CN108690126A

CN108690126A - 一种牦牛源轮状病毒重组vp6蛋白抗原与应用

Info

Publication number: CN108690126A
Application number: CN201810582665.6A
Authority: CN
Inventors: 汤承; 岳华; 罗雪; 王远微
Original assignee: Southwest Minzu University
Current assignee: Southwest Minzu University
Priority date: 2018-06-07
Filing date: 2018-06-07
Publication date: 2018-10-23

Abstract

本发明公开了一种牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白抗原与应用。本发明的牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；重组VP6蛋白具有良好的抗原性和免疫原性，能够在原核系统中高效表达，本发明的间接ELISA检测方法优于商品化检测试剂盒，为我国BRV抗体检测和血清流行病学调查提供了一种快速、简便、实惠的诊断方法，它解决了目前对犊牛轮状病毒腹泻的诊断方法存在着费时、费力、生物试剂和仪器设备昂贵的弊端。同时本发明的亚单位疫苗在小鼠中具有良好的保护效果，可用于预防由BRV引起的腹泻。

Description

一种牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白抗原与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白抗原与应用。

背景技术

牛轮状病毒(Bovine Rotavirus，BRV)，又名牛流行性腹泻，属呼肠孤病毒科，轮状病毒属，主要引起犊牛腹泻。国内于1974年首次发现该病，其临床特征主要是喷射状水泻。牛轮状病毒主要通过粪-口途径传播，一般10～100个病毒粒子即可引发感染，因此，快速、准确的诊断对确定病原体、有效的预防和控制疾病传播具有重要的意义。

牛轮状病毒常用检测方法主要有病毒分离、电镜观察、聚丙烯酰氨凝胶电泳、酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术、环介导等温扩增技术、分子探针技术、基因芯片技术等方法，其中以PCR技术和ELISA使用最为广泛。PCR技术和ELISA均有操作简单、特异性好、灵敏度高，无需昂贵仪器等优点，但在用于大量样本的检测时，ELISA更加方便，耗时更短。

轮状病毒为无囊膜的双链RNA病毒，基因组由11个基因节段构成，分别编码6种结构蛋白(Viral Protein,VP；VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7)和6种非结构蛋白(Non-structural Protein,NSP；NSP1～NSP6)。病毒的毒力和基因型由外衣壳蛋白VP4和VP7决定。VP6为内衣壳蛋白，含有病毒组和亚组特异性决定簇，其基因序列是11个基因节段中最保守的，全长约1356bp，编码397个氨基酸，其氨基酸序列在不同血清型或基因型间同源性>70％，因此VP6成为多种检测方法的首选靶基因。

VP4和VP7蛋白被认为是BRV的主要中和抗原，关于VP6能否刺激机体产生中和抗体曾有过争议。但是有不少研究发现，VP4和VP7蛋白并不是唯一的抗原，VP6也具有很强的抗原性和免疫原性。Kohli等人(Kohli E,Pothier P,Tosser G,et al.Inhibition of invitro reconstitution of rotavirus transcriptionally active particles by anti-VP6monoclonal antibodies[J].Archives of Virology,1994,135(1-2):193.)显示抗VP6的单克隆抗体能够抑制细胞培养物中RV的转录和复制。Herrman等(Herrmann J E,Chen SC,Fynan E F,et al.Protection against rotavirus infections by DNA vaccination.[J].Journal of Infectious Diseases,1996,174Suppl 1(Supplement 1):S93.)将RV的VP6 DNA 疫苗免疫小鼠，能产生病毒特异性血清抗体和CTL反应，用同源小鼠RV攻击小鼠时，RV排毒量明显减少。Choi等(Choi A H,Basu M,Mcneal M M,et al.Antibody-independent protection against rotavirus infection of mice stimulated byintranasal immunization with chimeric VP4or VP6protein.[J].Journal ofVirology,1999,73(9):7574.Choi A H,Mcneal M M,Basu M,et al.Intranasal or oralimmunization of inbred and outbred mice with murine or human rotavirusVP6proteins protects against viral shedding after challenge with murinerotaviruses.[J].Vaccine,2002,20(27):3310-3321.)将大肠杆菌表达的鼠RVVP6蛋白和E.coli的LT(R192G)，通过滴鼻或口服免疫成年BALB/c小鼠，然后用EDIM株攻击，发现几乎所有的免疫小鼠都能免受鼠EDIM株的攻击，排毒水平降低＞99％，而滴鼻免疫产生的免疫保护＞1年。

