CN107936123A - 一种猪传染性胃肠炎病毒融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪传染性胃肠炎病毒融合蛋白及其制备方法和应用。本发明提供的融合蛋白S1‑TAT，包括猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）S蛋白主要抗原位点的一段序列及结合在其C端的TAT蛋白转导肽碱性氨基酸富集区的11个核心氨基酸。将融合蛋白S1‑TAT通过腹腔注射或灌胃的方式免疫小鼠，可有效诱导特异性血清IgG抗体和sIgA黏膜抗体的产生，具有良好的免疫原性；TAT能够携带与其融合表达的S1蛋白穿过小肠肠壁细胞；且融合蛋白S1‑TAT对于小鼠生长没有影响。因此，本发明将TGEV S1蛋白与TAT融合表达，为预防TGEV感染提供了一种新的方法，也为猪传染性胃肠炎病毒新型疫苗的开发奠定了基础。

Description

一种猪传染性胃肠炎病毒融合蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因生物工程技术领域，具体涉及一种猪传染性胃肠炎病毒S1 和TAT融合蛋白及其制备方法和相关应用。
背景技术
猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)属于冠状病毒属，是一种单股正链RNA病毒，是引起急性猪传染性胃肠炎疾病的主要病原体。该病毒主要感染猪群体的小肠器官，可迅速复制增殖，破坏小肠黏膜上皮细胞，导致肠道功能紊乱，肠膜萎缩，幼猪在感染数小时内出现呕吐、腹泻和脱水等症状。该病毒具有季节爆发性，特别在冬春两季呈群体爆发趋势，一般发病后3-7天内死亡率可达到100％，而感染了TGEV的成年猪死亡极少，但较正常猪体重下降，发育缓慢，但病毒也会随着排泄物长期潜伏在生活环境中，继而蔓延到整个猪场，甚至处于哺乳期的母猪感染了TGEV后，会加剧初生幼仔猪的死亡。一般幼猪出生后体内抗体要达到成年猪水平需要一段时间，但通过检测吮吸母乳健康幼仔猪的粪便，观察到血液内的IgG发生迅速下降，而sIgA抗体可在较长时间内保持较高的水平，可见 sIgA抗体是仔猪获得被动免疫保护的重要基础(Welter MW,Horstman MP,Welt -er CJ,et al.An overview ofsuccessfμl TGEV vaccination strategies and discussion o -n theinterrelationship between TGEV and PRCV.Adv Exp Med Biol.1993；342:46 3-8.)。
TGEV病毒粒子包裹着一层囊膜，全基因组共分为7个不分节段区域，编码着7种不同的功能蛋白，分为3种非结构蛋白和4种结构蛋白。其包膜主要由纤突蛋白(S)和膜蛋白(M)组成，在病毒核心内部，则由核衣壳蛋白(N) 和膜结合蛋白(sM)一起包裹着病毒的RNA基因组与M蛋白的羧基末端相互作用。其中，S蛋白可作用于B淋巴细胞，引起体液免疫反应产生血清特异性中和抗体，对开发抗猪传染性胃肠炎病毒疫苗具有重要的研究意义。TGEV的S基因全长约为4300bp，在S蛋白的氨基末端S1区域含有4个主要抗原位点，从N 末端到C末端，依次是C、B、D和A(Reguera J,D,Santiago C,et al.Antig -enic modμles inthe N-terminal S1region of the transmissible gastroenteritis virus spi -keprotein.J Gen Virol.2011；92(Pt 5):1117-26)。C和B抗原区域是决定感染发生的位置取向所必需的基因序列，B位点空间结构较为复杂，但和A、D抗原位点一样在不同毒株之间高度保守，而C位点在碱基上略有不同。A抗原位点的氨基酸范围位于第538-591之间，是能够诱导机体发生免疫反应产生中和抗体的关键糖基化位点，存在于病毒粒子的表面上，是研究TGEV糖蛋白S免疫中和反应的热点序列；D抗原位点由至少2个以上的相关抗原表位构成，不经过细胞内的糖基化修饰作用，应用仅含D抗原位点基因免疫小鼠产生的血清特异性抗体也具有中和活性。若TGEV S蛋白缺失编码A、D位点的基因序列，则其表达产物不能诱导机体产生中和抗体(Jiménez G,Correa I,Melgosa MP,et al.Critical epi -topes intransmissible gastroenteritis virus neutralizati.J Virol.1986；60(1):131-139)(Gebauer F,Posthumus WP,Correa I,et al.Residues involved in the antigenicsites of transmissible gastroenteritis coronavirus Sglycoprotein.Virology.1991；183(1):225- 38)(De Diego M,Laviada MD,Enjuanes L,et al.Epitope specificity of protective lact -ogenic immunity against swinetransmissible gastroenteritis virus.J Virol.1992；66(1 1):6502-8)。研究表明，含TGEV S基因主要抗原位点(称为S1序列)比完整长度S基因具有更好的免疫效果(任晓峰,尹杰超,司微等.猪传染性胃肠炎病毒 TH-98株S基因核酸疫苗的构建及其免疫效力[J].中国兽医科学. 2006；(03):203-6)。
