CN109212230B - 用于检测犬细小病毒结构蛋白vp2抗体的致敏聚苯乙烯纳米微球及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测犬细小病毒结构蛋白VP2抗体的致敏聚苯乙烯纳米微球及其制备方法和应用。所述的致敏聚苯乙烯纳米微球的表面偶联有犬细小病毒重组VP2蛋白，所述的重组VP2蛋白为犬细小病毒VP2蛋白的截短蛋白，位于犬细小病毒VP2蛋白的第365～486位，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。该蛋白含有VP2蛋白的主要抗原表位区、抗原性强、亲水性好，具有较强的特异性和免疫原性。利用该重组蛋白作为抗原制备了致敏彩色聚苯乙烯纳米微球，用于检测犬细小病毒血清抗体。实验证明，制备的致敏微球无自凝现象，重复性好，性质稳定。本发明的方法适用于宠物临床对单份或多份犬血清的快速检测，与商品化检测试剂盒比较，操作简便，检测结果有较高的确准性和符合率。

Description

用于检测犬细小病毒结构蛋白VP2抗体的致敏聚苯乙烯纳米 微球及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种用于检测犬细小病毒抗体的致敏聚苯乙烯纳米微球及其制备方法和应用，特别涉及一种用于检测犬细小病毒结构蛋白VP2抗体的致敏聚苯乙烯纳米微球及其制备方法和应用，本发明属于病毒检测技术领域。
背景技术
犬细小病毒病(Canine parvovirus disease)是由犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起的犬的一种高度接触性传染病，发病率和死亡率较高。临床上主要表现为出血性肠炎和非化脓性心肌炎。各年龄段的犬均可感染此病，其中以幼犬及纯种犬发病居多。近年来由于犬的数量增多，流通量增大，缺乏科学的疫苗预防接种，在工作犬养殖场、宠物交易市场以及流浪犬救助站内等高密集犬群中，该病的流行趋势也在不断上升，临床诊断病例明显增多，成为危害犬类健康的主要疾病之一。
目前防治该病的主要措施是预防接种疫苗，但除了病毒变异引起免疫失败以外，母源抗体干扰和抗体水平过低也是造成免疫失败的原因。因此，通过抗体监测可以了解幼犬母源抗体水平和免疫犬的抗体水平，确定幼犬首次免疫和加强免疫的时机，对发挥疫苗免疫保护作用具有重要意义。
目前可用于检测CPV抗体的方法有血凝抑制试验(HI)，血清中和试验(SN)，酶联免疫吸附试验(ELISA)等。然而，HI检测费时费力，需要制备新鲜的动物红细胞和完整的病毒粒子，操作繁琐，容易受一些非特异性抑制剂的影响。SN检测的是血清中和抗体水平，可直接反映机体中和病毒的能力和疫苗免疫效果，但需要具备细胞培养条件，费时较长，且需要专业技术较强的人员操作。间接ELISA试剂盒适合批量样品的检测，不适合宠物门诊对单份血清样品或少量样品的随时检测。虽然斑点ELISA试剂盒可对单份血清样品随时检测，但价格昂贵。因此，建立适合临床应用的检测方法对及时了解幼犬CPV母源抗体水平和免疫犬CPV抗体水平，确定正确的免疫时机，预防犬细小病毒病的发生和流行具有重要的意义。
间接凝集反应是将可溶性抗原(或抗体)吸附在一种与免疫无关的惰性载体颗粒表面，使其成为致敏载体，然后与相应抗体(或抗原)结合，在电解质存在的条件下，载体颗粒被动地发生凝集。载体颗粒包括红细胞(绵羊红细胞或正常人“O”型红细胞)、聚苯乙烯纳米微球、活性炭粒等，其中聚苯乙烯纳米微球已实现商品化生产，粒径均一，来源稳定，作为载体颗粒已广泛用于生物检测技术。聚苯乙烯纳米微球作为载体的间接凝集试验具有高特异性和敏感性，快速、简单，结果易于判定，适合宠物门诊对单份血清样本的检测。建立犬细小病毒抗体聚苯乙烯纳米微球间接凝集试验的难点在于具有良好特异性，且与微球能很好结合的可溶性抗原的制备及结合条件的优化。
VP2蛋白是CPV衣壳蛋白的主要成分，具有良好的免疫原性，可诱导机体产生中和抗体。本发明通过分离CPV现地流行毒株，克隆分析其主要结构蛋白VP2编码基因，分析其分子遗传演化与疫苗株的差异；用表达纯化的重组蛋白致敏羧化彩色聚苯乙烯纳米微球，建立CPV抗体检测间接凝集试验，为临床检测CPV血清抗体水平提供简便、特异、经济的检测技术。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种用于检测犬细小病毒结构蛋白VP2抗体的致敏彩色聚苯乙烯纳米微球及其制备方法。
本发明的目的之二在于提供一种犬细小病毒抗体聚苯乙烯纳米微球间接凝集检测方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明将临床疑似感染CPV的病犬排泄物处理后接种F81细胞，传代培养后，经电镜观察、间接免疫荧光技术、PCR、血凝(HA)鉴定确定分离获得1株CPV病毒，命名为CPV-DN17-1。结合DNAStar-Protein软件分析，在CPV-DN17-1的VP2基因主要抗原表位编码区设计并合成两对引物sVP2-F1/R1和sVP2-F2/R2，克隆并构建了重组质粒pGEX-vp2-s1和pGEX-vp2-s2。诱导、表达和鉴定后的重组蛋白命名rVP2-S1和rVP2-S2。用重组蛋白制备的多克隆抗体经ELISA、中和试验检测，rVP2-S1的间接ELISA效价为1:12800，中和效价为1:128；rVP2-S2的间接ELISA效价为1:6400，中和效价为1:54。选择免疫原性更好的rVP2-S1致敏红色聚苯乙烯羧基纳米微球，对致敏蛋白浓度、致敏缓冲液、EDC含量等致敏条件的优化结果表明，当纳米微球为25μL(5％w/v)，致敏蛋白量1mL(0.3mg/mL)，EDC 0.015g，醋酸缓冲液(pH5.0)500μL时，致敏的彩色微球与兔抗CPV阳性血清凝集效果最佳。凝集结果经试剂盒标定，判定标准为能使致敏微球发生50％(++)以上凝集的血清为阳性血清，该血清抗体对犬有免疫保护作用；低于50％凝集为阴性结果，血清抗体无免疫保护作用。试验证明该方法特异性、敏感性、重复性和稳定性良好。利用建立的检测方法和试剂盒同时对临床采集的40份犬血清进行检测，符合率为97.5％。
因此，在上述研究的基础上，本发明首先提出了一种犬细小病毒重组VP2蛋白，所述的蛋白为犬细小病毒VP2蛋白的截短蛋白，位于犬细小病毒VP2蛋白的第365～486位，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
编码所述的犬细小病毒重组VP2蛋白的核苷酸序列以及含有所述核苷酸序列的表达载体也在本发明的保护范围之内，其中，优选的，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步的，本发明还提出了所述的犬细小病毒重组VP2蛋白在制备检测犬细小病毒VP2抗体的试剂中的用途。
更进一步的，本发明提出了一种用于检测犬细小病毒结构蛋白VP2抗体的致敏聚苯乙烯纳米微球，即在所述的致敏聚苯乙烯纳米微球的表面偶联有本发明所述的犬细小病毒重组VP2蛋白。
更进一步的，本发明还提出了一种制备所述的致敏聚苯乙烯纳米微球的方法，包括以下步骤：将纯化的本发明所述的犬细小病毒重组VP2蛋白、醋酸缓冲液、EDC和聚苯乙烯纳米微球混匀后，25℃下置于脱色摇床，100r/min摇2h；致敏后置于离心机离心，弃上清，加入乙磺酸缓冲液，充分悬起后离心弃上清，用醋酸缓冲液重新悬起，即得，4℃保存。