轮状病毒目前尚无特效药物，提高环境卫生、提供清洁的水源不能降低发病率和阻止病毒的传播。因此，有必要选择一种用重组蛋白作为抗原的疫苗，以完全避免毒力复壮和散毒的风险。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白抗原与应用，本发明的重组VP6蛋白可作为诊断BRV的抗原和BRV亚单位疫苗抗原。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白抗原，牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白抗原由重组载体质粒pET-28H-VP6质粒转化Rosetta(DE3)菌株中表达；其中重组载体质粒pET-28H-VP6含有牦牛源轮状病毒VP6基因。

可选地，所述抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

可选地，所述的牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白通过以下方法制备得到：提取病毒核酸后进行RT-PCR，拼接扩增序列，得到序列表中SEQ ID NO.1的DNA序列；对该基因序列进行优化，5’增加酶切位点BamH I，3’增加酶切位点Xho I，His标签在N端，然后合成整个序列；将合成的全序列与pET-28H载体分别酶切后连接转化TOP10感受态，获得pET-28H-VP6质粒；将所得到的重组原核表达载体pET-28H-VP6转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞，用终浓度为0.8mM的IPTG于37℃诱导重组VP6蛋白的表达16h，将所表达的蛋白回收并纯化即得。

可选地，PCR反应的拼接引物共2条引物：两端酶切位点分别是BamH1和Xho1，其序列分别如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.5所示。

本发明还公开了一种基于牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白的间接ELISA检测方法，包括以下步骤：0.1μg权利要求1-4中任一权利要求所述的牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白包被酶标板，37℃孵育2h；PBST洗涤后加入4％PEG6000封闭30min；PBST洗涤后加入1:1400稀释的血清，37℃孵育2h；PBST洗涤后加入1:2300稀释的酶标二抗，37℃孵育30min；PBST洗涤后加入显色液，37℃避光显色10min，加入终止液在450nm处读取OD₄₅₀。

可选地，所述牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白的包被浓度为1μg/ml。

可选地，血清稀释浓度为1:1400，酶标二抗稀释浓度为1:2300。

本发明还公开了一种利用上述的牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白生产的亚单位疫苗。

可选地，用上述的牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白作为抗原，粘膜佐剂作为佐剂，以滴鼻的方式免疫BALB/c成年雌鼠，刺激母鼠体内产生了高水平的血清IgG抗体；用牛轮状病毒同时对免疫母鼠所生乳鼠和未免疫母鼠所生乳鼠灌胃攻毒，证实母源抗体传递给乳鼠，免疫母鼠为乳鼠提供保护。

本发明还公开了一种上述的牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白生产的亚单位疫苗在预防轮状病毒引起的幼龄动物腹泻中的应用。

本发明利用大肠杆菌表达的牦牛源重组VP6蛋白作为抗原，建立了检测牛轮状病毒的间接ELISA检测方法，结果显示本方法特异性、稳定性、灵敏性好，与商品化试剂盒符合性良好。

在兽医实际工作中大量的血清样品监测及现地未知疾病的爆发，迫切需要一种反应快速、操作简捷、结果准确、可大量检测的诊断方法，ELISA很符合临床检测的要求。间接ELISA方法可以很方便的进行大量样品的检测，并且整个实验操作过程所用时间短于琼扩实验、中和试验等，相对更为快速。

本发明的轮状病毒亚单位疫苗滴鼻免疫可诱导机体产生可检测的血清抗体，能够用于预防轮状病毒引起的幼龄动物腹泻。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)成本低：原核表达系统比真核系统更廉价。

