CN107167609B - 区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接elisa检测方法 - Google Patents

区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接elisa检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检测方法，该方法以PRRSV NSP2基因组为模板，针对N1、N2基因序列设计特异性引物，构建重组表达质粒PET‑32a‑N1N2；在重组菌E.coliBL21(DE3)中成功诱导表达，利用His柱层析纯化，得到纯度较高的融合蛋白；利用纯化的PET‑32a‑N1N2蛋白，建立可用于区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检测方法。本发明的方法特异性强、稳定性高、快速便捷，为猪蓝耳病免疫抗体水平检测、疫情监控及流行病学调查提供了一种新的检测方法。

Description

区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检 测方法
技术领域
本发明属于动物病毒分子生物检测技术领域，具体涉及一种区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检测方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种急性传染病，临床主要特征为流产、产死胎、木乃伊胎、弱胎，呼吸困难等，在发病过程中会出现两耳皮肤发绀发紫，故又称为“蓝耳病”。本病于1996年在我国首次报道。
2006年我国南方部分省份出现养猪场暴发猪“高热病”疫情，发病猪以“高热”、“高发病率”和“高死亡率”为主要特征，给我国的养猪业造成了较大的经济损失。中国动物疫病预防控制中心田克恭等研究发现，猪“高热病”的主要致病病原为Nsp2缺失30个氨基酸的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异引起，后将其命名为“高致病性猪蓝耳病”(Highly PathogenicPorcine reproductive and respiratory syndrome，HP-PRRS)，其致病性大大增加，仔猪发病率可达100％、死亡率可达50％以上，母猪流产率可达30％以上，育肥猪也可发病死亡。依据猪繁殖与呼吸综合征病毒结构基因序列的不同可以将其分为欧洲型和美洲型两种基因型，而依据其致病力的不同，又可将其中的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒分为经典猪蓝耳病病毒和高致病性猪蓝耳病病毒两种亚型，高致病性猪蓝耳病病毒包括高致病性猪蓝耳病病毒江西株(JXA1-R株)、高致病性猪蓝耳病病毒湖南株(HuN4-F112株)、高致病性猪蓝耳病病毒天津株(TJ株)。目前我国使用的高致病性猪蓝耳病活疫苗有江西株(JXA1-R株)和湖南株(HuN4-F112株)、天津株(TJ株)。疫苗的使用需要配备适合的检测试剂盒才能进行免疫效果评估。本研究关于猪蓝耳病NSP2片段部分蛋白的制备，可运用于猪蓝耳病间接ELISA抗体的检测；建立了间接ELISA的方法来检测猪蓝耳病毒抗体，为猪蓝耳病免疫监测提供了技术平台。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、简便、特异性好的能够区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检测方法，为蓝耳病免疫监测和流行病学研究提供技术平台，对PRRS 的防控有着重要的意义。
本发明所采用的技术方案如下：
1、引物设计
本发明根据GenBank已发表的PRRSV NSP2基因序列，设计一对克隆引物(N1、N2)，见表1，扩增包含PRRSV-NSP2-N1N2基因的序列，大小为332bp，见表1，并插入SalⅠ和BamH Ⅰ两个酶切位点。
表1扩增PRRSV-NSP2-N1N2基因的引物核苷酸序列
