CN115969967A - 用于预防猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mRNA疫苗及其制备方法 - Google Patents

用于预防猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mRNA疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mRNA疫苗其制备方法。该三联mRNA疫苗由表达猫疱疹病毒gB蛋白的mRNA，表达猫疱疹病毒gD蛋白的mRNA，表达猫杯状病毒VP1蛋白的mRNA和表达猫细小病毒VP2蛋白的mRNA结合脂质体包裹方案混合后制备mRNA疫苗，并应用于猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的预防免疫。所得三联mRNA疫苗能够有效激活特异性抗体，并且简化了接种程序，能达到一次免疫接种可同时预防和控制猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的目的。

Description

用于预防猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mRNA疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及核酸疫苗领域，具体而言涉及一种用于预防猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mRNA疫苗及其制备方法。
背景技术
猫病毒性鼻气管炎(FVRs)，又称猫传染性鼻气管炎，是由猫疱疹病毒(Felineherpesvirus，FHV)感染引起猫的一种急性、高度接触性传染病。FHV感染的典型临床症状是体温升高、打喷嚏、咳嗽、角膜结膜炎、鼻眼浆液性或脓性分泌物和眼周皮肤溃疡。在幼猫和成年猫中均可发生，主要感染2-4个月龄，发病率高达100％，成年猫不引起死亡，幼猫死亡率可达50％，是目前已知最严重的猫呼吸道疾病之一。FHV的gB蛋白是由UL27基因编码的949个氨基酸组成的囊膜糖蛋白，是FHV囊膜表面的重要组成部分，同时gB糖蛋白也是最主要的免疫抗原性蛋白，对于病毒入侵细胞、病毒复制、细胞融合以及在细胞间传播起着决定性作用。FHV的gD蛋白是病毒囊膜的主要成分，存在于感染的细胞膜上，具有高度的保守性和抗原性，能够与细胞表面的分子特异性结合。诱导机体产生细胞免疫和体液免疫，在病毒穿入易感细胞中起重要作用，是宿主细胞免疫和体液免疫反应的主要靶细胞之一。gB蛋白和gD蛋白也是极为保守的免疫原性蛋白，作为研究疱疹病毒亚单位疫苗常选择的靶蛋白，具有较好的免疫原性。
猫杯状病毒病(Felinecaliciviral disease，FCVD)是由猫杯状病毒(FelineCalicivirus，FCV)引起的一种以上呼吸道感染为主要症状的疾病，该病主要侵害7-84日龄幼猫，常发于56-84日龄，1岁以下的猫最易感，日龄越小的猫感染后死亡率越高，潜伏期2-3日，自然病程7-10日。其主要临床症状表现为口腔溃疡、肺炎、慢性胃炎、关节炎及跛行等。FCV的VP1蛋白是一种结构蛋白，在病毒粒子的形成、抗原决定以及病毒-宿主细胞的相互作用中起到关键作用。VP1拥有大部分中和抗体表位，是重点研究对象。
猫泛白细胞减少症(feline panleukopenia，FP)是由猫细小病毒(Felineparvovirus，FPV)引起的猫的一种急性、高度接触性传染病。FPV感染的典型临床症状是双相热、呕吐、腹泻、脱水，循环障碍及白细胞严重减少和出血性肠炎。主要感染1岁以内的幼猫，通常情况下，对1岁以下的猫的致死率为50％～60％，对5月龄以下的幼猫的死亡率高达80％～90％。FPV的VP2蛋白约占所有结构蛋白的90％，VP1蛋白占所有结构蛋白的10％，因此VP2蛋白是FPV编码的主要的抗原蛋白，在免疫应答、识别受体及感染组织的过程中发挥着重要作用。VP2蛋白上有多个抗原识别位点，能够刺激机体产生中和抗体，起到自我保护作用。
研究并开发用于预防猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的mRNA疫苗，对于猫主要疫病的防控具有积极的意义。相比传统疫苗，mRNA疫苗作为新型疫苗的形式，具有生产工艺简单、开发速度快、无需细胞培养、成本低。相较与DNA疫苗，mRNA疫苗无需进入细胞核，没有整合至宿主基因组的风险，半衰期可以通过修饰进行调整。mRNA疫苗可提供对适应性和先天免疫力的综合刺激，即原位抗原表达和危险信号传递；可以诱导“平衡”免疫反应，包括体液和细胞效应因子以及免疫记忆。临床上，猫的上述三种疾病交叉混合感染较多，通常还继发细菌感染，症状更加复杂。相关技术中，尚缺乏针对上述三种病毒的三联mRNA疫苗，一旦感染发病，常采用对症治疗或施用抗生素的方式进行治疗，但治疗效果和治疗特异性较差，而且普遍存在耐药性和毒副作用。
