CN111551713A

CN111551713A - 一种covid-19病毒抗体检测微球及其制备方法和含该微球的试剂盒

Info

Publication number: CN111551713A
Application number: CN202010412022.4A
Authority: CN
Inventors: 马光辉; 王冰; 杨建国; 杜昱光; 张明程; 黄永东; 王琪; 夏宇飞; 朱玉山; 齐建成; 刘冬冬; 李恩成; 李颖; 王倬; 王双; 于龙河; 吴楠; 朱凯; 未金花; 闫雅璐
Original assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Current assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Priority date: 2020-05-15
Filing date: 2020-05-15
Publication date: 2020-08-18

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体公开了一种COVID‑19病毒抗体检测微球及其制备方法和含该微球的试剂盒，基于抗原抗体反应，利用纳米微球作为载体接上冠状病毒蛋白抗原，当交联有抗原的微球与抗体结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能，进而可以采用肉眼、手机、放大镜以及光镜等简单的仪器观察，根据雾面范围尺寸和黑点的相对占比，判断血清特异性抗体水平；同时，也可在全自动生化分析仪上检测，具有较高的检测灵敏度和特异性，适用于机场、火车站等关口的快速筛选，有利于产品的快速推广。

Description

一种COVID-19病毒抗体检测微球及其制备方法和含该微球的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种生物检测技术领域，具体涉及一种COVID-19病毒抗体检测微球及其制备方法和含该微球的试剂盒。

背景技术

新型冠状病毒肺炎-2019(COVID-19)是一种新发现的冠状病毒，其引起的这种新型肺炎疾病，发病快，传播速度快，若不及时诊断治疗，病死率非常高。鉴于 COVID-19病毒具有传染性强、传播迅速的特点，找到一种准确性高、低成本、操作方便的快速筛查诊断方法可以有效地控制疫情，避免巨大的人员物资的损耗与浪费。

目前，可以检测COVID-19的方法有：PCR基于核酸检测的PCR方法、ELISA 法以及胶体金免疫层析法等。其中，基于核酸检测的PCR方法虽然是临床的金标准，但是其取样复杂(咽试纸)，需要专业医护人员，且检测时间长，不适用于在高速公路、机场、火车站等关口设置的快速筛查方法。ELISA法虽然敏感性和特异性很好，但是，操作复杂，而且测试时间长，完成全部试验需要2～4个小时以上。而胶体金免疫层析法操作简单、检测时间短，但准确度不高，检测范围窄，而且所选用的试剂(酶联IgM二抗、酶联IgG二抗等)造价较高。

中国专利CN1661372A公开了一种用于检测SARS抗体的免疫微球及其制备方法和用途。该免疫微球是以表面有羧基修饰的聚苯乙烯微球为内核，其表面的羧基通过多聚赖氨酸化学偶联了作为抗原的SARS冠状病毒S、N、M或E蛋白。但该专利在聚苯乙烯微球制备过程中，由于聚苯乙烯微球中的羧基含量低(可用于活化、偶联的位点少)、疏水性强、非特异性吸附高。为解决微球的亲水差和偶联位点少的，在后续抗原偶联过程中，需要额外引入亲水性和富含氨基的多聚赖氨酸，造成操作步骤多、时间长、偶联效率低的问题。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供基于微球技术的新型冠状病毒 (COVID-19)抗体检测微球及含该微球的试剂盒，该检测试剂盒具有较高的检测灵敏度和特异性，稳定性好，操作简单，反应时间短；可适用于肉眼观察、手机拍照、全自动生化分析仪等多种检测方式。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种COVID-19病毒抗体检测微球，所述检测微球为高分子纳米颗粒表面的羧基上偶联COVID-19病毒重组抗原。

优选地，所述COVID-19病毒重组抗原为COVID-19病毒重组S蛋白、COVID-19 病毒重组N蛋白、COVID-19病毒重组M蛋白和COVID-19病毒重组E蛋白中的一种或几种。

优选地，所述高分子纳米颗粒，其粒径为100～300纳米；所述高分子纳米颗粒为含羧基的高分子纳米颗粒或含环氧基的高分子纳米颗粒；

所述含羧基的高分子纳米颗粒，以甲基丙烯酸和/或丙烯酸为单体，与苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和甲基丙烯酸羟乙酯的一种或多种共聚；

所述含环氧基的高分子纳米颗粒，以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体得到的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米颗粒，或以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体与苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸和丙烯酸的一种或多种共聚。

更具体地，所述高分子纳米颗粒所采用的高分子选自聚苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸(PST-MMA-MAA)、聚苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸缩水甘油酯 (PST-MMA-GMA)、聚苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸羟乙酯 (PST-MMA-HEMA)、聚苯乙烯-甲基丙烯酸羟乙酯-甲基丙烯酸(PST-HEMA-MAA)、聚苯乙烯-甲基丙烯酸(PST-MAA)、聚苯乙烯-甲基丙烯酸缩水甘油酯(PST-GMA)、聚苯乙烯-甲基丙烯酸羟乙酯(PST-HEMA)、聚甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸 (PMMA-MAA)、聚甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸缩水甘油酯(PMMA-GMA)和聚甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸羟乙酯(PMMA-HEMA)中的一种或几种。

