CN104198723A - 一种基于氨基酸间臂的ngal快速检测试剂盒 - Google Patents
一种基于氨基酸间臂的ngal快速检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104198723A CN104198723A CN201410393375.9A CN201410393375A CN104198723A CN 104198723 A CN104198723 A CN 104198723A CN 201410393375 A CN201410393375 A CN 201410393375A CN 104198723 A CN104198723 A CN 104198723A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- amino acid
- ngal
- detection kit
- arm
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了一种定量快速测定人血清(血浆)或尿液中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)的基于氨基酸间臂的NGAL快速检测试剂盒。所述试剂盒包括R1:包括生物缓冲液、表面活性剂、稳定剂、促凝剂、防腐剂;R2试剂:包括包被NGAL抗体的乳胶颗粒、生物缓冲液、保护剂、表面活性剂、防腐剂;所述R2中,抗人NGAL抗体通过氨基酸间壁与聚苯乙烯乳胶微球连接。本发明还公开了一种包被抗人NGAL抗体的乳胶颗粒的制备方法。本发明的试剂盒可灵敏度高,线性范围宽,配套用于POCT散射比浊分析仪,可达到准确快速测定人血清(血浆)或尿液中NGAL的目的。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测领域,具体涉及一种采用胶乳增强免疫比浊法测定人体血液及尿液中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)的基于氨基酸间臂的NGAL快速检测试剂盒及其制备方法,同时涉及该试剂盒检测NGAL的使用方法。
背景技术
急性肾损伤(AKI)是由各种原因引起的肾功能在短时间(几小时至几天)内突然下降而出现的临床综合症。由于早期缺乏特异性的生物指标,给该病的早期治疗带来障碍。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)是lipocalin家族的新成员,其结构与功能研究进展为人瞩目,众多研究表明NGAL基因可能是人类的一种重要的癌基因和一种重要的细菌抑制剂;NGAL还参与肾小管上皮细胞的发生及功能调控,对肾脏功能的诊断价值比传统的急性肾衰竭(ARF)实验室指标血肌酐更为快速和准确,是AKI最强有力的预测因子。因此,快速准确地测定人血液及尿液中NGAL的含量,对于急性肾损伤(AKI)的早期及时治疗具有重要意义。
目前,检测NGAL方法主要有酶联免疫法(中国专利CN102072960A)、基于抗体免疫的微型柱测试法(中国专利CN101163971),普通的胶乳增强比浊法(中国专利CN102072960A),化学发光法(中国专利CN102967714A)等。但这些方法受到专门特定仪器的影响,不易于达到快速检测的目的。
其中,南京基蛋生物科技有限公司利用胶体金试纸条(中国专利CN102759623A)、纳米磁珠免疫试纸条纸条(中国专利CN202676708)、荧光纳米免疫层析试纸条(中国专利CN202837307)对血液中的NGAL进行快速测定,但这些都是半定量测定方法,测定准确性有待提高。
武汉生之源生物科技有限公司(中国专利CN102253217A、CN103048464)与南京诺尔曼生物科技有限公司(中国专利CN102680698)利用胶乳增强比浊法开发出用于生化分析仪测定NGAL的试剂,其采用传统偶联方法,即直接将抗体偶联至羧基化乳胶微球,这样势必会使一部分抗体不能正确定向偶联,导致抗体Fab端结合抗原时空间位阻增大,而使得检测灵敏度和线性受到一定影响;且其未报道试剂用于快速检测时的检测性能评价。