其中，优选的，各原料的用量是：纯化的浓度为0.3mg/mL所述的犬细小病毒重组VP2蛋白液1mL，pH5.0的醋酸缓冲液500μL，EDC 0.015g，浓度为5％w/v的聚苯乙烯纳米微球为25μL。
其中，优选的，所述的聚苯乙烯纳米微球为410nm的红色聚苯乙烯纳米微球。
更进一步的，本发明还提出了所述的致敏聚苯乙烯纳米微球在制备通过间接凝集反应检测犬细小病毒VP2抗体的试剂中的用途。
一种犬细小病毒抗体聚苯乙烯纳米微球间接凝集检测方法，按照以下步骤进行：取干净的玻片滴加10μL PBS，10μL CPV待检血清，然后分别加入10μL所述的致敏聚苯乙烯纳米微球的悬液，充分混匀后手动摇晃1～2min观察凝集现象。实验证明本发明所建立的CPV抗体检测间接凝集试验具有良好的特异性、敏感性、稳定性，可满足临床对单份血清的检测需求，具有明显的应用价值。
相较于现有技术，本发明的有益效果为：
1、本发明提出了一种犬细小病毒重组VP2蛋白，所述的蛋白为自行分离到的犬细小病毒CPV-DN17-1VP2蛋白的截短蛋白，位于犬细小病毒VP2蛋白的第365～486位，该蛋白含有VP2蛋白的主要抗原表位区、抗原性强、亲水性好，具有较强的特异性和免疫原性。本发明所选择的截短基因包含CPV VP2氨基酸的323位氨基酸，根据文献报道，该氨基酸位点是引起CPV与FPV、MEV抗原性存在明显差异的主要位点，因此截短蛋白可有效排除被其它种属动物细小病毒干扰的可能性。
2、本发明还提供了一种犬细小病毒抗体聚苯乙烯纳米微球及其间接凝集检测方法，利用重组蛋白rVP2-S1作为抗原制备了致敏彩色聚苯乙烯纳米微球检测犬细小病毒血清抗体。制备的致敏微球无自凝现象，重复性好，性质稳定。本发明的方法适用于宠物临床对单份或多份犬血清的快速检测，与商品化检测试剂盒比较，操作简便，检测结果有较高的确准性和符合率。
附图说明
图1为分离样品引起的细胞病变；
A.病料接种F81细胞36h后的CPE；B.病料接种F81细胞72h后的CPE；C.病料接种F81细胞96h后的CPE；D.未接种病料的F81细胞；
图2为分离株VP2基因片段PCR产物；
M.Trans2K Plus II DNA marker；1.阴性对照；2.CPV疫苗株C-154；3.病毒细胞培养物；4.病料处理样品；
图3为间接免疫荧光鉴定结果；
A.接毒的F81细胞；B.未接毒F81细胞；
图4为分离株与其它CPV VP2核苷酸同源性比较；
图5为CPV VP2基因片段进化树；
图6为分离株与其它CPV VP2氨基酸同源性比较；
图7为VP2重组蛋白的SDS-PAGE分析；
M.蛋白分子质量标准；1.诱导BL21/pGEX-6p-1空载体重组菌；2.BL21/pGEX-vp2-s1诱导超声后上清；3.BL21/pGEX-vp2-s1诱导超声后沉淀；4.BL21/pGEX-vp2-s2诱导超声后上清；5.BL21/pGEX-vp2-s2诱导超声后沉淀；
图8为重组蛋白SDS-PAGE分析结果；
M.蛋白分子质量标准；1.纯化后BL21/pGEX-vp2-s2产物；2.纯化后的BL21/pGEX-vp2-s1产物；3.未纯化的BL21/pGEX-vp2-s2产物；4.未纯化的BL21/pGEX-vp2-s1产物；
图9为重组蛋白的Western blot分析；
M.蛋白质分子量标准；1.GST蛋白；2.纯化后的rVP2-S1；3.纯化后的rVP2-S2；
图10为重组蛋白免疫抗体效价检测结果；
图11为微球凝集程度判定；
1.PBS；2.“++++”凝集效果；3.“+++”凝集效果；4.“++”凝集效果；5.“+”凝集效果；
图12为间接凝集试验与试剂盒检测结果比较；
注：纵坐标凝集度0、1、2、3、4分别代表凝集效果“-”、“+”、“++”、“+++”、“++++”；
图13为特异性试验。
1.CPV阳性血清；2.阴性对照；3.犬CPV阴性血清；4.CDV阳性血清；5.CAV阳性血清；6.RABV阳性血清。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所涉及的实验材料及来源：
1、实验动物、细胞系、菌株及质粒
新西兰大白兔，用于CPV VP2重组蛋白多克隆抗体的制备，购自辽宁长生生物技术有限公司；猫肾细胞系(F81)用于CPV的培养增殖，质粒pGEX-6P-1用于CPV VP2重组蛋白的表达，均由东北农业大学动物医学学院兽医传染病学教研室(以下简称本实验室)保存；感受态细胞E.coli Trans-T1用于CPV VP2重组基因的克隆，E.coli BL21用于CPV VP2重组基因的表达，购自北京全式金生物有限公司；pMD-19T Simple vector，用于CPV VP2重组基因的克隆，购自宝生物工程(大连)有限公司。
2、病毒分离样品、阳性血清、CPV疫苗株
狂犬病病毒(RABV)阳性血清购于哈尔滨市疾病预防控制中心；犬腺病毒(CAV)阳性血清由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所曲连东研究员惠赠；兔抗CPV阳性血清、犬瘟热病毒(CDV)阳性血清、CPV阴性血清由本实验室保存，用于CPV抗体检测间接凝集试验特异性试验；40份免疫犬血清来自哈尔滨警犬基地和东北农业大学动物医院，用于CPV抗体检测间接凝集试验临床样品检测。CPV疫苗株NL-35-D(美国辉瑞四联苗)、C-154(宠必威二联苗)、CR86106(吉林五星五联苗)、B114(优乐康六联苗)用于制备免疫犬血清，其中疫苗株C-154作为参考株，用于CPV参考与鉴定，购自东北农业大学动物医院。
3、主要试剂
超敏ECL显色液，用于Western blot分析，购自碧云天生物有限公司；410nm彩色聚苯乙烯纳米微球，用于制备凝集试验的致敏微球，购自上海涛宇国际有限公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)用于致敏微球的活化剂，购自哈尔滨百杰斯生物公司；
Figure BDA0001797911120000061
Canine VacciCheck试剂盒用于CPV血清抗体检测，购自哈尔滨市中兴动物医药有限公司。
实施例1CPV的分离鉴定
1、方法
1.1病毒培养增殖
病料处理：将冷冻的疑似感染CPV的犬腹泻物置于4℃冰箱融化，取200μL病料加入800μL的PBS配制成体积比为1：4的病料悬液，加入双抗(青霉素终浓度为100μg/mL，链霉素终浓度为50μg/mL)溶液，混匀后反复冻融3次，4℃10000r/min离心10min。取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，收集滤液，置-80℃保存备用。
细胞培养：复苏F81细胞，连续传2代，待其达到最佳的生长状态后，用10％血清的DMEM细胞培养液将消化的F81细胞充分悬起，置于5％CO2培养箱37℃培养2h，待90％以上细胞贴壁后，弃掉培养液，加入7mL 2％血清的DMEM细胞维持液，同步将已处理的700μL病料滤液接种于F81细胞中，设置未接种病料滤液的细胞作为阴性对照，置于培养箱中连续培养3～4d，观察细胞病变(CPE)，待CPE(皱缩、拉丝、脱落等)达到80％以上时，反复冻融3次收集细胞培养物上清，将此上清液按上述方法连续盲传5代，观察CPE，收集细胞培养物，-80℃冰箱保存。
1.2 PCR鉴定
