CN114480304B - 猫泛白细胞减少症鼻气管炎鼻结膜炎三联灭活疫苗 - Google Patents

猫泛白细胞减少症鼻气管炎鼻结膜炎三联灭活疫苗 Download PDF

Info

Publication number
CN114480304B
CN114480304B CN202210118572.4A CN202210118572A CN114480304B CN 114480304 B CN114480304 B CN 114480304B CN 202210118572 A CN202210118572 A CN 202210118572A CN 114480304 B CN114480304 B CN 114480304B
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
feline
strain
vaccine
tcid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210118572.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114480304A (zh
Inventor
舒秀伟
陈生雷
王博
刘艳霞
谷崇高
刘现
吴迪
赵岩
刘国英
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Liaoning Yikang Biological Corp ltd
Original Assignee
Liaoning Yikang Biological Corp ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Liaoning Yikang Biological Corp ltd filed Critical Liaoning Yikang Biological Corp ltd
Priority to CN202210118572.4A priority Critical patent/CN114480304B/zh
Publication of CN114480304A publication Critical patent/CN114480304A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114480304B publication Critical patent/CN114480304B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/16063—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2750/14063—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/16011—Caliciviridae
    • C12N2770/16021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/16011—Caliciviridae
    • C12N2770/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/16011—Caliciviridae
    • C12N2770/16061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2770/16063—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于预防猫泛白细胞减少症、猫鼻气管炎和猫鼻结膜炎的疫苗株组合，包括微生物保藏号为CGMCC No.22382的猫泛白细胞减少症病毒株，微生物保藏号为CGMCC No.22383的猫鼻气管炎病毒株和微生物保藏号为CGMCC No.22381的猫鼻结膜炎病毒株。该疫苗株组合中的三种疫苗毒株特异性良好，免疫原性良好。本发明还公开了以前述疫苗株组合为免疫原的灭活疫苗组合物及其制备方法。该疫苗组合物安全有效。

Description

猫泛白细胞减少症鼻气管炎鼻结膜炎三联灭活疫苗
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种猫泛白细胞减少症、鼻气管炎、鼻结膜炎三联灭活疫苗及其制备方法与用途。
背景技术
猫泛白细胞减少症又称猫全白细胞减少症、猫瘟热或猫传染性肠炎，是由猫泛白细胞减少症病毒引起猫及猫科动物的一种急性、高度接触性传染病，临诊以突发高热、呕吐、腹泻、脱水及循环血流中白细胞减少为特征。猫泛白细胞减少症病毒属于细小病毒属，细小病毒科；与犬细小病毒和水貂肠炎病毒具有密切的抗原相关性。
猫鼻气管炎是由猫疱疹病毒1型引起的一种以上呼吸道感染为主要症状的急性、高度接触性传染病。临床以角膜结膜炎、上呼吸道感染和流产为特征，但以上呼吸道症状为主。主要感染猫科动物，发病率很高，可达100％，但病死率在不同年龄的猫上差异很大，成年猫一般不引起死亡，但幼仔猫的死亡率可达50％。
猫鼻结膜炎是由猫杯状病毒引起的一种以上呼吸道感染为主要症状的疾病，广泛流行于猫科动物，3月龄以下的幼猫最为易感，严重危害宠物猫的健康，被列为猫的三大病毒性传染病之一。猫杯状病毒是杯状病毒科的一员，猫杯状病毒是小型单链正股RNA病毒，基因组大小约为7.7kb，典型的杯状病毒呈球形或近球形，无囊膜，直径一般在30～38nm之间。
尚未见到猫泛白细胞减少症、鼻气管炎、鼻结膜炎三联灭活疫苗的应用报道，而这三种疾病疫苗的三联苗对同时预防猫的疾病具有重大意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明第一方面提供了一种疫苗株，所述疫苗株为猫泛白细胞减少症病毒疫苗株、猫鼻气管炎病毒疫苗株和猫鼻结膜炎病毒疫苗株的组合；或者
所述疫苗株为猫鼻结膜炎病毒疫苗株；
其中，所述猫泛白细胞减少症病毒疫苗株是微生物保藏号为CGMCC No.22382的病毒株；
所述猫鼻气管炎病毒疫苗株是微生物保藏号为CGMCC No.22383的病毒株；
所述猫鼻结膜炎病毒疫苗株是微生物保藏号为CGMCC No.22381的病毒株。
本发明第二方面提供了一种疫苗组合物，所述疫苗组合物以本发明第一方面所述的疫苗株为免疫原。
在一些实施方式中，所述疫苗组合物的原料包括所述免疫原和辅料。
在一些实施方式中，所述辅料为1313水佐剂。
在一些实施方式中，所述疫苗组合物为灭活疫苗组合物。
在一些实施方式中，所述猫泛白细胞减少症病毒疫苗株是灭活的。
在一些实施方式中，所述猫鼻气管炎病毒疫苗株是灭活的。
在一些实施方式中，所述猫鼻结膜炎病毒疫苗株是灭活的。
在一些实施方式中，在所述疫苗组合物中，所述猫泛白细胞减少症病毒疫苗株的用量、所述猫鼻气管炎病毒疫苗株的用量、所述猫鼻结膜炎病毒疫苗株和所述辅料的用量比为0.4-60×107.0TCID50：1.5-320×108.0TCID50：0.4-60×109.0TCID50：0-20ml(比如，5×107.0TCID50、10×107.0TCID50、15×107.0TCID50、20×107.0TCID50、25×107.0TCID50、30×107.0TCID50、35×107.0TCID50、45×107.0TCID50、50×107.0TCID50、55×107.0TCID50中的任一值：10×108.0TCID50、50×108.0TCID50、80×108.0TCID50、100×108.0TCID50、120×108.0TCID50、150×108.0TCID50、180×108.0TCID50、200×108.0TCID50、220×108.0TCID50、250×108.0TCID50、280×108.0TCID50、300×108.0TCID50中的任一值：5×109.0TCID50、10×109.0TCID50、15×109.0TCID50、20×109.0TCID50、25×109.0TCID50、30×109.0TCID50、35×109.0TCID50、40×109.0TCID50、45×109.0TCID50、50×109.0TCID50、55×109.0TCID50中的任一值：2ml、4ml、6ml、8ml、10ml、12ml、14ml、16ml、18ml中的任一值)；或者
