CN100540059C - 基于nsp4基因的轮状病毒基因疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新型疫苗的研制。具体而言，本发明涉及基于NSP4基因的轮状病毒基因疫苗及其应用。

Description

基于NSP4基因的轮状病毒基因疫苗

技术领域

本发明涉及新型疫苗的研制。具体而言，本发明涉及基于NSP4基因的轮状病毒基因疫苗及其应用。

背景技术

A组轮状病毒(Rotavirus，RV)是全世界范围内婴幼儿急性腹泻的最主要病原。最新数字表明，在发展中国家，轮状病毒引起的儿童严重腹泻占腹泻住院病例的1/3，每年引起5岁以下儿童死亡的人数为87.3万人，相当于每天死亡2000-2400人。我国多次流行病学调查表明，秋冬季婴幼儿腹泻有大约50％是由A组轮状病毒引起的。轮状病毒腹泻关系到国家的公共安全、社会稳定以及人口素质。鉴于轮状病毒危害严重且缺乏有效治疗手段，世界卫生组织将轮状病毒疫苗列为最优先发展的疫苗项目之一。

RV的基因组由11个双链RNA节段组成，编码6个结构蛋白和5个非结构蛋白(NSP1-NSP5)。RV的衣壳分为3层，其外壳由VP7和VP4组成，内壳由VP6和VP2组成。RV的外壳蛋白中含有中和抗原表位。但是与其它RNA病毒相似，RV外壳蛋白的变异性很强，根据VP7的变异性可将RV分为至少14个不同的血清型，根据VP4的变异可将其分为至少20个亚型，目前RV疫苗中一般只包含了一个血清型，最多不超过4个血清型，而自然界中流行的轮状病毒是错综复杂、不断变换的，因此现有RV疫苗没有解决轮状病毒基因变异的有效对抗问题，严重影响了免疫效果。因此如何应对病毒变异是RV疫苗研制中必须要考虑的问题。

传统的病毒疫苗设计(灭活疫苗或减毒活疫苗)主要是模拟病毒自然感染过程，疫苗成分进入体内，被机体免疫系统识别的主要是病毒的外壳蛋白，其非结构蛋白和病毒内部抗原往往不能被免疫系统高效递呈，诱导的免疫反应很弱或不能诱导免疫反应，并且这种疫苗诱导产生的免疫反应以针对表面抗原的中和抗体为主，多为型特异性免疫反应，保护范围比较局限，往往不能形成对病毒变异株的保护。针对HIV、人丙型肝炎病毒以中和抗原为免疫原的疫苗没有达到预期效果的原因可能也与此有关(参见http://www.genetide.com/news/ shownews.asp？id＝120088)。筛选具有交叉保护性的病毒抗原无疑是解决病毒变异的一条重要途径。由于病毒的大部分非结构蛋白或内部抗原保守性较强，病毒的非结构蛋白在交叉免疫保护性及病毒疫苗设计中的地位逐渐受到重视。作为病毒复制过程中产生的非结构蛋白，也会引起机体产生相应的免疫反应，如免疫缺陷病毒的逆转录酶便具有CTL表位(参见De Berardinis P，et al.Phage display of peptide epitopesfrom HIV-1 elicits strong cytolytic responses.Nat Biotechnol，2000；18(8)：873-876.)，而且非结构蛋白较为保守，针对非结构蛋白的免疫反应可能具有更为广泛的交叉免疫保护性。在病毒自然过程中，非结构蛋白或内部蛋白(非中和抗原)未充分暴露于免疫系统之下，产生的免疫反应较弱，但是经过人为改造，可以大大增强其免疫原性，产生较强的免疫保护反应。例如，丙型肝炎病毒的非结构蛋白NS3蛋白可诱导特异性的细胞免疫反应；含有HIV非结构蛋白Tat的疫苗能在恒河猴引起高滴度的交叉免疫保护反应；流感病毒的非中和抗原NP在小鼠可以同时引起CD4⁺T细胞分泌细胞因子及CD8⁺CTL反应，并能诱发针对异型病毒的保护作用(参见Brinster C，et al.Hepatitis C virusnon-structural protein 3-specific cellular immune responses followingsingle or combined immunization with DNA or recombinant SemlikiForest virus particles.J Gen Virol，2002，83(Pt 2)：369-81.Cafaro A，et al.Control of SHIV-89.6P-infection of cynomolgus monkeys by HIV-1 Tatprotein vaccine.Nat Med，1999，5(6)：5643-5650.Richardson MW，et al.Immunogenicity of HIV-1 IIIB and SHIV 89.6P Tat and Tat toxoids inrhesus macaques：induction of humoral and cellular immune responses.DNA Cell Biol，2002，21(9)：637-651.Ulmer JB，Influenza DNA vaccines.Vaccine，2002，20：S74-S76)。这些非结构蛋白或非中和抗原已经成为相应病毒的重要疫苗候选基因，并显示出良好的应用前景，成为疫苗研制中新的亮点和突破点。