2)易于推广：原核表达使用的试剂材料容易获得，且无需特殊仪器，在所有实验室均可操作，同时生产周期短，易于形成产业化的规模，适合推广使用。

3)更省时：本发明的表达菌株只需培养16h，培养方式简单，培养周期短，可在几天时间内合成大量重组蛋白。

4)更高效：原核表达系统可以短期内获得大量优良的重组蛋白。抗原蛋白通过原核表达系统表达成包涵体，包涵体在变性条件下纯化，然后复性再折叠，再进过自我组装等过程而有效制备，弥补了原核表达系统缺少像真核系统重组蛋白表达后的修饰能力、不能产生正确的二硫键的缺点，同时缩短了重组蛋白的表达时间、提高了重组蛋白的生产效率。

5)更方便：在构建表达载体时，目的基因通常由临床样本或实验室培养物中直接扩增后克隆转化，扩增受样本处理方式和核酸浓度影响大同时需要一对可完全扩增目的基因的引物。本发明在已知基因序列的情况下，利用生物软件对基因序列进行了大肠杆菌偏爱密码子优化，将改造后的序列全序列合成，无需单独设计完全扩增目的基因的引物，避免了直接从临床样本或实验室培养物中扩增的对实验进程的影响，同时也便于对序列进行表达系统相应偏爱密码子优化和改造，有利于提高重组蛋白在表达系统中的产量和表达效率。

6)更安全：本发明是非复制型的，在机体内不增殖，不存在散毒危险。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1a是本发明重组质粒测序核苷酸(1-730)比对结果图；

图1b是本发明重组质粒测序核苷酸(731-1354)比对结果图；

图2是本发明重组质粒测序后的氨基酸序列比对结果图；

图3是本发明纯化的蛋白电泳图；

图4是本发明重组蛋白纯化后SDS-PAGE检测图；

图5是本发明Western Blot免疫印迹反应图；

图6是本发明间接ELISA检测方法待检血清最适工作浓度和酶标二抗最佳稀释度筛选结果；

图7是本发明间接ELISA检测方法封闭时间、血清温育时间、酶标抗体结合时间的筛选结果；

图8是本发明间接ELISA检测方法灵敏度试验结果图；

图9是本发明用ELISA检测免疫后1～4周成年小鼠产生的血清抗体情况；

图10是本发明乳鼠灌胃攻毒后出现的腹泻情况，其中，a为重度腹泻，b为普通腹泻，c为不腹泻；

图11是本发明乳鼠攻毒后实验组与对照组在攻毒后一周的腹泻情况；

图12是本发明乳鼠攻毒后对照组在攻毒后一周的腹泻情况。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

牦牛轮状病毒牦牛源RVMD8株和VP6扩增引物在文章《牦牛轮状病毒RT-PCR检测方法的建立和应用及病毒的分离培养》(周芳，2016)中公开。

实施例1牦牛源轮状病毒VP6蛋白抗原的制备

1、VP6基因的扩增：取适量牦牛源RVMD8株病毒液，按照QIAamp Viral RNA MiniKit(50)试剂盒提取总RNA，并按照SuperScirptTMIII First-Stand Synthesis Systemfor RT-PCR反转录试剂盒说明书合成cDNA，用VP6扩增引物分别扩出大小约407bp的基因片段(位于931bp～1338bp之间)和大小约937bp的基因片段(位于21bp～958bp之间)的两段序列。利用Contig软件将两段基因片段拼接到一起，获得一个完整的VP6基因的ORF序列，大小为1191bp，其序列如SEQ ID NO.1所示，编码397个的氨基酸，其氨基酸序列由SEQ ID NO.3所示。

2、将接拼的VP6基因序列进行优化，在不改变任何氨基酸情况下，使其密码子偏爱性接近大肠杆菌，优化后的VP6编码基因如SEQ ID No：2所示，在其5’增加酶切位点BamH I，3’增加酶切位点Xho I，N端添加His标签，然后将序列送至引物合成公司合成，BamH1和Xho1位点序列分别如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.5所示。

3、将合成的序列作为模板BamH1和Xho1双酶切后，与同样经过BamH1和Xho1双酶切的pET-28H载体连接转化TOP10感受态。挑单克隆菌落，菌落PCR鉴定阳性克隆送测序。基因测序比对结果如图1，氨基酸比对结果如图2，证明成功获得了pET-28H-VP6表达质粒。

4、pET-28H-VP6表达质粒转化Rosetta(DE3)，涂布LB固体培养基，于恒温培养箱中37℃培养16h。次日，挑单克隆菌落接入4mL LB液体培养基(含卡那霉素50ug/ml，氯霉素50ug/ml)中，37℃振摇培养16h。