所述猫鼻结膜炎病毒疫苗株的用量和所述辅料的用量比为1-100×109.0TCID50：0-10ml(比如，10×109.0TCID50、20×109.0TCID50、30×109.0TCID50、40×109.0TCID50、50×109.0TCID50、60×109.0TCID50、70×109.0TCID50、80×109.0TCID50、90×109.0TCID50中的任一值：2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml中的任一值)。
在一些实施方式中，在所述疫苗组合物中，所述猫泛白细胞减少症病毒疫苗株的用量、所述猫鼻气管炎病毒疫苗株的用量、所述猫鼻结膜炎病毒疫苗株和所述辅料的用量比为2-12×107.0TCID50：7-70×108.0TCID50：2-12×109.0TCID50：1-5ml；或者
所述猫鼻结膜炎病毒疫苗株的用量和所述辅料的用量比为6-32×109.0TCID50：1-5ml。
在一些实施方式中，在所述疫苗组合物的材料中，所述猫泛白细胞减少症病毒疫苗株的含量为106.0-108.5TCID50/ml。
在一些实施方式中，在所述疫苗组合物的材料中，所述猫鼻气管炎病毒疫苗株的含量为107.5-1010.5TCID50/ml。
在一些实施方式中，在所述疫苗组合物的材料中，所述猫鼻结膜炎病毒疫苗株的含量为108.0-1010.5TCID50/ml。
在一些实施方式中，所述猫泛白细胞减少症病毒疫苗株的TCID50是基于F81细胞培养根据Reed-Muench法计算得到的。
在一些实施方式中，所述猫鼻气管炎病毒疫苗株的TCID50是基于F81细胞培养根据Reed-Muench法计算得到的。
在一些实施方式中，所述猫鼻结膜炎病毒疫苗株的TCID50是基于F81细胞培养根据Reed-Muench法计算得到的。
本发明第三方面提供了本发明第二方面所述疫苗组合物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
将所述疫苗株制备成所述疫苗组合物。
在一些实施方式中，将所述疫苗株的与所述辅料混合，得到所述疫苗组合物。
在一些实施方式中，在F81细胞中培养收获病毒液，离心取上清或过滤取滤液，得到所述猫泛白细胞减少症病毒疫苗株。
在一些实施方式中，所述猫泛白细胞减少症病毒疫苗株的灭活条件为：甲醛溶液终浓度为0.05-0.15v/v％，温度25-37℃，时间24-48小时。
在一些实施方式中，用300-500KDa截留分子量的中空纤维浓缩所述猫泛白细胞减少症病毒疫苗株。
在一些实施方式中，在F81细胞中培养收获病毒液，离心取上清或过滤取滤液，得到所述猫鼻气管炎病毒疫苗株。
在一些实施方式中，所述猫鼻气管炎病毒疫苗株的灭活条件为：甲醛溶液终浓度为0.05-0.15v/v％，温度25-37℃，时间24-48小时。
在一些实施方式中，用300-500KDa截留分子量的中空纤维浓缩所述猫鼻气管炎病毒疫苗株。
在一些实施方式中，在F81细胞中培养收获病毒液，离心取上清或过滤取滤液，得到所述猫鼻结膜炎病毒疫苗株。
在一些实施方式中，所述猫鼻结膜炎病毒疫苗株的灭活条件为：甲醛溶液终浓度为0.05-0.15v/v％，温度25-37℃，时间24-48小时。
在一些实施方式中，用300-500KDa截留分子量的中空纤维浓缩所述猫鼻结膜炎病毒疫苗株。
本发明第四方面提供了一种本发明第一方面所述的疫苗株、本发明第二方面所述的疫苗组合物，或本发明第三方面所述的制备方法在制备用于单独使用或与其他免疫制剂或药物联合使用以治疗、预防、减缓和/或控制猫泛白细胞减少症、猫鼻气管炎和猫鼻结膜炎的制剂，或者治疗、预防、减缓和/或控制猫鼻气管炎的制剂中的用途。
附图说明
图1为FPV FP/15株细胞毒CPE照片。
图2为猫泛白细胞减少症病毒FPV FP/15株电镜照片。
图3为FH/AS株F3细胞毒CPE照片。
图4为猫鼻气管炎病毒FH/AS株电镜照片。
图5为FC/HF株F5细胞毒CPE照片。
图6为猫鼻结膜炎病毒FC/HF株电镜照片。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。本发明没有详细说明的步骤、材料和参数是本领域常规操作且符合《中国兽药典》的相关规定。
本发明的TCID50是根据Reed-Muench法计算得到的。
试验动物
11～16g小鼠(清洁级/KM/雌性)，购自辽宁长生生物技术股份有限公司。2～4月龄健康易感猫购自辽阳市宠物市场。
检验用毒种
猫泛白细胞减少症病毒cFPV株细胞毒由辽宁益康生物股份有限公司保存和供应。
特异性血清
猫泛白细胞减少症病毒(P12株)阳性血清和阴性血清，猫鼻气管炎病毒(H13株)阳性血清和阴性血清，猫鼻结膜炎病毒(CC株)阳性血清和阴性血清，均由辽宁益康生物股份有限公司自制、鉴定和保存。
细胞
F81细胞购自武汉菌种保藏中心，由辽宁益康生物股份有限公司繁殖、鉴定、保管。
试剂
1313水佐剂，即Montanide IMS 1313，购自塞彼科(上海)特殊化学品有限公司。
引物
RABV-F：5’-ATGGTTCCTCAAGCTCTGTTGCT
RABV-R：5’-TCACAGTCCAGTCTCACTCCCAC
FPV-F：5’-CTCAGCCACCAACTAAAG
FPV-R：5’-GTAAGCCCAATGCTCTAT
FHV-F：5’-TCCGTCTAATGATGACACGTC
FHV-R：5’-GAATGTGGACTTAAGGATG
FCV-F：5’-TGTGATGTGTTCGAAGTTTG
FCV-R：5’-AATCAGGCCTAATATTGAAT
实施例1.猫泛白细胞减少症病毒FP/15株的获取、鉴定与测试
(1)病料来源
辽阳某动物诊所，病猫发生呕吐、腹泻等临床表现，最后消瘦死亡。临床诊断为疑似猫泛白细胞减少症，采集病猫肠管及内容物进行病毒分离鉴定和研究。
(2)病毒的分离、培养与形态表征
取少许病料，加入35ml DMEM(含青霉素最终浓度为100U/ml，链霉素100mg/ml)培养基进行充分研磨使其成为匀浆后，12000rpm/min，离心30min。吸取上清液，在无菌条件下用0.22μm过滤除菌。将滤出液0.5ml同步接种用含8％新生牛血清的DMEM培养液传代的F81细胞，按细胞密度为2～5×106cells/ml，置37℃、含5％CO2培养箱中培养观察5日。出现病变的细胞，冻融2次，收集细胞培养液。将收获的出现病变的细胞培养液取0.5ml进行PCR鉴定；其余分别接种F81细胞扩大培养5次，待细胞出现病变后，冻融2次，1ml分装，将接种病料后和继代出现细胞病变的5代病毒液分别收集，冻干后，-70℃冰柜中保存。
将疑似病料分装标记为FP/15株(将病料中潜在的毒株暂称作FP/15株)组织毒F0代；F0代同步接种F81细胞3个T25细胞培养瓶，在病料接种后第4日后出现了细胞病变，收集细胞培养液，冻融2次，收集细胞培养液，1ml分装，暂时标记为FP/15株细胞毒F1代；病变细胞出现拉网状、破碎、脱落。将F1代细胞培养物扩大4次，接种4日出现病变后收集冻融细胞液，1ml分装，标记。将F1、F3、F5代进行冻干保种，各代次均放-70℃冰箱保存备用。细胞病变见图1。用F81细胞培养病毒上清，采用常规的磷钨酸染色后作负染，电镜观察，电镜下观察有呈立体对称，大小为20～24nm，细小病毒样粒子，结果见图2。由此可以更加确信病料中含有猫泛白细胞减少症病毒。
(3)核酸鉴定
采用猫泛白细胞减少症病毒(FPV)VP2基因特异性引物FPV-F和FPV-R、猫鼻气管炎病毒(FHV)gD基因特异性引物FHV-F和FHV-R、猫鼻结膜炎病毒(FCV)Cap基因特异性引物FCV-F和FCV-R、狂犬病毒(RABV)G蛋白基因特异性引物RABV-F和RABV-R的特异性引物，通过PCR(前两种病毒)和RT-PCR(后两种病毒)方法针对处理的病料第0代和产生细胞病变培养液F1～F5代病毒进行检验。设置相应四种病毒的阳性毒株做阳性对照。对扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测。
结果：阳性对照均显示条带，6个代次培养液针对猫泛白细胞减少症病毒(FPV)检测结果为阳性条带，其他三种病毒检测结果为阴性条带。回收以FPV-F和FPV-R扩增的DNA扩增片段，委托辽宁库美公司进行序列测定。并与国内外已发表FPV病毒株相应核苷酸序列进行同源性比较。FP/15株与MEV JL mink China MT250783.seq之间的序列同源性高达98.2％。由此可以更加确信本实施例猫病例患有泛白细胞减少症。