本发明还提供了上述COVID-19病毒抗体检测微球的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

1)高分子纳米颗粒加入NHS进行羧基的活化；

2)加入COVID-19病毒重组抗原进行偶联反应；

3)加入BSA进行封闭，室温下垂直混合，离心，重悬，分散，加入含稳定剂和防腐剂的缓冲溶液即得COVID-19病毒抗体检测微球。

具体地，当针对含羧基的高分子纳米颗粒时，上述COVID-19病毒抗体检测微球的制备方法包括以下步骤：

1)含羧基的高分子纳米颗粒加入NHS或碳二亚胺进行羧基的活化；

2)加入COVID-19病毒重组抗原进行偶联反应；

3)加入BSA进行封闭，室温下垂直混合，离心，重悬，分散，加入含稳定剂和防腐剂的缓冲液即得COVID-19病毒抗体检测微球。

优选地，步骤1)中，活化温度4-37℃，活化时间10min～12h；步骤2)中，偶联反应温度4-37℃，偶联反应时间1～24h；步骤3)中，所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液和巴比妥酸-盐酸缓冲液中的一种或多种；缓冲液的浓度为0.005～0.05mol/L；pH为6.0～8.0。

进一步优选地，采用NHS进行羧基活化时，步骤1)中，活化温度4-30℃，活化时间10～30min。步骤2)中，偶联反应温度4-30℃，偶联反应时间1～10h。

进一步优选地，采用碳二亚胺进行羧基活化时，步骤1)中，活化温度4-37℃，活化时间2-12h；步骤2)中，偶联反应温度4-37℃，偶联反应时间4-24h。

优选地，所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液和巴比妥酸-盐酸缓冲液中的一种或多种；缓冲液的浓度为0.005～0.05mol/L；pH为6.0～8.0。

当针对含环氧基的高分子纳米颗粒时，上述COVID-19病毒抗体检测微球的制备方法包括以下步骤：

1)含环氧基的的高分子纳米颗粒加入COVID-19病毒重组抗原进行偶联反应；

2)加入BSA进行封闭，室温下垂直混合，离心，重悬，分散，加入含稳定剂和防腐剂的缓冲液即得COVID-19病毒抗体检测微球。

优选地，步骤1)中，偶联反应温度4-37℃，偶联反应时间4～48h；步骤2) 中，所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液和巴比妥酸-盐酸缓冲液中的一种或多种；缓冲液的浓度为0.005～0.05mol/L；pH为6.0～8.0。

本发明中，优选地，所述稳定剂选自小牛血清、BSA、脱脂乳、明胶、蔗糖、甘油中的一种或多种；所述稳定剂的质量百分比浓度为0.5～20％。

本发明中，优选地，所述防腐剂选自叠氮化钠、苯酚、Proclin、对羟基苯甲酸中的一种或多种；所述防腐剂的质量百分比浓度为0.005-1％。

本发明进一步提供了一种COVID-19病毒抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的COVID-19病毒抗体检测微球。

本发明提供的一种新型冠状病毒(COVID-19)抗体检测试剂盒，其主要成分是抗体检测微球试剂，包含COVID-19病毒重组抗原修饰的纳微米颗粒、pH 6.0～8.0 的缓冲液、稳定剂和防腐剂。

在上述方案的基础上，所述的抗体检测微球试剂为COVID-19病毒重组蛋白修饰的纳微米颗粒(高分子纳米颗粒)；

优选地，纳微米颗粒可以由多种原料制备，优选聚苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸(PST-MMA-MAA)、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸 (PGMA-MMA-MAA)、聚甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸(PMMA-MAA)、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)中一种或两种的组合。

优选地，所使用的COVID-19病毒重组抗原蛋白可以是COVID-19新型冠状病毒的重组N蛋白。

优选地，COVID-19病毒抗体检测微球的制备方法所制备终产品中重组蛋白的浓度为0.025～2.0mg/mL。

在上述方案的基础上，所述的抗体检测微球试剂由以下方法制备而成：

步骤1)采用全基因合成技术合成COVID-19病毒N蛋白基因序列，内切酶消化后连入pET30a质粒(Nova gen)，并转化BL21感受态(DE3)宿主菌，培养后采用超声或高压均质的方法破碎细胞，将细胞上清进行离子交换层析和金属螯合层析进行纯化并鉴定，得到COVID-19的重组N蛋白。

优选地，破碎细胞为在冰水浴中进行超声破碎(30min，超声3s/停3s，30％功率)。

优选地，采用金属螯合层析的方式进行蛋白纯化。

步骤2)取15～60mg/mL的高分子纳米球，按一定比例加入N蛋白，以NHS 活化、环氧活化、碳二亚胺活化等方式连接N蛋白与纳米球；

优选地，采用NHS反应对纳米微球表面的羧基在4-30℃下进行10～30min的活化，然后与蛋白在4～30℃下进行1～10h的偶联反应，将蛋白偶联到微球上。

优选地，COVID-19的重组N蛋白加样终浓度为0.025～2.0mg/mL。

优选地，利用NHS/EDC反应的高反应活性，通过蛋白上的氨基将蛋白偶联到微球上。

步骤3)反应后收集上清，采用Bradford法测定上清液中未反应的蛋白浓度，计算偶联到纳米微球上的N蛋白量。

步骤4)加入1-10mL浓度为0.5～10mg/mL BSA到微球溶液中封闭微球上残留的未反应基团，室温下垂直混合过夜。

步骤5)采用离心的方式将免疫微球离心，去除上清液；用缓冲液重悬和离心；将免疫微球用缓冲液重悬，并用200～600W超声波处理20s分散微球，得到检测微球，随后加入稳定剂和防腐剂。

在上述方案的基础上，新型冠状病毒(COVID-19)抗体检测试剂盒中，所述的抗体检测微球试剂可以采用预铺板试剂盒的方式进行检测，即将抗体检测微球试剂涂布在基底材质上，包装成型，随后进行检测。

其制备步骤如下：

步骤1)将抗体检测微球试剂滴于洁净的玻片或透明塑料片上；

步骤2)在适当干燥条件下干燥。

优选地，所述适当干燥条件可以包括：室温环境自然干燥5～10min，37℃下干燥2～5min，减压干燥2～5min(0.5～2.6kPa)；

在上述方案的基础上，新型冠状病毒(COVID-19)抗体检测试剂盒中，所述的缓冲液包括PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、巴比妥酸-盐酸缓冲液的一种或多种组合；