发明内容
本发明提供了一种用于预防猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mRNA疫苗及其制备方法。
本发明提供的用于预防猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mRNA疫苗能够针对三种猫主要流行性传染病提供有效的免疫保护，并且本发明提供的三联mRNA疫苗只需免疫一次，就可以能达到一次免疫接种可同时预防和控制上述三种猫流行性传染病的目的，对于猫流行性传染病的防控具有积极的意义。
本发明的技术方案：
一种用于预防猫鼻气管炎、猫杯状病毒病和猫泛白细胞减少症的三联mRNA疫苗，所述的三联mRNA疫苗包含有表达抗原蛋白的mRNA，其中表达抗原蛋白的mRNA包含有表达猫疱疹病毒gB蛋白的mRNA、表达猫疱疹病毒gD蛋白的mRNA、表达猫杯状病毒VP1蛋白的mRNA和表达猫细小病毒VP2蛋白的mRNA。
编码猫疱疹病毒gB蛋白的基因为缺失3’端第2440-2847位核苷酸序列，编码猫疱疹病毒gD蛋白的基因为缺失3’端第988-1125位核苷酸序列，编码猫杯状病毒VP1蛋白的基因为缺失5’端第4-372位核苷酸序列。
编码猫疱疹病毒gB蛋白的基因是密码子优化后的基因，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；编码猫疱疹病毒gD蛋白的基因是密码子优化后的基因，核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；编码猫杯状病毒VP1蛋白的基因是密码子优化后的基因，核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；编码猫细小病毒VP2蛋白的基因是密码子优化后的基因，核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
优选的，表达猫疱疹病毒gB蛋白的mRNA序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.9所示，表达猫疱疹病毒gD蛋白的mRNA序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.10所示，表达猫杯状病毒VP1蛋白的mRNA序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.11所示，表达猫细小病毒VP2蛋白的mRNA序列如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.12所示。
表达猫疱疹病毒gB蛋白的mRNA、表达猫疱疹病毒gD蛋白的mRNA、表达猫杯状病毒VP1蛋白的mRNA和表达猫细小病毒VP2蛋白的mRNA的质量比为2∶2∶3∶3。
所述的三联mRNA疫苗还含有佐剂，所述的佐剂包括脂质纳米颗粒佐剂、水包油佐剂、聚合物和水佐剂、油包水佐剂、氢氧化铝佐剂或维生素E佐剂。所述的佐剂为阳离子脂质、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、聚乙二醇脂质和胆固醇，摩尔比为50∶10∶38.5∶1.5。
具体的，所述的三联mRNA疫苗为肌内、皮内或皮下给药的剂型。
本发明还提供了一种制备所述的三联mRNA疫苗的方法，包括以下步骤：
(1)构建表达抗原蛋白mRNA的合成质粒，使用限制性内切酶进行线性化处理，得到线性化的抗原蛋白mRNA的合成质粒；
(2)对线性化的抗原蛋白mRNA的合成质粒利用T7启动子序列进行体外转录反应，提纯获得表达抗原蛋白的mRNA；
(3)对步骤(2)中获得的表达抗原蛋白的mRNA使用牛痘病毒加帽酶和2′-O-甲基转移酶通过酶法进行Cap加帽修饰反应，提纯获得加帽修饰的表达抗原蛋白mRNA；
(4)将步骤(3)中加帽修饰的表达抗原蛋白mRNA与阳离子脂质、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质混合，获得所述的三联mRNA疫苗。