参考病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书分别提取病料、病料第五代细胞培养物以及CPV疫苗株C-154中的病毒DNA，以此为模板，CPV-F、CPV-R为引物进行PCR检测，同时以CPV疫苗株C-154作为参考菌株进行参考与鉴定。
CPV-F(EcoRⅠ)GCGAATTCATGAGTGATGGAGCAGTTC
CPV-R(SalⅠ)GCGTCGACTTAATATAATTTTCTAGGTGC
反应条件为：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃2min，终延伸72℃10min，30个循环。扩增产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，同时送哈尔滨新海生物技术有限公司进行序列分析。
1.3血凝试验
参照《动物病毒学》关于CPV鉴定的微量血凝试验方法，利用配制好的1％的新鲜猪红细胞进行凝集试验，记录能凝集50％红细胞的最高稀释倍数作为病毒凝集价。
1.4电镜观察
取病料第五代细胞培养物反复冻融3次后，10000r/min，离心10min，取上清液送哈尔滨兽医研究所，电镜观察细胞培养物中病毒的形态学特征。
1.5间接免疫荧光检测(IFA)
(1)将病料第五代细胞培养物与F81细胞按1:10接种于12孔细胞板，设未接病料滤液的细胞作为阴性对照，每个样品做3个平行孔；
(2)待50％细胞CPE后，弃去培养液，PBS洗2次，5min/次；
(3)每孔加500μL固定液，室温固定30min后弃液，室温晾干5min，PBS洗2次，5min/次；
(4)每孔加入500μL 0.2％的Triton-100，室温穿孔10min，PBS洗3次，5min/次；
(5)加入封闭液500μL，室温封闭30min，PBS洗3次，5min/次；
(6)每孔加入1：500稀释的兔抗CPV阳性血清(3％BSA稀释)，37℃孵育1h，PBS洗3次，5min/次；
(7)每孔加入500μL稀释后的FITC-山羊抗兔IgG(3％BSA稀释)，37℃避光孵育30min，PBS洗3～6次，5min/次；
(8)置于荧光显微镜下观察。
1.6分离病毒VP2基因分析
1.6.1 VP2全长基因的克隆
将1.2中获得的PCR产物切胶回收，将核酸浓度调整为50ng/μL，与pMD-19T-SimpleVector连接，16℃反应30min；将连接产物加入到50μL的Trans-T1感受态细胞中，冰水浴30min；42℃热激45s后，迅速转为冰水浴1min；加入100μL LB培养液，37℃振荡培养60min；转化产物涂布于LB琼脂培养基(Amp+,100mg/L)，37℃培养过夜。
1.6.2 VP2基因克隆的筛选
用灭菌的10μL枪头将生长于LB琼脂培养基(Amp+,100mg/L)的单个菌落挑起，置于3mL LB液体培养基(Amp+,100mg/L)中，160r/min，37℃恒温振荡培养6h，至培养基浑浊时进行PCR鉴定。将PCR鉴定正确的菌液送哈尔滨新海生物技术有限公司测序，获得的阳性质粒命名为pMD-19T-vp2。
1.6.3 VP2基因的序列分析
将测序获得的病毒分离株VP2基因序列与5种CPV疫苗株、19种国内外分离株的VP2基因，4株其它动物细小病毒基因进行核苷酸序列比对分析，通过DNAStar软件绘制系统进化树、氨基酸序列分析和抗原性分析。
1.6.4病毒TCID50测定
F81细胞经台盼蓝染色进行活细胞计数，将细胞培养液中细胞稀释为1×105个/mL，接种于96孔细胞板，每孔100μL。将病毒第五代细胞培养液进行倍比稀释(10-1、10-2、…、10-6)，参照1.1方法接种于F81细胞，设阳性对照、阴性对照，每组设8个重复。37℃、5％CO2培养72h后观察CPE，按Reed-Muench法计算TCID50。
1.6.5疫苗免疫抗体对CPV分离株中和抗体检测
将市面常见的4种CPV弱毒疫苗(疫苗毒株NL-35-D、C-154、CR86106、B114)按照疫苗说明书免疫程序，分别接种健康犬，三免后采血收集血清进行中和试验(SN)。试验操作参考《动物病毒学》，具体如下：
(1)制备病毒悬液：将病毒的第五代细胞培养物以3000r/min离心10min，取上清液，参照1.5方法测定的病毒TCID50值，将病毒稀释成200TCID50；
(2)处理血清：适度稀释血清后，56℃水浴30min，破坏血清中的补体及其他不耐热的非特异性杀病毒因子，然后进行2倍梯度稀释(21、22、…、212)；
(3)感作：取100μL病毒液与等体积的不同稀释度血清混匀，37℃感作2h接种于贴壁2h的F81细胞中。
(4)对照：分别设置病毒对照、血清毒性对照、宿主对照及阳性和阴性对照，每组试验4个重复；
(5)将96孔细胞板于5％CO2培养箱中37℃培养3～5d并观察CPE，按Reed-Muench法计算血清中和效价。
2、结果
2.1 CPV分离鉴定
2.1.1病毒分离
将病料处理液接种于F81细胞，于37℃5％CO2培养48h后，细胞出现了明显皱缩，形成空泡结构(图1A)，培养72h后细胞碎裂，失去细胞形态，大量细胞成片状脱落(图1B)，96h细胞几乎已经脱落殆尽，仅有部分细胞碎片贴于瓶底部(图1C)，未接种病料的阴性细胞形态规则完整，呈柳叶状，紧密贴于瓶底部且长势良好(图1D)。
2.1.2 PCR鉴定
CPV疫苗株C-154、病料样品处理液及病料第五代细胞培养物DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经0.8％的琼脂糖电泳分析显示，在接近2000bp处出现单一条带，与预期的目的基因大小相符(图2)。测序结果显示：扩增片段全长1755bp(SEQ ID NO.1所示)，与GenBank中收录的CPV VP2基因序列(登录号JQ996152)比对核苷酸同源性为99.6％。
2.1.3血凝效价
将病料第五代细胞培养物与1％的新鲜猪红细胞悬液进行微量血凝试验，以能凝集50％红细胞的最高稀释倍数作为病毒凝集价，实验结果判定其凝集价为1:27。证明细胞培养物能凝集猪红细胞，具有犬细小病毒的凝集特性。
2.1.4电镜观察
将病料第五代细胞培养物感染F81细胞，取其细胞培养物离心上清液进行负染，观察可见病毒粒子。该病毒粒子无囊膜，圆形或六角形，呈立体对称结构，内径大小约为20～25nm，与CPV粒子的形态特征一致。
2.1.5间接免疫荧光鉴定
将病料第五代细胞培养物接种于F81细胞，待出现50％CPE时，以兔抗CPV多克隆抗体作为一抗进行IFA鉴定，荧光显微镜下可见接毒细胞呈绿色荧光(图3A)，未接毒细胞无荧光出现(图3B)，证明接毒细胞中存在犬细小病毒或其抗原成份。病料第五代细胞培养物经过PCR鉴定、血凝试验、电镜观察、间接免疫荧光试验，结果表明，分离到的病毒为CPV，命名为CPV-DN17-1。
2.2 CPV VP2基因的序列分析
2.2.1 CPV VP2基因克隆鉴定
将已构建的含有CPV VP2基因的Trans-T1/pMD-19T-vp2菌株进行PCR鉴定，结果显示接近2000bp处出现与预期片段相符的单一条带，克隆菌株构建成功。
2.2.2 CPV分离株VP2基因序列分析
测序结果显示，CPV-DN17-1的VP2基因全长1755bp，编码584个氨基酸。将CPV-DN17-1分别与疫苗株、国内分离株以及国外分离株分析核苷酸同源性分析，结果如图4所示：