5、次日，菌种以1：100接入200mL LB液体培养基(含卡那霉素50ug/ml，氯霉素50ug/ml)，37℃振摇培养至OD约为0.4～0.6时，加入终浓度为0.8mM的IPTG，于37℃诱导表达16h，次日，离心收集菌体，沉淀用1×PBS重悬，取1ml重悬菌液超声破碎，收集上清和沉淀。SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况，结果显示VP6融合蛋白以包涵体形式表达(图3)。

6、剩余菌体重悬液超声破碎，经洗涤buffer去杂质，以8M尿素溶解包涵体，梯度尿素透析初步纯化和复性，经商业化蛋白酶酶切后，过高亲和力Ni柱，穿柱的是VP6目的蛋白，结合并洗脱的是标签蛋白。对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE检测(图4)，以BRV抗体阳性牛血清为一抗，HRP标记的山羊抗牛IgG为二抗进行Western Blot免疫印迹反应(图5)，结果显示目的蛋白约45kD，能被BRV阳性血清所识别，证明重组VP6蛋白具有生物活性和良好的免疫原性。

实施例2间接ELISA检测方法的建立

1ELISA操作流程将纯化的重组VP6蛋白用50mM pH 7.6的磷酸盐缓冲液稀释后包被于酶标板中，100μL/孔，4℃过夜。次日弃去包被液，用PBST洗涤3次，200μL/孔。加入2％牛血清白蛋白(BSA)作为封闭液，100μL/孔，37℃1h。弃去包被液，洗涤3次后将阴性和阳性血清用1％牛血清白蛋白(BSA)分别按比例稀释后加入酶标板中，100μL/孔，37℃1h。弃去板中的液体，洗涤5次后加入用1％牛血清白蛋白(BSA)按1:2500稀释的HRP标记的羊抗牛IgG，100μL/孔，37℃1h。弃去板中的液体，洗涤5次后加入TMB显色液，100μL/孔，37℃避光显色15min，然后加入2mol/L H₂SO₄终止反应，100μL/孔。在酶标仪上读取D_450nm值，阳性对照的D_450nm读值记为P，阴性对照的D_450nm读值记为N。

2正交法确定最适重组蛋白包被浓度纯化的重组蛋白稀释浓度为0.5(A1)，1(A2)，2(A3)μg/mL，阴性和阳性血清分别作1:400(B1)，1:800(B2)，1:1600(B3)倍稀释，羊抗牛IgGHRP酶标抗体按1:500(C1)，1:1500(C2)，1:2500(C3)稀释，其余按ELISA操作流程操作。结果见表1，以P/N最大作为优选依据，确定最适重组蛋白包被浓度为1μg/mL。

表1抗原包被浓度筛选结果

3方阵法确定待检血清最适工作浓度和酶标抗体最佳稀释度以最佳抗原包被量包被酶标板，将血清按1:800，1:1000，1:1200，1:1400，1:1600稀释，酶标二抗按1:1500，1:1700，1:1900，1:2100，1:2300，1:2500稀释，其他按照优化后条件进行操作。结果见图，以P/N最大作为优选依据，确定血清稀释浓度为1:1400，HRP标记的酶标二抗稀释浓度为1:2300(见图6)。

4包被液、封闭液、血清稀释液的优化用50mM pH 9.6碳酸盐缓冲液、50mM pH 7.6的磷酸盐缓冲液、50mM pH 7.6Tris-HCl缓冲液和50mM pH 13氢氧化钠溶液作为包被液；2％牛血清白蛋白(BSA)、1％牛血清白蛋白(BSA)5％脱脂乳、4％PEG6000和PBS作为封闭液；1％BSA，4％PEG6000，PBS，PBST作为血清稀释液，其他按照优化后条件分别进行操作。结果见表2、表3、表4，以P/N最大作为优选依据，50mM pH 7.6T ris-HCl缓冲液作为包被液，4％PEG6000作为封闭液，1％BSA为血清稀释液。