本发明利用RV基因10编码的非结构蛋白NSP4研制了基因疫苗，有望在轮状病毒腹泻预防中发挥重要作用。

发明内容

本发明的特征是利用表达人RV非结构蛋白NSP4或其免疫原性片段的不同表达载体作为新型轮状病毒基因疫苗。

NSP4基因全长750或751个核苷酸，编码175个氨基酸，含有2个糖基化位点。NSP4是重要的RV调节蛋白，在RV的复制成熟过程中发挥重要作用。

NSP4可作为新型轮状病毒疫苗的候选基因，是因为它与轮状病毒其它抗原相比，具有以下优点：

(1)非结构蛋白NSP4较为保守，除了其主要集中于131-145位氨基酸的“高变区”，其它区域即使在不同血清型间仍然较为保守，我国不同地区A组轮状病毒不同血清型间全长NSP4基因(包括高变区)的同源性均高于80％，并且NSP4的变异与病毒分布地区无关，不同地区间NSP4氨基酸序列的同源性可高达99％(参见：王大燕，王健伟，于修平等.中国轮状病毒非结构蛋白NSP4基因变异特征的分析.中华实验和临床病毒学杂志，2003，17(1)：10-14)。因此有可能产生较好的交叉免疫保护作用，有助于解决病毒的高变异问题；

(2)NSP4在病毒复制过程中发挥关键作用，它作为跨内质网(ER)膜糖蛋白，可作为胞浆中单壳颗粒的细胞内受体，NSP4与单壳颗粒结合促使其以出芽方式进入ER腔。NSP4还与病毒的外壳蛋白VP4和VP7结合，促进外壳蛋白的获得。因而针对NSP4的免疫反应有可能在病毒复制的早期阶段便可发挥作用；

(3)NSP4在轮状病毒致病中发挥重要作用，是目前发现的唯一与轮状病毒腹泻发生直接相关的轮状病毒蛋白。近年来，人们发现轮状病毒NSP4在病毒致腹泻的机制中扮演重要角色，最近在禽RV NSP4的研究中也发现其有致腹泻作用(Mori Y，et al.Diarrhea-inducing activity ofavian rotavirus NSP4 glycoproteins，which differ greatly from mammalianrotavirus NSP4 glycoproteins in deduced amino acid sequence in sucklingmice.J Virol，2002，76(11)：5829-34.)。现有的研究表明，NSP4可激活某些信号传导通路，使内质网内的Ca²⁺向胞浆转运而导致细胞内Ca²⁺浓度增高，Ca²⁺浓度增高将引发肠粘膜细胞内Cl^-外泌而导致腹泻。NSP4这种导致腹泻的机制类似于细菌肠毒素，目前看来这可能是轮状病毒导致腹泻的主要原因之一，因此抗轮状病毒腹泻药物和疫苗应当考虑NSP4的作用；

(4)已有的研究表明，RV自然感染后有针对NSP4蛋白的免疫反应，在血清中可以检测到抗NSP4抗体，并且NSP4蛋白具有T、B细胞表位，因此有望成为疫苗设计的靶位，通过人为改造，可以使针对NSP4的免疫反应增强。

要研制轮状病毒的疫苗必须要考虑病毒的感染特征，由于轮状病毒主要感染肠道并在局部繁殖，因此粘膜免疫以及细胞免疫等对于病毒清除可能发挥重要作用。要利用NSP4诱导有效的免疫反应，还必须要考虑疫苗的实现形式。NSP4作为单一病毒成分，只能研制基因工程疫苗。作为基因工程病毒疫苗，目前主要包括亚单位疫苗、多肽疫苗、活载体(病毒或细菌)疫苗、DNA疫苗(采用质粒载体)、转基因植物疫苗等，其中载体疫苗和DNA疫苗均属于基因疫苗范畴。