表1中，下划线部分为SalⅠ和BamHⅠ双酶切的酶切位点
2、目的基因的扩增和重组表达质粒的构建
通过特异性引物扩增克隆PRRSV NSP2基因部分片段(N1N2)，构建重组表达质粒PET-32a-N1N2，见图4。
3、目的蛋白的表达和纯化
通过转入重组菌E.coliBL21(DE3)进行诱导表达，通过使用最佳的诱导表达的时间和诱导剂的浓度，获得重组融合蛋白pET-32a-N1N2，为可溶性蛋白，见图9。经His柱层析方法对表达的重组整合蛋白进行纯化，经SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度，见图10。
4、重组蛋白的免疫反应活性分析：Western-blotting试验
经Western-blotting检测重组蛋白能与6×His-Tag Antibody Mousemonoclonal抗体特异性结合，见图11。
5、区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检测方法的建立
利用纯化的PET-32a-N1N2蛋白，建立间接ELISA检测方法，确定PET-32a-N1N2蛋白抗原的包被浓度为0.075μg/孔，包被条件为4℃过夜；血清的稀释度和反应时间分别为1:200 和37℃60min；封闭液(1％BSA)封闭时间为37℃60min；羊抗猪IgG-HRP使用浓度1:5000和反应时间为37℃60min；底物25℃避光反应20min。
本发明的有益效果：
1、利用RT-PCR和蛋白原核表达技术获得纯度较高且具有良好特异性和免疫原性的融合蛋白PET-32a-N1N2，以融合蛋白PET-32a-N1N2为包被抗原，建立检测蓝耳病血清抗体的间接ELISA方法；
2、该方法适用于大规模检测蓝耳病血清抗体，为区分PRRSV野毒株与天津株疫苗株的抗体检测提供了一种特异性强、稳定性高、快速便捷的方法，为猪蓝耳病免疫抗体水平检测、疫情监控及流行病学调查提供了技术平台。
附图说明
图1为N1N2基因RT-PCR扩增结果图
图中：M：DNA Marker DL2000，1：PRRSV NSP2的N1N2基因PCR产物。
图2为质粒PMD18-T-N1N2的PCR扩增结果图
图中：M：DNA Marker DL2000；1：质粒pMD18-N1N2的PCR产物。
图3为质粒PMD18-T-N1N2的酶切结果图
图中：M：DNA Marker DL2000；1：质粒pMD18-N1N2的酶切产物。
图4为重组质粒PET-32a-N1N2鉴定结果图
图中：M：DNA Marker DL2000，1：PET-32a-N1N2质粒PCR产物。
图5为重组质粒测序结果图。
图6为重组菌诱导表达产物的SDS-PAGE分析图
图中：M：标准蛋白质分子量；1：诱导pET-32a-N1N2/BL21；2：未诱导pET-32a-N1N2/BL21； 3：诱导pET-32a/BL21空载体。
图7为重组菌PET-32a-N1N2/BL21诱导1-8h表达产物的SDS-PAGE分析图
图中：M：蛋白分子质量标准Marker；1-8：1-8h pET-32a-N1N2/BL21表达产物。
图8为重组菌PET-32a-N1N2/BL21不同IPTG浓度诱导表达产物的SDS-PAGE分析图
图中：M：标准蛋白质分子量；1-6：分别为0.2mM、0.4mM、0.8mM、1.2mM、1.6mM、2.0mM的IPTG浓度诱导PET-32a-N1N2/BL21表达。
图9为pET-32a-N1N2重组蛋白可溶性分析图
图中：M：蛋白分子质量标准Marker；1：pET-32a-N1N2超声裂解上清；2：pET-32a-N1N2 超声裂解沉淀。
图10为纯化pET-32a-N1N2重组蛋白SDS-PAGE分析图
图中：M：蛋白分子质量标准Marker；1-6：纯化pET-32a-N1N2重组蛋白。
图11为PET-32a-N1N2重组蛋白的Western blot检测图
图中：M：蛋白质分子质量标准；1-6：pET-32a-N1N2重组蛋白。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，但不限制本发明的保护范围和应用范围：