TAT蛋白转导肽是一段可以携带多种外源生物大分子穿过细胞膜进入机体细胞中发挥生理功能的多肽，分为5个功能结构区域，碱性氨基酸富集区是TAT 转导肽的核心肽段，含有11个核心氨基酸(YGRKKRRQRRR)，包括6个精氨酸 (R)和2个赖氨酸(K)(Vivès E,Brodin P,Lebleu B.A truncated HIV-1Tat protein basic domain rapidlytranslocates through the plasma membrane and accumulates in the cellnucleus.J Biol Chem；1997,272(25):16010-7)。一般在跨膜转导过程中，生物大分子由于细胞膜的相关特性不能有效的渗透到细胞中，导致药物摄入量少， TAT蛋白转导肽的发现为弥补这种不足提供了一种新的安全有效的跨膜转导方式，具有良好的应用前景。因此，首次将TGEV S1与TAT基因进行融合表达，对研究预防TGEV感染具有重要意义。
发明内容
为了扩大现有技术的研究范围，本发明的目的是提供一种猪传染性胃肠炎病毒TGEV S1与TAT基因共表达的融合蛋白S1-TAT及含有重组表达载体 pGEX-6p-1-S1-TAT的大肠杆菌基因工程菌株。该菌株表达的融合蛋白S1-TAT 产量较大，易于工业化生产，成本低，具有较好的免疫原性。TAT蛋白转导肽可以携带S1蛋白穿过肠壁细胞而进入血液，经过血液循环，使融合蛋白S1-TAT 到达不同的组织，主动刺激机体产生针对该融合蛋白的抗体。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
本发明第一方面提供一种融合蛋白S1-TAT，其序列为SEQ ID NO.2所示。
本发明第二方面提供一种融合蛋白S1-TAT对应的的核苷酸序列，优选编码序列为SEQ ID NO.1所示。
本发明第三方面提供一种含有融合蛋白S1-TAT基因的大肠杆菌基因工程菌株，分类命名：Eschierichia coli BL21(DE3)(pGEX-6p-1-S1-TAT)大肠杆菌BL21(DE3)(pGEX-6p-1-S1-TAT)，保藏编号：CCTCC NO:M 2017785。该菌已于 2017年12月12日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，地址：中国.武汉. 武汉大学。
本发明第四方面提供一种融合蛋白S1-TAT的制备方法，其步骤如下：
1、获得含有TGEV S1基因及TAT转导肽基因的重组表达质粒 pGEX-6p-1-S1-TAT：
人工合成重组基因S1-TAT，其序列为SEQ ID NO.1所示，连接在表达载体 pGEX-6p-1上，即构建了重组表达质粒pGEX-6p-1-S1-TAT；
2、大肠杆菌基因工程菌的制备：
将重组表达质粒pGEX-6p-1-S1-TAT转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到的阳性转化子经菌液PCR和基因测序鉴定为阳性的菌落即为能表达融合蛋白 S1-TAT的重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)(pGEX-6p-1-S1-TAT)。
3、融合蛋白S1-TAT的制备：
将重组基因工程菌株E.coli BL21(DE3)(pGEX-6p-1-S1-TAT)的单菌落接种于含100μg/ml Amp的20ml LB液体培养基中，37℃过夜培养10-12h。第二天，取1ml菌液转接到100ml含100μg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃摇床培养 3h，到菌液OD值约为0.6-0.8时，加IPTG诱导剂至终浓度为0.5mM，于30℃诱导表达4h。诱导结束后，将100ml菌液分装于10mlEP中，4℃，8000rpm离心5min，收集菌体后用适量PBS缓冲液重悬菌体，400W超声破碎20min，破碎 3s，停5s。将破碎后菌液4℃，12000rpm离心10min，收集破碎后上清，按GST-Resin 纯化步骤纯化融合蛋白S1-TAT，其序列为SEQ ID NO.2所示。
本发明第五方面提供一种融合蛋白S1-TAT在制备预防猪传染性胃肠炎病毒疫苗中的应用。
在本发明的一个具体实施例中将昆明小鼠随机分为腹腔注射组、灌胃组和阴性对照组。腹腔注射组和灌胃组用纯化后的融合蛋白S1-TAT以100μg/只进行免疫，阴性对照组以相同剂量PBS进行免疫。免疫3次，每次间隔2周。在免疫后的第7、14、21、28、35和42天随机取3只小鼠断尾取血，分离血清，间接 ELISA测定免疫小鼠血清中特异性IgG抗体OD492值。实验结果显示，腹腔注射组的小鼠血清中IgG抗体OD492值持续上升，与阴性对照组之间差异极显著，而灌胃组的IgG抗体OD492值上升较为缓慢，且血清特异性IgG抗体水平始终低于腹腔注射组，阴性对照组则一直维持在较低水平，表明融合蛋白S1-TAT采用腹腔注射方式，可有效刺激机体产生体液免疫，提供免疫保护。
