉·武汉大学。

2、毒株的特性

2.1特异性

将猫杯状病毒和猫传染性鼻气管炎病毒两种毒种，分别用DMEM稀释为100TCID₅₀/mL,与相对应等量的FCV和FHV特异性阳性血清混合，放置37℃中和1h，接种已经长成良好单层的F81细胞的96孔细胞培养板，接种4孔，100ul/孔，同时设正常细胞对照和未加中和血清对照，置37℃5％CO₂下培养4日，逐日观察并记录细胞病变，阳性血清中和组和正常细胞对照组均不出现细胞病变；未加中和血清对照组全部出现细胞病变。

猫泛白细胞减少症病毒用PBS稀释到4单位抗原，与相对应等量的FPV特异性阳性血清混合，放置37℃中和1h，加入1％的猪红细胞悬液后，4℃放置2h后观察结果。同时设正常细胞对照和未加中和血清对照。阳性血清中和组和正常细胞对照组均不出现红细胞凝聚现象；未加中和血清对照组全部出现红细胞凝聚现在。

2.2毒力

2.2.1猫杯状病毒毒力试验

用2-3月龄健康易感幼猫(猫杯状病毒抗原抗体均为阴性)共10只，分2组各5只，第1组试验动物滴鼻接种攻击用强毒，0.5mL/鼻孔，共1mL/只猫。第2组为对照组，试验动物滴鼻接种F81细胞冻融液，0.5mL/鼻孔，共1mL/只猫。连续观察14天，记录试验数据，包括体温、临床症状、死亡情况及剖检等。

攻击动物攻毒后第3天开始表现出临床症状，临床症状逐渐加重，表现为:发热、精神萎靡、食欲减退、口舌溃疡、死亡等。剖检肺脏肉变，肺部有气泡充盈等。攻击动物发病率为100％，对照组试验动物无任何临床症状，无死亡。

2.2.2猫传染性鼻气管炎病毒毒力试验

用2-3月龄健康易感幼猫(猫传染性鼻气管炎病毒抗原抗体均为阴性)共10只，分为2组，各5只。第1组试验动物滴鼻接种攻击用强毒，0.5mL/鼻孔，共1mL/只猫。第2组为对照组，试验动物滴鼻接种F81细胞冻融液，0.5mL/鼻孔，共1mL/只猫。连续观察14天，记录试验数据，包括体温、临床症状、死亡情况及剖检等。

攻击动物攻毒后第2天开始表现出临床症状，临床症状逐渐加重，表现为：发热、精神萎靡、食欲减退、角膜炎、结膜炎甚至失明，并伴有明显的上呼吸道症状，如：打喷嚏，呼吸困难、张口呼吸，死亡等。剖检鼻腔和鼻甲骨黏膜呈弥漫性充血和数量不等的出血点。颌下淋巴结肿胀，肺脏肉变，肺部有气泡充盈等。攻击动物发病率为100％，对照组试验动物无任何临床症状，无死亡。

2.2.3猫泛白细胞减少症病毒攻击模型的建立

用2-3月龄健康易感幼猫(猫泛白细胞减少症病毒的抗原抗体均为阴性)共10只，分为2组各5只。第1组试验动物口服接种攻击用强毒，共1mL/只猫。第2组对照组试验动物口服接种F81细胞冻融液，共1mL/只猫。连续观察14天，记录试验数据，包括体温、临床症状、死亡情况及剖检等。

攻击组动物，在攻毒后第2天开始表现出临床症状，表现为：发热、最高温度可达40℃，最低温度可达37.4℃。精神萎靡、食欲减退、脱水、呕吐、血便等。死亡剖检主要表现脾脏肿大有出血点；肠道肿胀出血、甚至坏死；肠系膜淋巴结出血等。攻击动物发病率为100％，对照组试验动物无任何临床症状，无死亡。

3、猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联灭活冻干疫苗的制备及检验

3.1选择适应全悬浮培养F81S系细胞株作为制苗用细胞

(1)取液氮冻存的F81S系全悬浮细胞，置于37℃水浴中快速解冻并接种于含有2％血清悬浮培养液的专用悬浮培养摇瓶中，置于37℃、转速60-75rpm、5％(v/v)CO2培养箱内生长72-96h，PH为6.0-7.5，待悬浮细胞密度不低于5×10⁵个/mL，且细胞活力≥90％，得到摇瓶生长的细胞悬浮液。

(2)将摇瓶中培养的悬浮F81S细胞接种入生物反应器(工作体积5L)中，接种体积为1-2L，补加2％血清悬浮培养液至5L，生物反应器参数设定三路气体，分别为空气、氧气和二氧化碳，转速为60-75rpm，温度为36.5-37.5℃，PH为6.0-7.5，溶氧设定为40-60％，培养72-96h后的细胞培养液细胞密度不低于2×10⁶个/mL，且细胞活力≥90％。