(4)特异性检测
第F0、F1、F2、F3、F4、F5代种毒用含8％新生牛血清的DMEM细胞培养液稀释为200TCID50/0.1ml，取0.5ml与猫泛白细胞减少症病毒(P12株)特异性阳性血清(中和抗体效价不低于1:64)等量混合，37℃水浴中和1小时，接种96孔细胞培养板4孔，每孔0.1ml。同时设阴性血清中和对照、正常细胞对照、病毒对照各4孔。每孔加入F81细胞悬液(含8％新生牛血清的DMEM培养液)0.1ml，置37℃、5％CO2培养箱中培养并连续观察5日。
结果：6个代次病毒阳性血清中和组与细胞对照无细胞病变，阴性血清中和组和病毒对照均出现了拉网状、破碎、脱落的细胞病变。说明所分离的病毒为FPV。
(5)外源病毒检验
将F1～F5代病毒培养液与FPV特异性阳性血清(P12株)中和后，按照《中国兽药典》附录进行外源病毒检验。结果病毒被血清中和后，无红细胞凝集和红细胞吸附现象，接种F81细胞后未见产生致细胞病变作用。
(6)无菌检验
随机抽取第F1、F2、F3、F4、F5代病毒培养液，按《中国兽药典》附录进行检验。结果：TG培养基、GA培养基和GP培养基培养的5个代次毒种均无菌生长。
(7)支原体检验
随机抽取第F1、F2、F3、F4、F5代病毒培养液，按《中国兽药典》附录进行检验。结果：5个代次毒种接种的琼脂固体平板培养均无“煎蛋”状支原体菌落。阳性对照(猪鼻支原体)：固体培养基呈“煎蛋”状支原体菌落；液体培养基颜色变黄pH6.34，呈酸性。阴性对照：固体培养基无“煎蛋”状支原体菌落；液体培养基pH7.50。
(8)病毒含量测定
将分离的第F1、F2、F3、F4、F5次病毒分别用含8％新生牛血清的DMEM培养液做10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5、10-6稀释度，每个稀释度分别接种96孔细胞培养板8孔，每孔100μl。同时设细胞对照4孔。每孔加入F81细胞悬液(含8％新生牛血清的DMEM培养液)100μl，置37℃、含5％CO2培养箱中培养观察5日。根据Reed-Muench法计算TCID50。结果：F1-F5代次病毒含量依次为106.33TCID50/ml、106.43TCID50/ml、106.43TCID50/ml、106.5TCID50/ml、106.43TCID50/ml。
(9)毒力测定
F5代种毒攻毒后部分幼猫出现了精神沉郁、呕吐、轻度腹泻等症状。将第5代病毒培养液倍比稀释取10-1、10-2、10-3 3个稀释度，口服接种2～4月龄、且禁食不禁水24小时的猫泛白细胞减少症病毒中和抗体中和抗体不高于1﹕2的临床健康易感猫各5只，每只4.0ml，同时另取相同条件2只不接种作为空白对照猫，隔离饲养连续观察14日，根据Reed-Muench法计算ID50。
结果：FP/15株种毒F5代ID50为101.3/4ml，10-1、10-2、10-3 3个稀释度对应发病只数分别为3只、1只、0只，空白对照无发病，本病毒FP/15株F5代病毒对猫的致病性较弱。
(10)免疫原性
将第5代病毒培养液经6000rpm离心20分钟，取上清液得到纯化的病毒，用生理盐水为稀释液将纯化的病毒稀释为106.0TCID50/ml，用终浓度0.1％甲醛37℃灭活30小时后，将灭活的病毒液与1313佐剂按体积比7：3混合摇匀，制成灭活疫苗。
皮下接种2～4月龄临床健康易感猫(FPV中和抗体≤1:2)5只，每只1ml，21日后以相同剂量和相同免疫途径加强免疫一次。另取相同条件的猫2只不接种作为空白对照。加强免疫后21日连同对照猫分别采集血液，分离血清，通过固定病毒稀释血清法的中和试验测定血清FPV中和抗体效价。采血后采用口服接种方式攻击103.0TCID50/ml的cFPV强毒株，每只口服4ml。攻毒前免疫猫需禁食不禁水24小时，攻毒后隔离饲养观察14日，分别记录每组猫的临床表现。将毒种(FP/15株F5代)用含8％新生牛血清的DMEM培养液稀释成200TCID50/0.1ml，与2倍系列稀释的血清等量混合，置37℃中和1小时。每个稀释度接种4孔细胞，每孔100μl。同时设正常细胞对照4孔，每孔100μl含8％新生牛血清的DMEM培养液，病毒对照(200TCID50/0.1ml)4孔，每孔100μl。每孔加入F81细胞悬液(含8％新生牛血清的DMEM培养液)100μl，置37℃、含5％CO2培养箱中培养并连续观察5日。接种后，记录每组细胞的有无CPE的细胞孔数，然后计算其半数保护量(PD50)。能使50％细胞保护的最高血清稀释度即为该血清的中和效价。
结果：免疫组猫抗体效价分别为1:37.60、1:50.56、1:45.25、1:45.25、1:40.32，具有中和细胞中FPV的作用，免疫猫在攻击强毒后全部健活；对照猫抗体效价分别为0、0，在攻击强毒后全部发病且死亡。
(11)微生物保藏
本发明成功分离和建立猫泛白细胞减少症病毒原始种子批，命名该F81细胞适应株为FP/15株。本发明将所分离得到的F4猫泛白细胞减少症病毒FP/15株提交专利程序认可保藏机构保藏，其微生物保藏号是CGMCC No.22382；分类命名为：猫泛白细胞减少症病毒；保藏时间是：2021年4月23日：保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；该病毒株称作猫泛白细胞减少症病毒FP/15株、FPV FP/15株、FP/15株。
实施例2.猫鼻气管炎病毒FH/AS株的获取、鉴定与测试
(1)病料来源
于鞍山某宠物医院，其30日龄幼猫眼、鼻部出现大量分泌物，几日后眼部被分泌物封死，幼猫呼吸困难，经诊断该幼猫疑似猫鼻气管炎病发病，采集该发病幼猫鼻拭子放置于2ml含双抗(含青霉素最终浓度为100U/ml，链霉素100mg/ml)的DMEM培养基离心管中，用于病毒分离。
(2)病毒的分离、培养与形态表征
按照常规方法用8％新生牛血清的DMEM培养液复苏F81细胞，在37℃、含5％CO2培养箱中培养2～3日，待细胞长成单层后用0.25％胰蛋白酶消化细胞，分散后按1:2～1:4传代培养。取鼻拭子离心管经11000r/min离心30分钟后吸取上清液，在无菌条件下用0.22μm滤膜过滤除菌。取长成良好单层的F81细胞，弃去培养液，将处理后病毒液0.1％的接毒量接种于F81单层细胞上，37℃吸附1小时后补加2％新生牛血清的DMEM维持液，置37℃、含5％CO2培养箱中培养2日。当90％以上细胞出现病变时收获，冻融2次，收集细胞培养液，取少量进行鉴定；连续单层接种F81细胞扩大培养4次，出现病变后冻融细胞2次，分装后置-70℃以下保存。将疑似病猫鼻拭子的DMEM培养基经0.22μm滤膜过滤标记为FH/AS株(将病料中潜在的毒株暂称作FH/AS株)F0代；F0代单层接种F81细胞3个T25细胞培养瓶，接毒后37℃培养1～2日，出现了细胞出现了拉网状、破碎、脱落的细胞病变，当90％以上细胞出现典型病变时，收集细胞培养液，冻融2次，收集细胞培养液，分装，暂时标记为FH/AS株F1代。将F1代细胞培养物扩大4次，接种24～48小时出现病变后收集冻融细胞液，分装，标记。将F1、F3、F5代进行冻干保种，各代次均放-70℃冰箱保存备用。
F3代细胞病变见图3。用F81细胞培养的病毒上清采用常规的磷钨酸染色后作负染，然后进行电镜观察，病毒粒子直径约148nm，病毒粒子中心致密，具有囊膜，结果见图4。由此可以更加确信病料中含有猫鼻气管炎病毒。
(3)核酸鉴定
采用猫泛白细胞减少症病毒(FPV)VP2基因特异性引物FPV-F和FPV-R、猫鼻气管炎病毒(FHV)gD基因特异性引物FHV-F和FHV-R、猫鼻结膜炎病毒(FCV)Cap基因特异性引物FCV-F和FCV-R、狂犬病毒(RABV)G蛋白基因特异性引物RABV-F和RABV-R的特异性引物，通过PCR(前两种病毒)和RT-PCR(后两种病毒)方法针对处理的病料F0代和产生细胞病变培养液F1～F5代病毒进行检验。设置相应四种病毒的阳性毒株做阳性对照。对扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测。