本发明采用基因疫苗的形式，是因为其具有以下优点：

(1)基因疫苗可以采用黏膜免疫途径。研制轮状病毒基因工程疫苗必须考虑轮状病毒的生物学与免疫学特点，即轮状病毒经肠道感染且繁殖局限在肠道，因此粘膜免疫起主要保护作用。理论上讲，腺病毒、疱疹病毒、EB病毒、腺病毒伴随病毒(AAV)、痘苗病毒、甲病毒、慢病毒、逆转录病毒、流感病毒、副流感病毒、水泡性口炎病毒、冠状病毒、麻疹病毒、乙脑病毒、登革病毒、噬菌体等多种病毒、细菌载体或各种质粒载体均可作为NSP4的表达载体，通过滴鼻、口服、透皮、喷雾等免疫途径，诱导黏膜免疫，不经过包装处理或辅以佐剂，由于过敏、降解等原因，重组蛋白、多肽或从转基因植物提取的蛋白很难直接诱导较强的粘膜免疫反应；

(2)基因疫苗可激发多种免疫反应。目前研究表明，病毒载体或质粒载体疫苗可在细胞内表达抗原，从而不仅可诱导体液免疫、黏膜免疫，而且可诱导细胞免疫，后者在疫苗保护中往往具有更重要的作用。而亚单位疫苗、多肽疫苗和转基因植物疫苗往往只能诱导以体液免疫为主的反应。

(3)基因疫苗免疫效率高。目前病毒载体疫苗等本身就有良好的免疫刺激作用，不需要添加佐剂，而亚单位疫苗、多肽疫苗和转基因植物疫苗往往需要有佐剂才能激发有效的免疫反应，但是目前广泛使用的铝佐剂并不适用于黏膜免疫，其它佐剂尚无广泛使用，并且绝大部分尚未用于人体，因此疫苗可能因无合适佐剂而失败。

(4)生产成本低，容易制备。由于基因疫苗是以重组病毒、细菌或质粒的形式体现的，其制备相对容易，尤其是作为口服疫苗，无须纯化，因此成本较低。而亚单位疫苗需要复杂的纯化过程；合成肽成本高，本身免疫原性很弱，需要偶联担体；转基因植物目的抗原的表达量低，提取困难，其致敏性、安全性目前尚无定论。

纵上所述，本发明利用轮状病毒NSP4研制基因疫苗，具有可有效应对病毒变异、针对病毒致病环节、给药方便、可有效诱导体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫、制备方便等优点。

本发明一方面提供了一种轮状病毒基因疫苗，其中含有轮状病毒非结构蛋白NSP4或者其免疫原性片段的基因，所述NSP4或者其免疫原性片段的基因插入病毒、细菌或者质粒中，并能够在体内表达相应多肽从而诱导免疫反应。

在优选实施方案中，本发明的疫苗中所述病毒选自以下：腺病毒、疱疹病毒、EB病毒、腺病毒伴随病毒、痘苗病毒、甲病毒、慢病毒、逆转录病毒、流感病毒、副流感病毒、水泡性口炎病毒、冠状病毒、麻疹病毒、乙脑病毒、登革病毒、噬菌体或者其任何组合。更优选的实施方案中，所述病毒为腺病毒。最优选的实施方案中，本发明的基因疫苗为rvAdEasyNSP4。

本发明所述基因疫苗中，质粒可以为复制型或非复制型质粒。在优选实施方案中，本发明的基因疫苗为pCI-NSP4。

本发明的基因疫苗可以制成注射剂、口服剂、滴鼻剂、喷雾剂或透皮剂形式，以合适的方式给药。

基于本发明的公开内容，本领域技术人员可以利用轮状病毒非结构蛋白NSP4或者其免疫原性片段的基因来开发各种用于预防或者治疗由轮状病毒引起的疾病。因此，本发明也公开了轮状病毒非结构蛋白NSP4或者其免疫原性片段的基因作为疫苗的用途。

本发明的基因疫苗可以用于免疫动物，制备预防或治疗轮状病毒腹泻的抗体制剂。

本发明也公开了预防或治疗轮状病毒腹泻的抗体的生产方法，包括用本发明中公开的基因疫苗免疫动物，在动物体内产生抗体并分离出该抗体。所述动物可以是本领域技术人员熟知的可以用来制备抗体的动物，例如牛、马、兔、羊、鼠或者禽类。

附图说明

图1为重组腺病毒的PCR检测结果。

1：野生型腺病毒Ad5

2：rvAdEasyNSP4(全长基因)

3：DL2000DNA分子量标记

4：rvAdEasyNSP4(编码区基因)

图2为重组腺病毒rvAdEasyNSP4中特异性NSP4基因片段Southernblot检测。

1：Ad5/BamH I阴性对照

2：rvAdEasyNSP4/BamH I

图3为重组腺病毒中NSP4基因RT-PCR检测结果。

1：阴性对照

2：DL2000DNA分子量标记

3：rAdEasyNSP4

图4为rAdEasyNSP4表达产物的Western blot分析。

1：rAdEasyNSP4(293细胞沉淀)

2：野生型Ad5

3：rAdEasyNSP4(293细胞培养上清)