一、区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检测方法的建立
本发明根据GenBank已发表的PRRSV NSP2基因序列，设计一对克隆引物(N1、N2)，扩增包含PRRSV-NSP2-N1N2基因的序列，大小为332bp，并插入SalⅠ和BamHⅠ两个酶切位点。对目的片段和原核表达载体PET-32a同时双酶切，连接后得到重组表达质粒PET-32a-N1N2。
将重组质粒转入感受态细胞E.coliBL21(DE3)中，获得阳性重组大肠杆菌BL21(DE3)，将阳性重组大肠杆菌BL21(DE3)接种于Amp/LB培养基中进行IPTG诱导表达，IPTG浓度为 1mM条件下，诱导4小时后，收集样品。经SDS-PAGE电泳和Western blot检测，证实了所表达的重组蛋白大小相符具有免疫反应活性，且无交叉反应。通过对其特异性、敏感性及工作条件进行优化，建立了区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检测方法。
实施例1
引物设计
根据GenBank已发表的PRRSV NSP2基因序列，设计一对克隆引物(N1、N2)扩增包含PRRSV-NSP2-N1N2基因的序列，大小为332bp，见图1，并插入SalⅠ和BamHⅠ两个酶切位点。引物序列送大连宝生物工程公司合成。
表1扩增PRRSV-NSP2-N1N2基因的引物核苷酸序列
表1中，下划线部分为SalⅠ和BamHⅠ双酶切的酶切位点
实施例2
PRRSV-NSP2-N1N2基因克隆
2.1PRRSV病毒RNA的抽提
按照总RNA抽提试剂盒说明书(北京天根公司)步骤进行操作，提取PRRSV病毒抗原的RNA。步骤如下：①取200μL PRRSV病毒抗原，加入300μL裂解液RL和10μL蛋白酶K，振荡混匀放56℃水浴锅处理15分钟；②加入250μL无水乙醇，混匀后转入吸附柱CR3中(吸附柱套在收集管中)，12000转/分钟离心1分钟；③弃掉收集管中的废液，向吸附柱中加入 350μL的去蛋白液RW1，再12000转/分钟离心1分钟；④弃掉收集管中的废液，向吸附柱中加入配制好的DNaseⅠ工作液80μL，静置15分钟，加入350μL的去蛋白液，再12000转/分钟离心1分钟；⑤弃掉收集管中废液，向吸附柱中加入500μL的漂洗液RW，静置2分钟， 12000转/分钟离心1分钟；⑥弃掉收集管中的废液，再向吸附柱中加入500μL的漂洗液， 12000转/分钟离心1分钟；⑦弃掉收集管中的废液，再12000转/分钟离心2分钟，把吸附柱取出置于新的RNase-Free离心管中，打开盖子晾干；⑧向吸附柱中加入35μL dd H2O，静置 2分钟，12000转/分钟离心2分钟，离心管中为RNA溶液。
2.2病毒RNA RT-PCR反应
反转录(RT)体系：
补dd H2O至25μL，进行RT程序：42℃60min、95℃5min，取出用于 PCR或者-20℃保存。
聚合酶链式反应(PCR)体系：
加dd H2O至25μL，进行PCR程序：94℃5min；94℃45s、56℃45s、 72℃45S，35个循环；72℃10min,4℃保存。产物进行核酸电泳。
2.3PCR产物纯化回收
PCR产物按照琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒说明书(TaKaRa公司)步骤进行操作。步骤如下：①PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(1.0％-1.5％凝胶)，在紫外灯下切下目的基因片段，放离心管中；②根据胶块的重量，加入4个凝胶体积量的Buffer GM胶块溶解液，放置42℃水浴锅中，期间振荡混匀，使胶块充分融化；③转入Spin Column中(Spin Column先置于Collection Tube中)，12000转/分钟离心1分钟，将滤液再加入Spin Column中离心一次；④弃去滤液，向Spin Column中加入700μL的Buffer WB，静置2分钟，12000转/分钟离心1 分钟；⑤弃去滤液，向Spin Column中加入700μL的Buffer WB，12000转/分钟离心1分钟；⑥弃去滤液，将Spin Column放到新的离心管中，静置2分钟晾干，向Spin Column膜中央加入35ul去离子水，静置2分钟，12000转/分钟离心2分钟，离心管中为纯化的DNA。