在本发明的一个具体实施例中，采集免疫后第7、14、21、28、35和42天腹腔注射组、灌胃组和阴性对照组小鼠的粪便，间接ELISA测定免疫小鼠粪便中血清特异性抗体IgA的OD492值。实验结果显示，灌胃组小鼠特异性IgA抗体的OD492值有一定幅度的波动，但与阴性对照组之间仍然差异极显著，而腹腔注射组和阴性对照组IgA抗体的OD492值则处于较低水平，表明融合蛋白S1-TAT 采用灌胃方式，可诱导局部黏膜发生免疫反应产生sIgA黏膜抗体，获得免疫保护的基础。
在本发明的一个具体实施例中，使用间接ELISA检测融合蛋白S1-TAT穿肠功能，即测定PBS对照组和融合蛋白S1-TAT随着时间增加而穿过小鼠肠管进入试管中的OD492值。与对照组相比，试管中融合蛋白S1-TAT的OD492值逐渐上升，说明位于S1序列C端的蛋白转导肽TAT可以携带TGEV S1蛋白穿过小肠肠壁细胞进入到试管缓冲液中。
在本发明的一个具体实施例中，每隔2周称量腹腔注射组、灌胃组和PBS 对照组小鼠的平均体重，观察融合蛋白S1-TAT对小鼠生长指标的影响。实验结果表明，腹腔注射组和灌胃组小鼠的平均体重变化趋势与PBS对照组基本一致，3组小鼠的体重没有显著性差异，说明用融合蛋白S1-TAT免疫小鼠不影响小鼠的体重生长，可以初步评价为比较安全可靠的免疫抗原。
因此，本发明的优势在于：
首次将蛋白转导多肽TAT与TGEV S1基因进行融合表达。许多传统疫苗都有必须要经过注射才能产生体液免疫等问题，需要投入较大的人力和物力。如果将TAT基因与S1基因共同构建在表达载体上进行融合表达，那么TAT蛋白转导肽可以携带S1蛋白穿过小肠肠壁细胞，防止S1蛋白被胃液消化而直接进入到血液中，引起体液免疫，这样的方式效率更高，投入的人力和物力也会减少，具有实际操作的可行性。
附图说明
图1为一种重组表达质粒pGEX-6p-1-S1-TAT构建示意图。
图2为一种重组基因S1-TAT序列PCR扩增示意图：
M:DNA Marker IV；1:S1-TAT基因片段。
图3为一种重组表达质粒pGEX-6p-1-S1-TAT酶切鉴定示意图：
M:DNA Marker IV；2:pGEX-6p-1-S1-TAT经BamH I和EcoR I双酶切。
图4为一种重组工程菌E.coli BL21(DE3)(pGEX-6p-1-S1-TAT)诱导表达示意图：
M:蛋白Marker；1:未诱导的E.coli BL21(DE3)(pGEX-6p-1-S1-TAT)菌液； 2:诱导后E.coli BL21(DE3)(pGEX-6p-1)破碎液上清；3:诱导后E.coli BL21(DE3) (pGEX-6p-1)破碎液沉淀；4:诱导后E.coli BL21(DE3)(pGEX-6p-1-S1-TAT)破碎液上清；5:诱导后E.coli BL21(DE3)(pGEX-6p-1-S1-TAT)破碎液沉淀。
图5为一种融合蛋白S1-TAT可溶性表达的诱导温度摸索示意图：
M:蛋白Marker；1:未诱导的E.coli BL21(DE3)(pGEX-6p-1-S1-TAT)菌液； 2:诱导后E.coli BL21(DE3)(pGEX-6p-1)破碎液上清；3:诱导后E.coli BL21(DE3) (pGEX-6p-1)破碎液沉淀；4:18℃,6h诱导后E.coli BL21(DE3)(pGEX-6p-1-S1-TAT) 破碎液沉淀；5:18℃,6h诱导后E.coli BL21(DE3)(pGEX-6p-1-S1-TAT)破碎液上清；6:25℃,5h诱导后E.coliBL21(DE3)(pGEX-6p-1-S1-TAT)破碎液沉淀；7:25℃, 5h诱导后E.coli BL21(DE3)(pGEX-6p-1-S1-TAT)破碎液上清；8:30℃,4h诱导后 E.coli BL21(DE3)(pGEX-6p-1-S1-TAT)破碎液沉淀；9:30℃,4h诱导后E.coli BL21(DE3)(pGEX-6p-1-S1-TAT)破碎液上清；10:37℃,4h诱导后E.coli BL21(DE3) (pGEX-6p-1-S1-TAT)破碎液沉淀；11:37℃,4h诱导后E.coliBL21(DE3) (pGEX-6p-1-S1-TAT)破碎液上清。
图6为一种融合蛋白S1-TAT Western blot免疫印记分析示意图：
M:蛋白Marker；1:诱导后E.coli BL21(DE3)(pGEX-6p-1-S1-TAT)破碎液上清；2:诱导后E.coli BL21(DE3)(pGEX-6p-1-S1-TAT)破碎液沉淀。
图7为一种融合蛋白S1-TAT纯化示意图：
M:预染蛋白Marker；1:纯化蛋白S1-TAT。
图8为一种ELISA测定免疫小鼠血清特异性IgG抗体示意图。
图9为一种ELISA测定免疫小鼠血清特异性IgA抗体示意图。
图10为一种ELISA检测融合蛋白S1-TAT穿肠功能示意图。
图11为一种融合蛋白S1-TAT对小鼠安全性试验示意图。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