图5为重组腺病毒rvAdEasyNSP4免疫小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ的测定。

Ein：滴鼻实验组

Eis：灌胃实验组

Cin：滴鼻对照组

Cis：灌胃对照组

对照组：野生型5型腺病毒

图6为重组腺病毒rvAdEasyNSP4各次免疫后血清IgG抗体的阳转率。

1vacc：第1次免疫

2vacc：第2次免疫

3vacc：第3次免疫

Ad5：野生型腺病毒

rvAdEasyNSP4：重组腺病毒

图7为轮状病毒SA11病毒攻击后乳鼠的腹泻百分率。

Control：对照组

Ein：滴鼻实验组

Eis：灌胃实验组

横坐标数字：代表病毒攻击后的天数

图8为SA11病毒攻毒后灌胃组的腹泻评分。

Control：对照组

Eis：灌胃实验组

横坐标数字：代表病毒攻击后的天数

图9为SA11病毒攻毒后滴鼻组的腹泻评分。

Control：对照组

Ein：滴鼻实验组

横坐标数字：代表病毒攻击后的天数

图10为pCI-NSP4在293细胞表达的间接免疫荧光检测。

A：pCI质粒对照转染293细胞

B：pCI-NSP4转染293细胞

图11为DNA疫苗pCI-NSP4免疫后血清特异性抗NSP4IgG抗体的平均滴度。

系列1：pCI

系列2：pCI-NSP4

具体实施方式

下面结合优选实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体的实验方法，通常按照常规条件和方法，如分子克隆实验室手册(Sambrook，et al.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述方法或试剂制造商提供的方法。

实施例1

本实施例的内容是以腺病毒为载体，表达人轮状病毒非结构蛋白NSP4，在小鼠模型上对重组腺病毒的免疫效果进行了研究，在动物水平上证明该重组腺病毒有望作为新型轮状病毒疫苗。具体步骤如下：

1.将NSP4基因克隆入穿梭载体pShuttle-CMV

用内切酶Sal I和Not I(New England Biolabs)分别双酶切pGEM-11zf-NSP4质粒(参见：王大燕，王健伟等.人轮状病毒NSP4蛋白的表达及其致小鼠腹泻模型的初步建立.中国病毒学，2003，18(3)：217-220；王大燕，王健伟，于修平等.中国轮状病毒非结构蛋白NSP4基因变异特征的分析.中华实验和临床病毒学杂志，2003，17(1)：10-14)和穿梭质粒pAdShuttle-CMV(参见He TC，Zhou S，da Costa L，Yu J，Kinzler KW，Vogelstein B.A simplified system for generating recombinantadenoviruses.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，95：2509-14)：pShuttle-CMV 1μl，NSP4片段14μl，10×连接酶缓冲液2μl，DNA连接酶1μl，补水至20μl，12-16℃连接过夜。取10μl连接产物转化感受态E.coli DH10B(Invitrogen)。挑取氨苄青霉素(Amp)抗性克隆，用含Amp的LB培养液扩大培养后，以碱裂解法小量制备质粒，用Sal I和Not I双酶切鉴定，得到插入有NSP4的穿梭质粒pShuttle-CMV-NSP4。

2.重组腺病毒的获得

用碱裂解法小量制备上述克隆有外源基因的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-NSP4及腺病毒骨架质粒pAdEasy-1，并溶解于70μlddH2O中备用。取约500ng重组穿梭质粒，用Pme I单酶切以线性化，无水乙醇沉淀，溶解于6μl无菌去离子中，与约100ng pAdEasy-1(见He TC，Zhou S，da Costa L，Yu J，Kinzler KW，Vogelstein B.A simplifiedsystem for generating recombinant adenoviruses.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，95：2509-14)转化E.coli BJ5183(Stratagen)，取细菌悬液分别涂入含50μg/ml卡那霉素(Kan)的培养板中，于37℃培养16-20小时，挑选单菌落，接种至2ml含有Kan(25μg/ml)的培养液内，置37℃摇床培养10-15小时，碱裂解法小量提取质粒DNA，获得了重组腺病毒基因组质粒pAdEasyNSP4。所得重组腺病毒质粒经过琼脂糖电泳初筛后用Pac I(New England Biolabs)酶切进一步鉴定，可产生4.5Kb左右的片段。将所得重组腺病毒质粒转化以氯化钙法制备的宿主菌DH10B(rec A1，end A1)感受态细胞，在此宿主菌中可产生高拷贝数的质粒，挑取目的克隆，经酶切鉴定后，-70℃保存菌种备用。