CPV-DN17-1与疫苗株NL-35-D、C-154、CR86106、B114、C-780916进行比较，结果显示，核苷酸同源性为97.8％～99.2％，与NL-35-D疫苗株的同源性较高，与CR86106疫苗株的同源性较低。与哈尔滨分离株HRB-F8、HRB-e2、HRB-JB、CPV-HS(11)比较，分离株与HRB-F8、HRB-e2核苷酸同源性最高，可达99.8％，与CPV-HS(11)同源性较低为99.4％。与国内分离株YBYJ(延边)、CPV-S10(广东)、JL-13-1(吉林)、CPV/BJ015/07(北京)、04/09(长春)、Wh-1VP2(武汉)、CPV-S4(广州)、CPV-JS2(南京)、CPV-HS(哈尔滨)、YAZA4(四川)相比较，CPV-DN17-1与CPV-JS2(南京)株同源性最高，可达99.6％；与YAZA4(四川)株的同源性较低，只有98.7％。与国外分离株NY/LP62/08(USA)、CPV-159(Italy)、G362/97(Italy)、DH426(韩国)、LCPV-V139(日本)毒株相比较，CPV-DN17-1与DH426(韩国)株的同源性最高为99.4％，与NY/LP62/08(USA)、CPV-159(Italy)、G362/97(Italy)、LCPV-V139(日本)的同源性均为99.1％；CPV-DN17-1与其它种属的细小病毒CU-4(FPV)、H-1(PPV)、MPV-FL(MPV)、MEV-d(MEV)相比较，与CU-4(FPV)和MEV-d(MEV)的同源性较高为98.1％，与H-1(PPV)、MPV-FL(MPV)的同源性均较低。
为了分析CPV-DN17-1的遗传进化情况，本发明构建了CPV-DN17-1、疫苗株、哈尔滨分离株、国内外其它CPV分离株以及其它种属细小病毒系统进化树(图5)。分析结果表明，CPV-DN17-1与疫苗株和其它种属的细小病毒的亲缘关系较远，由此表明分离株不是由疫苗株进化而来的；同日本、美国、意大利毒株所处不同分支，亲缘关系较远，但与韩国分离株亲缘关系较近。与国内CPV分离株在一个独立大分支中，亲缘关系均比较近，其中与分离株HRB-F8(哈尔滨)属同一进化分支，与国内分离株JL-13-1(吉林)和CPV-JS2(南京)株的亲缘关系较近。
将CPV-DN17-1与疫苗株、哈尔滨分离株、国内其它分离株以及国外分离株进行氨基酸同源性分析。结果表明，与疫苗株NL-35-D、C-154、CR86106、B114、C-780916的氨基酸同源性为95.6％～98.8％，与疫苗株C-154的氨基酸同源性最高；与分离株HRB-e2(哈尔滨)的氨基酸同源性达到100％，与国内其他分离株的同源性为97.9％～99.5％；与国外分离株的氨基酸同源性为97.9％～99.0％(图6)。
2.2.3 CPV分离株亚型分析
将CPV-DN17-1与参考毒株的氨基酸序列进行比对分析(表1)，根据VP2蛋白中氨基酸的主要突变位点(即第87、297、300、324、426、440、555位氨基酸)，确定分离株的基因型。结果显示，CPV-DN17-1的VP2蛋白中，第87位氨基酸为甲硫氨酸(L)，297位氨基酸为丙氨酸(A)，第426位氨基酸为天冬酰胺(N)，由此可知，分离株病毒基因型为new CPV-2a型。
表1 VP2蛋白中氨基酸的突变位点分析
Figure BDA0001797911120000111
Figure BDA0001797911120000121
注：下划线部分表示CPV分型的主要氨基酸位点。
2.2.4抗原表位差异性分析
应用DVAStar Protein软件对CPV-DN17-1与疫苗株NL-35-D、C-154、CR86106、B114、C-780916主要抗原区进行比对分析，结合VP2氨基酸位点突变情况。结果表明，CPV-DN17-1与疫苗株主要有3个抗原位点差异性较大，经过氨基酸比对发现，分离株在第87位氨基酸(M87L)处与NL-35-D株、B114株、C-78091株存在差异，在第440位氨基酸(T440A)处与C-154株、CR86106株、B114株、C-780916株存在差异，在565位氨基酸(I565N)处与5株疫苗株之间均存在差异，此外在第2(S2G)、164(V164I)、267(F267Y)、324(I324Y)位氨基酸的突变，并没有引起抗原性的改变(表2)。
表2 CPV疫苗株VP2蛋白中氨基酸的突变位点分析
Figure BDA0001797911120000122
注：下划线部分表示氨基酸突变位点。
2.2.5 TCID50测定
测定CPV第五代细胞培养物的TCID50，经Reed-Muench法计算(表3)，结果表明CPV分离株CPV-DN17-1第五代细胞培养物的病毒滴度为103.6TCID50/0.1mL。
表3 TCID50测定表
Figure BDA0001797911120000131
2.2.6 CPV分离株中和效价检测
利用CPV第五代细胞培养物与4种疫苗株免疫犬血清进行中和试验，按Reed-Muench法计算中和效价，结果显示如下(表4)，疫苗株免疫血清可有效中和CPV分离株CPV-DN17-1，说明分离株与疫苗抗原差异性不显著。
表4免疫犬血清中和效价
疫苗株血清 NL-35-D C-154 B114 CR86106
中和效价 1:5000 1:512 1:625 1:1111
实施例2CPV VP2重组基因的克隆与表达
1方法
1.1引物设计及合成
结合DNAStar-Protein软件分析，以CPV分离株基因组DNA为模板，在VP2基因编码的主要抗原表位区设计两对引物sVP2-F1/R1和sVP2-F2/R2，引物5′端分别引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点(表5)，扩增两段截短VP2基因，命名为vp2-s1以及vp2-s2。
表5引物序列及产物长度
Figure BDA0001797911120000132
Figure BDA0001797911120000141
注：括号内为限制性内切酶；下划线内容为限制性内切酶酶切位点。
1.2 VP2重组基因的克隆
扩增目的基因：以CPV分离株基因组DNA为模板，分别以sVP2-F1/R1、sVP2-F2/R2为引物进行PCR扩增，反应体系及反应条件参照实施例1第1.2节。扩增产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳鉴定分析。
确定目的条带大小正确后，采用1％的琼脂糖凝胶电泳进行胶回收，在90V电压下电泳15min，在凝胶成像仪上切下目的条带。回收的两份PCR产物标记为VP2-S1、VP2-S2，分别连接pMD-19T-Simple Vector，转化Trans-T1感受态细胞，连接转化方法参考实施例1第1.6.1节。将PCR鉴定阳性克隆的菌株提取质粒，利用BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶对质粒进行单、双酶切鉴定，鉴定正确的重组菌命名为Trans-T1/pMD-vp2-s1、Trans-T1/pMD-vp2-s2，送哈尔滨新海生物技术有限公司测序。
1.3重组表达质粒的构建