在实施例中涉及的所有培养基和分子生物学操作方法为本领域技术人员所熟知。本实验所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟悉。本发明中未详细阐述的内容请参见《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等主编。
【实施例1】融合基因S1-TAT的制备
从美国生物技术中心(NCBI)基因库中获得TGEV TH-98株S1基因序列(KU729220)，并根据蛋白转导结构域多肽TAT基因与外源蛋白基因能够进行融合表达的特性，在TGEV S1基因3’端连接TAT的核苷酸序列，命名为：S1-TAT，其序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
人工合成重组基因S1-TAT，并连接到表达载体pGEX-6p-1上，即合成了重组表达质粒pGEX-6p-1-S1-TAT。
【实施例2】pGEX-6p-1-S1-TAT工程菌的构建
取1μl重组表达质粒pGEX-6p-1-S1-TAT转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，经菌液PCR和基因测序鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性转化子即为能够表达融合蛋白S1-TAT的重组基因工程菌株E.coli BL21(DE3) (pGEX-6p-1-S1-TAT)。
该菌株已于2017年12月12日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：Escherichia coli BL21(DE3)(pGEX-6p-1-S1-TAT)大肠杆菌BL21(DE3) (pGEX-6p-1-S1-TAT)，保藏编号：CCTCC NO:M 2017785，地址：中国.武汉.武汉大学。
【实施例3】基因工程融合蛋白S1-TAT的表达
①将重组基因工程菌株E.coli BL21(DE3)(pGEX-6p-1-S1-TAT)的单菌落接种于20ml含100μg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃过夜培养10-12h。
②次日，按1:100的比例转接到含100μg/ml Amp的20ml新鲜LB液体培养基中，37℃培养3h左右至OD值约为0.6-0.8时，加诱导剂IPTG至终浓度为 0.5mM，于37℃摇床250rpm诱导表达4h。
③将菌液在室温下离心1-2min，弃上清，沉淀用适量PBS缓冲液重悬菌体， 400W超声破碎破3min，破3s，停5s，然后室温下离心2min，取50μl上清与 5×SDS-PAGE上样缓冲液按比例混匀，制得诱导后破碎上清样品。弃去多余的上清，沉淀用适量PBS缓冲液重悬，取50μL沉淀溶液与等5×SDS-PAGE上样缓冲液按比例混匀，制得诱导后破碎沉淀样品。
④将破碎上清样品和破碎沉淀样品置于沸水中煮5-10min，SDS-PAGE电泳检测融合蛋白S1-TAT表达情况。
⑤电泳结束后，卸下凝胶，在考马斯亮蓝染色液中染色2-3h以上，然后用脱色液进行凝胶脱色，每隔30分钟换液一次，直至背景脱干净为止。
SDS-PAGE电泳结果显示，空载体pGEX-6p-1诱导后产物大小约为26kDa，而重组表达载体pGEX-6p-1-S1-TAT诱导表达后条带大小约为70kDa左右，与预期大小相符合，说明重组构建的表达质粒pGEX-6p-1-S1-TAT正确表达了融合蛋白S1-TAT。具体见附图4。
【实施例4】融合蛋白S1-TAT可溶性表达的诱导温度摸索
按照实施例3方法，将重组表达载体pGEX-6p-1-S1-TAT分别置于18℃,6h、 25℃,5h、30℃,4h、37℃,4h不同温度下用终浓度为0.5mM的IPTG诱导剂进行诱导表达，并以未诱导菌液为阴性对照组，空载体pGEX-6p-1为空白对照，探索融合蛋白S1-TAT可溶性表达的最佳温度。
SDS-PAGE结果显示，与未诱导对照组相比，pGEX-6p-1-S1-TAT经过18℃、 25℃、30℃和37℃诱导温度梯度的摸索，融合蛋白S1-TAT在各个温度条件下均有一定含量的可溶性表达。同时对比4组不同温度下融合蛋白S1-TAT可溶性表达的比例，可以明显地看出，在30℃,4h诱导条件下，融合蛋白S1-TAT的可溶性含量在整个上清中所占比例最大。具体见附图5。
【实施例5】融合蛋白S1-TAT Western blot免疫印记分析
①将基因工程菌E.coli BL21(DE3)(pGEX-6p-1-S1-TAT)接种于含100μg/ml Amp的20ml LB液体培养基中，37℃过夜培养10-12h后，转接到含100μg/ml Amp 的20ml新鲜的LB液体培养基中，37℃培养3h左右至OD值为0.6-0.8左右，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导剂，在30℃诱导表达4h。诱导结束后，制备诱导后破碎上清和沉淀样品，进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。