结果：阳性对照均显示条带，5个代次培养液针对猫鼻气管炎病毒(FHV)检测结果为阳性条带，其他三种病毒检测结果为阴性条带。回收以FHV-F和FHV-R扩增的DNA扩增片段，委托辽宁库美公司进行序列测定。并与国内外已发表FHV病毒株相应核苷酸序列进行同源性比较。FH/AS株与FHV-1C-27FJ478159.seq之间的序列同源性高达99.1％。由此可以更加确信猫病例患有猫鼻气管炎。
(4)特异性检测
将F1～F5代病毒培养液用含2％新生牛血清的DMEM培养液将毒种稀释至200TCID50/0.1ml，取0.5ml与猫鼻气管炎病毒(H13株)特异性阳性血清(中和抗体效价不低于1:32)等量混合，37℃作用1小时后，接种已长成良好单层、弃去细胞培养液的96孔F81细胞培养板4孔，每孔100μl，同时设正常细胞对照4孔，每孔100μl含2％新生牛血清的DMEM培养液；病毒对照(200TCID50/0.1ml)4孔，每孔100μl；阴性血清对照孔4孔，每孔100μl。每孔补加含2％新生牛血清的DMEM培养液100μl，置37℃、含5％CO2培养箱中培养并连续观察5日。通过已知FHV(H13株)阳性血清分别与分离的F1～F5代病毒混合中和后，单层接种F81细胞后5日，阳性血清中和组无细胞病变，阴性血清中和组和病毒对照均出现了拉网状、破碎、脱落的细胞病变。说明所分离的病毒为FHV。
(5)外源病毒检验
将F1～F5代病毒培养液与FHV(H13株)特异性阳性血清中和后，按照《中国兽药典》附录进行外源病毒检验。结果病毒被血清中和后，无特异性荧光、无红细胞凝集和红细胞吸附现象，接种F81细胞后未见产生致细胞病变作用。
(6)无菌检验
随机抽取第F1、F2、F3、F4、F5代病毒培养液，按《中国兽药典》附录进行检验。结果：TG培养基、GA培养基和GP培养基培养的5个代次毒种均无菌生长。
(7)支原体检验
随机抽取第F1、F2、F3、F4、F5代病毒培养液，按《中国兽药典》附录进行检验。结果：5个代次毒种接种的琼脂固体平板培养均无“煎蛋”状支原体菌落。阳性对照(猪鼻支原体)：固体培养基呈“煎蛋”状支原体菌落；液体培养基颜色变黄pH6.42，呈酸性。阴性对照：固体培养基无“煎蛋”状支原体菌落；液体培养基pH7.53。
(8)病毒含量测定
将F1～F5代病毒培养液用含2％新生牛血清的DMEM培养液作10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8、10-9 4个稀释度，分别接种已长成良好单层、弃去细胞培养液的96孔F81细胞培养板，每个稀释度接种8孔，每孔100μl，同时设正常细胞对照，每孔加2％新生牛血清DMEM培养液100μl。每孔补加含2％新生牛血清的DMEM细胞培养液100μl，在37℃、含5％CO2培养箱中培养观察5日，以Reed-Muench法计算TCID50。
结果：F1-F5代次病毒含量依次为107.5TCID50/ml、107.75TCID50/ml、108.0TCID50/ml、10 7.83TCID50/ml、108.0TCID50/ml。
(9)毒力测定
将F5代病毒培养液用生理盐水作10倍系列稀释，取10-1、10-2、10-3 3个稀释度，各滴鼻接种2～4月龄猫鼻气管炎病毒中和抗体不高于1:2的临床健康易感猫各5只，每只2.0ml。同时另取相同条件2只不接种作为空白对照猫，隔离饲养连续观察14日，根据Reed-Muench法计算ID50。将FH/AS株F5代病毒培养液做10倍系列稀释攻毒健康易感猫各5只，攻毒后猫全部出现泪眼或眼屎、脓涕、喷嚏、呼吸困难等症状，在14日内全部发病和部分死亡，ID50为102.3/2ml。
结果：本猫鼻气管炎病毒FH/AS株具有较强的毒力，107.5TCID50/ml滴鼻2ml可以导致5只接种猫全部发病(出现泪眼或眼屎、脓涕、喷嚏、呼吸困难等发病症状，严重者死亡)和部分死亡。具体为：10-1倍稀释度组5只发病，2只死亡，10-2倍稀释度组4只发病，1只死亡，10-3倍稀释度组无发病，无死亡，空白对照无发病，无死亡。
(10)免疫原性
将F5代病毒培养液经6000rpm离心20分钟，取上清液得到纯化的病毒，用生理盐水为稀释液将纯化的病毒稀释至每毫升107.5TCID50，用终浓度0.1％的甲醛溶液(v/v)灭活后，将灭活的病毒液与1313佐剂按体积比7:3混合，制成灭活疫苗。2～4月龄猫鼻气管炎病毒中和抗体不高于1:2的临床健康易感猫5只，每只1ml，21日后以相同方法加强免疫1次，另取条件相同的猫2只不接种作为空白对照。加强免疫后21日，连同对照猫分别采集血液，分离血清，测定猫鼻气管炎中和抗体效价。采血后采用滴鼻接种方式攻毒107.5TCID50/ml的FH/AS株F5代病毒液，每只2ml。攻毒前免疫猫需禁食不禁水24小时，攻毒后隔离饲养观察14日，分别记录每组猫的临床表现。将毒种(FH/AS株F5代)用2％新生牛血清的DMEM细胞培养液稀释为200TCID50/0.1ml，与2倍系列稀释的血清等量混合，置37℃中和1小时。每个稀释度接种已长成良好单层、弃去细胞培养液的4孔F81细胞，每孔100μl，同时设正常细胞对照4孔，每孔100μl 2％新生牛血清DMEM培养液，病毒对照(200TCID50/0.1ml)4孔，每孔100μl。每孔补加含2％新生牛血清的DMEM细胞培养液100μl，置37℃、含5％CO2培养箱中培养并连续观察5日。记录每组细胞的有无CPE的细胞孔数，然后计算其半数保护量(PD50)。能使50％细胞保护的最高血清稀释度即为该血清的中和效价。
结果：免疫组猫抗体效价分别为1:10.08、1:8、1:20.16、1:16、1:37.6，具有中和细胞中FHV的作用；免疫猫在攻击强毒后全部健活；对照猫抗体效价分别为0、0，对照猫在攻击强毒后全部发病且死亡。
(11)微生物保藏
本发明成功分离和建立猫鼻气管炎病毒原始种子批，命名该F81细胞适应株为FH/AS株。本发明将所分离得到的F4猫鼻气管炎病毒FH/AS株提交专利程序认可保藏机构保藏，其微生物保藏号是CGMCC No.22383；分类命名为：猫鼻气管炎病毒；保藏时间是：2021年4月23日：保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；该病毒株称作猫鼻气管炎病毒FH/AS株、FHV FH/AS株、FH/AS株。
实施例3.猫鼻结膜炎病毒FC/HF株的获取、鉴定与测试
(1)病料来源
沈阳某宠物医院的发病幼猫中分离获得，幼猫出生后40天后出现口腔粘膜溃疡，鼻腔粘膜潮红，鼻分泌物增多继而死亡等临床症状，疑似死于猫鼻结膜炎，采集发病猫口腔、鼻分泌物棉拭子放置于2ml含双抗(含青霉素最终浓度为100U/ml，链霉素100mg/ml)的DMEM培养基离心管中，用于病毒分离。
(2)病毒的分离、培养与形态表征
按照常规方法用8％新生牛血清的DMEM培养液复苏F81细胞，在37℃、含5％CO2培养箱中培养2～3日，待细胞长成单层后用0.25％胰蛋白酶消化细胞，分散后按1:2～1:4传代培养。取鼻拭子离心管经11000r/min离心30分钟后吸取上清液，在无菌条件下用0.22μm滤膜过滤除菌。取长成良好单层的F81细胞，弃去培养液，将处理后病毒液0.01％的接毒量接种于F81单层细胞上，37℃吸附1小时后补加2％新生牛血清的DMEM维持液，置37℃、含5％CO2培养箱中培养1～2日。当90％以上细胞出现病变时收获，冻融2次，收集细胞培养液，取少量进行鉴定；连续单层接种F81细胞扩大培养4次，出现病变后冻融细胞2次，分装后置-70℃以下保存。将疑似病猫鼻拭子的DMEM培养基经0.22μm滤膜过滤标记为FC/HF株(将病料中潜在的毒株暂称作FC/HF株)F0代；F0代单层接种F81细胞2个T75细胞培养瓶，接毒后在病料接种后24～48小时出现了细胞出现了拉网状、破碎、脱落的细胞病变，收集细胞培养液，冻融2次，收集细胞培养液，分装，暂时标记FC/HF株F1代。将F1代细胞培养物扩大4次，接种24～48小时出现病变后收集冻融细胞液，分装，标记。将F1、F3、F5代进行冻干保种，各代次均放-70℃冰箱保存备用。
F5代细胞病变见图5。用F81细胞培养的病毒上清采用常规的磷钨酸染色后作负染，然后进行电镜观察，杯状病毒粒子样病毒，病毒大小为35～39nm、无囊膜，结果见图6。由此可以更加确信病料中含有猫鼻结膜炎病毒。
(3)核酸鉴定