用QIAGEN Plasmid Midi Kit(Qiagen公司产品)提取重组腺病毒质粒，Pac I酶切，无水乙醇沉淀回收片段，溶于无菌去离子水中。在T-12.5培养瓶(Nunc)中培养293细胞(美国ATCC)，转染时细胞的丰度应为50％-70％。将Pac I酶切线性化后的重组腺病毒DNA 20μl及8μl的Lipofectamine 2000(Invitrogen公司产品)分别与100μl M液(无抗生素、无血清的含有谷氨酰胺及NaHCO3的DMEM培养液)充分混匀，室温下温育15分钟，混合两种悬液室温继续作用30分钟。在上述等候的时间里，移去293细胞的原培养液，用2ml M液洗细胞2次。补加800μl M液至Lipofectamine2000-DNA的复合物中，轻轻混匀后接种293细胞，37℃，5％CO₂培养箱，温育3-5小时。吸弃含DNA/脂质体复合物的培养液，补加含10％胎牛血清的DMEM完全培养液，继续培养。在转染后6-7天，细胞出现肿胀变圆等细胞病变(CPE)，收集细胞与上清液一起-70℃、37℃反复冻融3次(也可以超声破碎)，取适量的冻溶液接种293细胞，以含2％小牛血清的DMEM培养液于37℃、5％CO₂培养箱中培养，观察细胞病变，按上述方法收病毒传代一次。所得重组腺病毒命名为rvAdEasyNSP4。

3.重组腺病毒的鉴定

(1)形态学鉴定

293细胞培养rvAdEasyNSP4重组腺病毒，待细胞病变完全后，反复冻融3次，15000rpm，离心10分钟，取上清，磷钨酸负染后在透射电子显微镜下观察呈二十面体结构，直径约为70nm，具有典型的腺病毒形态。

(2)PCR分析

将重组腺病毒rvAdEasyNSP4接种293细胞，约3天后离心收集细胞沉淀，用QIAamp DNAMini Kit(Qiagen公司产品)提取DNA，分别用NSP4全长引物和编码区引物，对经反复冻融后获得的重组腺病毒模板进行PCR扩增，反应条件为：94℃灭活3分钟，开始PCR循环，条件为94℃60秒，54℃60秒，72℃60秒，共30次，最后72℃延伸7分钟。

PCR引物由上海生工生物工程公司合成：

NSP4全长引物：

Beg：RV10F 5’GGCTTTTAAAAGTTCTGTTC3’(SEQ ID NO：1)

End：RV10R 5’GGTCACGCTAAGACCATTCC3’(SEQ ID NO：2)

NSP4编码区引物：

Beg：RV10F0203 5’TGCGAATTCATGGATAAGCTTGCCGAC3’

(SEQ ID NO：3)

End：RV10R0203 5’AACCTCGAGCATGGATGCAGTCACTTC3’

(SEQ ID NO：4)

分别用NSP4全长引物和编码区引物进行PCR扩增，可以检测到750bp和525bp的特异性扩增条带，野生型腺病毒Ad5为阴性，说明重组腺病毒基因组中整合有NSP4基因(见图1)。

(3)Southern Blotting

采用Roche公司探针标记与杂交试剂盒，按说明书操作进行。结果表明在重组腺病毒中确有特异性的RV NSP4基因稳定整合。实验中使用了野生型Ad5作为阴性对照(见图2)。

(4)外源基因的表达检测

1)RT-PCR检测目的基因的转录

收取重组腺病毒及野生型Ad5感染的293细胞，用800μl Trizol试剂(Invitrogen)处理细胞，按试剂盒说明提取总RNA，溶于20μl DEPC处理水中，用0.5μl DNase I(Takara)处理RNA样品，除去污染的痕量DNA。加入DMSO 1μl，上下游引物各1μl，RNA 5μl，dNTP 4μl，10×PCRbuffer 5μl，Rnasin 0.5μl，逆转录酶(Promega公司)1μl，补加DEPC水至50μl，42℃反应1小时逆转录合成cDNA，然后补加1μl Taq酶(TaKaRa公司)进行PCR反应，反应条件同前。用野生型Ad5作为阴性对照，经RT-PCR获得的cDNA，与预计的大小一致，而Ad5则为阴性，表明重组腺病毒在293细胞内均能有效转录(见图3)。

2)Western blotting分析目的蛋白表达

待293细胞生长至70％-80％丰度时，接种重组腺病毒，收获感染的细胞，离心，分别取上清和细胞沉淀，取上清80μl，细胞沉淀用80μl PBS重悬，分别加入20μl 5×上样缓冲液，15％SDS-PAGE电泳后，蛋白转移至硝酸纤维素膜，进行Western blotting检测。可见上清和沉淀在30KD附近均检测到特异的条带，Ad5对照无特异条带产生，说明腺病毒携带的NSP4基因得到表达(见图4)。