②电泳后，取下电泳后的凝胶，按照相对蛋白胶的大小剪裁6张滤纸和1 张NC膜(一定要戴上手套，避免手上的蛋白将膜污染)，NC膜与棉垫、滤纸、凝胶一起置于转膜缓冲液中，浸泡15min。
③将转膜的夹子打开，以棉垫、三层滤纸、电泳后的凝胶、NC膜、三层滤纸、棉垫的顺序，在黑色一面上依次铺好上述装置(各层之间注意避免产生气泡)，将白色的一面放下来合起夹子(膜两边的滤纸不能相互接触，否则会发生短路)。
④将夹子缓缓放入槽中，20V电压下转膜2h左右(蛋白大小不同，转膜时间也不同)。
⑤用镊子取出NC膜，在摇床上用PBST清洗1-2min后，加入5％脱脂奶粉至完全覆盖NC膜，4℃封闭过夜。
⑥次日，倒掉封闭液，用PBST缓冲液将NC膜快摇清洗3次，每次10min，加入按适当比例稀释好的GST一抗，于室温慢摇孵育2h后，用PBST缓冲液将 NC膜快摇清洗5次，每次10min。
⑦加入按适当比例1：5000稀释好的HRP标记的二抗，室温下慢摇孵育2h 后，用PBST缓冲液将NC膜快摇清洗5次，每次10min。
⑧ECL化学发光检测，于暗室中进行X-光胶片曝光。
Western blot免疫印记结果显示，融合蛋白S1-TAT能与抗-GST抗体发生特异性反应且条带较清晰，无杂带。具体见附图6。
【实施例6】融合蛋白S1-TAT纯化
①将基因工程菌E.coli BL21(DE3)(pGEX-6p-1-S1-TAT)接种于20ml含 100μg/mlAmp的LB液体培养基中，37℃过夜培养10-12h后，转接到100ml含 100μg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃培养3h左右至OD值约为0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导剂，在30℃诱导表达4h。
②将发酵好的100ml菌液4℃，8000rpm离心5min，弃上清并收集菌体，用适量PBS缓冲液重悬菌体，400W超声破碎细胞20min(破碎3s，停5s)，然后4℃， 12000rpm离心10min，收集破碎后上清。
③取500μl Glutathione Agarose，用适量PBS缓冲液平衡，将已平衡好的Glutathione Agarose与破碎后上清混合，4℃孵育过夜。
④孵育后，将混合物4℃，3000rpm离心5min，缓慢去掉上清液。
⑤沉淀中加入10倍体积的PBS缓冲液清洗杂蛋白，4℃，3000rpm离心5min，缓慢去掉上清液，并重复2次。
⑥沉淀中加入1倍体积的Elution buffer，室温轻摇10min，4℃，3000rpm离心5min，收集上清液至EP管。
⑦重复步骤⑥两次，将3次收集的上清合并，SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白纯度。
⑧参照Bradford方法，以BSA为标准蛋白绘制标准曲线，检测纯化后融合蛋白S1-TAT浓度。
纯化结果显示，融合蛋白S1-TAT和谷胱甘肽-琼脂糖树脂结合后经PH 8.0 的还原性谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱后获得了纯化蛋白，同时根据BSA标准曲线计算出纯化后融合蛋白S1-TAT的浓度为240μg/mL。具体见附图7。
【实施例7】间接ELISA检测免疫小鼠血清中特异性IgG抗体
(1)血清中抗体的制备。
将昆明小鼠随机分为腹腔注射组、灌胃组和阴性对照组。腹腔注射组和灌胃组用纯化后的融合蛋白S1-TAT以100μg/只进行免疫，阴性对照组以相同剂量 PBS进行免疫。免疫3次，每次间隔2周。在免疫后的第7、14、21、28、35 和42天随机取3只小鼠断尾取血，全血37℃静置1h后，在4℃放置过夜，次日 4℃，2000g离心20min，将分层的血清吸出并分装冻存于-20℃备用。
(2)采用间接ELISA法检测血清特异性抗体IgG。
①包被：将浓度为10μg/ml的融合蛋白S1-TAT以每孔100μl包被酶标板，4℃包被过夜，用PBST洗涤3次，每次5min，洗完后在纸上将板子拍干(注意：每份样品要做3个平行，最后测量时取平均值)。
②封闭：每孔加入200μl 5％脱脂奶粉，37℃封闭2h后，PBST洗涤3次。
③一抗孵育：每孔加入100μl按适当倍数稀释好的待检血清(包括制备的待测阳性血清、阴性血清)，37℃孵育2h后，PBST洗涤5次。
④二抗孵育：每孔加入100μl按1:5000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG抗体， 37℃孵育2h后，PBST洗涤5次
⑤显色：每孔加入100μl OPD底物溶液，避光显色5min。
⑥终止反应：每孔加入50μL 2M H2SO4终止液，20min内测定OD值。
⑦OD值的测定：使用ELISA酶标仪于波长492nm下测定OD492值。
(3)实验结果及分析。