所述的抗原蛋白mRNA的合成质粒包括T7启动子序列、5’UTR区、编码猫疱疹病毒gB蛋白或猫疱疹病毒gD蛋白或猫杯状病毒VP1蛋白或猫细小病毒VP2蛋白的mRNA序列、3’UTR区和3’末端Poly A尾。
所述的mRNA的合成质粒可构建于任意克隆载体，Poly A尾末端保留一个限制性内切酶位点，用于质粒线性化制备。优选的，所述限制性内切酶位点为BspQ I、Bsa I或Mlu I。
目前，mRNA疫苗主要以两种序列结构存在，传统的非复制型mRNA序列和自扩增型(复制型)的mRNA疫苗序列。非复制型的mRNA疫苗结构简单，在体内无法自我复制，需要成熟的优化工艺才能在较低的剂量诱发免疫应答。自扩增型mRNA序列含有复制酶基因，可在细胞内扩增mRNA，从而以较少的mRNA剂量生产较多的抗原。
所述的表达猫疱疹病毒gB蛋白的mRNA、表达猫疱疹病毒gD蛋白的mRNA、表达猫杯状病毒VP1蛋白的mRNA和表达猫细小病毒VP2蛋白的mRNA还包括甲病毒非结构蛋白基因编码区。所述甲病毒非结构蛋白基因编码区为非结构蛋白1-4基因编码区。优选地，所述甲病毒为委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)。VEE复制酶基因nsp 1-4区，包含VEE病毒复制酶基因序列，表达的VEE病毒复制酶能够在体内合成mRNA，起到复制mRNA的功能。
本发明还提供了所述的三联mRNA疫苗在制备同时预防猫鼻气管炎、猫杯状病毒病和猫泛白细胞减少症药物中的应用。
使用LNP-mRNA疫苗免疫后的动物体内存在针对猫疱疹病毒，猫杯状病毒和猫细小病毒的特异性抗体，具有预防猫疱疹病毒，猫杯状病毒和猫细小病毒感染的作用。
本发明的有益效果：
本发明制备了一种猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mRNA疫苗，制备包含表达猫疱疹病毒gB蛋白的mRNA、表达猫疱疹病毒gD蛋白的mRNA、表达猫杯状病毒VP1蛋白的mRNA和表达猫细小病毒VP2蛋白的mRNA，结合脂质体包裹方案制备mRNA疫苗，并应用于猫疱疹病毒，猫杯状病毒和猫细小病毒的免疫。该方法在猫主要流行性传染病的研究和疫苗创制上具有应用价值，能够大力推进疫苗的转化应用。
附图说明
图1为猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mRNA疫苗表达抗原蛋白的非复制型mRNA的合成质粒示意图(包括T7-FHV-gB和T7-FHV-gD)。
图2为猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mRNA疫苗表达抗原蛋白的非复制型mRNA的合成质粒示意图(包括T7-FCV-VP1和T7-FPV-VP2)。
图3为猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mRNA疫苗表达抗原蛋白的复制型mRNA的合成质粒示意图(包括VEE-FHV-gB和VEE-FHV-gD)。
图4为猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mRNA疫苗表达抗原蛋白的复制型mRNA的合成质粒示意图(包括VEE-FCV-VP1和VEE-FPV-VP2)。
图5为三联mRNA疫苗表达抗原蛋白的非复制型mRNA合成质粒酶切线性化的琼脂糖凝胶电泳验证结果图；其中，M：DNA Maker，1：表达抗原蛋白的非复制型mRNA合成质粒，2：表达抗原蛋白的非复制型mRNA合成质粒酶切线性化。
图6为三联mRNA疫苗表达抗原蛋白的复制型mRNA合成质粒酶切线性化的琼脂糖凝胶电泳验证结果图；其中，M：DNAMaker，1：表达抗原蛋白的复制型mRNA合成质粒，2：表达抗原蛋白的复制型mRNA合成质粒酶切线性化。
图7为制备加帽修饰后的抗原蛋白的非复制型mRNA的琼脂糖凝胶电泳验证结果图(包括cap-gB-mRNA、cap-gD-mRNA、cap-VP1-mRNA和cap-VP2-mRNA)；其中，M：DNA Maker，1：表达抗原蛋白的非复制型mRNA合成质粒，2：加帽修饰的表达抗原蛋白的非复制型mRNA。
图8为制备加帽修饰后的抗原蛋白的复制型mRNA的琼脂糖凝胶电泳验证结果图(包括cap-VEE-gB-mRNA、cap-VEE-gD-mRNA、cap-VEE-VP1-mRNA和cap-VEE-VP2-mRNA)。
图9为细胞转染加帽修饰后的抗原蛋白的非复制型mRNA分别表达猫疱疹病毒gB蛋白、猫疱疹病毒gD蛋白、猫杯状病毒VP1蛋白和猫细小病毒VP2蛋白的间接免疫荧光法检测结果图。