将测序比对正确的Trans-T1/pMD-vp2-s1、Trans-T1/pMD-vp2-s2菌株扩大培养提取质粒，提取的质粒测定浓度后，使用BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶双酶切，回收产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定。质粒pGEX-6P-1同样进行双酶切操作，胶回收载体片段。载体片段分别与双酶切VP2-S1、VP2-S2片段连接转化。将连接产物与pGEX-6P-1空质粒分别转化至BL21感受态细胞中，构建BL21/pGEX-vp2-s1、BL21/pGEX-vp2-s2重组菌株，以及BL21/pGEX-6P-1空质粒重组菌。
1.4重组VP2蛋白的表达
将鉴定正确的重组菌BL21/pGEX-vp2-s1、BL21/pGEX-vp2-s2和空质粒重组菌BL21/pGEX-6P-1分别接种于3mL LB培养液(Amp+,100mg/L)中，37℃160r/min振荡培养过夜；按1:50接种于LB液体培养基(Amp+,100mg/L)中，37℃震荡培养至OD600nm为0.4～0.6时，加IPTG使其终浓度1mmol/L进行诱导表达，37℃震荡培养4h。将诱导前后菌体沉淀用PBS缓冲液重悬超声破碎，加入等体积的2×SDS上样缓冲液煮沸15min，12％SDS-PAGE电泳后，考马斯亮蓝染色鉴定蛋白表达情况。
1.5重组VP2蛋白的纯化
利用GST标签蛋白纯化试剂盒对重组蛋白进行纯化。
1.6重组VP2蛋白抗原性分析
将纯化后的重组蛋白分别进行SDS-PAGE电泳后，利用Western blot分析其抗原特异性，具体步骤如下：
(1)按照蛋白条带位置将凝胶进行裁剪，准备2份比凝胶稍大的厚滤纸，1份与凝胶等大的醋酸纤维膜(NC膜)，浸泡于转印缓冲液中；
(2)将厚滤纸①、凝胶、NC膜、厚滤纸②依次置于转印仪中，赶出气泡进行转印；
(3)转印条件：电流56mA，时间40min；
(4)将转印完毕的NC膜放置于提前配好封闭液中，摇床80r/min，室温封闭2h后，PBST洗5次，5min/次；
(5)孵育兔抗CPV阳性血清(1:500稀释)，4℃冰箱过夜后，PBST洗5次，5min/次；
(6)孵育二抗(1:5000稀释的HRP-山羊抗兔IgG)，室温置于水平摇床1h，PBST洗5次，5min/次；
(7)ECL化学发光显色(滴加后立即进行显色观察)。
1.7重组VP2蛋白免疫原性比较
(1)蛋白透析浓缩：将纯化的重组蛋白置于PBS缓冲液中，4℃透析，每2～3h换一次液，换液3次后，PEG2000浓缩至1mL。
(2)乳化蛋白：测定蛋白浓度，取1mg纯化蛋白与弗氏佐剂按1：1混合后乳化。
(3)免疫接种：将乳化后的重组蛋白以1mg/只蛋白剂量肌肉注射2月龄新西兰白兔。14d后将蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混匀乳化进行二免，剂量为1mg/只，间隔14d第三次免疫，免疫方法和剂量同二免。第三次免疫后7d，麻醉后自耳缘静脉采血并检测血清抗体效价，进行加强免疫。加强免疫后7d自心脏采血。收集的血液37℃静置2h后，4℃静置过夜，次日收集析出的血清，0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃保存备用。
(4)免疫抗体检测：采用本实验室已建立的血清抗体检测ELISA，每孔包被纯化重组蛋白200ng，4℃包被过夜；弃掉包被液，PBST洗3次，10min/次，加入200μL 5％脱脂乳封闭液于37℃温箱封闭2h；PBST洗3次，每孔加100μL一抗(待检血清由1:200开始进行2倍梯度稀释)于4℃温箱孵育8h；PBST洗3次，每孔加入100μL HRP标记的羊抗兔IgG(1:5000稀释)于37℃孵育1h；PBST洗3次，最后用TMB显色液室温避光显色，2mol/L H2SO4终止反应。用酶标仪检测各孔OD450nm值，并以P/N﹥2的最高稀释度为抗体滴度。
(5)中和试验(SN)：中和试验参考2.2.2.7方法，测定重组VP2蛋白免疫抗体对CPV分离株的中和效价，比较两种重组蛋白诱导中和抗体的能力，确定间接凝集试验的凝集原。
2结果
2.1扩增目的基因
以CPV-DN-17-1DNA为模板，以sVP2-F1/R1、sVP2-F2/R2为引物扩增VP2截短基因vp2-s1、vp2-s2，两种扩增产物在接近500bp上、下出现单一条带，与预期大小相符。
2.2克隆菌株鉴定
以构建的Trans-T1/pMD-vp2-s1和Trans-T1/pMD-vp2-s2菌株为模板，分别以sVP2-F1/R1、sVP2-F2/R2为引物，对克隆菌株进行PCR鉴定。结果显示，在接近500bp上、下出现单一条带，与预期片段相符。
阳性克隆质粒pMD-vp2-s1和pMD-vp2-s2经BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶单、双酶切后，结果显示，质粒pMD-vp2-s1经BamHⅠ或XhoⅠ单酶切后得到约3000bp片段，经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后分别得到接近3000bp和500bp以下的两条片段；质粒pMD-vp2-s2经BamHⅠ或XhoⅠ单酶切后在3000bp略高处得到单一片段，经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后分别得到接近3000bp和500bp的两条片段；以上所述片段与预期片段大小一致，单、双酶切鉴定结果正确，证明vp2-s1和vp2-s2基因已成功克隆至pMD-19T simple克隆载体中。
构建的Trans-T1/pMD-vp2-s1和Trans-T1/pMD-vp2-s2的菌株经测序分析，结果表明，克隆片段与CPV分离株CPV-DN17-1VP2基因核苷酸序列比对结果一致，同源性100％，vp2-s1和vp2-s2分别为383bp、518bp，表明基因克隆成功。
2.3重组CPV VP2质粒的构建及鉴定
以重组菌为BL21/pGEX-vp2-s1和BL21/pGEX-vp2-s2为模板，sVP2-F1/R1、sVP2-F2/R2为引物对重组菌进行PCR鉴定。结果显示，在接近500bp上、下出现特异性条带，于预期条带大小相符。
将重组质粒pGEX-vp2-s1和pGEX-vp2-s2进行BamHⅠ和XhoⅠ单、双酶切鉴定。结果显示，质粒pGEX-vp2-s1经BamHⅠ或XhoⅠ单酶切后得到约5000bp的片段，经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后分别得到约5000bp和接近500bp的两条特异性条带；质粒pGEX-vp2-s2经BamHⅠ或XhoⅠ单酶切后在略高于5000bp处出现单一条带，经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后分别得到约5000bp和500bp的两条带。单、双酶切鉴定条带均与预期大小相符，鉴定结果正确，证明vp2-s1和vp2-s2基因已成功克隆至pGEX-6p-1表达载体中。
2.4重组CPV VP2蛋白的表达
空载体重组菌BL21/pGEX-6P-1和重组菌BL21/pGEX-vp2-s1和BL21/pGEX-vp2-s2经IPTG诱导表达后，菌体进行超声处理，分别取沉淀和上清液进行SDS-PAGE电泳。结果显示，空载体重组菌BL21/pGEX-6P-1在约26kDa处正确表达与GST蛋白大小相符的蛋白，重组菌分别在40kDa和45kDa处大量表达且蛋白分子量大小与预期相符，菌体超声后上清中蛋白表达量较高，由此可见，重组CPV VP2蛋白均为可溶性表达(图7)。