免疫小鼠血清特异性IgG抗体检测结果显示，在免疫后第7天，腹腔注射组的IgG抗体OD492值为0.227，分别比灌胃组和阴性对照组高0.07和0.076，可见腹腔注射组在免疫后第7天就产生了特异性IgG抗体，与阴性对照组之间差异极显著(p<0.01)，而灌胃组与阴性对照组之间差异不显著(p>0.05)。在免疫后第14天，腹腔注射组的抗体OD492值为0.312，比阴性对照组高0.16，与阴性对照组之间依然差异极显著(p<0.01)，而灌胃组在第14天的抗体OD492值为 0.167，比阴性对照组高0.015，与阴性对照组之间也差异极显著(p<0.01)。在免疫后第21天和42天期间，腹腔注射组和灌胃组与阴性对照组之间的差异进一步扩大，均达到极显著水平(p<0.01)，并在第35天时，腹腔注射组和灌胃组的抗体OD492达到最大值。在整个实验过程中，腹腔注射组的血清特异性抗体IgG 水平始终高于灌胃组，而阴性对照组则一直维持在较低水平。具体见附图8。
【实施例8】间接ELISA检测免疫小鼠粪便中特异性IgA抗体
(1)粪便中抗体的制备。
采集免疫后第7、14、21、28、35和42天腹腔注射组、灌胃组和阴性对照组小鼠的粪便，每0.1g粪便用200μl 0.01mol/L的PBS充分混匀，4℃作用1.5h，离心收集上层液体，-20℃保存待检。
(2)采用间接ELISA法检测血清特异性抗体IgA。
根据实施例7中血清特异性抗体检测方法，将融合蛋白S1-TAT经过包被、封闭后，在酶标板中加入按适当倍数稀释好的待检血清(包括制备的待测阳性血清、阴性血清)，在37℃孵育2h后洗涤5次，与按1:5000稀释的HRP标记羊抗鼠IgA抗体在37℃孵育2h，后经过OPD显色和终止反应，使用ELISA酶标仪于波长492nm下测定OD492值。
(3)实验结果及分析。
免疫小鼠血清特异性IgA抗体检测结果显示，在免疫后第7天，灌胃组的 IgA抗体OD492值为0.156，腹腔注射组的IgA抗体OD492值为0.145，分别比阴性对照组高0.019和0.008，灌胃组与腹腔注射组分别与阴性对照组之间的差异达到了极显著水平(p<0.01)和显著水平(p<0.05)。由于IgA的半衰期很短，仅有6天，灌胃组的血清特异性IgA抗体水平有较大波动，在第7天和21天期间，IgA抗体OD492值持续上升，第28天略有下降，在第35天时，IgA抗体OD492值有较大提高，达到最大值，与阴性对照组之间的差异均达到了极显著水平(p<0.01)。腹腔注射组的IgA抗体OD492值始终维持在较低水平，在免疫后第 35天，IgA抗体OD492最大值为0.187，但与阴性对照组之间也均达到差异显著水平(p<0.05)。具体见附图9。
【实施例9】ELISA检测融合蛋白S1-TAT的穿肠功能
(1)实验样品准备：
将新购买的6-8周龄雄性昆明小鼠于实验室喂养几周，待小鼠状态稳定后处死，取5cm小鼠肠管用于融合蛋白S1-TAT穿肠功能实验。用PBS缓冲液冲洗小鼠肠管，将肠管一端扎紧，用移液枪吸取浓度为100μg/ml的融合蛋白S1-TAT 至扎好的小鼠肠管，扎好肠管的另一端，投入到装有10ml PBS缓冲液的试管中，并使PBS缓冲液完全浸没小鼠肠管，同时以等量的PBS作为对照组，并保证每根肠管均浸没于独立的试管中，30℃下静置，分别于0、1、2、3、4和5h吸取 100μl试管中的PBS溶液。
(2)穿肠功能检测
①将待检样品以100μl/孔加入到酶标板中，重复3个平行，37℃包被3-4h。
②倒掉酶标板中的待测样品，按250μl/孔加入PBST溶液，在振荡器上洗涤5min，在纸上扣干，以此重复3次。再按200μl/孔加入5％脱脂奶粉，4℃封闭过夜。
③倒掉封闭液，按上述步骤重复洗涤3次。再按100μl/孔加入1:1000稀释的GST标签抗体，37℃孵育2h。
④一抗孵育结束后，用PBST洗涤3次，按100μl/孔加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，37℃孵育2h。
⑤二抗孵育结束后，用PSBT重复洗涤3次，再按100μl/孔加入OPD显色液，室温下避光显色5min。
⑥取出后按50μl/孔加入终止反应液，使用酶标仪于492nm处的OD492值 (3)实验结果及分析
融合蛋白S1-TAT穿肠实验结果显示，在0h时，试管中融合蛋白S1-TAT的 OD492值为0.167，比PBS对照组高0.015，1h过后，试管中融合蛋白S1-TAT的 OD492值为0.231，相比于0h有了较大幅度的提高，并在4h期间保持持续上升，在第4h时，试管中融合蛋白S1-TAT的OD492值达到最大值，5h略微有点下降。而PBS对照组的OD492值在0-5h之间变化不大，处于较低水平。可见TAT蛋白转导肽能够携带与其融合表达的S1蛋白穿过小鼠肠壁细胞进入到试管中。具体见附图10。
【实施例10】小鼠安全性试验
体重作为生理指标之一，在一定程度上可以反映出小鼠的身体素质。在42d 内，分别在0、14、28、42d称量腹腔注射组、灌胃组和PBS对照组小鼠的平均体重，观察融合蛋白S1-TAT对小鼠生理指标的影响。
从图11可以看出，3组小鼠的体重没有显著性差异(P>0.05)，说明融合蛋白S1-TAT不影响小鼠的生长指标，可以初步评价为比较安全可靠的免疫抗原。具体见附图11。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 一种猪传染性胃肠炎病毒融合蛋白及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1239