优选地，所述缓冲液为0.005～0.05M浓度的PBS缓冲液；

优选地，所述缓冲液的pH为6.0～8.0；

在上述方案的基础上，新型冠状病毒(COVID-19)抗体检测试剂盒中，所述的稳定剂包括小牛血清、BSA、脱脂乳、明胶、蔗糖、甘油中的一种或多种组合；

优选地，所述稳定剂为5～50mL的质量百分比浓度0.5～10％BSA溶液、质量百分比浓度1～20％甘油溶液、质量百分比浓度10～20％蔗糖中的一种或几种组合；

在上述方案的基础上，新型冠状病毒(COVID-19)抗体检测试剂盒中，所述的防腐剂包括叠氮化钠、苯酚、Proclin、对羟基苯甲酸中的一种或多种组合；

优选地，所述防腐剂为质量百分比浓度0.005-0.01％NaN₃、质量百分比浓度 0.1-0.5％Proclin 300；0.1％-1％对羟基苯甲酸一种或多种组合；

本发明的新型冠状病毒(COVID-19)抗体检测试剂盒的检测方式为：

采用预铺板试剂盒进行检测，即将抗体检测微球试剂涂布在基底材质上，包装成型，随后进行检测；

步骤1)铺板：将抗体检测微球试剂滴于洁净的玻片或透明塑料片上；优选地，铺板加取抗体检测微球试剂量为0.5～2μL；

步骤2)首次干燥；优选地，在室温下干燥5～10min，或在37℃下干燥2～5min；

步骤3)点样；优选地，将被测血清样品滴在干燥好的铺板表面，点样量为0.5～ 2μL；

步骤4)再次干燥，优选地，在室温下干燥5～20min，或在37℃下干燥5～10 min；

步骤5)采用适当的检测方式进行观察，记录阴性与阳性。优选地，适当的检测方式可以包括：肉眼、手机显微镜、放大镜和光镜一种或几种的组合。

本发明的试剂盒抗体阳性率检测可以基于乳胶增强比浊法，以全自动生化分析仪、特种蛋白仪及分光光度计检测，其具体步骤为：

步骤1)稀释：将抗体检测微球试剂稀释20～500倍，加入到生化分析仪储存瓶中；

步骤2)加样：将10μL～200μL血清加入到样品管中；

步骤3)设置参数：将抗体检测试剂与待测血清按照1:10～3:7之间的比例进行混合加样设置；

步骤4)以检测数值进行分析。

试剂盒抗体阳性率检测可以选用肉眼观察、光镜观察或全自动生化分析仪及分光光度仪一种或几种的组合。

本发明检测结果可以区分COVID-19抗体的阴性和阳性；优选地，其检测结果可以给出COVID-19抗体的强阳性、中阳性、弱阳性和阴性。

本发明是基于抗原抗体反应，利用纳米微球作为载体接上冠状病毒N蛋白抗原，当交联有抗原的微球与抗体结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能。在载玻片或者其他透明基底下，微球与待测血清中综合抗体的结合，可以产生雾面或者黑点(透光性差的区域)，可以采用肉眼、手机、放大镜以及光镜等简单的仪器观察，根据雾面范围尺寸和黑点(透光性差的区域)的相对占比，省去了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力，判断弱阳性、强阳性、中阳性和阴性。适用于简单、低成本、快速的筛查方法。

另一方面，在均相的溶剂中，本发明的微球与待测样品中综合抗体(IgM和IgG 等)结合引发的聚集，引起了反应液散光性能或透光性能(即吸光度)的改变，其与被测抗体浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗体浓度。与全自动生化分析仪、蛋白分析仪和免疫比浊技术的联合使用，可以得到半定量的抗体浓度结果。

本发明采用COVID-19病毒重组抗原；微球采用了亲水性更好、羧基含量更高的聚苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸(PST-MMA-MAA)等微球，有利于简化后续的抗原偶联操作；抗原偶联优选采用NHS活化偶联技术，比EDC活化偶联技术的步骤少(仅3步)、时间短(小于12h)、偶联效率更高(大于95％)；结果判定上采用肉眼、手机、放大镜以及光镜等简单的仪器观察，也可以在全自动生化分析仪上检测。

与现有技术相比，本发明有益效果为：

1)本发明试剂盒具有较高的检测灵敏度和特异性，稳定性好，操作简单；

2)本发明试剂盒反应快速，时间只需数分钟，省时省力，避免了酶联免疫诊断试剂盒需要数小时的费时的缺点，适用于快速筛选试剂；

3)本发明试剂盒可以肉眼检测、手机拍照、放大镜、光镜等方式的直接观察，，不需要任何仪器设备，有利于产品的快速推广，适用于机场、火车站等关口的快速筛选，适合广大基层卫生防疫单位使用；

4)本发明试剂盒可以适用于全自动生化分析仪得到半定量数据，可以临床实时表征患者病情和康复情况，满足针对COVID-19抗体的多种检测需求；

5)该方法不需要预处理样本，操作简便、准确可靠、重复性好，可用于全自动生化分析仪、特种蛋白仪及分光光度计上使用。

6)本发明操作简单，避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，提升检测稳定性和重复性；

7)本发明的抗体检测微球试剂借助纳微米颗粒的聚集，放大了抗体与重组蛋白的结合的光学信号，解决了抗原抗体反应临床检测的线性范围窄，干扰因素多，实验稳定性差等问题。

附图说明

图1实施例1中N蛋白的SDS-PAGE电泳图；

图2实施例1中抗体检测微球试剂电镜图；

图3实施例2中试剂盒检测血清中COVID-19特异性抗体的存在；

图4实施例2中试剂盒检测强阳性结果示例图(+++)；

图5实施例2中试剂盒检测中阳性结果示例图(++)；

图6实施例2中试剂盒检测弱阳性示例图(+)；

图7实施例2中试剂盒检测阴性示例图(-)；

图8实施例2中标准抗体检测试剂盒灵敏度(检出限)；

图9实施例2中标准抗体交叉反应结果图；

图10实施例3中200个COVID-19阳性病例微球检测结果；

图11实施例3中200个COVID-19阳性病例各年龄段微球检测结果统计。

具体实施方式

本说明书中公开得任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或者类似特征中的一个例子而已。所述仅仅是为了帮助理解本发明，不应该视为对本发明的具体限制。