2.4克隆载体pMD18-T-N1N2的构建
克隆载体构建体系：
pMD18-T载体(50ng/μL) 1L
SolutionⅠ 5μL
PCR纯化回收产物 4μL
共10μL体系，4℃连接过夜，得到重组DNA进行下一步的
转化。
2.5重组质粒的转化
具体步骤：①-80℃冰箱里取出E.coliDH5α感受态细胞(100μL/管)，置于冰盒上待溶化；②将连接得到的重组DNA加入50ul感受态细胞中，轻混匀，冰浴30min。③将感受态细胞放入42℃的水浴锅中，作用90s。④从水浴锅中取出感受态细胞，冰浴3min，加入预热的SOC 培养基500μL，37℃，200r/min，培养45min-1h。⑤轻混匀感受态细胞，取100μL涂布于Amp/LB 培养板上，37℃培养16h。
2.6重组质粒提取
将白色菌落接种于5mlAmp/LB液体培养基中，37℃，2000r/min，培养过夜。按照质粒小提中量试剂盒(TIAN pure Midi Plasmid Kit)步骤提取质粒：①向收集管里的吸附柱中加入 500μL平衡液BL，12000转/分钟，离心1分钟，倒掉废液；②把菌液倒入离心管中约2ml 离心管中，12000转/分钟，离心1分钟，弃掉上清；③向离心管中加入250μL溶液P1，使用移液枪悬浮细菌沉淀；④向离心管中加入250μL溶液P2，轻柔上下翻转6-8次使细菌充分裂解；⑤向离心管中加入350μL溶液P3，立即轻柔上下翻转6-8次，12000转/分钟，离心10 分钟；⑥将上清转入吸附柱中，12000转/分钟，离心1分钟，弃掉废液；⑦向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12000转/分钟，离心1分钟，弃掉废液，重复漂洗一次；⑧将吸附柱放回收集管中，12000转/分钟，离心2分钟；⑨将吸附柱放到一个灭菌的离心管中，向吸附柱膜中央加入50μL洗脱缓冲液EB，静置2分钟，12000转/分钟，离心2分钟，得到质粒DNA 溶液。
2.7重组质粒鉴定
PCR鉴定：cDNA模板变为重组质粒1μL，2×taq buffer 12.5ul，上下游引物各0.5ul，加 dd H2O至25μL，进行PCR反应，得到的产物进行1％琼脂糖电泳观察结果，见图2。
双酶切鉴定：按照10μL的双酶切反应体系(10×K缓冲液1μL，质粒DNA 5μL，内切酶SalⅠ、BamHⅠ各0.5μL，dd H2O 3μL)，4℃过夜，取酶切产物进行1％琼脂糖电泳观察结果，见图3。
测序鉴定：将经过PCR和双酶切鉴定为阳性的质粒，送宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定，见图4。
实施例3
N1N2基因原核表达载体构建
3.1pMD18-T-N1N2质粒和表达载体质粒的双酶切
酶切体系(50μL)：10×buffer 5μL，模板(PCR纯化产物/表达载体质粒)25μL，SalⅠ和BamHⅠ内切酶分别2.5μL，dd H2O 15μL。4℃过夜。取酶切产物5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳，按照PCR产物纯化回收步骤对酶切产物进行回收纯化。
3.2目的基因表达载体的构建
连体体系(10μL)：10×T4连接酶缓冲液1μL，T4连接酶1μL，目的基因酶切回收产物5μL，表达载体pET-32a酶切回收产物3μL。4℃连接过夜，再按照2.2.1.2中重组质粒转化步骤将连接物转入感受态细胞E.coliBL21(DE3)中，涂布Amp/LB培养板上，37℃培养16小时。
3.3重组质粒pET-32a-N1N2提取
按照2.6中重组质粒提取步骤进行，得到重组表达质粒DNA溶液。
3.4重组质粒pET-32a-N1N2鉴定
对重组质粒pET-32a-N1N2双酶切鉴定，选用内切酶SalⅠ、BamHⅠ，其余步骤相同，见图4。
实施例4
重组菌的诱导表达
4.1重组菌的诱导表达