4.免疫效果观察

(1)免疫方法

将6-8周龄雌性BalB/c纯系小鼠(购自军事医学科学院动物中心)随机分组，接种前，通过小鼠尾部采取基础血，轮状病毒抗体检测均为阴性。鼻腔接种时，先用乙醚麻醉小鼠，然将100μl[2×10⁸荧光形成单位(IFU)]的重组腺病毒滴入小鼠鼻腔；口服接种时直接用注射器将200μl(2×10⁸IFU)的重组腺病毒注入小鼠胃内。4周和8周后，再次经尾部采血，并用与初次免疫时等量的病毒加强免疫，对照组，接种等量的野生型5型腺病毒，其它处理完全相同。

(2)小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ的检测

免疫后小鼠(实验组和对照组分别滴鼻免疫5只，灌胃免疫5只)摘眼球处死，在75％乙醇中浸泡后，超净台中取脾脏，200目筛网研磨，加入5ml 1640无血清培养液中，离心去上清，加入氯化铵轻轻混匀1分钟后，马上离心，1500转，6分钟，去上清，加入4ml无血清1640，1500转，10分钟，洗涤一次，加入1ml 1640完全培养液重悬细胞，台盼蓝染色计数活细胞数目，调整细胞数，以2×10⁶/ml浓度加入到96孔板中，100μl/孔，5小时后，待细胞贴壁，去上清，每孔再加入：①含有NSP4蛋白的1640完全培养液，用量为1μg/孔；②相应的对照孔仅加入1640完全培养液，取培养72小时的上清50μl用于检测IFN-γ。

使用小鼠IFN-γ检测试剂盒进行(Amsham Pharmacia公司)进行检测。根据系列稀释的IFN-γ标准品的ELISA 450nm吸光度值(A₄₅₀)绘制出标准曲线，根据标准曲线计算出每组小鼠脾细胞IFN-γ的分泌量。发现滴鼻组能够产生IFN-γ最高可达138.2pg/ml，平均为57.1pg/ml，而对照组没有显著性差别，证明重组腺病毒可诱导针对NSP4的细胞免疫反应。(见图5)

(3)小鼠血清标本中NSP4的特异性IgG抗体检测

用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释纯化的GST-NSP4T(见：王大燕，王健伟等.人轮状病毒NSP4蛋白的表达及其致小鼠腹泻模型的初步建立.中国病毒学，2003，18(3)：217-220)蛋白包被96孔平底酶标板(Costar)，每孔100μl(1μg)，4℃过夜，用含0.05％Tween的PBS(PBST)，pH7.4，洗板4次，以PBST配制含1％BSA的封闭液，按350μl/孔，封闭抗原包被孔，37℃1小时，洗板。加入经适当稀释的待检小鼠血清标本(抗体稀释液为PBST中加入BSA，终浓度为0.1％)，100μl/孔，做复孔，37℃1小时，洗板5分钟×4次。加入1∶2000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗鼠IgG(Santa Cruz Biotechnology)，37℃1小时，洗板5分钟×6次。加入TMB及H₂O₂底物，37℃作用15分钟，每孔加入50μl 2mol/L H₂SO4终止显色反应，读取A₄₅₀值。以P＞0.1且P/N≥2.1判为阳性。P：待测孔A值，N：阴性对照组A值(在本实验中以野生型腺病毒免疫组测得的A值作为N值)。

结果表明，初次免疫后血清抗体的滴度可达1∶1000，阳转率为28.5％；再次免疫后，最高血清抗体滴度仍为1∶1000，但是血清抗体阳转率有了较大幅度的提高，达到了85.7％；第三次免疫后，血清抗体阳转率达到100％(见图6)。第三次免疫后42.9％的小鼠血清抗体滴度达到了1∶10,000。证明重组腺病毒可诱导针对NSP4的特异性体液免疫。

(4)小鼠血清中特异性抗NSP4IgA抗体的检测

方法同上，二抗为1∶2000稀释的HRP标记的抗鼠IgA抗体(Sigma公司产品)。在第三次加强免疫后，血清IgA的滴度为1∶50-100，阳转率可以达到71.4％，证明重组腺病毒可有效诱导针对NSP4的黏膜免疫。