图10为细胞转染加帽修饰后的抗原蛋白的复制型mRNA分别表达猫疱疹病毒gB蛋白、猫疱疹病毒gD蛋白、猫杯状病毒VP1蛋白和猫细小病毒VP2蛋白的间接免疫荧光法检测结果图。
图11为通过酶联免疫吸附测定免疫猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mRNA疫苗后血清中猫杯状病毒特异性抗体水平的结果图。
图12为通过酶联免疫吸附测定免疫猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mRNA疫苗后血清中猫细小病毒特异性抗体水平的结果图。
图13为通过酶联免疫吸附测定免疫猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mRNA疫苗后血清中猫疱疹病毒特异性抗体水平的结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
本发明针对猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症开发的三联mRNA疫苗，主要采用(1)制备加帽修饰的表达猫疱疹病毒，猫杯状病毒和猫细小病毒抗原蛋白的mRNA和复制型mRNA；(2)制备新型LNP-mRNA疫苗这两种方式。
实施例1构建猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mRNA疫苗中表达抗原蛋白的mRNA的合成质粒
猫疱疹病毒(FHV)的gB和gD蛋白基因序列，猫杯状病毒(FCV)的VP1蛋白基因序列和猫细小病毒(FPV)的VP2蛋白基因保存于浙江大学动物科学学院(参考序列FHVFJ478159、FCV M86379和FPV MT614366)。
根据蛋白质跨膜序列分析和蛋白剪切分析，设计将猫疱疹病毒gB蛋白的基因为缺失3’端第2440-2847位核苷酸序列、猫疱疹病毒gD蛋白的基因为缺失3’端第988-1125位核苷酸序列、猫杯状病毒VP1蛋白的基因为缺失5’端第4-372位核苷酸序列。并且将以上改造的抗原蛋白基因序列和猫细小病毒VP2蛋白的基因序列进行哺乳动物表达密码子优化，序列如SEQ ID NO.1-4所示。
如图1和图2所示，按照T7启动子序列、5’UTR区、改造的表达抗原蛋白的密码子优化基因序列、3'UTR区和3’末端Poly(A)尾顺序构建于pUC克隆载体，基因合成表达抗原蛋白的mRNA合成质粒，包括T7-FHV-gB、T7-FHV-gD、T7-FCV-VP1和T7-FPV-VP2。其中Poly(A)尾末端存在一个Bsa I限制性内切酶位点，用于质粒线性化制备。
如图3和图4所示，按照T7启动子序列、5’UTR区、VEE复制酶基因nsp1-4区、改造的表达抗原蛋白的密码子优化基因序列、3’UTR区和3’末端Poly(A)尾顺序构建于VEE克隆载体，构建获得复制型mRNA质粒，包括VEE-FHV-gB、VEE-FHV-gD、VEE-FCV-VP1和VEE-FPV-VP2V。其中Poly(A)尾末端存在一个Mlu I限制性内切酶位点，用于质粒线性化制备。
质粒T7-FHV-gB、T7-FHV-gD、T7-FCV-VP1和T7-FPV-VP2，以及VEE-FHV-gB、VEE-FHV-gD、VEE-FCV-VP1和VEE-FPV-VP2保存于大肠杆菌T1感受态菌株中，随机挑取单个克隆，分别接种到200mL含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，37℃摇床培养，按照Omega质粒DNA大量试剂盒说明书提取所克隆获得的表达抗原蛋白的mRNA的合成质粒，测定浓度后保存使用。
实施例2体外转录制备表达抗原蛋白的mRNA
如图1和图2所示，猫疱疹病毒gB蛋白、猫疱疹病毒gD蛋白、猫杯状病毒VP1蛋白和猫细小病毒VP2蛋白的mRNA合成质粒T7-FHV-gB、T7-FHV-gD、T7-FCV-VP1和T7-FPV-VP2的Poly(A)尾末端保留一个Bsa I限制性内切酶位点，使用限制性内切酶Bsa I将载体质粒进行酶切线性化反应；如图3和图4所示，猫疱疹病毒gB蛋白、猫疱疹病毒gD蛋白、猫杯状病毒VP1蛋白和猫细小病毒VP2蛋白的复制型mRNA合成质粒VEE-FHV-gB、VEE-FHV-gD、VEE-FCV-VP1和VEE-FPV-VP2的Poly(A)尾末端保留一个Mlu I限制性内切酶位点，使用限制性内切酶Mlu I将载体质粒进行酶切线性化反应。两种酶切线性化反应按照如下步骤操作：