(3)取步骤(2)中得到的细胞培养液3.5L转移至生物反应器(工作体积10L)中，补加含2％血清悬浮培养液至10L，生物反应器参数设定三路气体，分别为空气、氧气和二氧化碳，转速为60-75rpm，温度为36.5-37.5℃，PH为6.0-7.5，溶氧设定为40-60％，继续培养72-96h后，细胞培养液细胞密度不低于2×10⁶个/mL，且细胞活力≥90％。即得到可用作接毒的细胞培养液。

3.2制苗毒液的繁殖

F81S悬浮细胞生长3天，换液后分别按照病毒培养液体积的2-5％、2-5％和5-15％比例同步接入猫杯状病毒BJ株、猫传染性鼻气管炎病毒SH株和猫泛白细胞综合症病毒SY株生产毒种，培养条件为：生物反应器参数设定三路气体，分别为空气、氧气和二氧化碳，转速为60-75rpm，温度为36.5-37.5℃，PH6.0-7.5，溶氧为40-60％；分别于接种后24-48h、24-48h和72-96h，当细胞活率﹤30％时收获病毒液，收获的毒液于-20℃以下保存。

猫杯状病毒、猫传染性鼻气管炎病毒和猫泛白细胞减少症病毒分别培养三批，批号为1901、1902和1903，每种病毒培养出的三批抗原滴度稳定，无太大差别，说明本申请的悬浮培养的方法培养的病毒稳定，抗原含量见表1。

表1抗原含量测定

制苗用病毒液的检验：按《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长。

3.3灭活及配苗

3.3.1灭活及其检验

将0.4mol/L BEA和0.4mol/L NaOH以体积比1:1比例在适当容器内混合。37±2℃环化至少1小时，生成BEI，调节pH至7.2～7.6。将检验合格的FCV BJ株、FHV SH株和FPV SY株病毒培养液，分置于3个容器内，加入BEI灭活剂，终浓度为3mM，灭活36～40小时，充分摇匀，再加入终浓度为0.03M的硫代硫酸钠进行中和。灭活后的病毒液置于4℃保存。

将灭活后的三种病毒液分别接种已长成100％单层的F81细胞，每组接种3瓶，置37℃作用60分钟后，弃病毒液，加入含2％新生牛血清的DMEM病毒维持液，同时设正常细胞对照和未灭活病毒对照，置37℃5％CO2的培养箱中培养3日后再传代1次，逐日观察并记录细胞病变。灭活病毒组和正常细胞对照组均不出现细胞病变，且FPV培养液，血凝试验应呈现阴性。未灭活病毒对照组全部出现细胞病变，血凝试验呈现阳性，则判为病毒未灭活完全。3批抗原的灭活检验效果如下表表2。

表2 3批抗原的灭活检验效果

3.3.2浓缩与配苗

分别将3批灭活的抗原经中空纤维柱浓缩。将浓缩后的三种检验无菌灭活抗原液按体积比1:1:1混合后，抗原混合液与冻干保护剂按1:1-5的比例制成匀浆，充分混合，定量分装后迅速按合适的冻干工艺曲线进行冷冻真空干燥，制备成冻干灭活疫苗成品。实验室共制得批制品，分别为F-1901、F-1902和F-1903。

按照《中国兽药典》附录的方法对3批疫苗进行无菌检验，结果均无菌生长，具体见下表表3。

表3 3批疫苗的无菌检验结果

实验例2：三种毒株的安全性试验

本发明猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联灭活冻干疫苗的超剂量安全性试验

本试验选用2-3月龄健康易感幼猫20头，要求猫血清抗FCV、抗FHV和抗FPV抗体效价均小于2。试验共分4组，免疫组3组，分别接种不同批次疫苗(批号：F-1901、F-1902和F-1903)，每组5只猫，对照组5只猫。免疫组颈部注射2mL(2头份)猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联灭活冻干疫苗。对照组颈部肌肉接种2mL F81S细胞冻融物。疫苗接种后21天，免疫组每组猫再次接种同样批次、同等剂量灭活冻干疫苗作为二免，对照组接种2mL F81S细胞冻融物。每次接种疫苗后连续14日定点测量试验动物直肠温度，并进行临床观察精神状态、食欲、行为活动、排便状况、口鼻分泌物等全身反应。

结果表明，2倍剂量首免后和二次免疫后各疫苗接种组和对照组试验动物体温均正常，疫苗接种组和对照组试验动物精神状态及食欲良好，未见不良反应，疫苗注射部位未见红肿、化脓等症状。3批疫苗超剂量接种猫后，无体温升高，无可见临床异常，注射后14日，吸收良好，与对照组无差异。结果表明(见表4)，3批次疫苗免疫幼猫均安全。