(5)乳鼠攻毒试验

为了评价针对NSP4免疫的保护效果及其作用机制，我们将小鼠免疫3次后与雄性小鼠(轮状病毒抗体阴性)合笼，使其怀孕，对生产的乳鼠(4日龄)通过灌胃途径用SA11株轮状病毒攻击，观察腹泻的产生情况并进行腹泻评级，即：将腹泻分为4级，1级为松软的黄色粪便，4级为完全的水样便。2级(水样粘液便带有固体松软粪便)以上的才判为腹泻。为了保证评价标准的一致性，腹泻的判断由同一人完成。图7、图8、图9显示rvAdEasyNSP4免疫组的腹泻的百分率和腹泻评分(反应腹泻严重程度)均较对照组低，表明表达NSP4的重组腺病毒免疫小鼠后能产生针对SA11株轮状病毒的免疫保护作用。

上述实施实例表明，我们获得的人轮状病毒NSP4基因非复制型重组腺病毒rvAdEasyNSP4，能诱导小鼠产生较强的针对轮状病毒NSP4的体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫，滴鼻和灌胃途径免疫小鼠均能产生针对SA11株轮状病毒的免疫保护作用，能降低腹泻的百分率和腹泻的严重程度。由此推之，本发明的思路也适用于其他的粘膜表达载体。

本发明证明，在重组腺病毒rvAdEasyNSP4免疫过的母鼠产生免疫反应之后，其产下的乳鼠对轮状病毒攻击有抵抗作用，这提示抗NSP4的IgG具有保护作用--因为已知只有IgG可以通过胎盘，活化T细胞、IgA等不能通过胎盘。因此有理由相信，基于NSP4的基因疫苗也可以用于免疫多种动物，如牛、羊、马、兔、鼠等，或鸡等禽类，生产抗NSP4抗体用于预防或治疗轮状病毒腹泻；也可以通过给动物注射基因疫苗的方式，通过诱导母体的免疫反应来预防幼仔的轮状病毒腹泻。

实施例2

本实施例中我们构建了表达不同基因型NSP4蛋白的真核表达质粒，并通过肌肉注射法免疫小鼠，对免疫学效果进行了检测。本内容也适用于其他真核表达载体。具体步骤如下：

1.真核表达质粒pCI-NSP4的构建

EcoR I和Kpn I分别双酶切质粒pFastBacHTa-NSP4(见王大燕，王健伟等.我国人轮状病毒不同基因型NSP4的致病性研究，中国病毒学，发表中)和pCI载体(Promega公司)，经T4 DNA连接酶4℃连接过夜，转化E.coli DH5α，碱裂解法小提质粒，经EcoR I和Kpn I双酶切鉴定阳性克隆，可以切下约750bp的目的片段。对经酶切鉴定正确的阳性克隆进行序列测定(由上海生工生物工程公司完成)。

2.NSP4基因在哺乳动物细胞中的表达测试

用QIAGEN plasmid Midi Kit(Qiagen公司产品)提取质粒DNA，溶于无内毒素水中备用。质粒提取操作方法按试剂盒说明书进行。在T-25培养瓶(Nunc公司产品)中培养293细胞(购自美国ATCC)，转染时细胞的丰度应为50％-70％(24小时内)。pCI-NSP4质粒20μl(约5μg)及10μl的Lipofectamine2000(Invitrogen)分别与100μl M溶液(M溶液为无抗生素、无血清的含有谷氨酰胺及NaHCO₃的DMEM培养液)充分混匀，室温下温育15分钟，轻轻混合两种悬液，室温继续作用30分钟。移去293细胞的原培养液，用2ml M溶液洗细胞2次。补加800μlM溶液至Lipofectamine2000-DNA的复合物中，轻轻混匀后，接种293细胞，置37℃、5％CO₂培养箱，温育3-5小时。补加4ml含10％小牛血清的DMEM完全培养液，置37℃、5％CO₂培养箱，温育过夜。约24小时后吸弃含DNA/脂质体复合物的培养液，补加5ml DMEM完全培养液，继续培养。

转染3天后刮取293细胞，涂抗原片，用风扇吹干(低倍镜下观察是否有足够的细胞且分布均匀，可保存于-80℃备用)。按常规方法进行间接免疫荧光试验(IFA)检测，用激光共聚焦显微镜(Leica公司)观察荧光，可以看到重组质粒转染的细胞浆内有NSP4抗原的表达，而pCI空载体转染的细胞未见到特异性的荧光(见图10)，证明我们构建的表达质粒能够在真核细胞中有效表达NSP4蛋白，可用于基因免疫。

3.DNA疫苗的制备

将800ml含有重组质粒的细菌的新鲜培养物利用QIAGENEndofree plasmid Mega kit(Qiagen公司)大量提取DNA，操作按照试剂盒说明进行，DNA溶于试剂盒中提供的无内毒素的TE(pH8.0)中。