采用猫泛白细胞减少症病毒(FPV)VP2基因特异性引物FPV-F和FPV-R、猫鼻气管炎病毒(FHV)gD基因特异性引物FHV-F和FHV-R、猫鼻结膜炎病毒(FCV)Cap基因特异性引物FCV-F和FCV-R、狂犬病毒(RABV)G蛋白基因特异性引物RABV-F和RABV-R的特异性引物，通过PCR(前两种病毒)和RT-PCR(后两种病毒)方法针对处理的病料第0代和产生细胞病变培养液F1～F5代病毒进行检验。设置相应四种病毒的阳性毒株做阳性对照。对扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果：阳性对照均显示条带，6个代次培养液针对猫鼻结膜炎病毒(FCV)检测结果为阳性条带，其他三种病毒检测结果为阴性条带。回收以FCV-F和FCV-R扩增的DNA扩增片段，委托辽宁库美公司进行序列测定。并与国内外已发表FCV病毒株相应核苷酸序列进行同源性比较。FC/HF株与Feline calicivirus Z11536.seq之间的序列同源性高达99.5％。由此可以更加确信猫病例患有猫鼻结膜炎。
(4)特异性检测
将F1～F5代病毒培养液用含2％新生牛血清的DMEM培养液将毒种稀释至200TCID50/0.1ml，取0.5ml与猫鼻结膜炎病毒特异性阳性血清(CC株，中和抗体效价不低于1:64)等量混合，37℃作用1小时后，接种已长成良好单层、弃去细胞培养液的96孔F81细胞培养板4孔，每孔100μl，同时设正常细胞对照4孔，每孔100μl含2％新生牛血清的DMEM培养液；病毒对照(200TCID50/0.1ml)4孔，每孔100μl；阴性血清对照孔4孔，每孔100μl。每孔补加含2％新生牛血清的DMEM培养液100μl，置37℃、含5％CO2培养箱中培养并观察3日。
结果：6个代次病毒阳性血清中和组与细胞对照无细胞病变，阴性血清中和组和病毒对照均出现了拉网状、破碎、脱落的细胞病变。说明所分离的病毒为FCV。
(5)外源病毒检验
将F1～F5代病毒培养液与FCV(CC株)特异性阳性血清中和后，按照《中国兽药典》附录进行外源病毒检验。结果病毒被血清中和后，无特异性荧光、无红细胞凝集和红细胞吸附现象，接种F81细胞后未见产生致细胞病变作用。
(6)无菌检验
随机抽取第F1、F2、F3、F4、F5代病毒培养液，按《中国兽药典》附录进行检验。结果：TG培养基、GA培养基和GP培养基培养的5个代次毒种均无菌生长。
(7)支原体检验
随机抽取第F1、F2、F3、F4、F5代病毒培养液，按《中国兽药典》附录进行检验。结果：5个代次毒种接种的琼脂固体平板培养均无“煎蛋”状支原体菌落。阳性对照(猪鼻支原体)：固体培养基呈“煎蛋”状支原体菌落；液体培养基颜色变黄pH6.34，呈酸性。阴性对照：固体培养基无“煎蛋”状支原体菌落；液体培养基pH7.50。
(8)病毒含量测定
将F1～F5代病毒培养液用含2％新生牛血清的DMEM培养液作10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8、10-9 4个稀释度，分别接种已长成良好单层、弃去细胞培养液的96孔F81细胞培养板，每个稀释度接种8孔，每孔100μl，同时设正常细胞对照4孔，每孔加2％新生牛无血清DMEM培养液100μl。每孔补加含2％新生牛血清的DMEM培养液100μl，在37℃、5％CO2培养箱中培养观察3日，通过接种F81细胞后观察和记录细胞病变，以Reed-Muench法计算TCID50。
结果：F1-F5代次病毒含量依次为108.5TCID50/ml、108.83TCID50/ml、108.0TCID50/ml、108.5TCID50/ml、108.5TCID50/ml。
(9)毒力测定
将F5代病毒培养液稀释为108.0TCID50/ml，用生理盐水作10倍系列稀释，取100、10-1、10-2 3个稀释度，滴鼻和点眼接种2～4月龄猫鼻结膜炎病毒中和抗体不高于1:2的临床健康易感猫5只，每只2.0ml，滴鼻和点眼各1ml。同时另取相同条件2只不接种作为空白对照猫，隔离饲养连续观察14日，根据Reed-Muench法计算ID50。将FC/HF株F5代病毒培养液稀释为108.0TCID50/ml攻毒健康易感猫5只，攻毒后猫全部出现口腔粘膜溃疡、鼻腔粘膜潮红、鼻分泌物增多等症状，无死亡。10倍系列稀释为107.0TCID50/ml、106.0TCID50/ml攻毒健康易感猫各5只，攻毒猫只部分发病或无发病，ID50为102.1/2ml。
结果：10-0倍稀释度组5只发病，0只死亡，10-1倍稀释度组3只发病，0只死亡，10-2倍稀释度组无发病，无死亡，空白对照无发病，无死亡。
(10)免疫原性
将F5代病毒培养液经6000rpm离心20分钟，取上清液得到纯化的病毒，用生理盐水为稀释液将纯化的病毒稀释至每毫升108.0TCID50，用终浓度0.1％的甲醛溶液(v/v)灭活后，将灭活的病毒液与1313佐剂按体积比7:3混合，制成灭活疫苗。2～4月龄猫鼻结膜炎病毒中和抗体不高于1:2的临床健康易感猫5只，每只1ml，21日后以相同方法加强免疫1次，另取条件相同的猫2只不接种作为空白对照。加强免疫后21日，连同对照猫分别采集血液，分离血清，测定猫鼻结膜炎中和抗体效价。采血后采用滴鼻和点眼各1ml的接种方式攻毒108.0TCID50/ml的FC/HF株F5代病毒液，每只2ml。攻毒前免疫猫需禁食不禁水24小时，攻毒后隔离饲养观察14日，分别记录每组猫的临床表现。将毒种(FC/HF株F5代)用2％新生牛血清的DMEM细胞培养液稀释为200TCID50/0.1ml，与2倍系列稀释的血清等量混合，置37℃中和1小时。每个稀释度接种已长成良好单层、弃去细胞培养液的4孔F81细胞，每孔100μl，同时设正常细胞对照4孔，每孔100μl2％新生牛血清DMEM培养液，病毒对照(200TCID50/0.1ml)4孔，每孔100μl。每孔补加含2％新生牛血清的DMEM细胞培养液100μl，置37℃、含5％CO2培养箱中培养并连续观察3日。记录每组细胞的有无CPE的细胞孔数，然后计算其半数保护量(PD50)。能使50％细胞保护的最高血清稀释度即为该血清的中和效价。
结果：免疫组猫抗体效价分别为1:92.32、1:121.5、1:70.15、1:70.15、1:64，具有中和细胞中FCV的作用，免疫猫在攻击强毒后全部健活；对照猫抗体效价分别为0、1:2，在攻击强毒后全部死亡。
(11)微生物保藏
本发明成功分离和建立猫鼻结膜炎病毒原始种子批，命名该F81细胞适应株为FC/HF株。本发明将所分离得到的F4猫鼻结膜炎病毒FC/HF株提交专利程序认可保藏机构保藏，其微生物保藏号是CGMCC No.22381；分类命名为：猫鼻结膜炎病毒；保藏时间是：2021年4月23日：保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；该病毒株称作猫鼻结膜炎病毒FC/HF株、FCV FC/HF株、FC/HF株。
实施例4.联苗的制备
本实施例所用反应器为5L搅拌式反应器(型号：DOE B5L)购自苏州迪欧益生物科技有限公司。
(1)猫泛白细胞减少症病毒FP/15株制苗用病毒液的制备
待反应器中F81悬浮细胞密度达2.0×106个/ml以上时，用细胞生长液(MDBKMedium A培养基，购自甘肃健顺生物科技有限公司)稀释细胞至0.3×106～0.8×106个/ml，按MOI值0.001～0.05接种猫泛白细胞减少症病毒FP/15株生产种毒(实施例1中的F15代毒株)，设定反应器病毒培养参数(pH值7.2～7.4、DO 40％～60％、温度36～37℃)，进行病毒培养，培养72～120小时收获培养物，留样备检。
以实施例1步骤(3)相同的方法测量病毒含量，差别在于取10-4、10-5、10-6、10-7 4个稀释度，三个批次每毫升病毒含量依次为：106.0TCID50、106.0TCID50、106.5TCID50。
(2)猫鼻气管炎病毒FH/AS株制苗用病毒液的制备
待反应器中F81悬浮细胞密度达2.0×106个/ml以上时，采用细胞生长液MDBKMedium A培养基稀释，按MOI值0.01～0.1接种猫鼻气管炎病毒FH/AS株生产种毒(实施例2中的F15代毒株)，设定反应器病毒培养参数(pH值7.2～7.4、DO 40％～60％、温度36～37℃)，进行病毒培养，培养36～72小时收获培养物，留样备检。
以实施例2步骤(8)相同的方法测量病毒含量，三个批次每毫升病毒含量依次为：108.0TCID50、107.5TCID50、108.5TCID50。
(3)猫鼻结膜炎病毒FC/HF株制苗用病毒液的制备