2.5重组蛋白的纯化及鉴定
2.5.1重组蛋白的纯化
重组蛋白经GST标签蛋白纯化试剂盒进行纯化，纯化后的蛋白通过SDS-PAGE鉴定。结果显示，纯化蛋白目的条带单一，无杂带，蛋白纯化成功(图8)。
2.5.2重组蛋白抗原性的Western-blot分析
纯化后的重组蛋白以兔抗CPV阳性血清作为一抗，通过Western blot鉴定，结果显示，两种重组蛋白均与兔抗CPV抗体发生特异性反应，分别在40kDa和45kDa处出现特异性反应条带，阴性对照不与兔抗CPV抗体发生反应，没有反应条带出现(图9)。表明重组蛋白具有良好的免疫反应原性，命名为rVP2-S1和rVP2-S2。
2.6 CPV重组蛋白免疫原性比较
采集免疫重组蛋白rVP2-S1和rVP2-S2的新西兰大白兔血液，收集血清，利用间接ELISA检测其免疫抗体效价，结果显示，重组蛋白rVP2-S1诱导产生的抗体效价为1:12800；组蛋白rVP2-S2诱导产生的抗体效价为1:6400(图10)。
采集重组蛋白rVP2-S1和rVP2-S2免疫的新西兰大白兔血清，经体外中和试验检测，结果显示，rVP2-S1诱导机体产生的中和抗体效价为1：128(表6)；rVP2-S2诱导机体产生的中和抗体效价为1：54(表7)。根据重组蛋白诱导中和抗体的能力，本发明选取免疫原性较好的rVP2-S1作为致敏蛋白，用于建立CPV抗体检测间接凝集试验。编码rVP2-S1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
表6免疫重组蛋白VP2-S1的血清SN效价
Figure BDA0001797911120000181
表7免疫重组蛋白VP2-S2的血清SN效价
Figure BDA0001797911120000182
实施例3CPV抗体检测间接凝集试验的建立及应用
1方法
1.1用于检测犬细小病毒结构蛋白VP2抗体的致敏聚苯乙烯纳米微球的制备
将实施例2纯化的重组蛋白rVP2-S1(0.1～0.3mg/L)、醋酸缓冲液(pH4.0～5.0)、EDC和聚苯乙烯纳米微球(25～50μL)混匀后，室温(25℃)置于脱色摇床，100r/min摇2h。致敏后置于离心机8000r/min，离心15min，弃上清，加入1mL乙磺酸缓冲液(MES pH4.7)，充分悬起相同条件离心15min后弃上清，用500μL醋酸缓冲液重新悬起，4℃保存。
重组蛋白致敏微球条件优化：采用矩阵法，确定最佳的蛋白量、EDC的量以及缓冲液的类别。首先固定纳米微球的量为25μL(5％w/v)，缓冲液为醋酸缓冲液，蛋白量分别选择0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg；EDC质量分别选择0.015g、0.030g、0.045g，致敏微球后，与兔抗CPV阳性血清相作用，具体步骤：取干净的玻片滴加10μL PBS，10μL CPV待检血清，然后分别加入10μL致敏的彩色微球悬液，充分混匀后手动摇晃1～2min观察凝集现象。凝集程度判定：“++++”表示为100％微球凝集，颗粒大量聚集成团，液体完全透明；“+++”表示75％微球凝集，颗粒明显分散，液体稍浑浊；“++”表示50％微球凝集，颗粒小而密集，液体较浑浊；“+”表示25％微球凝集，液体浑浊；“-”液滴呈原有的均匀乳状，且不出现凝集。
根据凝集效果筛选最优的蛋白量和EDC混合比例。根据筛选结果，固定蛋白量和EDC量，微球的用量不变，分别选择醋酸缓冲液(pH5.0)、磷酸缓冲液(PBS)、乙磺酸缓冲液(MES)作为致敏微球缓冲液，通过比较致敏微球凝集效果，确定最佳的致敏缓冲液。
1.2间接凝集试验阳性判定标准的确立
使用Canine
Figure BDA0001797911120000191
试剂盒检测20只犬血清中CPV抗体水平，通过比色卡读出相应的抗体效价S，具体步骤如下：取5μL血清分别加入试剂盒A孔中，将测试板放入A孔反复抽动几次，至试剂完全混匀，室温静置5min；取出测试板按上述方法依次放入B孔，静置2min，C孔静置5min，D孔静置2min，E孔静置2min，F孔静置5min，测试板插回E孔2min；取出晾干10min，与比色卡比色，读出抗体效价S。
根据上述凝集试验的操作方法，利用本发明建立的间接凝集试验检测上述20份犬血清CPV抗体，通过试剂盒检测结果，标定本研究建立的间接凝集试验阳性结果判定标准，即具有保护作用血清出现的凝集现象。
1.3间接凝集试验特异性试验和敏感性试验
根据上述凝集试验的操作方法对本研究建立的间接凝集试验进行特异性试验。
特异性试验：取CDV阳性血清、CAV阳性血清、RABV阳性血清，以及兔抗CPV阳性血清，CPV阴性血清、PBS，分别与致敏的彩色微球相作用，检测间接凝集试验的特异性。
敏感性试验：将试剂盒检测结果S为0～7的血清，分别与致敏的彩色微球相作用，检测间接凝集试验的敏感性。
1.4间接凝集试验重复性及稳定性试验
根据上述凝集试验的操作方法对建立的间接凝集试验进行重复性及稳定性试验。
批内重复性试验：取同一批次制备的致敏彩色微球三份标记为A、B、C。用此3份微球分别与CPV阴性血清、兔抗CPV阳性血清、CDV阳性血清、CAV阳性血清、RABV阳性血清相作用，检测试验的特异性。
批间重复性试验：将3个批次制备的致敏微球对同一份CPV阴性血清、兔抗CPV阳性血清、CDV阳性血清、CAV阳性血清、RABV阳性血清进行凝集试验，观察其特异性。
稳定性试验：将4℃保存15d、30d、45d、60d、90d致敏彩色微球分别与CPV阴性血清、兔抗CPV阳性血清、CDV阳性血清、CAV阳性血清相作用，通过凝集效价检测间接凝集试验的稳定性。
1.5 CPV疫苗免疫犬血清抗体检测
根据凝集试验的操作方法，利用建立的间接凝集试验对4份CPV疫苗免疫犬血清进行检测，根据阳性判定标准，评价免疫犬CPV抗体水平。
利用CPV抗体检测试剂盒检测免疫犬血清抗体效价。通过试剂盒检测结果，评价本实验建立的间接凝集试验对于CPV疫苗株血清抗体的检测效果。
对4份疫苗免疫犬血清中和抗体效价检测结果，确定对CPV具有中和作用的血清抗体与凝集试验结果的关系。
1.6间接凝集试验对临床样品的检测
采集40份免疫犬血清样品，利用本发明建立的间接凝集试验和试剂盒对其进行检测，评估检测的准确性和符合率。
2结果
2.1重组蛋白致敏微球条件优化
利用矩阵法优化纳米微球致敏条件，固定微球量和缓冲液，优化致敏蛋白量和EDC最适比例，将致敏后的彩色微球与兔抗CPV阳性血清相作用，检测其凝集效果。结果显示，固定微球为25μL(5％w/v)，醋酸缓冲液(pH5.0)500μL时，致敏蛋白量为0.3mg，EDC为0.015g，凝集效果最佳(凝集程度判定如图11)，随着EDC含量增高，蛋白量增多都将引起致敏微球自凝(表8)。固定纳米微球、致敏蛋白量和EDC的量，优化致敏缓冲液。结果显示，使用醋酸缓冲液时，微球的凝集效果更好，而使用磷酸缓冲液和乙磺酸缓冲液则容易引起致敏微球自凝(表9)。
表8优化致敏蛋白与EDC的量
Figure BDA0001797911120000211
表9优化致敏缓冲液
缓冲溶液 磷酸缓冲液 乙磺酸缓冲液 醋酸缓冲液
凝集效果 自凝 自凝 ++++
2.2阳性判定标准的确立