取阳性重组质粒pET-32a-N1N2的菌液进行复苏，取10μL菌液加入到5mlAmp/LB培养基中，37℃200r/min，培养过夜。分别取复苏菌液500μL加入到两管10ml Amp/LB培养液中， 37℃200r/min，斜摇培养待菌液OD值在0.4-0.6之间，其中一管加入终浓度为1mM的IPTG 诱导菌液表达蛋白，另外一管为不加IPTG空白对照，继续37℃200r/min，直摇培养4h。样品处理：分别收集诱导和未诱导的菌液各1ml，12000转/分钟离心1分钟，弃掉上清；用100μLPBS重悬细菌沉淀，12000转/分钟离心1分钟，弃掉上清；重复3次，弃掉上清液；加入PBS 30μL，4×Buffer 10μL，重悬细菌沉淀；沸水浴煮7分钟。得到的样品进行SDS-PAGE 电泳和Western blot检测重组菌蛋白表达情况。
4.2SDS-PAGE电泳
具体操作：①配制电泳缓冲液和5×样品缓冲液；②洗清玻璃，晾干后安装在制胶器上，用蒸馏水检查无漏液；③制SDS-PAGE凝胶，先配制15％分离胶用移液枪吸入玻璃板间约7ml，加入2ml蒸馏水压平胶面，待胶凝后倒掉胶面上的水，再加入配制好的5％积层胶约离边缘 0.5cm处，缓慢地插上梳子避免产生气泡，等待胶凝；④将胶移入电泳槽内，倒入电泳缓冲液漫过加样孔，轻轻拔掉梳子；5)处理好的蛋白样品30μL，5×Buffer 10μL混匀后，煮沸7 分钟，取10μL加入加样孔中，同时设预染蛋白marker作标准对照；⑥接通正负极电源，先 80V约60分钟，带染料刚过积层胶后，再使用120V直至染料到达胶底部约120分钟；⑦染色，按照考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液(北京索莱宝公司)步骤操作，将胶加入考马斯亮蓝快速染色液浸没凝胶，置摇床摇动4h，倒掉染色液再加入漂洗液，置摇床摇动2h，换上去离子水即可完成，观察结果并扫描，见图6。
4.3Western blot检测
具体步骤：①剪1张PVDF膜和6张厚滤纸，先将PVDF膜放入盛有甲醇的平皿中，置摇床上摇荡浸泡3分钟，再取出PVDF膜连同滤纸一起放入1×半干转膜液中摇荡浸泡15分钟；②SDS-PAGE胶取出后，切掉上面的积层胶，将胶放入1×半干转膜液中，在半干转移槽上面依次叠放3层厚滤纸、PVDF膜、SDS-PAGE胶和3层厚滤纸，并且各层均需要使用玻璃棒滚动挤出气泡；③盖上盖子，调节电压20V 45分钟，结束后取出PVDF膜做好标记；④用丽春红预染，观察有无条带，再用蒸馏水或TBST洗掉；⑤用5％脱脂奶粉4℃封闭过夜，用TBST洗膜三次，在摇床上摇动洗膜，每次5分钟；⑥用一抗37℃孵育60分钟，TBST摇动洗膜三次，每次5分钟；⑦使用辣根酶标二抗37℃孵育60分钟，TBST摇动洗膜三次，每次5分钟；⑧使用DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒，显色观察结果并扫描，见图11。
4.4重组菌表达条件的优化
对重组菌诱导表达时间和IPTG浓度进行了优化，按照重组菌诱导表达步骤进行。其中对时间的优化，加入1mMIPTG诱导菌液表达，在8h内每隔一小时收集1ml菌液，样品处理后进行SDS-PAGE电泳比较不同时间的蛋白表达量，见图7。由于诱导8h表达产物的条带最浓，所以选择的诱导时间是8h；对IPTG浓度的优化，在最佳时间上进行诱导表达分别加入终浓度为0.2mM，0.4mM，0.8mM，1.2mM，1.6mM，2.0mM的IPTG，样品处理后进行 SDS-PAGE电泳比较不同IPTG浓度下蛋白表达量，见图8，由于IPTG终浓度为1.2mM时表达产物的条带最浓，所以选择的IPTG浓度是1.2mM。
4.5重组菌表达形式的确定
在最佳诱导表达条件下，取诱导表达后的菌液100ml，10000g离心10分钟，弃掉上清；用PBS洗涤细菌沉淀，重复洗涤三次；加入10mlPBS重悬细菌沉淀，反复冻融三次后，在冰浴中超声裂解细菌，超声1s，间歇3s振幅30％，超声25分钟；10000g离心10分钟分别收集沉淀和上清，样品处理后进行SDS-PAGE电泳分析重组菌表达蛋白的形式。若表达的蛋白存在上清中，为可溶性蛋白；存在沉淀中，则为包涵体的形式，见图9。
实施例5