待反应器中F81悬浮细胞密度达2.0×106个/ml以上时，采用采用细胞生长液MDBKMedium A培养基稀释，按MOI值0.01～0.1接种猫鼻结膜炎病毒FC/HF株生产种毒(实施例3中的F15代毒株)，设定反应器病毒培养参数(pH值7.2～7.4、DO 40％～60％、温度36～37℃)，进行病毒培养，培养24～48小时收获培养物，留样备检。
以实施例3步骤(8)相同的方法测量病毒含量，三个批次每毫升病毒含量依次为：108.5TCID50、108.67TCID50、108.0TCID50。
分别取甲醛溶液以终浓度为0.1％(v/v)加入前述收获的猫泛白细胞减少症病毒FP/15株制苗用病毒液、猫鼻气管炎病毒FH/AS株制苗用病毒液、猫鼻结膜炎病毒FC/HF株制苗用病毒液中混匀，37℃搅拌灭活30小时，取样备检。灭活病毒液2～8℃保存，备用。将前述三种灭活病毒液分别接种于F81细胞测试，均无CPE，证明了它们灭活均已经完全。
(4)病毒纯化浓缩
取灭活后的前述三种各三个批次的病毒抗原液分别经6000rpm离心20分钟，取上清液得到纯化的病毒。各批纯化的病毒液均采用300KDa截留分子量的中空纤维进行浓缩10倍，去除大部分杂蛋白。
(5)无菌检验
将过滤纯化的三种病毒溶液的三个批次分别按《中国兽药典》附录进行检验。结果：TG培养基、GA培养基和GP培养基培养的12份样本均无菌生长。
(6)三联灭活疫苗的制备
将无菌检验合格已灭活的三种纯化浓缩的病毒溶液，按猫泛白细胞减少症病毒:猫鼻气管炎病毒:猫鼻结膜炎病毒溶液体积比1:1:1混合均匀，得到病毒混合液，取病毒混合液与1313水佐剂按体积比7:3混合，搅拌均匀，分装1ml/头份/瓶，加盖密封、贴标签。得到三联灭活疫苗，简称三联苗。
共制备了三批三联苗，前述三种病毒溶液各自第一批组合得到第一批三联苗，前述三种病毒溶液各自第二批组合得到第二批三联苗，前述三种病毒溶液各自第三批组合得到第三批三联苗。
(7)无菌检验
针对前述三批三联苗，分别按《中国兽药典》附录进行检验。结果：TG培养基、GA培养基和GP培养基培养均无菌生长。
(8)性状
前述三批三联苗均为均匀混悬液，静置出现微量灰白色沉淀。
实施例5.猫三联灭活疫苗安全性研究
(1)剂量与安全性测试
试验动物：2～4月龄健康易感猫34只，临床指标正常，猫泛白细胞减少症、猫鼻气管炎和猫鼻结膜炎中和抗体效价均不高于1:2，辽宁益康生物股份有限公司提供(购自辽阳市宠物市场)。
一次单剂量接种的安全性试验方法：取2～4月龄健康易感猫15只，随机分成3组，5只/组，三批三联苗分别以皮下途径注射2～4月龄健康易感猫5只，每只1.0ml，同时设置2只健康易感猫为对照组(灭菌生理盐水替代疫苗)，观察14日并记录结果。
单剂量重复接种的安全性试验方法：在单剂量安全性试验接种猫基础上，间隔14日，按相同途径、相同剂量重复注射1次同批次疫苗，同时设置2只健康易感猫为对照组(灭菌生理盐水替代疫苗)，观察14日并记录结果。
一次超剂量接种的安全性试验：取2～4月龄健康易感猫15只，随机分成3组，5只/组，三批三联苗分别以皮下途径注射2～4月龄健康易感猫5只，每只2.0ml，同时设置2只健康易感猫为对照组(灭菌生理盐水替代疫苗)，观察14日并记录结果。各组猫在相同条件下隔离饲养，免疫后每组记录实验猫的精神状况、全身反应、局部反应，观察14日。
前述所有注射疫苗猫精神良好，行为未见异常，粪便正常，采食、饮水未见异常，未见局部红、肿、疹、硬结，无全身反应，体温未见异常，注射疫苗猫与对照猫未见明显差别。实验结果表明猫三联灭活疫苗皮下接种猫安全。
(2)猫三联灭活疫苗对怀孕母猫的安全性试验
试验动物：取怀孕4～6周龄母猫共7只，辽宁益康生物股份有限公司提供(购自辽阳市宠物市场)。取怀孕母猫7只，免疫组5只，皮下接种第一批三联疫苗，2.0ml/只；对照组2只，皮下接种灭菌生理盐水，2.0ml/只。接种后连续观察14日记录实验。
前述所有注射疫苗猫精神良好，行为未见异常，粪便正常，采食、饮水未见异常，未见局部红、肿、疹、硬结，无全身反应，体温未见异常，未出现流产，未出现死胎，注射疫苗猫与对照猫未见明显差别。母猫观察期内各观察指标正常，仔猫出生至断奶均未出现采食异常、生长缓慢和死亡等现象，精神状态正常，采食正常。实验结果表明说明猫三联灭活疫苗对怀孕母猫安全。
(3)猫三联灭活疫苗对非靶动物小鼠的安全性试验
试验动物：11～16g小鼠(清洁级/KM/雌性)，购自辽宁长生生物科技股份有限公司。取11～16g小白鼠40只，随机分成4组，每组10只，实验组采用腹腔注射方式，0.5ml/只；对照组腹腔接种灭菌生理盐水，0.5ml/只。接种后连续观察7日。
前述所有注射疫苗小鼠精神良好，行为未见异常，粪便正常，采食、饮水未见异常，腹腔内疫苗吸收完全，剖检肺、肝、脾、肾未见异常，注射疫苗小鼠与对照小鼠未见明显差别。说明本疫苗对非靶动物小白鼠安全。
实施例6.猫三联灭活疫苗有效性研究
(1)疫苗有效性测试
选取2～4月龄健康易感猫60只，随机分为4大组，每大组随机分为3小组，每小组5只。第1大组15只猫作为免疫组，采用第一批三联苗，各皮下注射1.0ml疫苗，免疫后21日同样方法加强免疫1次。第2大组15只猫作为免疫组，采用第二批三联苗，各皮下注射1.0ml疫苗，免疫后21日同样方法加强免疫1次。第3大组15只猫作为免疫组，采用第三批三联苗，各皮下注射1.0ml疫苗，免疫后21日同样方法加强免疫1次。第4大组15只猫作为对照组，不接种疫苗。
加强免疫后21日对所有猫采血进行免疫效价测定，在每个大组中，针对第一小组，采用实施例1步骤(10)相同的方法，以泛白细胞减少症病毒FP/15株为检测抗原，测定猫泛白细胞减少症病毒抗体效价。针对第二小组，采用实施例2步骤(10)相同的方法，以鼻气管炎病毒FH/AS株为检测抗原，测定猫鼻气管炎病毒抗体效价。针对第三小组，采用实施例3步骤(10)相同的方法，以鼻结膜炎病毒HF株为检测抗原，测定猫鼻结膜炎病毒抗体效价。
采血测定抗体效价之后，在每个大组中，针对第一小组，猫口服猫泛白细胞减少症病毒cFPV株检验毒4ml(103.0TCID50/ml)，攻毒后连续观察14日。针对第二小组，滴鼻猫鼻气管炎病毒FH/AS株检验毒2.0ml(107.5TCID50/ml)，攻毒后连续观察14日。针对第三小组，点眼和滴鼻猫鼻结膜炎病毒FC/HF株检验毒各1.0ml，共2ml(108.0TCID50/ml)攻毒后连续观察14。观察每个大组的每个小组的每只猫的抗体效价以及攻毒保护情况。
第一批疫苗结果：猫泛白细胞减少症部分，血清中和抗体效价为1:45.25～1:90.51，攻毒保护为100％；猫鼻气管炎部分，血清中和抗体效价为1:22.03～1:32，攻毒保护为100％；猫鼻结膜炎部分，血清中和抗体效价为1:80.63～1:139.58，攻毒保护为100％。
第二批疫苗结果：猫泛白细胞减少症部分，血清中和抗体效价为1:64～1:101.59，攻毒保护为100％；猫鼻气管炎部分，血清中和抗体效价为1:16～1:46.48，攻毒保护为100％；猫鼻结膜炎部分，血清中和抗体效价为1:90.51～1:117.38，攻毒保护为100％。
第三批疫苗结果：猫泛白细胞减少症部分，血清中和抗体效价为1:45.25～1:128，攻毒保护为100％；猫鼻气管炎部分，血清中和抗体效价为1:21.77～1:40.32，攻毒保护为100％；猫鼻结膜炎部分，血清中和抗体效价为1:88.13～1:128，攻毒保护为100％。
对照组结果：猫泛白细胞减少症部分，血清中和抗体效价均为0，攻毒保护为0％；猫鼻气管炎部分，血清中和抗体效价均为0，攻毒保护为0％；猫鼻结膜炎部分，血清中和抗体效价均为0，攻毒保护为0％。
由此可见，本发明制备的三联苗能够针对猫泛白细胞减少症病毒、猫鼻气管炎病毒和猫鼻结膜炎病毒产生有效的免疫保护。
(2)疫苗最小有效剂量测试
选取2～4月龄健康易感猫75只，随机分为5大组，每大组随机分为3小组，每小组5只。第1大组15只猫作为免疫组，采用第一批三联苗，各皮下注射0.1ml疫苗，免疫后21日以同种剂量和方式加强免疫1次。第2大组15只猫作为免疫组，采用第一批三联苗，各皮下注射0.25ml疫苗，免疫后21日以同种剂量和方式加强免疫1次。第3大组15只猫作为免疫组，采用第一批三联苗，各皮下注射0.5ml疫苗，免疫后21日以同种剂量和方式加强免疫1次。第4大组15只猫作为免疫组，采用第一批三联苗，各皮下注射1.0ml疫苗，免疫后21日以同种剂量和方式加强免疫1次。第5大组15只猫作为对照组，不接种疫苗。各组动物在同环境和条件下进行饲养。