将20份犬血清样本分别用CPV抗体检测试剂盒和本研究建立的间接凝集试验检测，纵坐标表示利用间接凝集试验检测的血清抗体凝集度，横坐标表示试剂盒检测的血清抗体效价值S(当S<3，判定为阴性，表示抗体水平不具备保护效力；S≥3时判定为阳性，即CPV抗体HI≥1:80；S≥5，具备高保护效力)。由图可知(图12)，当试剂盒检测效价值S≥3时，表示血清中的抗体水平是具备保护效力的，此时间接凝集试验的最低凝集价为“++”(能凝集50％微球的血清)。因此，间接凝集试验的阳性判定值为“++”。
2.3特异性试验和敏感性试验
将致敏后的彩色微球分别与CDV阳性血清、CAV阳性血清、RABV阳性血清、兔抗CPV阳性血清、CPV阴性血清以及PBS反应，结果显示，乳胶微球只与兔抗CPV阳性血清产生凝集，与PBS、犬阴性血清、CDV阳性血清、CAV阳性血清、RABV阳性血清均不产生凝集，表明该CPV抗体间接凝集试验特异性良好(图13)。
致敏后的彩色微球分别与试剂盒检测效价为0～7的血清反应，结果显示，当S<3时，致敏后的微球均未达到50％(++)的凝集，S≥3时，致敏后的微球均可达到50％(++)以上凝集，S≥5时，致敏后的微球可达到100％(++++)凝集效果(表10)，表明该CPV抗体间接凝集试验具有良好的敏感性。
表10敏感性试验
S值 0 1 2 3 4 5 6 7
凝集度 - - + ++ +++ ++++ ++++ ++++
2.4重复性及稳定性试验
批内重复性试验：随机挑选一批致敏彩色微球(编号：1104)，在其中取三份致敏微球标记为A、B、C，分别与兔抗CPV阳性血清、CPV阴性血清、CDV阳性血清以及CAV阳性血清进行凝集反应，结果表明，三份致敏的彩色微球均与兔抗CPV阳性血清反应，与CPV阴性血清、CDV阳性血清以及CAV阳性血清均无凝集反应，说明本研究建立的间接凝集试验具有良好的批内重复性。
批间重复性试验：随机选取1012、1015、1020三个批次的致敏纳米微球，分别与兔抗CPV阳性血清、CPV阴性血清、CDV阳性血清以及CAV阳性血清相作用。结果表明，三个批次的致敏彩色微球均与兔抗CPV阳性血清发生凝集反应，与CPV阴性血清、CDV阳性血清以及CAV阳性血清均无凝集反应，说明本研究建立的间接凝集试验具有良好的批间重复性。
保存稳定性试验：将保存于4℃的致敏彩色微球，分别在保存15d、30d、45d、60d、90d后取出与兔抗CPV阳性血清相作用，检测其稳定性。结果表明，保存15d、30d、45d、60d和90d的致敏彩色微球与兔抗CPV阳性血清均发生明显凝集。说明保存90d内的致敏彩色微球不影响检测结果(表11)。
表11稳定性试验
Figure BDA0001797911120000221
Figure BDA0001797911120000231
2.5免疫犬血清抗体检测
商品疫苗免疫犬血清分别进行中和试验、间接凝集试验、试剂盒检测，对三种检测结果进行比对分析，结果显示，三种方法检测结果呈正向相关，当试剂盒效价≥3(即HI≥1:80)时，凝集价均在1:2以上，中和效价为≥1:512(表12)，说明建立的间接凝集试验可以检测免疫犬的中和抗体，且对于CPV疫苗株血清检测效果良好。
表12免疫犬血清CPV抗体检测结果
Figure BDA0001797911120000232
2.6临床样品的检测
利用本发明建立的间接凝集试验对40份免疫犬血清样品检测结果显示，血清样品中的CPV抗体阳性为35份，阴性为5份。利用试剂盒进行样品检测，结果显示，血清样品中CPV抗体阳性为36份，阴性为4份，两者相比较符合率为97.5％(表13)。
表13间接凝集试验和试剂盒对样品的检测结果
Figure BDA0001797911120000233
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 用于检测犬细小病毒结构蛋白VP2抗体的致敏聚苯乙烯纳米微球及其制备方法和应用
<160>3
<170>Patent-In 3.5
<210>1
<211>1755
<212>DNA
<213> Canine parvovirus
<400>1
atgagtgatg gagcagttca accagacggt ggtcagcctg ctgtcagaaa tgaaagagct 60
acaggatctg ggaacgggtc tggaggcggg ggtggtggtg gttctggggg tgtggggatt 120
tctacgggta ctttcaataa tcagacggaa tttaaatttt tggaaaacgg atgggtggaa 180
atcacagcaa actcaagcag acttgtacat ttaaatatgc cagaaagtga aaattataga 240
agagtggttg taaataattt ggataaaact gcagttaatg gaaacatggc tttagatgat 300
acccatgcac aaattgtaac accttggtca ttggttgatg caaatgcttg gggagtttgg 360
tttaatccag gagattggca actaattgtt aatactatga gtgagttgca tttagttagt 420
tttgaacaag aaatttttaa tgttgtttta aagactgttt cagaatctgc tactcagcca 480
ccaactaaaa tttataataa tgatttaact gcatcattga tggttgcatt agatagtaat 540
aatactatgc catttactcc agcagctatg agatctgaga cattgggttt ttatccatgg 600
aaaccaacca taccaactcc atggagatat tattttcaat gggatagaac attaatacca 660
tctcatactg gaactagtgg cacaccaaca aatatatacc atggtacaga tccagatgat 720
gttcaatttt acactattga aaattctgtg ccagtacact tactaagaac aggtgatgaa 780
tttgctacag gaacatttta ttttgattgt aaaccatgta gactaacaca tacatggcaa 840
acaaatagag cattgggctt accaccattt ctaaattctt tgcctcaagc tgaaggaggt 900
actaactttg gttatatagg agttcaacaa gataaaagac gtggtgtaac tcaaatggga 960
aatacaaaca ttattactga agctactatt atgagaccag ctgaggttgg ttatagtgca 1020
ccatattatt cttttgaggc gtctacacaa gggccattta aaacacctat tgcagcagga 1080
cgggggggag cgcaaacaga tgaaaatcaa gcagcagatg gtgatccaag atatgcattt 1140
ggtagacaac atggtcaaaa aactaccaca acaggagaaa cacctgagag atttacatat 1200