(1)根据实施例1构建的mRNA合成质粒和复制型mRNA合成质粒，通过Bsa I酶或MluI酶切线性化。
a)首先取25μg的T7-FHV-gB、T7-FHV-gD、T7-FCV-VP1或T7-FPV-VP2质粒，37℃下用Bsa I酶切2h，配制的酶切反应体系如下：
Figure BDA0004048202210000071
取25μg的VEE-FHV-gB、VEE-FHV-gD、VEE-FCV-VP1或VEE-FPV-VP2质粒，37℃下用Mlu I酶切2h，配制的酶切反应体系如下：
Figure BDA0004048202210000072
b)酶切后加入5μL的10％SDS溶液，使得SDS终浓度为0.5％；
c)加入0.5μL的20mg/μL的蛋白酶K，使得蛋白酶终浓度为50-100μg/mL；
d)37℃孵育1h，后置于冰上，加入200μL无核酸酶水，300μL的Phenol/CHCl3/IAA混合液，涡旋后静置5min；
e)在12000rpm转速下室温离心10min，吸取上清液，加入750μL无水乙醇，于-20℃冰箱静置30min；
f)在12000rpm转速下4℃离心15min，弃去上清液；
g)加入75％的乙醇1mL，在12000rpm转速下4℃离心5min，重复此步骤2次后弃去上清液，将离心管晾干；
h)加20μL无核酸酶水，溶解DNA，取1μL稀释10倍后测定线性化DNA浓度，保存于-20℃；
i)通过琼脂糖凝胶电泳验证抗原蛋白mRNA合成质粒的酶切线性化。
如图5所示，mRNA合成质粒琼脂糖凝胶电泳条带大小要小于酶切线性化DNA片段，证明T7-FHV-gB、T7-FHV-gD、T7-FCV-VP1和T7-FPV-VP2质粒线性化完成；
如图6所示，复制型mRNA合成质粒琼脂糖凝胶电泳条带大小要小于酶切线性化DNA片段，证明VEE-FHV-gB、VEE-FHV-gD、VEE-FCV-VP1和VEE-FPV-VP2质粒线性化完成。
(2)以步骤(1)线性化DNA为模板，体外转录获得表达抗原蛋白的mRNA和复制型mRNA。
利用mRNA合成质粒目的基因上游的T7启动子，通过体外转录反应制备并表达猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mRNA的抗原蛋白mRNA。
a)首先取1～2μg线性化的mRNA或线性化的复制型mRNA质粒，37℃下用T7RNA聚合酶合成mRNA，配制的体外转录反应体系如下：
Figure BDA0004048202210000081
b)体外转录体系在37℃下孵育4h，随后加入1μL DNase，37℃孵育15min，消化DNA模板；
c)通过Trizol法或亲和层析法提取gB-mRNA(序列如SEQ ID NO.5所示)、gD-mRNA(序列如SEQ ID NO.6所示)、VPl-mRNA(序列如SEQ ID NO.7所示)和VP2-mRNA(序列如SEQID NO.8所示)(或VEE-gB-mRNA(序列如SEQ ID NO.6所示)、VEE-gD-mRNA(序列如SEQ IDNO.10所示)、VEE-VP1-mRNA(序列如SEQ ID NO.11所示)和VEE-VP2-mRNA(序列如SEQ IDNO.12所示))，取1μL稀释10倍后测定mRNA浓度，保存于-80℃。
实施例3加帽修饰反应制备cap mRNA
利用牛痘病毒加帽酶及相关组分，将7-甲基鸟苷帽结构加到mRNA的5’末端。使得mRNA更稳定、有利于转运和翻译。
a)体外转录获得的gB-mRNA、gD-mRNA、VP1-mRNA和VP2-mRNA(或VEE-gB-mRNA、VEE-gD-mRNA、VEE-VP1-mRNA和VEE-VP2-mRNA)，37℃下用牛痘病毒加帽酶和Cap 2′-O-甲基转移酶进行加帽修饰反应，配制的加帽修饰反应体系如下：
Figure BDA0004048202210000082
Figure BDA0004048202210000091
b)加帽修饰反应体系在37℃下孵育60min；
c)通过Trizol法或亲和层析法提取加帽修饰的表达抗原蛋白的mRNA，取1μL稀释10倍后测定mRNA浓度，保存于-80℃；
d)通过琼脂糖凝胶电泳验证加帽修饰后的表达抗原蛋白的mRNA，包括非复制型mRNA：cap-gB-mRNA、cap-gD-mRNA、cap-VP1-mRNA和cap-VP2-mRNA，以及复制型mRNA：cap-VEE-gB-mRNA、cap-VEE-gD-mRNA、cap-VEE-VP1-mRNA和cap-VEE-VP2-mRNA。