二免后21日采血进行免疫效价测定，在每个大组中，针对第一小组，采用实施例1步骤(10)相同的方法，以泛白细胞减少症病毒FP/15株为检测抗原，测定猫泛白细胞减少症病毒抗体效价。针对第二小组，采用实施例2步骤(10)相同的方法，以鼻气管炎病毒FH/AS株为检测抗原，测定猫鼻气管炎病毒抗体效价。针对第三小组，采用实施例3步骤(10)相同的方法，以鼻结膜炎病毒HF株为检测抗原，测定猫鼻结膜炎病毒抗体效价。
采血测定抗体效价之后，在每个大组中，针对第一小组，猫口服猫泛白细胞减少症病毒cFPV株检验毒4ml(103.0TCID50/ml)，攻毒后连续观察14日。针对第二小组，滴鼻猫鼻气管炎病毒FH/AS株检验毒2.0ml(107.5TCID50/ml)，攻毒后连续观察14日。针对第三小组，点眼和滴鼻猫鼻结膜炎病毒FC/HF株检验毒各1.0ml，共2ml(108.0TCID50/ml)攻毒后连续观察14。每个大组的每个小组的每只猫的抗体效价以及攻毒保护情况。
0.1头份/只免疫组结果：猫泛白细胞减少症部分，血清中和抗体效价为1:8～1:17.45，攻毒保护为40％；猫鼻气管炎部分，血清中和抗体效价为1:2～1:6.35，攻毒保护为60％，；猫鼻结膜炎部分，血清中和抗体效价为1:12.7～1:32，攻毒保护为20％。
0.25头份/只免疫组结果：猫泛白细胞减少症部分，血清中和抗体效价为1:16～1:22.63，攻毒保护为80％；猫鼻气管炎部分，血清中和抗体效价为1:4～1:10.08，攻毒保护为80％；猫鼻结膜炎部分，血清中和抗体效价为1:32～1:46.48，攻毒保护为80％。
0.5头份/只免疫组结果：猫泛白细胞减少症部分，血清中和抗体效价为1:32～1:64，攻毒保护为100％；猫鼻气管炎部分，血清中和抗体效价为1:8～1:16，攻毒保护为100％；猫鼻结膜炎部分，血清中和抗体效价为1:64～1:90.51，攻毒保护为100％。
1头份/只免疫组结果：猫泛白细胞减少症部分，血清中和抗体效价为1:45.25～1:101.59，攻毒保护为100％；猫鼻气管炎部分，血清中和抗体效价为1:16～1:46.48，攻毒保护为100％；猫鼻结膜炎部分，血清中和抗体效价为1:80.63～1:128，攻毒保护为100％。
对照组结果：猫泛白细胞减少症部分，血清中和抗体效价为0，攻毒保护为0％；猫鼻气管炎部分，血清中和抗体效价为0，攻毒保护为0％；猫鼻结膜炎部分，血清中和抗体效价为0，攻毒保护为0％。
由此可见，本发明制备的三联苗能够针对猫泛白细胞减少症病毒、猫鼻气管炎病毒和猫鼻结膜炎病毒产生有效的免疫保护。
由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。

Claims (28)

1.一种疫苗株，所述疫苗株为猫泛白细胞减少症病毒疫苗株、猫鼻气管炎病毒疫苗株和猫鼻结膜炎病毒疫苗株的组合；或者
所述疫苗株为猫鼻结膜炎病毒疫苗株；
其中，所述猫泛白细胞减少症病毒疫苗株是微生物保藏号为CGMCC No.22382的病毒株；
所述猫鼻气管炎病毒疫苗株是微生物保藏号为CGMCC No.22383的病毒株；
所述猫鼻结膜炎病毒疫苗株是微生物保藏号为CGMCC No.22381的病毒株。
2.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物以权利要求1所述的疫苗株为免疫原。
3.如权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物的原料包括所述免疫原和辅料。
4.如权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述辅料为1313水佐剂。
5.如权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物为灭活疫苗组合物。
6.如权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猫泛白细胞减少症病毒疫苗株是灭活的。
7.如权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猫鼻气管炎病毒疫苗株是灭活的。
8.如权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猫鼻结膜炎病毒疫苗株是灭活的。
9.如权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，在所述疫苗组合物中，所述猫泛白细胞减少症病毒疫苗株的用量、所述猫鼻气管炎病毒疫苗株的用量、所述猫鼻结膜炎病毒疫苗株和所述辅料的用量比为0.4-60×107.0TCID50：1.5-320×108.0TCID50：0.4-60×109.0TCID50：0-20ml；或者
所述猫鼻结膜炎病毒疫苗株的用量和所述辅料的用量比为1-100×109.0TCID50：0-10ml。
10.如权利要求9所述的疫苗组合物，其特征在于，在所述疫苗组合物中，所述猫泛白细胞减少症病毒疫苗株的用量、所述猫鼻气管炎病毒疫苗株的用量、所述猫鼻结膜炎病毒疫苗株和所述辅料的用量比为2-12×107.0TCID50：7-70×108.0TCID50：2-12×109.0TCID50：1-5ml；或者
所述猫鼻结膜炎病毒疫苗株的用量和所述辅料的用量比为6-32×109.0TCID50：1-5ml。
11.如权利要求9所述的疫苗组合物，其特征在于，在所述疫苗组合物的材料中，所述猫泛白细胞减少症病毒疫苗株的含量为106.0-108.5TCID50/ml。
12.如权利要求9所述的疫苗组合物，其特征在于，在所述疫苗组合物的材料中，所述猫鼻气管炎病毒疫苗株的含量为107.5-1010.5TCID50/ml。
13.如权利要求9所述的疫苗组合物，其特征在于，在所述疫苗组合物的材料中，所述猫鼻结膜炎病毒疫苗株的含量为108.0-1010.5TCID50/ml。
14.如权利要求9所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猫泛白细胞减少症病毒疫苗株的TCID50是基于F81细胞培养根据Reed-Muench法计算得到的。
15.如权利要求9所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猫鼻气管炎病毒疫苗株的TCID50是基于F81细胞培养根据Reed-Muench法计算得到的。
16.如权利要求9所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猫鼻结膜炎病毒疫苗株的TCID50是基于F81细胞培养根据Reed-Muench法计算得到的。
17.如权利要求2-16中任一项所述疫苗组合物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
将所述疫苗株制备成所述疫苗组合物。
18.如权利要求17所述的制备方法，其特征在于，将所述疫苗株与所述辅料混合，得到所述疫苗组合物。
19.如权利要求17所述的制备方法，其特征在于，在F81细胞中培养收获病毒液，离心取上清或过滤取滤液，得到所述猫泛白细胞减少症病毒疫苗株。
20.如权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述猫泛白细胞减少症病毒疫苗株的灭活条件为：甲醛溶液终浓度为0.05-0.15v/v％，温度25-37℃，时间24-48小时。
21.如权利要求17所述的制备方法，其特征在于，用300-500KDa截留分子量的中空纤维浓缩所述猫泛白细胞减少症病毒疫苗株。
22.如权利要求17所述的制备方法，其特征在于，在F81细胞中培养收获病毒液，离心取上清或过滤取滤液，得到所述猫鼻气管炎病毒疫苗株。
23.如权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述猫鼻气管炎病毒疫苗株的灭活条件为：甲醛溶液终浓度为0.05-0.15v/v％，温度25-37℃，时间24-48小时。
24.如权利要求17所述的制备方法，其特征在于，用300-500KDa截留分子量的中空纤维浓缩所述猫鼻气管炎病毒疫苗株。
25.如权利要求17所述的制备方法，其特征在于，在F81细胞中培养收获病毒液，离心取上清或过滤取滤液，得到所述猫鼻结膜炎病毒疫苗株。