重组蛋白pET-32a-N1N2的纯化
5.1His·Bind柱层析纯化
①柱子里加入2ml树脂，待保存液降至树脂表面；②依次加入3ml去离子水，5ml 1×charger buffer，3ml 1×binding buffer来平衡柱子；③加入处理好的样品，收集洗脱液，做好标记；④依次加入10ml 1×binding buffer，6ml 1×washing buffer,6ml 1×elution buffer，并分别收集液体，elution buffer洗脱下来的则为纯化的pET-32a-N1N2重组蛋白，取样进行 SDS-PAGE电泳检测重组蛋白纯化情况，见图10。
5.2纯化pET-32a-N1N2重组蛋白的浓缩
将超滤离心管加入超纯水，水量完全过膜，冰浴或冰箱里预冷几分钟。然后将水倒出，加入适量将鉴定过的重组蛋白液，当浓缩到剩下1ml时，继续加入剩下的蛋白液浓缩，直至获得需浓度蛋白(200μl-500μl)。离心过程中需注意是否发生蛋白沉淀而堵塞滤膜。取出浓缩好的蛋白浓缩液的操作在冰上操作，用200μl枪头轻轻顺着边缘插入枪头，轻轻吹打、混匀蛋白液，注意不要碰到超滤膜，然后吸取浓缩液，每次吸接近200ul，直到吸完。整个过程冰浴操作，注意不要损坏超滤膜。
实施例6
纯化重组蛋白的鉴定
将纯化浓缩的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，用1:1500 6×His-Tag AntibodyMouse monoclonal做Western blot试验，对纯化的重组蛋白进行鉴定，酶标二抗使用羊抗猪IgG-HRP，见图11。
实施例7
区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检测方法的建立
7.1间接ELISA检测方法：
①包被：包被纯化的pET-32a-N1N2重组蛋白，0.075μg/孔，4℃过夜；
②洗板：PBST(pH7.4)洗板五次用纸巾拍干；
③封闭：加入封闭液(1％BSA),100μL/孔，37℃封闭60min，同上洗板拍干；
④加样：加入待检样品、阴阳对照及空白对照，50μL/孔，37℃孵育60min，同上洗板拍干；
⑤加二抗：加入羊抗猪IgG-HRP，50μL/孔，37℃孵育60min，同上洗板拍干；
⑥显色：加入TMB底物，50μL/孔，25℃避光20min；
⑦终止：加入硫酸终止液，50μL/孔；
⑧测值：酶标仪测定OD450值。
7.2间接ELISA反应条件的优化
7.2.1最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定
7.2.1.1最佳抗原包被浓度的确定
酶标板包被纯化的pET-32a-N1N2重组蛋白，用PBST稀释至0.15μg/孔、0.1μg/孔、0.075μg/孔、0.025μg/孔，进行间接ELISA，测定OD值，计算各P/N值，结果如表2所示。当蛋白浓度为0.075ug/孔时，样品的P值接近于1，且P/N值最大(P/N＞2.5)。所以选择0.075ug/ 孔为最适抗原包被量。
表2 pET-32a-N1N2重组蛋白抗原最佳包被浓度的确定
7.2.1.2血清稀释度的确定
包被纯化的PET-32a-N1N2蛋白0.075μg/孔；猪阳性血清用PBST分别作1:100、1：200、 1：300、1：400、1：500倍稀释，进行间接ELISA，测定OD值，计算各P/N值，结果如表3所示。当血清稀释倍数为1：200时，样品的P值接近于1，且P/N值最大(P/N＞2.5)，所以选择1:200为最佳血清稀释度。
表3血清最佳稀释度的确定
7.2.2酶标抗体浓度
对酶标抗体羊抗猪IgG–HRP分别作1：2000、1：5000、1：8000、1：10000倍稀释，进行间接ELISA，测定OD450值，计算各P/N值，结果如表4所示。当选酶标二抗1:5000 倍稀释时，阳性OD450值接近于1.0。因此，酶标抗体最佳工作浓度1:5000。
表4酶标抗体最佳工作浓度
7.2.3封闭液选择