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。本发明为一种新型冠状病毒(COVID-19)抗体检测试剂盒，其主要成分是抗体检测微球试剂，包含COVID-19病毒重组抗原修饰的纳微米颗粒、pH 6.0～8.0的缓冲液、稳定剂和防腐剂，其具体实施例如下：

实施例1 COVID-19重组蛋白抗原制备

1.COVID-19重组蛋白抗原的构建：

1.1COVID-19重组蛋白的氨基酸序列如下：

(1)N蛋白：

MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFT ALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRW YFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQ GTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVT QAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTP SGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQA LPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA，共有419个氨基酸，该蛋白的等电点是pH 10.0；

(2)S蛋白：

MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLP FFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSK TQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTF EYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALE PLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNE NGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFG EVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNV YADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYN YLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQ PYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPF QQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTE VPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQ TQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKT SVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIY KTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAA RDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQM AYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDI；

(3)M蛋白：

MADSNGTITVEELKKLLEQWNLVIGFLFLTWICLLQFAYANRNRFLYIIKLIFLWLL WPVTLACFVLAAVYRINWITGGIAIAMACLVGLMWLSYFIASFRLFARTRSMWSF NPETNILLNVPLHGTILTRPLLESELVIGAVILRGHLRIAGHHLGRCDIKDLPKEITVA TSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYSRYRIGNYKLNTDHSSSSDNIALLVQ；

(4)E蛋白：

MYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCCNIVNVSLVKPSFYVYSRVKNLNSSRVPDLLV；

1.2COVID-19重组蛋白的基因克隆、载体构建、表达和纯化：

利用标准的基因重组技术克隆基因，构建表达载体，转化大肠杆菌，表达和纯化抗原。首先采用全基因合成技术，合成COVID-19病毒重组蛋白抗原基因序列，以Nde I和Sal I内切酶消化后回收，插入经Nde I和Xho I内切酶消化的pET30a质粒(Nova gen)，16℃连接后转化BL21感受态(DE3)宿主菌，常规卡那霉素固体培养基37℃培养后，挑选表达菌株。大量表达后进行纯化。纯化后的蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定抗原纯度，抗原纯度在95％以上(其中，N蛋白的凝胶电泳如图1所示)。

实施例2羧基纳米微球制备

将装有3200mL超纯水的反应釜放入水浴锅中，向反应釜中通入氮气，然后将水浴锅升温至70-90℃并进行搅拌。向反应釜中依次加入过硫酸铵和甲基丙烯酸单体，与苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和甲基丙烯酸羟乙酯的一种或多种共聚。反应结束后降温至室温，出料，制备得到粒径100～300nm的微球。根据固含量(每毫升微球溶液中微球的质量)测定结果，采用旋蒸浓缩方式将纳米微球固含量提高到目标值(15～60mg/mL)。

实施例3环氧基纳米微球制备

将装有3200mL超纯水的反应釜放入水浴锅中，向反应釜中通入氮气，然后将水浴锅升温至70-90℃并进行搅拌。向反应釜中依次加入过硫酸铵，以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体聚合得到聚甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米颗粒，或以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体，与苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羟乙酯和甲基丙烯酸的一种或多种共聚。反应结束后降温至室温，出料，制备得到粒径100～300nm的微球。根据固含量(每毫升微球溶液中微球的质量)测定结果，采用旋蒸浓缩方式将纳米微球固含量提高到目标值(15～60mg/mL)。

实施例4 COVID-19病毒重组N蛋白修饰的PST-MMA-MAA纳微米颗粒的制备

取10mL(15mg/mL固含量)实施例2中制备的PST-MMA-MAA纳米微球，依次加入浓度为200mM的NHS，于4℃下垂直混合反应30min。反应结束后，采用离心的方式进行固液分离，去除上清液，收集离心沉淀；用MES缓冲溶液补足至 10mL，超声破碎分散，得到活化的纳米微球。

往10mL活化的纳米微球溶液中加入10mL浓度为2.0mg/mL的N蛋白。4℃ 下反应12h；反应后收集上清，采用Bradford法测定上清液中未反应的蛋白浓度，计算偶联到每毫升纳微颗粒上的N蛋白量为2.0mg(偶联率为100％)。

加入1mL浓度为10mg/mL的BSA到纳微颗粒溶液中封闭表面上残留的NHS 基团，室温下垂直混合过夜。

采用离心的方式将重组蛋白修饰的纳微米颗粒离心，去除上清液；依次用10mL 含1％BSA的PBS溶液、5％甘油的PBS溶液超声分散、清洗；将重组N蛋白修饰的纳微米颗粒用10mL含有稳定剂(0.5％小牛血清)和防腐剂(0.1％叠氮化钠)的 PBS缓冲液(0.05M，pH6.0)重悬，并用200-600W超声波处理1min分散微球，得到抗体检测微球试剂。微球的电镜图如图2所示，从图2可以看出，微球粒径均一、分散性良好。