表2包被液筛选结果

表3封闭液筛选结果

表4血清稀释液筛选结果

5、包被条件的选择包被条件分别按37℃2h后4℃过夜，37℃1h后4℃过夜，37℃2h，37℃1h，4℃过夜，其他按照优化后条件进行操作。结果见表5，以P/N最大作为优选依据，包被条件为37℃2h。

表5包被时间筛选结果

6封闭时间、血清温育时间、酶标抗体结合时间的选择封闭时间设为30min，60min，90min和120min；血清温育时间分别设为30min，60min，90min和120min；酶标抗体作用时间分别设为30min，60min，90min和120min，其他按照优化后条件分别进行操作。结果见图7，以P/N最大作为优选依据，封闭时间为30min，血清温育时间为2h，酶标抗体结合时间为30min。

7底物作用时间的选择底物作用时间分别设为15min，20min，25min，30min，其他按照优化后条件进行操作。结果见表，结果见表6，以P/N最大作为优选依据，底物作用时间为10min。

表6底物作用时间筛选结果

优化后的ELISA检测程序如下：纯化的重组蛋白用50mM pH 7.6Tris-HCl缓冲液稀释为1μg/mL后包被于酶标板中，100μL/孔，37℃2h。弃去包被液，用PBST洗涤3次，200μL/孔。加入4％PEG6000，37℃封闭30min，100μL/孔,弃去包被液，洗涤3次后将阴性和阳性血清用1％BSA分别按1:1400比例稀释后加入酶标板中，100μL/孔，37℃2h。弃去板中的液体，洗涤5次后加入用1％BSA按1:2300稀释的HRP标记的羊抗牛IgG，100μL/孔,37℃30min。弃去板中的液体，洗涤5次后加入TMB显色液，100μL/孔，37℃10min，然后加入2mol/L H₂SO₄终止反应，100μL/孔。

8间接ELISA阴、阳性临界值的确定随机选取无轮状病毒感染的牦牛或牛血清48份，用已建立的间接ELISA方法检测，求得这些样品的D_450nm的平均值(X)和标准差(s)，如果样品D_450nm>X+3S，即判定为阳性；

D_450nm<X+2S,即判定为阴性，中间为可疑。计算出OD_450nm值的平均值(X)为0.161，标准差(S)为0.044，则X+2S＝0.248，X+3S＝0.292因此，在酶标仪上测定的OD_450nm＞0.292者判为阳性，OD_450nm＜0.248者判为阴性。处于临界值中间的为可疑，建议重新检测。

9特异性试验将包被好的酶标板分别加入牛冠状病毒(BCoV)、牛病毒性腹泻粘膜病毒(BVDV)、牛肠道病毒(BEV)、牛衣原体(CVM)、牛结核分枝杆菌(M.bovis)的阳性血清为待检样品，同时分别设牦牛轮状病毒阳性和阴性血清对照，每种样品做2个重复，依据OD_450nm＜0.248者为无交叉反应。本次试验中待检样品的OD值均小于为0.248(表7)，说明重组VP6蛋白用作包被抗原建立的间接ELISA抗体检测方法具有良好的特异性，与牛冠状病毒、牛病毒性腹泻粘膜病毒、牛肠道病毒、牛衣原体、牛结核分枝杆菌无交叉反应。

表7特异性实验结果

10重复性试验

10.1批内重复性试验用同一批的ELISA板，按优化后的条件对包括阴阳性血清在内的6份样品进行检测，重复3孔，根据变异系数(CV)判定批内重复性。由表8可以看出同一血清各孔间的变异系数值在0.580％～4.350％之间，小于10％，表明该方法的批内重复性良好。

10.2批间重复性试验在其他条件相同的情况下，用3次不同时间包被的反应板，对包括阴阳性血清在内的6份样品进行检测，根据变异系数(CV)判定批间重复性。由表9可以看出，批间重复试验的变异系数在2.62％～8.86％之间，小于10％，表明不同批次包被的酶标板对同一份血清的检测结果具有较好的重复性，所建的ELISA检测方法的稳定性良好。

表8批内重复试验

表9批间重复性试验

11灵敏性试验

对包括阴阳性血清在内的6份样品从最优稀释比例开始做倍比稀释后进行检测，检测结果为阴性的阳性血清的稀释倍数越大，本方法的灵敏度越好。检测结果如图8，当阳性血清1:11200稀释时，5份阳性血清检测结果仍为阳性，表明所建立的方法灵敏度高，具有较好的敏感性。