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggccacag tgttttcatt gaacacaacg ggtggtgtca ctcttgaaat ttcatgttat 60
acagtgagtg actcgagctt tttcagttac ggtgaaattc cgttcggcgt aactgatgga 120
ccacggtact gttacgtaca ctataatggc acagctctta agtatttagg aacattacca 180
cctagtgtca aggagattgc tattagtaag tggggccatt tttatattaa tggttacaat 240
ttctttagca catttcctat tgattgtata tcttttaatt tgaccactgg tgatagtgac 300
gttttctgga caatagctta cacatcgtac actgaagcat tagtacaagt tgaaaacaca 360
gctattacaa aggtgacgta ttgtaatagt cacgttaata acattaaatg ctctcaaatt 420
actgctaatt tgaataatgg attttatcct gtttcttcaa gtgaagttgg tcttgtcaat 480
aagagtgttg tgttactacc tagcttttac acacatacca ttgttaacat aactattggt 540
cttggtatga agcgtagtgg ttatggtcaa cccatagcct caacattaag taacatcaca 600
ctaccaatgc aggatcacaa caccgatgtg tactgtattc gttctgacca attttcagtt 660
tatgttcatt ctacttgcaa aagtgcttta tgggacaata tttttaagcg aaactgcacg 720
gacgttttag attccacagc tgttataaaa actggtactt gtcctttctc atttgataaa 780
ttgaacaatt acttaacttt taacaagttc tgtttgtcgt tgagtcctgt tggtgctaat 840
tgtaagtttg atgtagctgc ccgtacaaga accaatgagc aggttgttag aagtttgtat 900
gtaatatatg aagaaggaga caacatagtg ggtgtaccgt ctgataatag tggtgtgcac 960
gatttgtcag tgctacacct agattcctgc acagattaca atatatatgg tagaactggt 1020
gttggtatta ttagacaaac taacaggacg ctacttagtg gcttatatta cacatcacta 1080
tcaggtgatt tgttaggttt taaaaatgtt agtgatggtg tcatctactc tgtaacgcca 1140
tgtgatgtaa gcgcacaagc agctgttatt gatggtacca tagttggggc tatcacttcc 1200
atttatggcc gtaagaaacg tcgtcagcgt cgtcgttag 1239
<210> 2
<211> 412
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Thr Val Phe Ser Leu Asn Thr Thr Gly Gly Val Thr Leu Glu
1 5 10 15
Ile Ser Cys Tyr Thr Val Ser Asp Ser Ser Phe Phe Ser Tyr Gly Glu
20 25 30
Ile Pro Phe Gly Val Thr Asp Gly Pro Arg Tyr Cys Tyr Val His Tyr
35 40 45
Asn Gly Thr Ala Leu Lys Tyr Leu Gly Thr Leu Pro Pro Ser Val Lys
50 55 60
Glu Ile Ala Ile Ser Lys Trp Gly His Phe Tyr Ile Asn Gly Tyr Asn
65 70 75 80
Phe Phe Ser Thr Phe Pro Ile Asp Cys Ile Ser Phe Asn Leu Thr Thr
85 90 95
Gly Asp Ser Asp Val Phe Trp Thr Ile Ala Tyr Thr Ser Tyr Thr Glu
100 105 110
Ala Leu Val Gln Val Glu Asn Thr Ala Ile Thr Lys Val Thr Tyr Cys
115 120 125
Asn Ser His Val Asn Asn Ile Lys Cys Ser Gln Ile Thr Ala Asn Leu
130 135 140
Asn Asn Gly Phe Tyr Pro Val Ser Ser Ser Glu Val Gly Leu Val Asn
145 150 155 160