实施例5 COVID-19病毒重组S蛋白修饰的PST-HEMA-MAA纳微米颗粒的制备

取10mL(60mg/mL固含量)实施例2中制备的PST-HEMA-MAA纳米微球，依次加入浓度为100mM的NHS，于30℃下垂直混合反应10min。反应结束后，采用离心的方式进行固液分离，去除上清液，收集离心沉淀；用MES缓冲溶液补足至 10mL，超声破碎分散，得到活化的纳米微球。

往10mL活化的纳米微球溶液中加入20mL浓度为0.025mg/mL的S蛋白。30℃ 下反应1h；反应后收集上清，采用Bradford法测定上清液中未反应的蛋白浓度，计算偶联到每毫升纳微颗粒上的S蛋白量为0.0475mg(偶联率为95％)。

加入5mL浓度为5mg/mL的BSA到纳微颗粒溶液中封闭表面上残留的NHS 基团，室温下垂直混合过夜。

采用离心的方式将重组蛋白修饰的纳微米颗粒离心，去除上清液；依次用10mL 含1％BSA的PBS溶液、5％甘油的PBS溶液超声分散、清洗；将重组S蛋白修饰的纳微米颗粒用10mL含有稳定剂(20％BSA)和防腐剂(1％苯酚)的Tris-HCl缓冲液(0.05M，pH 8.0)重悬，并用200-600W超声波处理1min分散微球，得到抗体检测微球试剂。

实施例6 COVID-19病毒重组M蛋白修饰的PST-MMA-MAA纳微米颗粒的制备

取10mL(30mg/mL固含量)实施例2中制备的PST-MMA-MAA纳米微球，依次加入浓度为20mM的NHS，于15℃下垂直混合反应20min。反应结束后，采用离心的方式进行固液分离，去除上清液，收集离心沉淀；用MES缓冲溶液补足至 10mL，超声破碎分散，得到活化的纳米微球。

往10mL活化的纳米微球溶液中加入0.5mL浓度为1.0mg/mL的M蛋白。15℃ 下反应6h；反应后收集上清，采用Bradford法测定上清液中未反应的蛋白浓度，计算偶联到每毫升纳微颗粒上的M蛋白量为0.05mg(偶联率为100％)。

加入10mL浓度为0.5mg/mL的BSA到纳微颗粒溶液中封闭表面上残留的NHS 基团，室温下垂直混合过夜。

采用离心的方式将重组蛋白修饰的纳微米颗粒离心，去除上清液；依次用10mL 含1％BSA的PBS溶液、5％甘油的PBS溶液超声分散、清洗；将重组M蛋白修饰的纳微米颗粒用10mL含有稳定剂(5％脱脂乳)和防腐剂(0.05％Proclin)的硼砂 -硼酸缓冲液(0.005M，pH7.0)重悬，并用200-600W超声波处理1min分散微球，得到抗体检测微球试剂。

实施例7 COVID-19病毒重组E蛋白修饰的PHEMA-MAA纳微米颗粒的制备

取10mL(15mg/mL固含量)实施例2中制备的PHEMA-MAA纳米微球，加入碳二亚胺，于4℃下垂直混合反应12h。反应结束后，采用离心的方式进行固液分离，去除上清液，收集离心沉淀；用磷酸缓冲液补足至10mL，超声破碎分散，得到活化的纳米微球。

往10mL活化的纳米微球溶液中加入20mL浓度为0.5mg/mL的E蛋白。4℃下反应24h；反应后收集上清，采用Bradford法测定上清液中未反应的蛋白浓度，计算偶联到每毫升纳微颗粒上的E蛋白量为0.75mg(偶联率为75％)。

加入2mL浓度为10mg/mL的BSA到纳微颗粒溶液中封闭表面上残留的活化基团，室温下垂直混合过夜。

采用离心的方式将重组蛋白修饰的纳微米颗粒离心，去除上清液；依次用10mL 含1％BSA的PBS溶液、5％甘油的PBS溶液超声分散、清洗；将重组E蛋白修饰的纳微米颗粒用10mL含有稳定剂(5％明胶)和防腐剂(0.1％对羟基苯甲酸)的巴比妥酸缓冲液(0.02M，pH7.0)重悬，并用200-600W超声波处理1min分散微球，得到抗体检测微球试剂。

实施例8 COVID-19病毒重组N蛋白修饰的PHEMA-MMA-MAA纳微米颗粒的制备

取10mL(45mg/mL固含量)实施例2中制备的PHEMA-MMA-MAA纳米微球，加入碳二亚胺，于37℃下垂直混合反应2h。反应结束后，采用离心的方式进行固液分离，去除上清液，收集离心沉淀；用磷酸缓冲液补足至10mL，超声破碎分散，得到活化的纳米微球。

往10mL活化的纳米微球溶液中加入10mL浓度为2mg/mL的N蛋白。37℃下反应4h；反应后收集上清，采用Bradford法测定上清液中未反应的蛋白浓度，计算偶联到每毫升纳微颗粒上的N蛋白量为1.2mg(偶联率为60％)。

加入5mL浓度为5mg/mL的BSA到纳微颗粒溶液中封闭表面上残留的活化基团，室温下垂直混合过夜。

采用离心的方式将重组蛋白修饰的纳微米颗粒离心，去除上清液；依次用10mL 含1％BSA的PBS溶液、5％甘油的PBS溶液超声分散、清洗；将重组N蛋白修饰的纳微米颗粒用10mL含有稳定剂(5％蔗糖)和防腐剂(0.05％叠氮化钠)的PBS 缓冲液(0.05M，pH 6.0)重悬，并用200-600W超声波处理1min分散微球，得到抗体检测微球试剂。

实施例9 COVID-19病毒重组S蛋白修饰的PST-MMA-AA纳微米颗粒的制备

取10mL(15mg/mL固含量)实施例2中制备的PST-MMA-AA纳米微球，加入碳二亚胺，于20℃下垂直混合反应6h。反应结束后，采用离心的方式进行固液分离，去除上清液，收集离心沉淀；用磷酸缓冲液补足至10mL，超声破碎分散，得到活化的纳米微球。