12符合性试验

利用所建的方法与商品化的试剂盒同时检测63份牛轮状病毒阳性血清和11份牛轮状病毒阴性血清，检测结果显示本试验所建方法敏感性优于比商品化试剂盒，本研究阳性符合率达100％，阴性符合率100％；商品化试剂盒阳性符合率达85.71％，阴性符合率为181.81％；两种方法符合率为87％(见表10)。

表10重组VP6蛋白ELISA方法与商品化试剂盒的比较

实施例3轮状病毒重组VP6蛋白免疫小鼠可使其产生可检测的血清检测抗体

6～8week SPF级雌性BALB/c小鼠25只，随机分为2组，其中免疫组15只，空白对照组10只。免疫前眼眶采集所有小鼠的血液，用ELISA方法进行血清IgG检测。疫苗为重组VP6蛋白配合粘膜佐剂免疫，采取滴鼻免疫的方式，每个免疫点VP6蛋白免疫剂量为20μg/只，一免后间隔3周进行第二次免疫，共免疫两次。免疫时乙醚麻醉小鼠后每个鼻孔用微量移液枪滴入25μl疫苗，对照组免疫等体积的无菌PBS。在初免后每周各进行一次眼眶采血，共采集4周，并用间接ELISA检测血清特异性抗体。

间接ELISA检测程序及条件如下：100μl(1μg/ml)本发明重组VP6蛋白包被酶标板，37℃2h。PBST洗涤后加入2％BSA封闭30min。PBST洗涤后加入1:200稀释的血清，37℃1h。PBST洗涤后加入1:4000稀释的羊抗鼠酶标二抗，37℃30min。PBST洗涤后加入显色液，37℃避光显色15min，加入终止液在450nm处读取OD₄₅₀。

ELISA检测结果(图9)显示免疫后小鼠产生了可检测的血清抗体，表明重组VP6蛋白具有良好的生物活性和体内免疫原性。

实施例4牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白免疫母鼠可使其子代乳鼠获得保护

分别将5只免疫后的母鼠和空白对照组的母鼠在免疫程序结束后(共免疫2次)与公鼠合笼进行配对，之后将怀孕母鼠继续喂养。免疫后的母鼠所生的乳鼠作为免疫组，空白对照组的母鼠产的仔作为对照组，每组8只。在乳鼠出生4d时，将乳鼠与母鼠分开，饥饿处理2小时后进行灌胃攻毒。灌胃完成后用消毒棉球擦拭幼鼠嘴部，并将其放回。病毒液注射体积控制为200μl。攻毒后，每天定时观察乳鼠3次，3次中有一次出现腹泻即判断为腹泻，连续7d观察并记录乳鼠的腹泻情况。

腹泻程度根据其肛门颜色和应激便形态来判断：肛门充血红肿，粪便不成型，呈黄色水样状，则判断为重度腹泻(图10A)；肛门红肿，粪便水分重，稀而软，则判断为普通腹泻(图10B)；应激便呈正常黄色条状，肛周无异常，则判断为不腹泻(图10C)。免疫组在7d内均未见腹泻，但对照组均出现腹泻(图11、12)，在第3天腹泻情况最为严重，第6天时停止腹泻。

实施例5

利用荧光定量PCR检测攻毒后粪便抗原脱落量(见表11)，免疫组粪便抗原脱落量明显低于对照组，表明对照组的感染情况更严重，RV增殖更多，并且观察期间免疫组全部未出现腹泻症等临床症状，而对照组腹泻率达100％，证明牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白免疫母鼠可使其子代乳鼠获得保护。

表11粪便抗原脱落量

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 西南民族大学

<120> 一种牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白抗原与应用

<130> 2018

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1191

<212> DNA

<213> 牛轮状病毒(Bovine Rotavirus，BRV)