(1)浓度测定

测定核酸溶液在260nm的光密度。1A≈50μg双链DNA。

(2)纯度测定

1)分光光度法：样品的A260/A280应在1.8～2.0之间。

2)琼脂糖凝胶电泳法：应为单一的条带，无RNA条带存在。

3)酶切鉴定法：酶切片段与预期的酶切结果相符。

4.动物免疫试验

(1)免疫方法

选取6周龄BalB/C雌性小鼠，分为2组：①pCI(5只)；②pCI-NSP47只)。注射用DNA的浓度为1μg/μl，每只小鼠每次肌肉注射100μg，每间隔4周免疫1次，共免疫5次，在每次免疫前采鼠尾血进行抗体测试，在最后一次免疫后4周将小鼠放血处死。给小鼠注射时在注射器的针头上加套一个小管，使针头仅外漏2-3毫米，以保证每次注射时针头扎入的深度一致，并注射到肌肉中。将针头垂直扎入胫骨前肌，把100μl 0.25％的无菌蔗糖溶液注射入肌肉内。将针头保持3-5秒，防止泄漏，然后将针拔出。间隔24小时后，在同一部位按照相同方法将100μl浓度为1μg/μl的DNA溶液注射到胫骨前肌内。

(2)特异性抗体检测

用ELISA测定抗体的效价，具体方法如下：用表达纯化的NSP4蛋白(见王大燕，王健伟等.人轮状病毒NSP4蛋白的表达及其致小鼠腹泻模型的初步建立.中国病毒学，2003，18(3)：217-220)为抗原包被酶标板(Costar公司)，每孔100μl(10ng/μl)，4℃过夜，酶标板用PBS-T洗3×5分钟后，每孔加入不同稀释度的待测血清100μl(用含0.1％BSA的PBST作为抗体稀释液)，37℃反应1小时，PBS-T洗3×5分钟，加入HRP标记的抗小鼠IgG抗体(用抗体稀释液作1∶5000稀释)，每孔100μl，37℃1小时，PBS-T洗5×5分钟，加入底物TMB溶液，每孔100μl，37℃15-30分钟，加入50μl 2mol/L硫酸作为终止液，在450nm波长读取吸光度值。以P/N≥2.1为阳性。(P为实验组血清A值，N为pCI空载体免疫组相应稀释度血清A值)。

IgG抗体滴度的检测方法如下：第一次免疫后血清样品从1∶16开始作倍比稀释，第二次和第三次免疫后从1∶64开始作倍比稀释，第四次、第五次免疫后从1∶100开始倍比稀释至1∶800，对阳性血清进一步进行1∶1,000和1∶10,000稀释。每个稀释度做两个复孔，酶标检测仪测定每孔的吸光度值。结果取两个复孔的吸光度值的平均值，空白对照调零。血清最高稀释度的倒数即为免疫小鼠血清IgG抗体滴度。

我们一共进行了5次免疫。以每一组所有小鼠的抗体滴度的几何平均值作为平均抗体滴度，图11显示了免疫小鼠血清的特异性抗NSP4IgG抗体滴度。免疫前血清为阴性结果，小鼠第一次免疫后即能检测到特异性抗体，但是抗体滴度较低，加强免疫后，特异性结合抗体逐步升高，尤其在第三次免疫后滴度迅速升高。第四次免疫后抗体滴度达到1∶800的比例为85.7％，第五次免疫后滴度达到1∶1000的比例为100％。

由于在实施例1中，我们已证明抗NSP4的IgG具有良好的保护作用，因此我们主要检测了NSP4DNA疫苗诱导IgG抗体的情况，结果表明DNA免疫可以有效诱导针对NSP4的抗体，这提示表达NSP4的DNA疫苗也可以有效激发免疫反应。

序列表

<110>王健伟

     王大燕

     洪涛

<120>基于NSP4基因的轮状病毒基因疫苗

<130>CP1050016

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>1

ggcttttaaa agttctgttc                                    20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>2

ggtcacgcta agaccattcc                                    20

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>3

tgcgaattca tggataagct tgccgac                27

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>4

aacctcgagc atggatgcag tcacttc                27

Claims (4)

1.一种含有人轮状病毒非结构蛋白NSP4的基因的轮状病毒基因疫苗，所述疫苗为rvAdEasyNSP4。

2.一种含有人轮状病毒非结构蛋白NSP4的基因的轮状病毒基因疫苗，所述疫苗为pCI-NSP4。

3.权利要求1或2的基因疫苗，其为注射剂、口服剂、滴鼻剂、喷雾剂或透皮剂形式。

4.人轮状病毒非结构蛋白NSP4的基因用于制备轮状病毒疫苗的用途。

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