往10mL活化的纳米微球溶液中加入1mL浓度为2.0mg/mL的S蛋白。20℃下反应12h；反应后收集上清，采用Bradford法测定上清液中未反应的蛋白浓度，计算偶联到每毫升纳微颗粒上的S蛋白量为0.138mg(偶联率为69％)。

加入10mL浓度为1mg/mL的BSA到纳微颗粒溶液中封闭表面上残留的活化基团，室温下垂直混合过夜。

采用离心的方式将重组蛋白修饰的纳微米颗粒离心，去除上清液；依次用10mL 含1％BSA的PBS溶液、5％甘油的PBS溶液超声分散、清洗；将重组S蛋白修饰的纳微米颗粒用10mL含有稳定剂(10％甘油)和防腐剂(0.05％叠氮化钠)的PBS 缓冲液(0.02M，pH 7.0)重悬，并用200-600W超声波处理1min分散微球，得到抗体检测微球试剂。

实施例10 COVID-19病毒重组N蛋白修饰的PGMA纳微米颗粒的制备

取10mL(45mg/mL固含量)实施例2中制备的PGMA纳米微球，用0.1M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH 10.5)置换缓冲液体系，并补足至10mL。

往10mL含环氧基的纳米微球溶液中加入10mL浓度为1.0mg/mL的N蛋白。 4℃下反应48h；反应后收集上清，采用Bradford法测定上清液中未反应的蛋白浓度，计算偶联到每毫升纳微颗粒上的N蛋白量为0.72mg(偶联率为72％)。

加入10mL浓度为1mg/mL的BSA到纳微颗粒溶液中封闭表面上残留的环氧基，室温下垂直混合过夜。

采用离心的方式将重组蛋白修饰的纳微米颗粒离心，去除上清液；依次用10mL 含1％BSA的PBS溶液、5％甘油的PBS溶液超声分散、清洗；将重组N蛋白修饰的纳微米颗粒用10mL含有稳定剂(2％BSA)和防腐剂(0.1％叠氮化钠)的Tris-HCl 缓冲液(0.05M，pH 8.0)重悬，并用200-600W超声波处理1min分散微球，得到抗体检测微球试剂。

实施例11 COVID-19病毒重组S蛋白修饰的PGMA-ST-MAA纳微米颗粒的制备

取10mL(30mg/mL固含量)实施例2中制备的PGMA-ST-MAA纳米微球，用 0.1M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH 10.5)置换缓冲液体系，并补足至10mL。

往10mL含环氧基的纳米微球溶液中加入20mL浓度为0.05mg/mL的S蛋白。 37℃下反应4h；反应后收集上清，采用Bradford法测定上清液中未反应的蛋白浓度，计算偶联到每毫升纳微颗粒上的S蛋白量为0.052mg(偶联率为52％)。

加入5mL浓度为3mg/mL的BSA到纳微颗粒溶液中封闭表面上残留的环氧基，室温下垂直混合过夜。

采用离心的方式将重组蛋白修饰的纳微米颗粒离心，去除上清液；依次用10mL 含1％BSA的PBS溶液、5％甘油的PBS溶液超声分散、清洗；将重组S蛋白修饰的纳微米颗粒用10mL含有稳定剂(5％甘油)和防腐剂(0.5％苯酚)的PBS缓冲液 (0.05M，pH 8.0)重悬，并用200-600W超声波处理1min分散微球，得到抗体检测微球试剂。

实施例12 COVID-19病毒重组N蛋白修饰的PGMA-HEMA-AA纳微米颗粒的制备

取10mL(60mg/mL固含量)实施例2中制备的PGMA-HEMA-AA纳米微球，用0.1M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH 10.5)置换缓冲液体系，并补足至10mL。

往10mL含环氧基的纳米微球溶液中加入5mL浓度为1.0mg/mL的N蛋白。 20℃下反应24h；反应后收集上清，采用Bradford法测定上清液中未反应的蛋白浓度，计算偶联到每毫升纳微颗粒上的N蛋白量为0.32mg(偶联率为64％)。

往10mL活化的纳米微球溶液中加入1mL浓度为0.2mg/mL的N蛋白。20℃ 下反应12h；反应后收集上清，采用Bradford法测定上清液中未反应的蛋白浓度，计算偶联到每毫升纳微颗粒上的N蛋白量为0.0138mg(偶联率为69％)。

加入10mL浓度为0.5mg/mL的BSA到纳微颗粒溶液中封闭表面上残留的环氧基，室温下垂直混合过夜。

采用离心的方式将重组蛋白修饰的纳微米颗粒离心，去除上清液；依次用10mL 含1％BSA的PBS溶液、5％甘油的PBS溶液超声分散、清洗；将重组N蛋白修饰的纳微米颗粒用10mL含有稳定剂(5％BSA)和防腐剂(0.1％叠氮化钠)的Tris-HCl 缓冲液(0.05M，pH 8.0)重悬，并用200-600W超声波处理1min分散微球，得到抗体检测微球试剂。

实施例13一种新型冠状病毒(COVID-19)抗体检测试剂盒检测血清中 COVID-19综合抗体水平

1.观察法检测综合抗体水平

1.1铺板：

将0.5～50μL的抗体检测微球试剂(实施例4-12所制备的任一种)滴于洁净的玻片或透明塑料片上。随后在室温或者37℃下，干燥2～10min。

1.2点样：

将0.5～2μL的被测血清样品滴在干燥好的铺板表面，随后在室温或者37℃下，干燥2～10min。

1.3以观察法检测血清中COVID-19特异性抗体的存在

将干燥好的样品通过肉眼、手机拍照、手机显微镜、光镜等方式观察，记录阴性与阳性。其检验标准如下：

阳性：在中央区域形成磨砂状白色，阳性反应越强，中间白色圈越大(如图3 左)。

阴性：在中央区域为明显的透明状(如图3右)。

1.4以观察法检测血清中COVID-19特异性抗体的水平

将干燥好的样品通过手机显微镜和光镜等方式观察，记录样品中COVID-19特异性抗体水平：阴性、弱阳性、中阳性、强阳性。其检验标准如下：

强阳性(+++)：呈树枝状结晶：可以认为抗体与抗原反应，侵占了微球表面的水化层，抗体在微球之间密堆，进而形成了窗花状的侵蚀层结构(如图4)；

中阳性(++)：全局以大量闭合沟壑为主，感觉像要形成六角形窗花而未形成的样子：抗体进一步降低，宏观看只能展现出来球和球之间通过抗体连成串的沟壑状，而难以形成“窗花”(如图5)；

弱阳性(+)：黑色团状沉淀(如图6)；

阴性(-)：在中央区域为明显的透明状(如图7)。

2.以生化分析仪检测血清中COVID-19特异性抗体的水平

2.1稀释

将抗体检测微球试剂用稀释20-500倍，加入到生化分析仪储存瓶中。

2.2加样

将10μL-200μL血清加入到样品管中。

2.3设置参数

将抗体检测试剂与血清按照1:10-3:7之间的比例进行混合加样设置

2.4以检测数值进行分析，检验结果标准如下：

阳性：数值与对照组相差1个数量级

阴性：数值与对照组无数量级差异

2.性能测试

3.1可靠性分析：

对20份临床血清样本进行检测，同时用RT-PCR法平行测定，结果一致性100％。

结果如下表1：

表1本发明试剂盒与RT-PCR结果比较

3.2灵敏度分析

选用COVID-19标准N蛋白抗体检测，本试剂盒检出限为31.25μg/mL(如图8 所示)。

3.3精密性分析

将3份重组标准COVID-19N蛋白特异性免疫球蛋白IgG，浓度浓度分别为500 mg/L、200mg/L、80mg/L作为实验样本，各重复20次计算平均值、标准差和变异系数得到批内精密度相关系数据，再将此3个样本每天测定2次(上午、下午各一次)，每次测定双点重复，测定20d，计算平均值、标准差和变异系数得到批间精密度相关数据，结果如下表2：

表2本发明试剂盒精密度结果

3.4交叉反应分析

选用纯化的重组MERS N蛋白抗体、SARS-CoV N蛋白抗体、SARS-CoV S蛋白抗体、MERS S蛋白抗体、RSV-F抗体、RSV-G抗体、EBV-G抗体、EV71-VP1 蛋白抗体、H1N1 NA抗体、H1N1 HA抗体、H3N2 HA抗体和乙型流感抗体，用光镜检测本发明试剂盒的交叉反应特异性。如附图9所示，重组COVID-19N蛋白抗体光镜滴度为++，其余交叉反应抗体中MERS S蛋白抗体、SARS N蛋白抗体以及 SARS S蛋白抗体滴度为+，但仍弱于COVID-19N蛋白抗体，其余抗体均为阴性。因此，本发明试剂盒会与同为冠状病毒的MERS和SARS抗体产生交叉反应，但是反应强度弱于COVID-19抗体，具备很好的特异性。

实施例14一种新型冠状病毒(COVID-19)抗体检测试剂盒于临床规模化快速筛查

在此次临床试验中，分别采集经临床确诊的COVID-19患者及对照人群的血清标本，利用RT-PCR试剂盒COVID-19病原，验证COVID-19检测试剂盒针对临床样本的灵敏度、准确性及可靠性。本次试验共对315例患者进行检测，包含COVID-19 阳性病例(实验组)200例，其中假阴性病例17例，假阴性率8.5％；COVID-19阴性病例(对照组)115例，未检出假阳性病例，假阳性率0。具体实施如下：

1、材料与方法

1.1病例选择

受试者必须符合所有下列入选标准才有资格参加本研究：

(1)感染组及对照组纳入的受试者年龄≥18岁的男性或女性；

(2)感染组为通过临床症状，CT影像及核酸检测确认的COVID-19病毒感染患者，确诊时间小于14天。

(3)对照组为COVID-19病毒未感染者，咽拭子检测阴性。

1.2样本数

研究入组总例数：315例，分为2组：

对照组：115例

感染组：200例

1.3检测试剂盒

基于免疫纳米微球技术的COVID-19病毒抗体快速检测试剂盒，按照相应说明书操作。

2、结果

2.1 COVID-19阳性病例微球检测结果统计

200个COVID-19阳性病例中，微球诊断阳性183例，其中弱阳性22例，中阳性43例，强阳性118例，真阳性率91.5％；微球诊断阴性17例，假阴性率8.5％(如图10所示)；

2.2 COVID-19阳性病例年龄分布

200个COVID-19阳性病例中，患者平均年龄58.8岁，年龄中位数59岁；微球诊断183个真阳性病例中，患者平均年龄58.1岁，年龄中位数59岁；微球诊断17 个假阴性病例中，患者平均年龄66.6岁，年龄中位数67岁。各年龄段患者统计如图 11所示。