Lys Ser Val Val Leu Leu Pro Ser Phe Tyr Thr His Thr Ile Val Asn
165 170 175
Ile Thr Ile Gly Leu Gly Met Lys Arg Ser Gly Tyr Gly Gln Pro Ile
180 185 190
Ala Ser Thr Leu Ser Asn Ile Thr Leu Pro Met Gln Asp His Asn Thr
195 200 205
Asp Val Tyr Cys Ile Arg Ser Asp Gln Phe Ser Val Tyr Val His Ser
210 215 220
Thr Cys Lys Ser Ala Leu Trp Asp Asn Ile Phe Lys Arg Asn Cys Thr
225 230 235 240
Asp Val Leu Asp Ser Thr Ala Val Ile Lys Thr Gly Thr Cys Pro Phe
245 250 255
Ser Phe Asp Lys Leu Asn Asn Tyr Leu Thr Phe Asn Lys Phe Cys Leu
260 265 270
Ser Leu Ser Pro Val Gly Ala Asn Cys Lys Phe Asp Val Ala Ala Arg
275 280 285
Thr Arg Thr Asn Glu Gln Val Val Arg Ser Leu Tyr Val Ile Tyr Glu
290 295 300
Glu Gly Asp Asn Ile Val Gly Val Pro Ser Asp Asn Ser Gly Val His
305 310 315 320
Asp Leu Ser Val Leu His Leu Asp Ser Cys Thr Asp Tyr Asn Ile Tyr
325 330 335
Gly Arg Thr Gly Val Gly Ile Ile Arg Gln Thr Asn Arg Thr Leu Leu
340 345 350
Ser Gly Leu Tyr Tyr Thr Ser Leu Ser Gly Asp Leu Leu Gly Phe Lys
355 360 365
Asn Val Ser Asp Gly Val Ile Tyr Ser Val Thr Pro Cys Asp Val Ser
370 375 380
Ala Gln Ala Ala Val Ile Asp Gly Thr Ile Val Gly Ala Ile Thr Ser
385 390 395 400
Ile Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
405 410

Claims (5)

1.一种融合蛋白S1-TAT，其特征在于：其序列为SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述的融合蛋白S1-TAT对应的的核苷酸序列，其特征在于：编码序列为SEQ ID NO.1所示。
3.一种含有融合蛋白S1-TAT基因的大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于：其分类命名：大肠杆菌BL21(DE3) (pGEX-6p-1-S1-TAT)，保藏编号：CCTCC NO: M 2017785。
4.权利要求1所述的融合蛋白S1-TAT的制备方法，包括步骤如下：
1）、获得含有TGEV S1基因及TAT转导肽基因的重组表达质粒pGEX-6p-1-S1-TAT：
人工合成重组基因S1-TAT，其序列为SEQ ID NO.1所示，连接在表达载体pGEX-6p-1上，即构建了重组表达质粒pGEX-6p-1-S1-TAT；
2）、大肠杆菌工程菌的制备：
将重组表达质粒pGEX-6p-1-S1-TAT转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到的阳性转化子经菌液PCR和基因测序鉴定为阳性的菌落即为能表达融合蛋白S1-TAT的重组基因工程菌E.coli BL21(DE3) (pGEX-6p-1-S1-TAT)；
3）、融合蛋白S1-TAT的制备：
将重组基因工程菌株E.coli BL21(DE3) (pGEX-6p-1-S1-TAT)的单菌落接种于含100μg/ml Amp的20ml LB液体培养基中，37℃过夜培养10-12h；次日，转接到新鲜的含100μg/mlAmp的100ml LB液体培养基中，37℃培养至OD值约为0.6-0.8时，加终浓度为0.5mM的 IPTG诱导剂，于30℃诱导表达4h；诱导结束后，将发酵好的菌液在低温高速离心机中8000rpm离心5min，弃上清并收集菌体，后用适量PBS缓冲液重悬菌体，400W超声破碎20min，在低温高速离心机中12000rpm离心10min，收集上清，按GST-Resin纯化方法纯化融合蛋白S1-TAT，其序列为SEQ ID NO.2 所示。
5.权利要求1所述的融合蛋白S1-TAT在制备预防猪传染性胃肠炎病毒的疫苗中的应用。
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