如图7所示，琼脂糖凝胶电泳显示mRNA的条带大小，表达抗原蛋白的mRNA合成质粒作为对照，证明有效合成了猫疱疹病毒gB蛋白的mRNA(cap-gB-mRNA)、猫疱疹病毒gD蛋白的mRNA(cap-gD-mRNA)、猫杯状病毒VP1蛋白的mRNA(cap-VP1-mRNA)和猫细小病毒VP2蛋白的mRNA(cap-VP2-mRNA)。
如图8所示，琼脂糖凝胶电泳显示mRNA的条带大小，证明有效合成了猫疱疹病毒gB蛋白的复制型mRNA(cap-VEE-gB-mRNA)、猫疱疹病毒gD蛋白的复制型mRNA(cap-VEE-gD-mRNA)、猫杯状病毒VP1蛋白的复制型mRNA(cap-VEE-VP1-mRNA)和猫细小病毒VP2蛋白的复制型mRNA(cap-VEE-VP2-mRNA)。
实施例4免疫荧光实验检测转染表达抗原蛋白的mRNA表达猫疱疹病毒gB蛋白、猫疱疹病毒gD蛋白、猫杯状病毒VP1蛋白和猫细小病毒VP2蛋白
在细胞中转染表达抗原蛋白的mRNA能够表达猫疱疹病毒gB蛋白、猫疱疹病毒gD蛋白、猫杯状病毒VP1蛋白和猫细小病毒VP2蛋白，利用抗原蛋白的特异性抗体能够检测对应抗原蛋白的mRNA的翻译有效，按照如下步骤操作：
a)在48孔板铺贴壁细胞如BHK-21，置于5％CO2培养箱中37℃培养，待细胞密度达到70％左右，将获得的cap-gB-mRNA、cap-gD-mRNA、cap-VP1-mRNA和cap-VP2-mRNA(或cap-VEE-gB-mRNA、cap-VEE-gD-mRNA、cap-VEE-VP1-mRNA和cap-VEE-VP2-mRNA)进行转染；
b)取洁净的EP管，加入300μL的Opti-MEM培养基和4μL的DMRIE-C转染试剂，涡旋混匀，室温孵育30min，分别加入2μg的cap-gB-mRNA、cap-gD-mRNA、cap-VP1-mRNA和cap-VP2-mRNA(或cap-VEE-gB-mRNA、cap-VEE-gD-mRNA、cap-VEE-VP1-mRNA和cap-VEE-VP2-mRNA)，轻轻敲打混匀，孵育10min；
c)用Opti-MEM培养基将细胞清洗一遍，加入孵育好的混合物，24h后使用猫疱疹病毒gB蛋白、猫疱疹病毒gD蛋白、猫杯状病毒VP1蛋白和猫细小病毒VP2蛋白的特异性兔多克隆抗体，通过间接免疫荧光检测gB蛋白的表达情况；
其中gB蛋白的特异性兔多克隆抗体来源于使用gB蛋白多肽区段TPPKPTTDPTDMSDC和GKRRRGSRWQGHSGC合成肽偶联免疫新西兰大白兔制备获得的抗体血清。gD蛋白的特异性兔多克隆抗体来源于使用gD蛋白多肽区段KRSNDSRGESSGPNC和CDDDVPTAPPKGMNNQSV合成肽偶联免疫新西兰大白兔制备获得的抗体血清。VP1蛋白的特异性兔多克隆抗体来源于使用VP1蛋白多肽区段STLPETGARGGNHPC和TATLDGDNNNKINPC合成肽偶联免疫新西兰大白兔制备获得的抗体血清。VP2蛋白的特异性兔多克隆抗体来源于使用VP2蛋白多肽区段CQPDGGQPAVRNERA和QTDENQAADGDPRYC合成肽偶联免疫新西兰大白兔制备获得的抗体血清。
如图9所示，结果显示共转染cap-gB-mRNA、cap-gD-mRNA、cap-VP1-mRNA和cap-VP2-mRNA的BHK-21细胞在荧光显微镜下能够明显的观察到绿色荧光信号，表明mRNA能够有效表达猫疱疹病毒gB蛋白、猫疱疹病毒gD蛋白、猫杯状病毒VP1蛋白和猫细小病毒VP2蛋白。
如图10所示，结果显示转染cap-VEE-gB-mRNA、cap-VEE-gD-mRNA、cap-VEE-VP1-mRNA和cap-VEE-VP2-mRNA的BHK-21细胞在荧光显微镜下能够明显的观察到绿色荧光信号，表明复制型mRNA能够有效表达猫疱疹病毒gB蛋白、猫疱疹病毒gD蛋白、猫杯状病毒VP1蛋白和猫细小病毒VP2蛋白，且表达水平更高。
实施例5脂质纳米颗粒mRNA疫苗LNP-gB/gD/VP1/VP2-mRNA和脂质纳米颗粒复制型mRNA疫苗LNP-VEE-gB/gD/VP1/VP2-mRNA的制备
mRNA是带负电的生物大分子，难以通过被动运输穿过带负电细胞膜。脂质纳米颗粒(LNP)能够用来递送RNA，是mRNA疫苗的有效载药方式。
脂质纳米颗粒mRNA疫苗LNP-gB/gD/VP1/VP2-mRNA或脂质纳米颗粒复制型mRNA疫苗LNP-VEE-gB/gD/VP1/VP2-mRNA的制备，按照如下步骤操作：
a)将SM-102、DSPC、DMG-PEG2000和胆固醇按照摩尔比50∶10∶38.5∶1.5，总质量为480μg的配方，溶于100μL无水乙醇中；