以0.075μg/孔的最佳浓度包被抗原，分别采用1％BSA、1％酪蛋白和5％脱脂奶粉作为封闭液，选择天津株阳性免疫猪血清和PRRS抗体阴性血清各4份进行间接ELISA，取平均值，测定OD450值，计算各P/N值，结果如表5所示。试验结果显示，1％BSA的封闭效果最好，1％酪蛋白阴性值较高，5％脱脂奶粉P值较低、N值较高，因此选择1％BSA作为封闭液。
表5最佳封闭液的选择
7.2.4封闭时间的确定
37℃分别封闭30min、60min、120min，进行间接ELISA，结果如表6所示。结果显示：封闭60min时P/N值最大封闭效果最好，因此封闭时间确定为60min。
表6封闭时间的确定
7.2.5待检血清最适作用时间
将待检血清分别作用30min、60min、120min进行间接ELISA，结果如表7所示。结果显示：待检血清反应60min和120min接近，综合考虑待检血清作用时间确定为60min。
表7待检血清作用时间的确定
7.2.6底物显色时间
以10min、20min和30min作为间接ELISA的底物显色时间，见表8。对比发现20min时达到最佳值，随后缓慢下降，选择20min为最佳底物显色时间。
表8最佳显色时间的确定
7.2.7间接ELISA阴阳临界值的确定
挑选50份PRRSV阴性血清，运用已确定的最适间接ELISA条件进行实验，结果如表9所示。计算其平均值和标准差SD值，分别为0.2285和0.0705，临界值为即0.4401。所以判定标准为：样品0D450>0.4401，且P/N>2.5，判定为阳性，否则为阴性。
表9间接ELISA阴阳临界值的确定
7.2.8特异性试验结果
挑选猪瘟病毒(HCV)，猪伪狂犬病毒(PRV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJ株、野毒株抗体阳性血清和PRRSV抗体阴性血清作为待检血清间接ELISA交叉检测。检测结果如表10所示，表明建立的间接ELISA方法特异性强，与猪繁殖与呼吸综合征JX株抗体阳性没有交叉反应。
表10特异性试验结果
7.2.9符合性检验结果
利用建立的间接ELISA方法检测138份PRRSV阳性血清和50份PRRSV阴性血清，见表11，计算其符合率。均为阳性样品为138，阴性为50，符合率100％。
表11 PRRSV阴阳性血清符合率检测的符合率
7.2.10重复性试验结果
4份不同效价的血清和2份阴性血清进行间接ELISA，每份血清进行3个重复，选择同一次纯化的蛋白进行批内重复、不同次的纯化蛋白进行批间重复。结果见表12、表13，数据显示：板内和板间重复的变异系数CV值均小于15％，表明建立的单抗间接ELISA重复性较好。
表12批内重复性试验结果
表13批间重复性试验结果
二、应用
应用建立的ELISA方法检测猪场的猪血清。
1、利用建立的间接ELISA方法和IDEXX试剂盒检测只用PRRSV TJ株疫苗免疫的1个广西重点种猪场的猪血清96份，由于PRRSV TJ株疫苗不含N1N2基因，所以两种方法符合率仅为1.06％，表明与IDEXX试剂盒检测比较，PET-32a-N1N2蛋白对本发明方法有更强的特异性和免疫原性，同时也表明免疫效果好，且未受到野毒感染，见表14。
表14 I-ELISA检测PRRSV TJ株免疫种猪场
2、利用建立的间接ELISA方法和IDEXX试剂盒检测只用PRRS JX疫苗免疫的1个广西重点种猪场的猪血清143份，均阳性为131份，均阴性为0份，两种方法符合率为91.6％，表明免疫效果好，其中12份可能感染了PRRSV TJ株野毒，见表15。
表15 I-ELISA检测PRRSV JX株免疫种猪场
3、利用建立的间接ELISA方法和IDEXX试剂盒检测只用PRRSV TJ株疫苗免疫的1个小型猪场的猪血清30份。其中均阳性23份，均阴性2份，推断均阳性的23份血清有野毒株感染，均阴性的未免疫成功，剩余的5份血清则是免疫成功且未受到野毒株感染，见表16。
表16 I-ELISA检测PRRSV TJ株免疫小型猪场
4、利用建立的间接ELISA方法和IDEXX试剂盒检测PRRSV没有疫苗免疫的1个小型猪场的猪血清30份。两种方法均阳性为27份，均阴性为0，推测猪场可能受到了两种类型野毒株的感染，见表17。
表17 I-ELISA检测未免疫小型猪场
核苷酸序列表
<110> 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心