<400> 1

atggatgtcc tgtactcctt gtcaaaaact cttaaagatg ctagagacaa aattgtcgaa 60

ggcacattat actccaatgt gagtgatcta attcaacaat ttaatcaaat gataattact 120

atgaatggaa atgagtttca aactggagga attggtaacc taccaattag aaattggaat 180

tttgattttg gattacttgg aacaacccta ctaaatttag acgctaacta cgtcgaaaca 240

gcccgcaata caattgatta ttttgtagat tttgtagaca atgtatgtat ggacgaaatg 300

gttagagaat cacaaagaaa tggaattgca ccacaatcgg attcactcag aaagttgtcg 360

ggtattaaat ttaaaagaat aaattttgac aattcatcag aatacataga gaactggaat 420

ttgcaaaaca gaagacaaag aacgggtttt acatttcata aaccaaacat tttcccttat 480

tcagcgtcat tcacactgaa tagatcacaa ccagctcatg ataatttgat gggtacgatg 540

tggctaaatg cgggatcaga aattcaggtc gctggattcg actattcatg tgcaattaat 600

gcaccagcta atacacaaca atttgagcat attgtacagc tccgaagagt gttgactaca 660

gctacaataa ctcttttacc agatgcagaa agatttagtt ttccaagagt gatcaattca 720

gctgacggag caactacatg gtacttcaac ccagtgattc ttaggccaaa taacgtagaa 780

gtagagttcc tactaaatgg gcagataata aatacttacc aagcaagatt tggaactatc 840

atagctagga attttgatac gatcagatta tcgtttcagt tgatgagacc accaaacatg 900

acaccagcgg tagcggcgtt atttccgaat gcgcagccat ttgaacatca cgctacagtg 960

gggcttacgc ttagaattga atctgcagtt tgtgaatctg tacttgctga cgcaagtgaa 1020

acaatgctag caaatgtgac atctgttaga caagaatacg cagtaccagt tgggccagtt 1080

tttccaccag gtatgaattg gactgatttg atcactaatt attcaccatc tagagaagat 1140

aatttacagc gtgtatttac agtggcttcc attagaagca tgcttgtcaa a 1191

<210> 2

<211> 1191

<212> DNA

<213> 牛轮状病毒(Bovine Rotavirus，BRV)

<400> 2

atggatgtgc tgtatagcct gagcaaaacc ctgaaagatg cgcgtgataa aattgtggaa 60

ggcaccctgt atagcaacgt gagcgatctg attcagcaat ttaaccagat gattatcacc 120

atgaacggca atgaatttca gaccggcggt attggcaacc tgccgattcg taattggaac 180

tttgatttcg gcctgttagg caccacgctg ttgaacctgg atgcgaacta tgtggaaacc 240

gcgcgtaaca ccattgatta ttttgtggat ttcgtggata acgtgtgcat ggatgaaatg 300

gtgcgtgaaa gccagcgtaa cggcattgcg ccgcagagcg atagtctgcg taaactgagc 360

ggcattaaat ttaagcgtat taactttgat aacagctctg aatatattga aaactggaat 420

ctgcagaacc gtcgccagcg taccggcttt accttccata aaccgaacat ttttccgtat 480

agcgcgagtt ttaccctgaa ccgtagccag ccggcgcatg ataacctgat gggcaccatg 540

tggctgaacg cgggcagcga aattcaggtg gcgggctttg attatagctg cgcgattaac 600

gcgccggcca acacccagca atttgaacat attgtgcagc tgcgtcgcgt gctgaccacg 660

gcgaccatta ccctgcttcc ggatgcggaa cgttttagct tcccgcgtgt gattaacagc 720

gcggatggcg caaccacgtg gtattttaac ccggtgattc tgcgtccgaa caatgtggaa 780

gtggagtttc tgttgaacgg ccagattatc aacacctatc aggcgcgttt tggcaccatt 840

atcgcgcgta actttgatac cattcgtctg agctttcagc tgatgcgtcc gccaaacatg 900

accccggcgg tggcggccct gtttccgaac gcgcagccgt ttgaacatca cgcgaccgtg 960

ggcctgaccc tgcgtattga aagcgcggtg tgcgaaagcg tgctggcgga tgccagcgaa 1020

accatgctgg cgaacgtgac cagcgtgcgt caggaatatg cggtgccggt tggccctgtg 1080

tttccgccag gcatgaactg gaccgatctg attaccaact atagcccgag tcgtgaagat 1140

aacctgcagc gtgtgtttac cgtggcgagc attcgtagca tgctggtgaa a 1191

<210> 3

<211> 397

<212> PRT

<213> 牛轮状病毒(Bovine Rotavirus，BRV)