b)在涡旋的条件下，将该乙醇溶液快速注入300μL含有实施例3制备获得的cap-gB-mRNA和cap-gD-mRNA各2μg、cap-VP1-mRNA和cap-VP2-mRNA各3μg(或cap-VEE-gB-mRNA和cap-VEE-gD-mRNA各2μg、cap-VEE-VP1-mRNA和cap-VEE-VP2-mRNA各3μg)的20mM醋酸钠缓冲液中，剧烈搅拌20s，然后静置10分钟，制得纳米颗粒；
c)将制得的含有纳米颗粒的乙醇醋酸钠混合溶液，在10mM的PBS溶液中透析2～4小时除去乙醇，经过超滤浓缩后得到最终产品LNP-gB+gD+VP1+VP2-mRNA或复制型LNP-VEE-gB+gD+VP1+VP2-mRNA。
实施例6猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mRNA疫苗的免疫实验
三联mRNA疫苗LNP-gB+gD+VP1+VP2-mRNA和复制型三联mRNA疫苗LNP-VEE-gB+gD+VP1+VP2-mRNA的免疫效用评估，按照如下步骤操作：
a)将44只6周龄的雌性BALB/c品系小鼠随性等分为11组：阴性对照组(Mock)，非复制型三联mRNA疫苗组(T7-三联，LNP-gB+gD+VP1+VP2-mRNA疫苗)，复制型三联mRNA疫苗组(VEE-三联，复制型LNP-VEE-gB+gD+VP1+VP2-mRNA疫苗)，以及非复制型单价mRNA疫苗组(T7-gB组，T7-gD组，T7-VP1组和T7-VP2组)和复制型单价mRNA疫苗组(VEE-gB组，VEE-gD组，VEE-VP1组和VEE-VP2组)，BALB/c小鼠在第0天和第30天以肌内途径注射LNP-gB+gD+VP1+VP2-mRNA疫苗(或复制型LNP-VEE-gB+gD+VP1+VP2-mRNA疫苗)，或单价LNP-gB/gD/VP1/VP2-mRNA疫苗(或单价复制型LNP-VEE-gB/gD/VP1/VP2-mRNA疫苗)，或不含mRNA的LNP；
b)第二次免疫后的第7天，通过眼眶途径采血，收集采集的血清样品；
c)通过双抗一步夹心法酶联免疫吸附试验测定免疫mRNA疫苗后血清中分别针对猫疱疹病毒、猫杯状病毒和猫细小病毒的特异性抗体水平：预先包被猫疱疹病毒、猫杯状病毒或猫细小病毒抗原的包被微孔中，依次加入血清样品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，并在1M硫酸的作用下转化成最终的黄色，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)。
如图11所示，判定血清样品中猫杯状病毒(FCV)特异性抗体水平。免疫过单价mRNA疫苗(T7-VP1)，复制型单价mRNA疫苗(VEE-VP1)以及三联mRNA疫苗(T7-三联)或复制型三联mRNA疫苗(VEE-三联)的动物体内均产生不同水平的FCV特异性抗体。其中T7-三联组的抗体水平显著高于单价T7-VP1组，复制型VEE-三联组的抗体水平略高于单价VEE-VP1组，数据表明猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mRNA疫苗能有效激活体液免疫产生猫杯状病毒特异性抗体，并且非复制型三联mRNA疫苗产生抗体水平优于单价mRNA疫苗。
如图12所示，判定血清样品中猫细小病毒(FPV)特异性抗体水平。免疫过单价mRNA疫苗(T7-VP2)，复制型单价mRNA疫苗(VEE-VP2)以及三联mRNA疫苗(T7-三联)或复制型三联mRNA疫苗(VEE-三联)的动物体内均产生不同水平的FPV特异性抗体。其中T7-三联组的抗体水平略高于单价T7-VP1组，复制型VEE-三联组的抗体水平显著高于单价VEE-VP1组，数据表明猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mRNA疫苗能有效激活体液免疫产生猫细小病毒特异性抗体，并且复制型三联mRNA疫苗产生抗体水平优于单价mRNA疫苗。
如图13所示，判定血清样品中猫疱疹病毒(FHV)特异性抗体水平。免疫过单价mRNA疫苗(T7-gB，T7-gD)，复制型单价mRNA疫苗(VEE-gB，VEE-gD)以及三联mRNA疫苗(T7-三联)或复制型三联mRNA疫苗(VEE-三联)的动物体内均产生不同水平的FHV特异性抗体。其中T7-三联组的抗体水平显著高于单价T7-gB和T7-gD组，复制型VEE-三联组的抗体水平显著高于单价VEE-gB和VEE-gD组，并且复制型VEE-三联组的FHV抗体水平最高。数据表明猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mRNA疫苗能有效激活体液免疫产生猫疱疹病毒特异性抗体，并且产生抗体水平优于单价mRNA疫苗。