表4 3批疫苗的安全性检测结果

实验例3：三种疫苗的效力试验

本发明猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联灭活冻干疫苗的效力试验

1.抗体测定

试验用2-3月龄健康易感幼猫(要求猫血清抗FCV、抗FHV和抗FPV抗体效价均小于2)30只，各试验组均5只猫，经颈部肌肉注射疫苗1.0mL，各对照组均5只猫，每只颈部肌肉接种1mL F81S细胞冻融物。接种14日后，所有猫只均采集颈静脉血液，分离血清，测定猫杯状病毒和猫传染性鼻气管炎病毒中和抗体，测定猫泛白细胞减少症病毒的HI。免疫组猫中和抗体和HI抗体均不低于1:16，对照组猫中和抗体及HI抗体均应不高于1:4。

结果显示：3批疫苗的猫杯状病毒、猫传染性鼻气管炎病毒和猫泛白细胞减少症病毒中和抗体效价检验均合格，见表5。

表5 3批疫苗免疫后的中和抗体检测结果

2、免疫攻毒法

试验用2-3月龄健康易感幼猫(要求猫血清抗FCV、抗FHV和抗FPV抗体效价均小于2)

试验共使用2-3月龄健康易感幼猫(猫血清抗FCV、抗FHV和抗FPV抗体效价均小于2)15只(分为1、2和3组，每组5只)，各只颈部肌肉注射疫苗1.0mL，另外15只(分为4、5和6组，每组5只)颈部肌肉注射同剂量F81S细胞冻融物，免疫后14日，第1、4组猫各滴鼻接种猫杯状病毒BJ株1.0mL/只，第2、5组猫各滴鼻接种猫传染性鼻气管炎病毒SH株1.0mL/只，第3、6组猫各经口服接种猫泛白细胞减少症病毒SY株1.0mL/只。连续观察14日。

结果表明，该灭活冻干疫苗免疫试验动物后，对强毒攻击可产生较好的保护作用，保护率为100％，免疫组1组、免疫组3组和免疫组5组均没有出现猫杯状病毒病或猫传染性鼻气管炎或猫泛白细胞综合症的相关症状，而对照组2组、对照组4组和对照组6组在攻毒后第三天均体温明显升高，且伴有口腔溃疡、呼吸困难、呕吐、便血等症状。说明3批疫苗的猫杯状病毒或猫传染性鼻气管炎病毒或猫泛白细胞减少症病毒攻毒保护检验均合格，见表6。

表6 3批疫苗免疫后的攻毒保护结果

对比例

猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联灭活冻干疫苗与市面在售的猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联灭活疫苗效力比较试验

1.材料

猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联灭活冻干疫苗，实施例2中的疫苗制品(批号：F-1901)；

市面在售：猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联灭活疫苗(批号：1620388A)

2.方法

用批号为F-1901的三联灭活冻干疫苗、市售三联灭活疫苗，对2-3月龄健康易感幼猫(猫血清抗FCV、抗FHV和抗FPV抗体效价均小于1：2)分为3组，分别为免疫A组、免疫B组和对照组，5只/组，分别免疫本发明猫三联疫苗、市售猫三联疫苗和PBS，免疫剂量为1.0mL/只，免疫后观察猫的反应、临床症状；另外，分别对这些猫在免疫后的7日、14日、28日采血，分离血清，测定其FCV、FHV中和抗体效价，FPV血凝抑制抗体效价。

4实验结果

结果如表7-表10所示：

表7猫杯状病毒中和抗体效价(1：n)

表8猫传染性鼻气管炎病毒中和抗体水平(1：n)

表9猫泛白细胞减少症病毒血凝抑制抗体效价(1：2ⁿ)

表10疫苗免疫后的临床表现

免疫后7日，免疫A组均可刺激机体产生抗猫杯状病毒中和抗体(表7)；抗猫传染性鼻气管炎病毒中和抗体(表8)；猫泛白细胞减少症病毒血凝抑制抗体(表9)，且加强免疫后抗体增加，并可持续至第28日。免疫A组与对照组饮食、精神状态、体温均正常，也无其他不良反应；而免疫B组，相对的有个别猫表现为精神沉郁，体温略高(表10)。

此外，针对FCV和FHV的中和抗体效价而言，免疫后7日，免疫A组和免疫B组均可刺激机体产生中和抗体，但免疫A组比免疫B组引起的抗体水平高。之后抗体水平继续增高，在免疫后的28日，抗体水平达到高峰。免疫A组FCV和FHV的最高中和抗体效价均为1：128，免疫B组FCV和FHV的最高中和抗体效价均为1:64(见表7、表8)。