<400> 3

Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp

1 5 10 15

Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln

20 25 30

Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr

35 40 45

Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Ile Arg Asn Trp Asn Phe Asp Phe Gly

50 55 60

Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr

65 70 75 80

Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys

85 90 95

Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln

100 105 110

Ser Asp Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn

115 120 125

Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg

130 135 140

Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr

145 150 155 160

Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Asp Asn Leu

165 170 175

Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly

180 185 190

Phe Asp Tyr Ser Cys Ala Ile Asn Ala Pro Ala Asn Thr Gln Gln Phe

195 200 205

Glu His Val Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr

210 215 220

Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser

225 230 235 240

Ala Asp Gly Ala Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro

245 250 255

Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr

260 265 270

Tyr Gln Ala Arg Phe Gly Thr Ile Ile Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile

275 280 285

Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Pro Asn Met Thr Pro Ala Val

290 295 300

Ala Ala Leu Phe Pro Asn Ala Gln Pro Phe Glu His His Ala Thr Val

305 310 315 320

Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Val Cys Glu Ser Val Leu Ala

325 330 335

Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu

340 345 350

Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr

355 360 365

Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg

370 375 380

Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Val Lys

385 390 395

<210> 4

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

ggatccccta gg 12

<210> 5

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

ctcgaggagc tc 12

Claims

1.一种牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白抗原，其特征在于，牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白抗原由重组载体质粒pET-28H-VP6质粒转化Rosetta(DE3)菌株中表达；其中重组载体质粒pET-28H-VP6含有牦牛源轮状病毒VP6基因。

2.根据权利要求1所述的牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白抗原，其特征在于，所述抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求1所述的牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白抗原，其特征在于，所述的牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白通过以下方法制备得到：提取病毒核酸后进行RT-PCR，拼接扩增序列，得到序列表中SEQ ID NO.1的DNA序列；对该基因序列进行优化，5’增加酶切位点BamHI，3’增加酶切位点Xho I，His标签在N端，然后合成整个序列；将合成的全序列与pET-28H载体分别酶切后连接转化TOP10感受态，获得pET-28H-VP6质粒；将所得到的重组原核表达载体pET-28H-VP6转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞，用终浓度为0.8mM的IPTG于37℃诱导重组VP6蛋白的表达16h，将所表达的蛋白回收并纯化即得。

4.根据权利要求3所述的牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白抗原，其特征在于，PCR反应的拼接引物共2条引物：两端酶切位点分别是BamH1和Xho1，其序列分别如SEQ ID NO.4-SEQ IDNO.5所示。

5.一种基于牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白的间接ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：0.1μg权利要求1-4中任一权利要求所述的牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白包被酶标板，37℃孵育2h；PBST洗涤后加入4％PEG6000封闭30min；PBST洗涤后加入1:1400稀释的血清，37℃孵育2h；PBST洗涤后加入1:2300稀释的酶标二抗，37℃孵育30min；PBST洗涤后加入显色液，37℃避光显色10min，加入终止液在450nm处读取OD₄₅₀。

6.根据权利要求5所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，所述牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白的包被浓度为1μg/ml。

7.根据权利要求5所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，血清稀释浓度为1:1400，酶标二抗稀释浓度为1:2300。

8.一种利用权利要求1所述的牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白生产的亚单位疫苗。

9.根据权利要求8所述的亚单位疫苗，其特征在于，用权利要求1所述的牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白作为抗原，粘膜佐剂作为佐剂，以滴鼻的方式免疫BALB/c成年雌鼠，刺激母鼠体内产生了高水平的血清IgG抗体；用牛轮状病毒同时对免疫母鼠所生乳鼠和未免疫母鼠所生乳鼠灌胃攻毒，证实母源抗体传递给乳鼠，免疫母鼠为乳鼠提供保护。

10.权利要求9所述的牦牛源轮状病毒重组VP6蛋白生产的亚单位疫苗在预防轮状病毒引起的幼龄动物腹泻中的应用。