<120> 区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检测方法
<130> GX-1710044JYC
<160> 2
<210> 1
<211> 29
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
ACGCGTCGAC AAGATCACAC GCCCAAAAT 29
<210> 2
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
CGCGGATCCT TATGCGAGGT AACATCACAA AC 32

Claims (7)

1.一种区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检测方法，其特征在于，包括以下实施步骤：
T1：构建重组表达质粒PET-32a-N1N2
以PRRSV NSP2基因组为模板，针对N1、N2基因序列设计特异性引物，其中针对N1基因序列设计的特异性引物核苷酸序列为：5’-ACGCGTCGACAAGATCACACGCCCAAAAT-3’，针对N2基因序列设计的特异性引物核苷酸序列为：5’-CGCGGATCCTTATGCGAGGTAACATCACAAAC-3’；通过PCR扩增得到目的片段，构建克隆质粒pMD-18T-N1N2，对克隆载体和原核表达载体pET-32a同时进行双酶切，连接后得到重组表达质粒pET-32a-N1N2；
T2：对目的蛋白进行表达及纯化
将构建重组表达质粒PET-32a-N1N2转入E.coliBL21(DE3)，诱导表达融合蛋白，利用His柱层析进行纯化，得到经SDS-PAGE电泳分析纯度较高的蛋白；
T3：建立间接ELISA检测方法
利用纯化的PET-32a-N1N2蛋白，建立间接ELISA检测方法，确定PET-32a-N1N2蛋白抗原的包被浓度为0.075μg/孔，包被条件为4℃过夜；血清的稀释度和反应时间分别为1:200和37℃60min；封闭液为1％BSA，封闭时间为37℃60min；羊抗猪IgG-HRP使用浓度和反应时间分别为1:5000和37℃60min；底物25℃避光反应20min。
2.根据权利要求1所述区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤T3中，针对PRRSV-NSP2-N1N2蛋白样本阴阳性临界值，判定标准是：当样本OD450>0.4401时，P/N＞2.5判定为阳性，当样本OD450＜0.4401判定为阴性。
3.根据权利要求1所述区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤T2中，纯化所得的目的蛋白，经Western blot检测能与6×His-Tag小鼠单克隆抗体特异性结合。
4.根据权利要求1所述区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤T2中，纯化所得的目的蛋白为可溶性蛋白。
5.根据权利要求1所述区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检测方法，其特征在于，步骤T2中对目的蛋白的诱导表达的最佳条件为IPTG浓度为1.2mM条件下，诱导8小时。
6.根据权利要求1所述区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检测方法，其特征在于，步骤T1中所得pET-32a-N1N2重组质粒大小为6207bp。
7.根据权利要求1所述区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接ELISA检测方法，其特征在于，PET-32a-N1N2蛋白皆不与猪瘟病毒(HCV)，猪伪狂犬病毒(PRV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJ株抗体阳性血清发生反应。
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