Claims (10)

1.一种用于预防猫鼻气管炎、猫杯状病毒病和猫泛白细胞减少症的三联mRNA疫苗，其特征在于，所述的三联mRNA疫苗包含有表达抗原蛋白的mRNA，其中表达抗原蛋白的mRNA包含有表达猫疱疹病毒gB蛋白的mRNA、表达猫疱疹病毒gD蛋白的mRNA、表达猫杯状病毒VP1蛋白的mRNA和表达猫细小病毒VP2蛋白的mRNA。
2.如权利要求1所述的三联mRNA疫苗，其特征在于，编码猫疱疹病毒gB蛋白的基因为缺失3’端第2440-2847位核苷酸序列，编码猫疱疹病毒gD蛋白的基因为缺失3’端第988-1125位核苷酸序列，编码猫杯状病毒VP1蛋白的基因为缺失5’端第4-372位核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的三联mRNA疫苗，其特征在于，编码猫疱疹病毒gB蛋白的基因是密码子优化后的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码猫疱疹病毒gD蛋白的基因是密码子优化后的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码猫杯状病毒VP1蛋白的基因是密码子优化后的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码猫细小病毒VP2蛋白的基因是密码子优化后的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.如权利要求1所述的三联mRNA疫苗，其特征在于，表达猫疱疹病毒gB蛋白的mRNA序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.9所示，表达猫疱疹病毒gD蛋白的mRNA序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.10所示，表达猫杯状病毒VP1蛋白的mRNA序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.11所示，表达猫细小病毒VP2蛋白的mRNA序列如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.12所示。
5.如权利要求1所述的三联mRNA疫苗，其特征在于，表达猫疱疹病毒gB蛋白的mRNA、表达猫疱疹病毒gD蛋白的mRNA、表达猫杯状病毒VP1蛋白的mRNA和表达猫细小病毒VP2蛋白的mRNA的质量比为2∶2∶3∶3。
6.如权利要求1所述的三联mRNA疫苗，其特征在于，所述的三联mRNA疫苗还含有佐剂，所述的佐剂包括脂质纳米颗粒佐剂、水包油佐剂、聚合物和水佐剂、油包水佐剂、氢氧化铝佐剂或维生素E佐剂。
7.如权利要求6所述的三联mRNA疫苗，其特征在于，所述的佐剂为阳离子脂质、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、聚乙二醇脂质和胆固醇，摩尔比为50∶10∶38.5∶1.5。
8.如权利要求1所述的三联mRNA疫苗，其特征在于，所述的三联mRNA疫苗为肌内、皮内或皮下给药的剂型。
9.一种制备权利要求1～8任一所述的三联mRNA疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建表达抗原蛋白mRNA的合成质粒，使用限制性内切酶进行线性化处理，得到线性化的抗原蛋白mRNA的合成质粒；
(2)对线性化的抗原蛋白mRNA的合成质粒利用T7启动子序列进行体外转录反应，提纯获得表达抗原蛋白的mRNA；
(3)对步骤(2)中获得的表达抗原蛋白的mRNA使用牛痘病毒加帽酶和2′-O-甲基转移酶通过酶法进行Cap加帽修饰反应，提纯获得加帽修饰的表达抗原蛋白mRNA；
(4)将步骤(3)中加帽修饰的表达抗原蛋白mRNA与阳离子脂质、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇脂质混合，获得所述的三联mRNA疫苗。
10.权利要求1～8任一所述的三联mRNA疫苗在制备同时预防猫鼻气管炎、猫杯状病毒病和猫泛白细胞减少症药物中的应用。
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