atagcacatc aagatacagg aagatatcca gaaggagatt ggattcaaaa tattaacttt 1260
aaccttcctg taacaaatga taatgtattg ctaccaacag atccaattgg aggtaaagca 1320
ggaattaact atactaatat atttaatact tatggtcctt taactgcatt aaataatgta 1380
ccaccagttt atccaaatgg tcaaatttgg gataaagaat ttgatactga cttaaaacca 1440
agacttcatg taaatgcacc atttgtttgt caaaataatt gtcctggtca attatttgta 1500
aaagttgcgc ctaatttaac aaatgaatat gatcctgatg catctgctaa tatgtcaaga 1560
attgtaactt actcagattt ttggtggaaa ggtaaattag tatttaaagc taaactaaga 1620
gcctctcata cttggaatcc aattcaacaa atgagtatta atgtagataa ccaatttaac 1680
tatgtaccaa gtatcattgg aggtatgaaa attgtatatg aaaaatctca actagcacct 1740
agaaaattat attaa 1755
<210>2
<211>366
<212>DNA
<213> Canine parvovirus
<400>2
caaacagatg aaaatcaagc agcagatggt gatccaagat atgcatttgg tagacaacat 60
ggtcaaaaaa ctaccacaac aggagaaaca cctgagagat ttacatatat agcacatcaa 120
gatacaggaa gatatccaga aggagattgg attcaaaata ttaactttaa ccttcctgta 180
acaaatgata atgtattgct accaacagat ccaattggag gtaaagcagg aattaactat 240
actaatatat ttaatactta tggtccttta actgcattaa ataatgtacc accagtttat 300
ccaaatggtc aaatttggga taaagaattt gatactgact taaaaccaag acttcatgta 360
aatgca 366
<210>3
<211>122
<212>PRT
<213> Canine parvovirus
<400>3
Gln Thr Asp Glu Asn Gln Ala Ala Asp Gly Asp Pro Arg Tyr Ala Phe Gly Arg Gln His 20
Gly Gln Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu Thr Pro Glu Arg Phe Thr Tyr Ile Ala His Gln 40
Asp Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Gly Asp Trp Ile Gln Asn Ile Asn Phe Asn Leu Pro Val 60
Thr Asn Asp Asn Val Leu Leu Pro Thr Asp Pro Ile Gly Gly Lys Ala Gly Ile Asn Tyr 80
Thr Asn Ile Phe Asn Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala Leu Asn Asn Val Pro Pro Val Tyr 100
Pro Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys Glu Phe Asp Thr Asp Leu Lys Pro Arg Leu His Val 120
Asn Ala 122

Claims (10)

1.犬细小病毒重组VP2蛋白，其特征在于，所述的蛋白为犬细小病毒VP2蛋白的截短蛋白，位于犬细小病毒VP2蛋白的第365~486位，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.编码权利要求1所述的犬细小病毒重组VP2蛋白的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求2或3所述的核苷酸序列。
5.权利要求1所述的犬细小病毒重组VP2蛋白在制备检测犬细小病毒VP2抗体的试剂中的用途。
6.一种用于检测犬细小病毒结构蛋白VP2抗体的致敏聚苯乙烯纳米微球，其特征在于，在所述的致敏聚苯乙烯纳米微球的表面偶联有权利要求1所述的犬细小病毒重组VP2蛋白。
7.一种制备权利要求6所述的致敏聚苯乙烯纳米微球的方法，其特征在于，包括以下步骤：将纯化的权利要求1所述的犬细小病毒重组VP2蛋白、醋酸缓冲液、EDC和聚苯乙烯纳米微球混匀后，25℃下置于脱色摇床，100 r/min摇2 h；致敏后置于离心机离心，弃上清，加入乙磺酸缓冲液，充分悬起后离心弃上清，用醋酸缓冲液重新悬起，即得，4℃保存。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，各原料的用量是：纯化的浓度为0.3 mg/mL的犬细小病毒重组VP2蛋白液1mL，pH5.0的醋酸缓冲液500 μL，EDC 0.015 g，浓度为5% w/v的聚苯乙烯纳米微球为25 μL。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述的聚苯乙烯纳米微球为410 nm的彩色聚苯乙烯纳米微球。
10.权利要求6所述的致敏聚苯乙烯纳米微球在制备通过间接凝集反应检测犬细小病毒VP2抗体的试剂中的用途。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN112661818A (zh) * 2020-12-28 2021-04-16 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种犬猫细小病毒vp2350-420蛋白及其制备方法与应用
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Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
乳胶凝集试验快速检测副猪嗜血杆菌;曹芸等;《动物医学进展》;20091231;第8-13页 *
乳胶凝集试验快速检测肠出血性大肠杆菌0157：H7的研究;罗玲等;《中国家禽》;20170325;第49-52页 *
水貂肠炎细小病毒致病株的分离及VP2蛋白部分关键氨基酸位点的功能研究;毛亚萍;《中国博士学位论文全文数据库农业科技辑》;20160815;第77-78页 *
犬细小病毒 VP2 基因编码主要抗原表位区的核酸免疫及其免疫原性研究;吴植等;《中国预防兽医学报》;20150616;第473-476页 *
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