26.如权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述猫鼻结膜炎病毒疫苗株的灭活条件为：甲醛溶液终浓度为0.05-0.15v/v％，温度25-37℃，时间24-48小时。
27.如权利要求17所述的制备方法，其特征在于，用300-500KDa截留分子量的中空纤维浓缩所述猫鼻结膜炎病毒疫苗株。
28.如权利要求1所述的疫苗株、权利要求2-16中任一项所述的疫苗组合物或权利要求17-27中任一项所述的制备方法在制备用于预防猫泛白细胞减少症、猫鼻气管炎和猫鼻结膜炎的制剂或者预防猫鼻结膜炎的制剂中的用途。
CN202210118572.4A 2022-02-08 2022-02-08 猫泛白细胞减少症鼻气管炎鼻结膜炎三联灭活疫苗 Active CN114480304B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210118572.4A CN114480304B (zh) 2022-02-08 2022-02-08 猫泛白细胞减少症鼻气管炎鼻结膜炎三联灭活疫苗

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210118572.4A CN114480304B (zh) 2022-02-08 2022-02-08 猫泛白细胞减少症鼻气管炎鼻结膜炎三联灭活疫苗

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114480304A CN114480304A (zh) 2022-05-13
CN114480304B true CN114480304B (zh) 2024-02-20

Family

ID=81478104

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210118572.4A Active CN114480304B (zh) 2022-02-08 2022-02-08 猫泛白细胞减少症鼻气管炎鼻结膜炎三联灭活疫苗

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114480304B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114426956B (zh) * 2022-02-08 2023-11-17 辽宁益康生物股份有限公司 猫狂犬病泛白细胞减少症鼻气管炎鼻结膜炎四联灭活疫苗
CN115969967B (zh) * 2023-01-10 2023-08-04 浙江大学 用于预防猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mRNA疫苗及其制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103773739A (zh) * 2013-03-01 2014-05-07 上海启盛生物科技有限公司 一种猫泛白细胞减少症病毒减毒疫苗株及其应用
CN111632137A (zh) * 2020-06-19 2020-09-08 郑州爱科生物科技有限公司 猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗及其制备方法和应用
CN111876391A (zh) * 2020-07-23 2020-11-03 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 猫泛白细胞减少症病毒fpv bj05株及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7306807B2 (en) * 2004-09-13 2007-12-11 Wyeth Hemorrhagic feline calicivirus, calicivirus vaccine and method for preventing calicivirus infection or disease

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103773739A (zh) * 2013-03-01 2014-05-07 上海启盛生物科技有限公司 一种猫泛白细胞减少症病毒减毒疫苗株及其应用
CN111632137A (zh) * 2020-06-19 2020-09-08 郑州爱科生物科技有限公司 猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗及其制备方法和应用
CN111876391A (zh) * 2020-07-23 2020-11-03 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 猫泛白细胞减少症病毒fpv bj05株及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
猫鼻气管炎病毒、杯状病毒、泛白细胞减少症病毒的分离及其形态学观察;李六金, 李成, 姜焕宏, 吴钟灵, 胡淑贤, 师长宏, 张志培, 李学忠, 刘晓荣;中国预防兽医学报(第05期);第341-345页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114480304A (zh) 2022-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114480304B (zh) 猫泛白细胞减少症鼻气管炎鼻结膜炎三联灭活疫苗
CN114426956B (zh) 猫狂犬病泛白细胞减少症鼻气管炎鼻结膜炎四联灭活疫苗
CN102458461B (zh) 包含减毒的牛支原体菌株的疫苗和减毒的方法
CN108558995B (zh) 一种防治新型鹅星状病毒的卵黄抗体及其制备方法
CN114854697B (zh) 一种猪轮状病毒g4-g5-g9型三价灭活疫苗及其制备方法和用途
CN109868262B (zh) 一种犬瘟热弱毒株及其应用
CN112316128B (zh) 一种犬瘟热病毒犬细小病毒犬传染性肝炎病毒三联活疫苗
CN116426487A (zh) 一种猪流行性腹泻病毒株及其在疫苗制备中的应用
CN112195161B (zh) 一种犬细小病毒疫苗株、疫苗及其制备方法
CN113493775B (zh) 一种猪德尔塔冠状病毒毒株及其应用
KR20210038171A (ko) 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스에 대한 백신 조성물
CN112251416B (zh) 一种犬瘟热病毒疫苗株、疫苗及其制备方法
CN109207438A (zh) 猪伪狂犬病病毒强毒株及其在制备灭活疫苗中的应用
CN110859956B (zh) 一种犬细小病毒灭活疫苗及其制备方法
CN106854647B (zh) 鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体及其制备方法和应用
CN110846284B (zh) 一种犬细小病毒CPV-HuN1703株及其应用
CN108949700B (zh) 一种山羊副流感病毒3型js14-2株及其应用
CN112341539A (zh) 防治具有跨种传播能力的新型鹅星状病毒的卵黄抗体及其制备方法
CN116064417A (zh) 一株猫泛白细胞减少症病毒毒株及其应用
CN113046271B (zh) 一株兔f型多杀性巴氏杆菌及其在制备灭活疫苗中的应用
CN115554396A (zh) 一种猫嵌杯病毒和猫疱疹病毒二联疫苗及其制备方法与应用
CN111073863B (zh) 猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗及其制备方法
TW201731526A (zh) 混成核心之貓科動物疫苗
CN112725288B (zh) 犬腺病毒2型弱毒疫苗株及其应用
CN113234689B (zh) 一株鸡传染性支气管炎病毒毒株及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant