CN112730827A - 一种新型冠状病毒抗体检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学检验分析技术领域，具体公开了一种新型冠状病毒抗体检测试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包括各自独立包装的试剂1与试剂2，试剂2至少包括包被有新冠蛋白的胶乳微粒，用于与被测样本中的新型冠状病毒抗体发生抗原抗体反应，以形成凝集使浊度改变并得到被测样本中的新型冠状病毒抗体含量。本发明提供的试剂盒具有检测简便且灵敏度高的优点，通过采用胶乳增强免疫比浊法得到新型冠状病毒抗体含量，设施要求低、耗时短且适于大规模筛查，解决了现有新型冠状病毒检测方法存在设施要求较高、耗时长且不适于大规模筛查或急诊的问题，而提供的制备方法适合产业化，具有广阔的市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验分析技术领域，具体是一种新型冠状病毒抗体检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
随着2019年12月以来，2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2，简称新型冠状病毒、新冠状病毒或新冠病毒)逐渐爆发。2020年1月10日前后，新型冠状病毒基因组全序列由复旦大学上海市公共卫生临床中心提交至NCBI GenBank数据库，其中28274-29533位为“N”基因，可产生病毒核衣核蛋白(即N蛋白)，新冠病毒的N蛋白相对保守，在病毒的结构蛋白中所占比例最大，感染早期机体就能产生抗N蛋白的高水平抗体。而新冠病毒的S蛋白(spikeglycoprotein，刺突糖蛋白)是一个长度
的三聚体结构，具有三角形截面。新冠病毒的S蛋白与SARS-CoV(Severe acute respiratory syndrome coronavirus，非典型肺炎病毒)的S蛋白具有76％的氨基酸序列同一性，因此，可以利用N蛋白与S蛋白建立快速检测SARS-CoV-2抗体方法，从而起到辅助诊断的作用。
目前，检测新冠病人的检测方法主要有两大类，一是直接对新冠病毒进行核酸检测；二是对新冠病人机体自身产生的抗体进行检测。其中，对于新型冠状病毒核酸检测的方法，目前采用的是实时PCR荧光法，优点是没有窗口期，缺点是检测不方便，对医院设施要求较高，操作繁琐、耗时长，不适于大规模筛查或急诊。对新冠病人机体自身产生的抗体进行检测通常是采用新冠抗体检测试剂盒，新冠抗体检测试剂盒特点是采用全自动生化分析仪，基层医院与检测中心都有此设备，操作方便快捷，自动化程度高、速度快、定量准确、灵敏度高，适用于大规模体检、筛查的需要。
因此，以上的技术方案存在以下不足：目前市场上的新型冠状病毒检测方法主要以核酸检测为主，以完成新冠的及时筛查，存在设施要求较高、耗时长且不适于大规模筛查或急诊的问题，而且，目前市场上用于检测新冠抗体的胶乳比浊试剂基本没有。因此，研制一种具有国产自主知识产权的新冠抗体胶乳检测试剂盒，检测灵敏度高，可靠性强，操作简单，并能降低成本，具有十分重要的意义。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种新型冠状病毒抗体检测试剂盒，以解决上述背景技术中提出的现有新型冠状病毒检测方法主要以核酸检测为主，存在设施要求较高、耗时长且不适于大规模筛查或急诊的问题。本发明提供的一种新型冠状病毒抗体检测试剂盒的检测灵敏度高，可靠性强，并降低成本适合产业化和临床推广。
为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
一种新型冠状病毒抗体检测试剂盒，包括各自独立包装的试剂1与试剂2，其中，所述试剂1用于放置待检测新型冠状病毒抗体含量的被测样本；
所述试剂2至少包括包被有新冠蛋白的胶乳微粒，用于与被测样本中的新型冠状病毒抗体发生抗原抗体反应，以形成凝集使浊度改变并得到被测样本中的新型冠状病毒抗体含量。
作为本发明进一步的方案：在所述新型冠状病毒抗体检测试剂盒中，所述试剂1包括促凝剂、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲液；所述试剂2包括防腐剂、缓冲液以及包被有新冠蛋白的胶乳微粒；其中，所述试剂2中的新冠蛋白是新冠病毒的重组蛋白，且pH值范围为5.0-9.5，重组蛋白的抗原种类选自新冠病毒的N蛋白和/或新冠病毒的S蛋白；所述胶乳微粒为表面修饰有官能团的聚苯乙烯微球，直径为100-200nm，所述聚苯乙烯微球表面修饰的官能团选自羧基、氨基或羟基。
本发明实施例通过将被测样本加入至试剂1中，再与试剂2混合，其中的新冠抗体与包被在胶乳微粒上的新冠蛋白发生抗原抗体反应，形成抗原-抗体-乳胶微粒的复合物交织成网状并发生凝集，导致浊度上升，保持反应体系中抗体过量，检测反应形成的浊度在给定波长处的吸光度，对照校准曲线即可求出被测样本中新冠抗体的含量，其检测灵敏度高，可靠性强，并降低成本。检测了1000个临床样本，成功率可达到100％的质量水平，适合产业化和临床推广。
本发明实施例的另一目的在于提供一种新型冠状病毒抗体检测试剂盒的制备方法，所述的新型冠状病毒抗体检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1)将表面修饰有官能团的聚苯乙烯微球与加入至交联缓冲液中的新冠蛋白进行混合均匀，再加入化学交联剂与N-羟基琥珀酰亚胺进行交联，然后加入封闭剂将聚苯乙烯微球表面上未被新冠蛋白粘附的裸露区进行封闭，得到混合溶液；
2)将步骤1)中得到的所述混合溶液进行离心，取沉淀，得到包被有新冠蛋白的胶乳微粒；
3)将包被有新冠蛋白的胶乳微粒加入至储存液中振匀，然后进行超声处理，得到胶乳悬浮液；
4)将步骤3)中得到的所述胶乳悬浮液进行离心处理，吸取上层均匀胶乳，得到所述试剂2；
5)将试剂1与试剂2进行各自独立包装，得到所述新型冠状病毒抗体检测试剂盒。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1)本发明实施例提供的新型冠状病毒抗体检测试剂盒具有检测简便且灵敏度高的优点，通过采用胶乳增强免疫比浊法，以包被有新冠蛋白的胶乳微粒与被测样本中的新型冠状病毒抗体发生抗原抗体反应来形成凝集使浊度改变，进而得到被测样本中的新型冠状病毒抗体含量，设施要求低、耗时短且适于大规模筛查，解决了现有新型冠状病毒检测方法主要以核酸检测为主，存在设施要求较高、耗时长且不适于大规模筛查或急诊的问题，而提供的制备方法适合产业化，具有广阔的市场前景。
2)本发明实施例提供的新型冠状病毒抗体检测试剂盒可以定量检测人血清中新冠抗体含量，工艺简单，只需重组原核新冠蛋白，可实现高灵敏度与反应度，同时具有良好的抗乳糜干扰能力。
3)本发明实施例提供的新型冠状病毒抗体检测试剂盒灵敏度高，检测低浓度样本可准确至0.1AU/mL，而且准确率远超国内试剂质量水平，且价格较低，降低大众检测成本，检测手段简单，对医疗设备要求不高，能应用于各种自动生化分析仪，可靠性强，适合产业化和临床推广。
附图说明
图1为本发明一实施例提供的新型冠状病毒抗体检测试剂盒中试剂2的制备工艺流程图。
图2为本发明一实施例提供的新型冠状病毒抗体检测试剂盒的使用方法的流程图；
图3为本发明一实施例提供的新型冠状病毒抗体检测试剂盒在使用时的定标拟合曲线图；
图4为本发明一实施例提供的新型冠状病毒抗体检测试剂盒在使用时的线性相关性的趋势线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细地说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明实施例中，提供一种新型冠状病毒抗体检测试剂盒，具体是新型冠状病毒抗体免疫胶乳比浊法检测试剂盒，包括各自独立包装的试剂1与试剂2，其中，所述试剂1用于放置待检测新型冠状病毒抗体含量的被测样本；所述试剂2至少包括包被有新冠蛋白的胶乳微粒，用于与被测样本中的新型冠状病毒抗体发生抗原抗体反应，以形成凝集使浊度改变并得到被测样本中的新型冠状病毒抗体含量。
作为本发明的另一优选实施例，在所述新型冠状病毒抗体检测试剂盒中，所述试剂1包括促凝剂、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲液；所述试剂1主要是用于提供适当的反应条件，使被测样本中的抗原保持天然构象，并控制反应达到终点的时间和速率。
作为本发明的另一优选实施例，所述试剂2包括防腐剂、缓冲液以及包被有新冠蛋白的胶乳微粒；其中所述试剂2中的新冠蛋白是新冠病毒的重组蛋白，且pH值范围为5.0-9.5，重组蛋白的抗原种类选自(原核表达或真核表达的)新冠病毒的N蛋白和/或新冠病毒的S蛋白；所述胶乳微粒为表面修饰有官能团的聚苯乙烯微球，直径为100-200nm，所述聚苯乙烯微球表面修饰的官能团选自羧基、氨基或羟基。
作为本发明的另一优选实施例，所述新冠蛋白通过化学交联法包被至胶乳微粒表面，其中，包被过程中的化学交联剂选自碳化亚胺(EDAC，碳二亚胺异型双功能交联剂)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、酰肼或异氰酸酯；包被过程中的交联缓冲液的pH是6.5-8.5，所述交联缓冲液选自MOPSO缓冲液、Tris-HCl缓冲液或HEPS缓冲液。
在本发明实施例中，所述新型冠状病毒抗体检测试剂盒的检测原理为：被测样本中的新冠抗体与包被在胶乳微粒上的新冠蛋白发生抗原抗体反应，形成抗原-抗体-乳胶微粒的复合物交织成网状并发生凝集，导致浊度上升，保持反应体系中抗体过量，检测反应形成的浊度在700nm波长处的吸光度，在给定波长下，反应形成的浊度与待测物质的含量具有正相关性，对照校准曲线即可求出被测样本中新冠抗体的含量，可以参照图2所示的新型冠状病毒抗体检测试剂盒的具体使用方法的流程图。
作为本发明的另一优选实施例，在所述试剂1中，所述缓冲液的pH为7.0-9.0、浓度为20-100mM(mM即表示mmol/L)；所述促凝剂的浓度为1.0wt％-5.0wt％；所述表面活性剂的浓度为0.01wt％-0.5wt％；所述防腐剂的浓度为0.05wt％-0.2wt％。
作为本发明的另一优选实施例，所述试剂1的制备方法是按照比例将缓冲液中加入促凝剂、表面活性剂、防腐剂混合均匀，然后加入氯化钠作为电解质，再加入适量螯合剂进行混合均匀，调节pH至7.0-9.0，得到所述试剂1。
作为本发明的另一优选实施例，在所述试剂1中，所述促凝剂选自聚乙二醇(PEG系列产品)、葡聚糖70、硫酸葡聚糖钠或Tris(氨基丁三醇)；所述表面活性剂选自吐温(吐温系列产品)、曲拉通-100或脂肪醇聚乙二醇醚；所述稳定剂可以采用现有的免疫胶乳比浊法检测试剂盒中使用的稳定剂，这里并不作赘述。
作为本发明的另一优选实施例，所述新型冠状病毒抗体检测试剂盒还包括用于校准新型冠状病毒抗体含量的校准品溶液，可以用来与样本比较进行结果计算，所述校准品溶液的原料包括纯化水、防腐剂以及新型冠状病毒抗体，且校准品溶液中新型冠状病毒抗体含量是0-100AU/mL；所述校准品溶液中防腐剂的浓度范围为0.05wt％-0.2wt％。
作为本发明的另一优选实施例，所述试剂1、试剂2和校准品溶液中的防腐剂选自NaN3、Proclin系列防腐剂或对羟基苯甲酸；所述试剂1和试剂2中的缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液或MOPSO缓冲液。
作为本发明的另一优选实施例，具体地，在所述试剂1中，所述缓冲液的pH为7.0-9.0、浓度为20-100mM(mM即表示mmol/L)；所述促凝剂为PEG-6000，浓度为1.0wt％-5.0wt％；所述表面活性剂为曲拉通-100与吐温-20，且曲拉通-100与吐温-20的浓度分别为0.01wt％-0.5wt％与0.01wt％-0.2wt％；所述防腐剂为NaN3，浓度为0.05wt％-0.2wt％；电解质为NaCl，浓度为1wt％-5wt％，螯合剂是浓度为1mM-5mM的EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠)。
优选的，所述试剂1的制备方法是取pH为7.0-9.0、浓度为20-100mM的Tris-HCl缓冲液，向其中加入浓度为1.0wt％-5.0wt％的PEG-6000、浓度为0.01wt％-0.5wt％的曲拉通-100、浓度为0.05wt％-0.2wt％的NaN3、浓度为1wt％-5wt％的NaCl，浓度为1mM-5mM的EDTA-2Na，浓度为0.01wt％-2wt％的吐温-20，搅拌均匀，并调节pH至7.0-9.0，即得所述试剂1。
作为本发明的另一优选实施例，在所述试剂2中，所述缓冲液是Tirs，pH为7.0-9.0，浓度为20-80mM；所述防腐剂浓度是0.05wt％-0.2wt％；所述新冠蛋白为新冠病毒的N蛋白和新冠病毒的S蛋白的混合蛋白；胶乳微粒表面修饰羧基，且化学交联剂为碳化亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺，交联缓冲液为Tris-HCl缓冲液，其中，胶乳微粒表面上的新冠蛋白的浓度0.15-4mg/mL。
作为本发明的另一优选实施例，具体地，所述校准品溶液中，新冠抗体来自将新冠蛋白原的核酸序列优化成大肠杆菌表达体系，全基因合成后构建于原核表达载体中，通过大肠杆菌高效表达与纯化得到新冠病毒的N蛋白和新冠病毒的S蛋白，再将此N蛋白与S蛋白注射兔子进行免疫获取相应的N蛋白兔抗与S蛋白兔抗，其纯度≥95wt％，含量满足线性范围0-100AU/mL；校准品溶液中防腐剂的浓度范围为0.05wt％-0.2wt％。
本发明实施例还提供一种上述新型冠状病毒抗体检测试剂盒的制备方法，所述的新型冠状病毒抗体检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1)将表面修饰有官能团的聚苯乙烯微球与加入至交联缓冲液中的新冠蛋白进行混合均匀，再加入化学交联剂与NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)进行交联，然后加入封闭剂将聚苯乙烯微球表面上未被新冠蛋白(抗体)粘附的裸露区进行封闭，得到混合溶液；
2)将步骤1)中得到的所述混合溶液进行离心去除多余的化学交联剂、交联副产物、新冠蛋白(抗体)和封闭剂，取底部沉淀，即得到包被有新冠蛋白的胶乳微粒；
3)将包被有新冠蛋白的胶乳微粒加入至储存液中振匀，然后进行超声处理，得到均一的乳白色胶乳悬浮液；
4)将步骤3)中得到的所述胶乳悬浮液进行离心处理，吸取上层均匀胶乳，得到所述试剂2；
5)将试剂1与试剂2进行各自独立包装，得到所述新型冠状病毒抗体检测试剂盒。
作为本发明的另一优选实施例，在所述的新型冠状病毒抗体检测试剂盒的制备方法中，所述封闭剂为50-80mM甘氨酸和浓度为2％-5％的牛血清白蛋白的混合物。
作为本发明的另一优选实施例，在所述的新型冠状病毒抗体检测试剂盒的制备方法中，所述储存液的原料包括10-30mM的HEPES缓冲液、浓度为1％-5％的海藻糖、浓度为0.5-1.5％的甘油和浓度为0.05-0.15％的Proclin300。
优选的，在所述的新型冠状病毒抗体检测试剂盒的制备方法中，所述储存液的原料包括10-30mM的HEPES缓冲液、浓度为1％-5％的海藻糖、浓度为1％的甘油和浓度为0.1％的Proclin300。
作为本发明的另一优选实施例，在所述的新型冠状病毒抗体检测试剂盒的制备方法中，还包括校准品溶液的制备步骤，所述校准品溶液的制备包括：取新型冠状病毒抗体冻干品用纯化水稀释为0-100AU/mL，振荡摇匀，得到所述校准品溶液。
优选的，所述校准品溶液的制备包括：取100AU/mL的新型冠状病毒抗体冻干品1mL，用纯化水稀释为100AU/mL、50AU/mL、25AU/mL、12.5AU/mL、1.25AU/mL、0AU/mL，振荡摇匀，用作新型冠状病毒抗体检测试剂盒的多点校准品。
作为本发明的另一优选实施例，所述的新型冠状病毒抗体检测试剂盒的制备方法包括以下步骤：
a)试剂1的制备：
取pH为7.0-9.0、浓度为20-100mM的Tris-HCl缓冲液，向其中加入浓度为1.0％-5.0％的PEG-6000、浓度0.01％-0.5％的曲拉通-100、浓度为0.05％-0.2％的NaN3、浓度为1％-5％的NaCl，浓度为1mM-5mM的EDTA-2Na，浓度为0.01％-2％的吐温-20，搅拌均匀，并调节pH至7.0-9.0，即得试剂1；
b)试剂2的制备(具体参照图1所示)：
S1、微球活化：
在pH为6.0的Mes缓冲液中加入150μL直径为100-200nm的表面修饰羧基的聚苯乙烯微球，然后加入活化剂(可以采用现有技术来实现，例如采用EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与NHS的混合液进行活化，具体的用量和操作条件可以参考现有技术，这里并不作赘述)，在37℃下反应，再经离心处理，去除上清液中多余的活化剂，取沉淀，用5mL的Tris-HCl缓冲液重悬，即得活化的聚苯乙烯胶乳溶液；
S2、抗体交联：
将等重量的新冠病毒的N蛋白与新冠病毒的S蛋白混合，用5mL的20mM的Tris-HCl缓冲液稀释后，加入步骤S1中得到的活化的聚苯乙烯胶乳溶液，再加入加0.15mg的EDAC、0.23mg的NHS，在37℃下反应1-2h，即可在聚苯乙烯微球表面上交联抗体，得到交联溶液；
S3、乳胶微粒封闭：
向步骤S2中得到的交联溶液中加入封闭剂，将聚苯乙烯微球表面上未被抗体粘附的裸露区封闭，得到混合溶液；
S4、置换储存液：
将步骤S3中得到的混合溶液进行离心去除多余的交联剂、交联副产物、抗体和封闭剂，底部沉淀即为包被有新冠蛋白的胶乳微粒，取10mL储存液加入至上述沉淀中，振匀，并经超声处理，得到均一的乳白色胶乳悬浮液；
S5、去除大颗粒：
将步骤S4中得到的胶乳悬浮液离心处理5min，吸取上层均匀胶乳，即得试剂2；
c)校准品溶液的制备：
取100AU/mL的新冠抗体冻干品1mL，用纯化水分别稀释为100AU/mL、50AU/mL、25AU/mL、12.5AU/mL、1.25AU/mL、0AU/mL的样品，振荡摇匀，用作新冠试剂的多点校准品；
其中，新冠抗体冻干品为液态新冠抗体定量分装后，用冷冻干燥机去除其中的水分，冻干成固体粉末状，以便于新冠抗体的长期储存，保证抗体活性的稳定期≥3年。
作为本发明的另一优选实施例，在所述的新型冠状病毒抗体检测试剂盒的制备方法中，具体地，步骤S3中的封闭剂为50-80mM甘氨酸和浓度为2％-5％的牛血清白蛋白的混合物，其pH值为7.4。
作为本发明的另一优选实施例，在所述的新型冠状病毒抗体检测试剂盒的制备方法中，具体地，步骤S4中的储存液包括10-30mM的HEPES缓冲液、浓度为1％-5％的海藻糖、浓度为1％的甘油和浓度为0.1％的Proclin300，其pH值为7.5。
本发明实施例还提供一种采用上述的新型冠状病毒抗体检测试剂盒的制备方法制备得到的新型冠状病毒抗体检测试剂盒。
本发明实施例还提供一种所述的新型冠状病毒抗体检测试剂盒在新冠病人检测中的应用。
以下通过列举具体实施例对本发明的新型冠状病毒抗体检测试剂盒的技术效果做进一步的说明。
实施例1
一种新型冠状病毒抗体检测试剂盒，具体的制备过程如下：
a)试剂1的制备：
取pH为7.45、浓度为20-100mM的Tris-HCl缓冲液，向其中加入浓度为3％的PEG-6000、浓度0.01％的曲拉通-100、浓度为0.1％的NaN3、浓度为1.25％的NaCl，浓度为1mM的EDTA-2Na，浓度为0.02％的吐温-20，搅拌均匀，并调节pH至7.45，即得试剂1；
b)试剂2的制备(具体参照图1所示)
S1、微球活化：
在pH为6.0的Mes缓冲液中加入150μL直径为130nm的表面修饰羧基的聚苯乙烯微球，然后加入活化剂，在37℃下反应0.5h，13500rpm离心55min，去除上清液中多余的活化剂，取沉淀，用5mL的Tris-HCl缓冲液重悬，即得活化的聚苯乙烯胶乳溶液；
S2、抗体交联：
将两株配对的新冠病毒的N蛋白与新冠病毒的S蛋白按照1:1的摩尔比进行混合，用5mL的20mM的Tris-HCl缓冲液稀释后，加入步骤S1中得到的活化的聚苯乙烯胶乳溶液，再加入加0.15mg的EDAC、0.23mg的NHS，在37℃下反应1-2h，即可在聚苯乙烯微球表面上交联抗体，得到交联溶液，交联溶液中抗体(即新冠蛋白)的浓度0.25mg/mL；
S3、乳胶微粒封闭：
向步骤S2中得到的交联溶液中加入pH值为7.4的浓度是50mM的甘氨酸和浓度为4％的牛血清白蛋白的混合物，将聚苯乙烯微球表面上未被抗体粘附的裸露区封闭，得到混合溶液；
S4、置换储存液：
将步骤S3中得到的混合溶液进行离心，底部沉淀即为包被有新冠蛋白的胶乳微粒，取10mL的pH值为7.5的18mM的HEPES缓冲液、浓度为3％的海藻糖、浓度为1％的甘油和浓度为0.1％的Proclin300的混合物，将其加入上述沉淀，振匀，超声处理1min，得到均一的乳白色胶乳悬浮液；
S5、去除大颗粒：
将步骤S4中得到的胶乳悬浮液在5000rpm离心5min，吸取上层均匀胶乳，即得试剂2；
c)校准品溶液的制备：
取100AU/mL的新冠抗体冻干品1mL，用纯化水分别稀释为100AU/mL、50AU/mL、25AU/mL、12.5AU/mL、1.25AU/mL、0AU/mL，振荡摇匀，用作新冠试剂的多点校准品。
实施例2
一种新型冠状病毒抗体检测试剂盒的使用方法，采用实施例1中的新型冠状病毒抗体检测试剂盒进行检测被测样本，其中，具体的实验参数如下：
分析方法：两点终点法；
试剂用量：试剂1和试剂2用量分别为240μL和60μL；
被测样本用量：4μL；
检测波长：600nm；
检测步骤：如图2所示，取240μL试剂1，向其中加入4μL被测样本，在37℃条件反应5min后，再向其中加入60μL试剂2后开始读点，反应5min后读取另一点，得到吸光度差值。
在日立7170S全自动生化分析仪上，按上述步骤，测得本发明实施例1中校准品溶液的定标线，如图3所示。图3中曲线上的每个点代表一个新冠抗体含量的校准品，其中X轴表示新冠抗体含量(AU/mL)，Y轴表示吸光度(吸光度的单位为1)。
取待测的被测样本，按照上述步骤检测样本的吸光度差值，代入校准曲线即可算出被测样本中新冠抗体的含量。
实施例3
将实施例1中的校准品溶液参照实施例2中的方法进行定标线，对应的定标线的反应度如表1所示，相应的实施例1中新型冠状病毒抗体检测试剂盒的定标拟合曲线见图3所示，其中，每个浓度的样品检测两次取平均值。
表1定标结果表
根据表1的结果，可以将图3中的曲线作为对照校准曲线来求出被测样本中新冠抗体的含量。
实施例4
对于实施例1中的新型冠状病毒抗体检测试剂盒在使用过程中进行质控，具体是选用2020年5月(第一次)上海室间质评样本，采用本发明实施例1中的新型冠状病毒抗体检测试剂盒对其检测，检测结果见表2-1，其中，样品编号包括2021号样品、2022号样品2023号样品2024号样品2025号样品，每个样品检测两次并取平均值。
表2-1质控结果表
| 样本编号 | 预期值 | 实施例1 | 结论 |
| 2021 | + | 16.04AU/mL | 合格 |
| 2022 | + | 13.00AU/mL | 合格 |
| 2023 | - | 0.00AU/mL | 合格 |
| 2024 | + | 1.01AU/mL | 合格 |
| 2025 | + | 1.21AU/mL | 合格 |
根据上海临检中心发布的样本结果，2021号样品与2022号样品为强阳性，2023号样品为阴性样本，2024号样品与2025号样品为弱阳性样本。根据表2-1数据可以看出，本发明的新冠试剂测上海临检中心样本室间质评都合格，即本发明的新型冠状病毒抗体检测试剂盒的质量合格。
同时，对于实施例1中的新型冠状病毒抗体检测试剂盒进行初步测试样本检测，其中，试剂测水没有本底，合格。样本检测值大于1，为阳性，小于1为阴性，具体的结果见表2-2所示。
表2-2初步测试样本检测结果表
| 样本(编号) | 检测值 | 反应度(34-18) |
| 纯化水 | 0.05 | / |
| 9 | 0.00 | / |
| 17 | 0.00 | / |
| 133 | 7.07 | 7770-7210＝560 |
| 132 | 1.19 | 7341-7131＝210 |
| 142 | 2.56 | 9678-9408＝270 |
由表2-2可知，编号133、132、142为从武汉采集的阳性血清样本，检测数据显示为阳性。133号为强阳性，132号为弱阳性，142号为中阳性。9号与17号为正常临床血清，表2-2显示其为阴性，合格。因此该试剂初步确定能够检测到阳性与阴性样本，特异性好，准确度100％。
实施例5
参照实施例4中的方法对实施例1的新型冠状病毒抗体检测试剂盒进行精密性对比，具体是采用本发明实施例1中的新型冠状病毒抗体检测试剂盒对同样的血清样本(2021号样品)进行对照测定10次，计算平均值和CV值，检测结果见表3所示。
表3精密性对比测试结果
| 次数 | 实施例1测试值 |
| 1 | 16.14AU/mL |
| 2 | 16.15AU/mL |
| 3 | 16.21AU/mL |
| 4 | 15.91AU/mL |
| 5 | 16.11AU/mL |
| 6 | 15.17AU/mL |
| 7 | 16.21AU/mL |
| 8 | 16.22AU/mL |
| 9 | 15.87AU/mL |
| 10 | 16.31AU/mL |
| 平均值 | 16.03AU/mL |
| SD | 0.33 |
| CV(％) | 2.07％ |
| CV(％)要求 | 5.00％ |
| 结论 | 合格 |
从表3中测试结果可知，测试相同样本10次，本发明实施例1提供的新型冠状病毒抗体检测试剂盒的精密性较好，说明本发明的新型冠状病毒抗体检测试剂盒的重复性良好，产品质量可靠。
实施例6
将本发明实施例1中的新型冠状病毒抗体检测试剂盒进行线性相关性测试，线性相关性测试结果如表4所示，本发明实施例1中的线性相关性的趋势线，见图4所示。
表4线性相关性的趋势结果(单位：AU/mL)
| 理论值 | 样本稀释倍数 | 测试值1 | 测试值2 | 平均值 |
| 100 | 1(原倍) | 99.35 | 96.40 | 97.9 |
| 50 | 1/2 | 47.71 | 47.82 | 47.81 |
| 25 | 1/4 | 25.12 | 25.61 | 25.42 |
| 12.5 | 1/8 | 14.43 | 15.41 | 14.92 |
| 6.2 | 1/16 | 8.58 | 8.21 | 8.44 |
| 3.1 | 1/32 | 3.34 | 4.32 | 3.83 |
| 1.5 | 1/64 | 1.33 | 1.91 | 1.62 |
| 0.75 | 1/128 | 0.60 | 0.72 | 0.65 |
| 0 | 水 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
由图4可知，本发明实施例1中的新型冠状病毒抗体检测试剂盒有很好的线性相关性，线性相关系数(r)都达到0.999，本发明中的新型冠状病毒抗体检测试剂盒在线性方面达到较高水平。
实施例7
采用本发明实施例1中的新型冠状病毒抗体检测试剂盒对纯化水进行空白对比测试，测试16点的吸光度，测试结果见表5所示，其中，具体的测试条件参照实施例1与实施例2。
表5空白对比测试结果表
| 组别 | 实施例1的OD值(16点) |
| 第一次 | 4056 |
| 第二次 | 4043 |
| 平均值 | 4050 |
由表5中测试结果可知，本发明实施例1中提供的新型冠状病毒抗体检测试剂盒的水空白反应度是4050，满足要求吸光度小于1.5，即反应度＜15000。
实施例8
为了检测本发明提供的新型冠状病毒抗体检测试剂盒的灵敏度，下面分别采用本发明实施例1中的新型冠状病毒抗体检测试剂盒与对照试剂盒测试1.21AU/mL的血清样本，吸光度差值在0.01-0.1(即100-1000)为合格，测试结果见表6。
表6灵敏度测试结果
| 实施例1 | |
| 测试值 | 1.2ng/mL |
| 反应度(34-19点) | 7494-6962＝532 |
由表6中的测试结果可知，本发明实施例1中的新型冠状病毒抗体检测试剂盒的测试室间质评2025号样本时的分析灵敏度，反应度在532(即530左右)，符合100-1000的范围，灵敏度合格。
实施例9
将本发明实施例1提供的新型冠状病毒抗体检测试剂盒进行测试大量正常人临床样本，具体是选取常州1000例病人，分别采用本发明实施例1中的新型冠状病毒抗体检测试剂盒对这1000例病人的新鲜血清进行测试，测试结果基本都是0.00，显示阴性。因为数据量太大，这里选取100例，结果如表7所示。
表7临床样本结果表(单位：ng/mL)
由表7统计的结果可以看出，在这截取的100例新鲜病人血清的数据中，所有样本检测结果基本都是0.00，只有2个样本显示0.10左右，原因可能是样本中有点颗粒物，或者反应杯有点没洗干净，但是因为没有超过1.00，所以不影响检测结果。因此，此次1000例随机临床新鲜血清中未发现有阳性样本，说明常州本地新冠病毒基本消失。从临床应用的角度来判断，两者相关性良好，临床意义显著。
实施例10
对本发明提供的新型冠状病毒抗体检测试剂盒的长期稳定性进行检测，具体是将本发明实施例1中的新型冠状病毒抗体检测试剂盒分别进行冷藏与开瓶稳定性测试，稳定性测试结果见表8。
表8稳定性测试结果表(单位：ng/mL)
由表8测试结果可知，经冷藏保存实施例1中的新型冠状病毒抗体检测试剂盒和对照试剂盒中试剂基本稳定，开瓶后，数值均会升高，是由于试剂敞口，在空气中挥发，但在可控范围10％内。
总体来看，本发明实施例1中提供的新型冠状病毒抗体检测试剂盒，各项性能指标与稳定性都较好，本发明中的新型冠状病毒抗体检测试剂盒适合产业化和临床推广。
实施例11
一种新型冠状病毒抗体检测试剂盒，包括各自独立包装的试剂1与试剂2，所述试剂1包括促凝剂、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲液；所述试剂2包括防腐剂、缓冲液以及包被有新冠蛋白的胶乳微粒；其中，所述试剂2中的新冠蛋白是新冠病毒的重组蛋白，且pH值为5.0，重组蛋白的抗原种类选自新冠病毒的N蛋白；所述胶乳微粒为表面修饰有官能团的聚苯乙烯微球，直径为100nm，所述聚苯乙烯微球表面修饰的官能团选自羧基。
在本实施例中，所述新冠蛋白通过化学交联法包被至胶乳微粒表面，其中，包被过程中的化学交联剂选自碳化亚胺；包被过程中的交联缓冲液的pH是6.5，所述交联缓冲液选自MOPSO缓冲液。
在本实施例中，在所述试剂1中，所述缓冲液的pH为7.0、浓度为20mmol/L；所述促凝剂的浓度为1.0wt％；所述表面活性剂的浓度为0.01wt％；所述防腐剂的浓度为0.05wt％。所述促凝剂选自聚乙二醇；所述表面活性剂选自吐温。
在本实施例中，在所述试剂2中，所述缓冲液的pH为7.0，浓度为20mmol/L；所述防腐剂浓度是0.05wt％；包被有新冠蛋白的胶乳微粒中的新冠蛋白的浓度0.15mg/mL。
在本实施例中，所述试剂1、试剂2中的防腐剂选自NaN3；所述试剂1和试剂2中的缓冲液选自Tris-HCl缓冲液。
在本实施例中，所述新型冠状病毒抗体检测试剂盒的制备方法包括以下步骤：
1)按照比例将缓冲液中加入促凝剂、表面活性剂、防腐剂混合均匀，然后加入氯化钠作为电解质，再加入螯合剂进行混合均匀，调节pH至7.0，得到所述试剂1；
2)将表面修饰有官能团的聚苯乙烯微球与加入至交联缓冲液中的新冠蛋白进行混合均匀，再加入化学交联剂与N-羟基琥珀酰亚胺进行交联，然后加入封闭剂将聚苯乙烯微球表面上未被新冠蛋白粘附的裸露区进行封闭，得到混合溶液；
3)将步骤2)中得到的所述混合溶液进行离心，取沉淀，得到包被有新冠蛋白的胶乳微粒；
4)将包被有新冠蛋白的胶乳微粒加入至储存液中振匀，然后进行超声处理，得到胶乳悬浮液；
5)将步骤4)中得到的所述胶乳悬浮液进行离心处理，吸取上层均匀胶乳，得到所述试剂2；
6)将试剂1与试剂2进行各自独立包装，得到所述新型冠状病毒抗体检测试剂盒；其中，所述封闭剂是浓度50mmol/L的甘氨酸和浓度为2wt％的牛血清白蛋白的混合物，所述储存液的原料包括10mmol/L的HEPES缓冲液、浓度为1wt％的海藻糖、浓度为0.5wt％的甘油和浓度为0.05wt％的Proclin300。
实施例12
一种新型冠状病毒抗体检测试剂盒，包括各自独立包装的试剂1与试剂2，所述试剂1包括促凝剂、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲液；所述试剂2包括防腐剂、缓冲液以及包被有新冠蛋白的胶乳微粒；其中，所述试剂2中的新冠蛋白是新冠病毒的重组蛋白，且pH值范围为9.5，重组蛋白的抗原种类选自新冠病毒的S蛋白；所述胶乳微粒为表面修饰有官能团的聚苯乙烯微球，直径为200nm，所述聚苯乙烯微球表面修饰的官能团选自氨基。
在本实施例中，所述新冠蛋白通过化学交联法包被至胶乳微粒表面，其中，包被过程中的化学交联剂选自N-羟基琥珀酰亚胺；包被过程中的交联缓冲液的pH是8.5，所述交联缓冲液选自Tris-HCl缓冲液。
在本实施例中，在所述试剂1中，所述缓冲液的pH为9.0、浓度为100mmol/L；所述促凝剂的浓度为5.0wt％；所述表面活性剂的浓度为0.5wt％；所述防腐剂的浓度为0.2wt％。所述促凝剂选自葡聚糖70；所述表面活性剂选自曲拉通-100。
在本实施例中，在所述试剂2中，所述缓冲液的pH为9.0，浓度为80mmol/L；所述防腐剂浓度是0.2wt％；包被有新冠蛋白的胶乳微粒中的新冠蛋白的浓度4mg/mL。
在本实施例中，所述试剂1、试剂2中的防腐剂选自Proclin防腐剂；所述试剂1和试剂2中的缓冲液选自甘氨酸-NaOH缓冲液。
在本实施例中，所述新型冠状病毒抗体检测试剂盒的制备方法包括以下步骤：
1)按照比例将缓冲液中加入促凝剂、表面活性剂、防腐剂混合均匀，然后加入氯化钠作为电解质，再加入螯合剂进行混合均匀，调节pH至9.0，得到所述试剂1；
2)将表面修饰有官能团的聚苯乙烯微球与加入至交联缓冲液中的新冠蛋白进行混合均匀，再加入化学交联剂与N-羟基琥珀酰亚胺进行交联，然后加入封闭剂将聚苯乙烯微球表面上未被新冠蛋白粘附的裸露区进行封闭，得到混合溶液；
3)将步骤2)中得到的所述混合溶液进行离心，取沉淀，得到包被有新冠蛋白的胶乳微粒；
4)将包被有新冠蛋白的胶乳微粒加入至储存液中振匀，然后进行超声处理，得到胶乳悬浮液；
5)将步骤4)中得到的所述胶乳悬浮液进行离心处理，吸取上层均匀胶乳，得到所述试剂2；
6)将试剂1与试剂2进行各自独立包装，得到所述新型冠状病毒抗体检测试剂盒；其中，所述封闭剂是浓度80mmol/L的甘氨酸和浓度为5wt％的牛血清白蛋白的混合物，所述储存液的原料包括30mmol/L的HEPES缓冲液、浓度为5wt％的海藻糖、浓度为1.5wt％的甘油和浓度为0.15wt％的Proclin300。
实施例13
一种新型冠状病毒抗体检测试剂盒，包括各自独立包装的试剂1与试剂2，所述试剂1包括促凝剂、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲液；所述试剂2包括防腐剂、缓冲液以及包被有新冠蛋白的胶乳微粒；其中，所述试剂2中的新冠蛋白是新冠病毒的重组蛋白，且pH值为7.0，重组蛋白的抗原种类选自新冠病毒的N蛋白和新冠病毒的S蛋白；所述胶乳微粒为表面修饰有官能团的聚苯乙烯微球，直径为150nm，所述聚苯乙烯微球表面修饰的官能团选自羟基。
在本实施例中，所述新冠蛋白通过化学交联法包被至胶乳微粒表面，其中，包被过程中的化学交联剂选自酰肼；包被过程中的交联缓冲液的pH是7.5，所述交联缓冲液选自HEPS缓冲液。
在本实施例中，在所述试剂1中，所述缓冲液的pH为8.0、浓度为60mmol/L；所述促凝剂的浓度为3.0wt％；所述表面活性剂的浓度为0.2wt％；所述防腐剂的浓度为0.1wt％。所述促凝剂选自硫酸葡聚糖钠；所述表面活性剂选自脂肪醇聚乙二醇醚。
在本实施例中，在所述试剂2中，所述缓冲液的pH为8.0，浓度为50mmol/L；所述防腐剂浓度是0.12wt％；包被有新冠蛋白的胶乳微粒中的新冠蛋白的浓度2mg/mL。
在本实施例中，所述试剂1、试剂2中的防腐剂选自对羟基苯甲酸；所述试剂1和试剂2中的缓冲液选自MOPSO缓冲液。
在本实施例中，所述新型冠状病毒抗体检测试剂盒的制备方法包括以下步骤：
1)按照比例将缓冲液中加入促凝剂、表面活性剂、防腐剂混合均匀，然后加入氯化钠作为电解质，再加入螯合剂进行混合均匀，调节pH至8.0，得到所述试剂1；
2)将表面修饰有官能团的聚苯乙烯微球与加入至交联缓冲液中的新冠蛋白进行混合均匀，再加入化学交联剂与N-羟基琥珀酰亚胺进行交联，然后加入封闭剂将聚苯乙烯微球表面上未被新冠蛋白粘附的裸露区进行封闭，得到混合溶液；
3)将步骤2)中得到的所述混合溶液进行离心，取沉淀，得到包被有新冠蛋白的胶乳微粒；
4)将包被有新冠蛋白的胶乳微粒加入至储存液中振匀，然后进行超声处理，得到胶乳悬浮液；
5)将步骤4)中得到的所述胶乳悬浮液进行离心处理，吸取上层均匀胶乳，得到所述试剂2；
6)将试剂1与试剂2进行各自独立包装，得到所述新型冠状病毒抗体检测试剂盒；其中，所述封闭剂是浓度70mmol/L的甘氨酸和浓度为3wt％的牛血清白蛋白的混合物，所述储存液的原料包括20mmol/L的HEPES缓冲液、浓度为3wt％的海藻糖、浓度为1wt％的甘油和浓度为0.1wt％的Proclin300。
实施例14
与实施例13相比，所述新型冠状病毒抗体检测试剂盒还包括用于校准新型冠状病毒抗体含量的校准品溶液，所述校准品溶液的原料包括纯化水、防腐剂以及新型冠状病毒抗体，且校准品溶液中新型冠状病毒抗体含量是0-100AU/mL；所述校准品溶液中防腐剂的浓度为0.12wt％。所述防腐剂选自对羟基苯甲酸。
实施例15
与实施例14相比，除了所述防腐剂选自NaN3以及所述校准品溶液中防腐剂的浓度为0.05wt％外，其他与实施例14相同。
实施例16
与实施例14相比，除了所述防腐剂选自Proclin300以及所述校准品溶液中防腐剂的浓度为0.2wt％外，其他与实施例14相同。
实施例17
与实施例13相比，除了在所述试剂1中，所述缓冲液的pH为7.0、浓度为30mmol/L；所述促凝剂的浓度为2.0wt％；所述表面活性剂的浓度为0.265wt％；所述防腐剂的浓度为0.12wt％。所述促凝剂选自氨基丁三醇；所述表面活性剂选自曲拉通-100外，其他与实施例13相同。
实施例18
与实施例13相比，除了在所述试剂1中，所述缓冲液的pH为8.0、浓度为70mmol/L；所述促凝剂的浓度为4.0wt％；所述表面活性剂的浓度为0.3wt％；所述防腐剂的浓度为0.09wt％。所述促凝剂选自聚乙二醇；所述表面活性剂选自脂肪醇聚乙二醇醚外，其他与实施例13相同。
实施例19
与实施例13相比，除了在所述试剂2中，所述缓冲液的pH为8.0，浓度为30mmol/L；所述防腐剂浓度是0.09wt％；包被有新冠蛋白的胶乳微粒中的新冠蛋白的浓度0.8mg/mL外，其他与实施例13相同。
实施例20
与实施例13相比，除了在所述试剂2中，所述缓冲液的pH为9.0，浓度为56mmol/L；所述防腐剂浓度是0.17wt％；包被有新冠蛋白的胶乳微粒中的新冠蛋白的浓度2.5mg/mL外，其他与实施例13相同。
需要说明的是，新型冠状病毒核酸检测方法目前采用的是实时PCR荧光法。这种PCR荧光法也叫聚合酶链式反应，是通过一种分子生物学的技术用来放大这种极少见的RNA病毒。可以将新冠病毒RNA片段扩增到百万倍以上，这样更容易检测出新冠病毒。但是，PCR荧光方法必须在PCR有资质的实验室进行，因此在绝大部分基层医院是没有上述条件以及专业人员的。绝大部分的医院是通过采集咽拭纸样本，放置专用的密封袋以及送检袋，在低温下保存，及时送到有条件的实验室，但需要注意的是，检验人员都要身穿三级的防护衣，配备护目镜、N95口罩，戴两层橡胶手套等防护装备。因此，新冠核酸检测的缺点是检测不方便，操作繁琐、耗时长，对医院设施要求较高，不利于大规模筛查或急诊，且咽拭子存在生物污染的风险，且对配套设施要求高，无法应用于中低层医院和医疗卫生机构。而本发明提供的新型冠状病毒抗体检测试剂盒的特点是采用全自动生化分析仪，基层医院与检测中心都有此设备，操作方便快捷。胶乳免疫比浊法，操作简便、自动化、速度快、定量准确、灵敏度高，适用于大规模体检、筛查的需要。
需要进一步说明的是，本发明提供的新型冠状病毒抗体检测试剂盒的检测原理是：通过人体血清中SARS-CoV-2抗体与相应交联在胶乳上的SARS-CoV-2蛋白在液体中相遇，立即形成抗原-抗体复合物，并形成一定的浊度，该浊度的高低在一定量的抗原存在时与抗体的含量形成一定比例，通过与同样处理的标准血清比较，计算出样品中SARS-CoV-2抗体的浓度，从而起到辅助诊断的作用。本发明的预期用途是：1.用于早期检测：排查新冠病毒感染情况，根据检测数据分析病人情况；2.愈后检测：对于治疗恢复期间病人，可定期做定量检测，间接评价病人住院治疗后恢复情况，辅助医生做进一步诊疗。
而且，本发明的优势是：1.操作方便：医务人员抽取受检者的静脉血，离心后直接上机检测；2.检测用时短，通量大：单个样本反应时间10分钟，可在全自动生化分析仪上机检测，最高500样本/小时；3.采取均相法，新冠抗原直接捕捉抗体，避免试剂盒出现漏检与假阳性；4定量检测：正常参考范围0-1AU/mL，可用于通过抗体检测以判断疫苗是否接种成功，还可以用于体检及愈后恢复情况检测。
因此，本发明提供的新型冠状病毒抗体检测试剂盒采用胶乳增强免疫比浊法定量检测人血清中新冠抗体含量，工艺简单，只需重组原核新冠蛋白，可实现高灵敏度与反应度，同时具有良好的抗乳糜干扰能力；所述新型冠状病毒抗体检测试剂盒灵敏度高，检测低浓度样本可准确至0.1AU/mL(正常人血清中新冠抗体含量为小于1.00AU/mL)；而且，本发明的新型冠状病毒抗体检测试剂盒通过对1000例临床样本进行比对检测，数据显示，准确率100％，远超国内试剂质量水平(准确率65％-85％)，且价格较低，降低大众检测成本，检测手段简单，对医疗设备要求不高，能应用于各种自动生化分析仪。
上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种新型冠状病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，所述新型冠状病毒抗体检测试剂盒包括各自独立包装的试剂1与试剂2，其中
所述试剂1用于放置待检测新型冠状病毒抗体含量的被测样本；
所述试剂2至少包括包被有新冠蛋白的胶乳微粒，用于与被测样本中的新型冠状病毒抗体发生抗原抗体反应，以形成凝集使浊度改变并得到被测样本中的新型冠状病毒抗体含量。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，在所述新型冠状病毒抗体检测试剂盒中，所述试剂1包括促凝剂、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲液；所述试剂2包括防腐剂、缓冲液以及包被有新冠蛋白的胶乳微粒；其中
所述试剂2中的新冠蛋白是新冠病毒的重组蛋白，且pH值范围为5.0-9.5，重组蛋白的抗原种类选自新冠病毒的N蛋白和/或新冠病毒的S蛋白；所述胶乳微粒为表面修饰有官能团的聚苯乙烯微球，直径为100-200nm，所述聚苯乙烯微球表面修饰的官能团选自羧基、氨基或羟基。
3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，所述新冠蛋白通过化学交联法包被至胶乳微粒表面，其中，包被过程中的化学交联剂选自碳化亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、酰肼或异氰酸酯；包被过程中的交联缓冲液的pH是6.5-8.5，所述交联缓冲液选自MOPSO缓冲液、Tris-HCl缓冲液或HEPS缓冲液。
4.根据权利要求2所述的新型冠状病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，在所述试剂1中，所述缓冲液的pH为7.0-9.0、浓度为20-100mmol/L；所述促凝剂的浓度为1.0wt％-5.0wt％；所述表面活性剂的浓度为0.01wt％-0.5wt％；所述防腐剂的浓度为0.05wt％-0.2wt％；
在所述试剂2中，所述缓冲液的pH为7.0-9.0，浓度为20-80mmol/L；所述防腐剂浓度是0.05wt％-0.2wt％；包被有新冠蛋白的胶乳微粒中的新冠蛋白的浓度0.15-4mg/mL。
5.根据权利要求4所述的新型冠状病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂1的制备方法是按照比例将缓冲液中加入促凝剂、表面活性剂、防腐剂混合均匀，然后加入氯化钠作为电解质，再加入螯合剂进行混合均匀，调节pH至7.0-9.0，得到所述试剂1。
6.根据权利要求2所述的新型冠状病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，在所述试剂1中，所述促凝剂选自聚乙二醇、葡聚糖70、硫酸葡聚糖钠或氨基丁三醇；所述表面活性剂选自吐温、曲拉通-100或脂肪醇聚乙二醇醚。
7.根据权利要求2所述的新型冠状病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，所述新型冠状病毒抗体检测试剂盒还包括用于校准新型冠状病毒抗体含量的校准品溶液，所述校准品溶液的原料包括纯化水、防腐剂以及新型冠状病毒抗体，且校准品溶液中新型冠状病毒抗体含量是0-100AU/mL；所述校准品溶液中防腐剂的浓度范围为0.05wt％-0.2wt％。
8.根据权利要求7所述的新型冠状病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂1、试剂2和校准品溶液中的防腐剂选自NaN3、Proclin防腐剂或对羟基苯甲酸；所述试剂1和试剂2中的缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液或MOPSO缓冲液。
9.一种如权利要求1-8任一所述的新型冠状病毒抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将表面修饰有官能团的聚苯乙烯微球与加入至交联缓冲液中的新冠蛋白进行混合均匀，再加入化学交联剂与N-羟基琥珀酰亚胺进行交联，然后加入封闭剂将聚苯乙烯微球表面上未被新冠蛋白粘附的裸露区进行封闭，得到混合溶液；
2)将步骤1)中得到的所述混合溶液进行离心，取沉淀，得到包被有新冠蛋白的胶乳微粒；
3)将包被有新冠蛋白的胶乳微粒加入至储存液中振匀，然后进行超声处理，得到胶乳悬浮液；
4)将步骤3)中得到的所述胶乳悬浮液进行离心处理，吸取上层均匀胶乳，得到所述试剂2；
5)将试剂1与试剂2进行各自独立包装，得到所述新型冠状病毒抗体检测试剂盒。
10.根据权利要求9所述的新型冠状病毒抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述的新型冠状病毒抗体检测试剂盒的制备方法中，所述封闭剂是浓度50-80mmol/L的甘氨酸和浓度为2wt％-5wt％的牛血清白蛋白的混合物，所述储存液的原料包括10-30mmol/L的HEPES缓冲液、浓度为1wt％-5wt％的海藻糖、浓度为0.5wt％-1.5wt％的甘油和浓度为0.05wt％-0.15wt％的Proclin300。
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|---|---|---|---|
| CN202011460161.0A CN112730827A (zh) | 2020-12-11 | 2020-12-11 | 一种新型冠状病毒抗体检测试剂盒及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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2020
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