针对FPV的血凝抑制抗体效价而言，免疫A与免疫B组的效果无显著差异，血凝抑制抗体效价最高时均可达到1:2⁸(见表9)。

针对疫苗免疫后猫只临床表现情况而言，疫苗免疫后，免疫A组与对照组猫只临床表现均正常，无其他不良反应。免疫B组免疫后个别猫只出现一过性的体温升高和精神沉郁现象(见表10)。

说明本发明三联灭活冻干疫苗与市售三联灭活疫苗相比，免疫产生的中和效价的水平较高，抗体增加快，持续时间长。其猫只免疫后无不良的临床表现。因此，本发明的三联灭活冻干疫苗免疫后产生的抗体水平，及免疫后的临床表现均优于市面在售三联灭活疫苗。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗，其特征在于：所述三联疫苗包括抗原组分和冻干保护剂，其中抗原组分包括猫杯状病毒BJ株灭活抗原、猫传染性鼻气管炎病毒SH株灭活抗原和猫泛白细胞减少症病毒SY株灭活抗原。

2.根据权利要求1所述的猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗，其特征在于：所述猫杯状病毒BJ株灭活抗原由猫杯状病毒BJ株制备，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202002，分类命名为：猫杯状病毒BJ株，保藏日期为：2020年6月10日，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学。

3.根据权利要求1所述的猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗，其特征在于：所述猫传染性鼻气管炎病毒SH株灭活抗原由猫传染性鼻气管炎病毒SH株制备，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202003，分类命名为：猫传染性鼻气管炎病毒SH株，保藏日期为：2020年6月10日，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学。

4.根据权利要求1所述的猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗，其特征在于：所述猫泛白细胞减少症病毒SY株灭活抗原由猫泛白细胞减少症病毒SY株制备，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202004，分类命名为：猫泛白细胞减少症病毒SY株，保藏日期为：2020年6月10日，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学。

5.权利要求1-4任一项所述的猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）分别将猫杯状病毒BJ株、猫传染性鼻气管炎病毒SH株和猫泛白细胞减少症病毒SY株接种于悬浮F81S细胞培养液中，培养一段时间后，分别收集三种毒株的毒液即为三种毒株的抗原液；

（2）将步骤（1）的三种毒株的抗原液中分别加入灭活剂灭活后，再等比例混匀得混匀液，再加入冻干保护剂冷冻真空干燥即得猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗。

6.根据权利要求5所述的猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗的制备方法，其特征在，所述步骤（1）中的悬浮F81S细胞的培养方法为：

① 将全悬浮F81S细胞接种于含有2%血清悬浮培养液的专用悬浮培养摇瓶中，在36.5-37.5℃培养60-72h进行扩增，细胞培养液细胞密度不低于5×10⁵个/mL，且细胞活力≥90%，按照1:（3-5）的比例传代放大培养，得F81S细胞悬浮液；

② 将步骤①培养得到的F81S细胞悬浮液接种入生物反应器中，接种体积为1-2L，补加2%血清悬浮培养液至5L，培养72-96h后的细胞培养液细胞密度不低于2×10⁶个/mL，且细胞活力≥90%；

③ 取步骤②得到的细胞培养液3.5L转移至生物反应器中，补加含2%血清悬浮培养液至10L，继续培养72-96h后，细胞培养液细胞密度不低于2×10⁶个/mL，且细胞活力≥90%，即得到可用作接毒的悬浮F81S细胞培养液。

7.根据权利要求5所述的猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中猫杯状病毒BJ株的接毒量为悬浮F81S细胞培养液体积的2-5%，猫传染性鼻气管炎病毒SH株的接毒量为悬浮F81S细胞培养液体积的2-5%，猫泛白细胞减少症病毒SY株的接毒量为悬浮F81S细胞培养液体积的5-15%；猫杯状病毒BJ株、猫传染性鼻气管炎病毒SH株和猫泛白细胞减少症病毒SY株的培养时间分别为24-48小时、24-48小时和72-96小时，当细胞活率﹤30%时收获病毒液，收获的毒液于-20℃以下保存。

8.根据权利要求5所述的猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗的制备方法，其特征在，所述步骤（2）中灭活剂为BEI灭活剂，BEI灭活剂为0.4mol/LBEA和0.4mol/L NaOH以体积比1:1比例混合制备，每种毒株的抗原液中加入灭活剂后毒株的终浓度为3mM，灭活时间为36-40小时。

9.根据权利要求5所述的猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗的制备方法，其特征在，所述步骤（2）中冻干保护剂为脱脂奶粉；混匀液与冻干保护剂的体积比为1:（1-5）。

10.权利要求1所述的三联疫苗在制备联合预防猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症药物中的应用。

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