2.3 COVID-19阴性病例微球检测结果统计

115个COVID-19阴性病例中，经病理检验为病毒感染病例13例，其中COVID-19 阳性0例，微球诊断阳性0例，假阳性率0；

115个COVID-19阴性病例中，经临床诊断为肺部及呼吸系统疾病病例46例，其中COVID-19阳性0例，微球诊断阳性0例，假阳性率0；

115个COVID-19阴性病例中，经核酸检测COVID-19阴性9例，微球诊断阴性 9例，假阳性率0；

115个COVID-19阴性病例中，临床带有疑似新冠肺炎症状(咳嗽、发热等)患者22例，其中COVID-19阳性0例，微球检测阳性0例，假阳性率0。

综上，本发明的COVID-19病毒抗体快速检测试剂盒在临床检测中具有假阴性率低且假阳性率低的特点，有较好的临床使用潜质。

需要说明的是，本研究由中国科学院过程工程研究所与大连医科大学附属第二医院和武汉大学中南医院临床试验中心合作完成，已通过大连医科大学附属第二医院伦理审查，且经武汉大学中南医院临床试验中心备案。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

本发明的工艺参数(如温度、时间等)区间上下限取值以及区间值都能实现本法，在此不一一列举实施例。

本发明未详细说明的内容均可采用本领域的常规技术知识。

序列表

<110> 中国科学院过程工程研究所

<120> 一种COVID-19病毒抗体检测微球及其制备方法和含该微球的试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 419

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

35 40 45

Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu

50 55 60

Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro

65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly

85 90 95

Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr

100 105 110

Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp

130 135 140

His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln

145 150 155 160

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser

165 170 175

Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn

180 185 190

Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala

195 200 205

Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

210 215 220

Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln

225 230 235 240

Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys

245 250 255

Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln

260 265 270

Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp

275 280 285

Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile

290 295 300

Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile

305 310 315 320

Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala

325 330 335

Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu

340 345 350

Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro

355 360 365

Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln

370 375 380

Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu

385 390 395 400

Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser

405 410 415

Thr Gln Ala

<210> 2

<211> 980

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

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420 425 430

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Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

450 455 460

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

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Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

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500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

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530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

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Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

565 570 575

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

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610 615 620

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625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

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Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

660 665 670

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675 680 685

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Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe

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Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly

820 825 830

Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp

835 840 845

Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu

850 855 860

Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly

865 870 875 880

Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile

885 890 895

Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr

900 905 910

Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn

915 920 925

Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala

930 935 940

Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn

945 950 955 960

Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val

965 970 975

Leu Asn Asp Ile

980

<210> 3

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ala Asp Ser Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Lys Leu

1 5 10 15

Leu Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Thr Trp Ile

20 25 30

Cys Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ala Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile

35 40 45

Ile Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys

50 55 60

Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Ile Thr Gly Gly Ile

65 70 75 80

Ala Ile Ala Met Ala Cys Leu Val Gly Leu Met Trp Leu Ser Tyr Phe

85 90 95

Ile Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser Phe

100 105 110

Asn Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro Leu His Gly Thr Ile

115 120 125

Leu Thr Arg Pro Leu Leu Glu Ser Glu Leu Val Ile Gly Ala Val Ile

130 135 140

Leu Arg Gly His Leu Arg Ile Ala Gly His His Leu Gly Arg Cys Asp

145 150 155 160

Ile Lys Asp Leu Pro Lys Glu Ile Thr Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu

165 170 175

Ser Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Ser Gln Arg Val Ala Gly Asp Ser Gly

180 185 190

Phe Ala Ala Tyr Ser Arg Tyr Arg Ile Gly Asn Tyr Lys Leu Asn Thr

195 200 205

Asp His Ser Ser Ser Ser Asp Asn Ile Ala Leu Leu Val Gln

210 215 220

<210> 4

<211> 75

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser

1 5 10 15

Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala

20 25 30

Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn

35 40 45

Val Ser Leu Val Lys Pro Ser Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn

50 55 60

Leu Asn Ser Ser Arg Val Pro Asp Leu Leu Val

65 70 75

Claims

1.一种COVID-19病毒抗体检测微球，其特征在于，所述检测微球为高分子纳米颗粒表面的羧基上偶联COVID-19病毒重组抗原。

2.根据权利要求1所述的COVID-19病毒抗体检测微球，其特征在于，所述COVID-19病毒重组抗原为COVID-19病毒重组S蛋白、COVID-19病毒重组N蛋白、COVID-19病毒重组M蛋白和COVID-19病毒重组E蛋白中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的COVID-19病毒抗体检测微球，其特征在于，所述高分子纳米颗粒，其粒径为100～300纳米；所述高分子纳米颗粒为含羧基的高分子纳米颗粒或含环氧基的高分子纳米颗粒；

所述含羧基的高分子纳米颗粒，以甲基丙烯酸和/或丙烯酸为单体，与苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和甲基丙烯酸羟乙酯中的一种或多种共聚；

所述含环氧基的高分子纳米颗粒，以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体得到的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米颗粒，或以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体与苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸和丙烯酸中的一种或多种共聚。

4.权利要求3所述COVID-19病毒抗体检测微球的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

2)加入COVID-19病毒重组抗原进行偶联反应；

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，活化温度4-37℃，活化时间10min～12h；步骤2)中，偶联反应温度4-37℃，偶联反应时间1～24h；步骤3)中，所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液和巴比妥酸-盐酸缓冲液中的一种或多种；缓冲液的浓度为0.005～0.05mol/L；pH为6.0～8.0。

6.权利要求3所述COVID-19病毒抗体检测微球的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，偶联反应温度4-37℃，偶联反应时间4～48h；步骤2)中，所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液和巴比妥酸-盐酸缓冲液中的一种或多种；缓冲液的浓度为0.005～0.05mol/L；pH为6.0～8.0。

8.根据权利要求4-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述稳定剂选自小牛血清、BSA、脱脂乳、明胶、蔗糖、甘油中的一种或多种；所述稳定剂的质量百分比浓度为0.5～20％。

9.根据权利要求4-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述防腐剂选自叠氮化钠、苯酚、Proclin、对羟基苯甲酸中的一种或多种；所述防腐剂的质量百分比浓度为0.005-1％。

10.一种COVID-19病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的COVID-19病毒抗体检测微球。