若在聚苯乙烯微球与偶联抗体之间增加一个合适的间臂,则可以减小抗原抗体结合空间位阻,达到抗体利用最大化,从而达到提高其检测灵敏度及线性范围的效果,使试剂可配套简单小型化仪器,达到快速准确检测的效果。
发明内容
发明目的:本发明的第一个目的是提供检测浓度范围达0-8000ng/ml,快速、准确、高灵敏度,配套用于散射比浊快速检测仪的一种基于氨基酸间臂的NGAL快速检测试剂盒,并提供所述检测试剂盒的使用方法。本发明的第二个目的是提供了一种包被抗人NGAL抗体的制备方法。
技术方案:为了解决上述问题,本发明的技术方案是提供了一种基于氨基酸间臂的NGAL快速检测试剂盒,包括试剂R1与试剂R2组成,所述R1包括生物缓冲液A、表面活性剂、保护剂、促凝剂、防腐剂;所述R2包括包被抗人NGAL抗体的乳胶颗粒、生物缓冲液B、保护剂、表面活性剂、防腐剂。
其中,所述抗人NGAL抗体是多克隆抗体或单克隆抗体或两者的混合。优选多克隆抗体,其可以是鼠源、兔源或羊源抗体,优选兔源多克隆抗体。
其中,所述包被抗人NGAL抗体的乳胶颗粒是通过氨基酸间臂介导连接乳胶微球与抗人NGAL抗体制备得到。
其中,所述氨基酸间臂为α-氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸、δ-氨基酸或其他具有氨基及羧基的脂肪链。即具有以下结构式的氨基酸及在其基础上的衍生物:CH3(CH2)nCH(NH2)(CH2)iCOOH(n≥0,i≥0)或NH2(CH2)nCOOH(n≥1)及其衍生物。优选含4-9碳的具有NH2(CH2)nCOOH(n≥1)结构式的氨基酸及其衍生物,最优选的为6-氨基己酸。1g聚苯乙烯微球体系中加入氨基酸的范围:0.1-100mmol,优选5-20mmol,最优选15mmol。
试剂R1或试剂R2中的生物缓冲液是用来维持体系一定pH值的生物缓冲液。其中,所述生物缓冲液A为磷酸盐缓冲液、Tris–盐酸缓冲液、硼酸–硼砂缓冲液或甘氨酸缓冲液中的一种,优选磷酸盐缓冲液;所述缓冲液A的浓度为20-200mM,优选40-60mM,pH为6-10,优选7-8;所述NGAL试剂盒R2中的缓冲液B可以是4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液、磷酸盐缓冲液;Tris–盐酸缓冲液、硼酸–硼砂缓冲液等,优选HEPES缓冲液;所述缓冲液B的浓度为1-200mM,优选5-20mM,pH为6-10,优选7-8。
试剂R1或试剂R2中表面活性剂主要起促进体系中各组分及样本中物质的分散,减小样本浊度对测定的影响,所以只要能起分散增溶效果的表面活性剂都可以作为R1和R2中的表面活性剂;其中,所述表面活性剂为TritonX-100,BL-9,Tween-20,Tween-80,皂素中的一种或多种。优选Tween-20;所述表面活性剂浓度为0.01-5%,优选0.1%。
保护剂是能够保护乳胶颗粒表面包被抗体稳定性的物质。其中,所述保护剂为糖类、醇类、蛋白类以及多聚氨基酸类中的一种或多种。本发明优选血清白蛋白(BSA),所述保护剂浓度为0.01-10%,优选0.1%。
试剂R1中促凝剂主要作用是通过破坏溶液中蛋白周围的水化层和双电层,促进抗原抗体相互接近,加速反应进程。其中,所述促凝剂为PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG20000中的一种或多种。优选PEG6000,所述促凝剂浓度为1-6%,优选2.5%。
试剂R1或试剂R2中添加防腐剂是为了抑制试剂中微生物的滋生与生长。其中,所述防腐剂为NaN3、硫柳汞、proclin300中的一种或多种。优选NaN3,所述防腐剂浓度为0.01-1%,优选0.1%。
一种包被抗人NGAL抗体的乳胶颗粒的制备方法,包括以下步骤:
1)羧基化聚苯乙烯微球的活化;
2)氨基酸间臂与羧基化聚苯乙烯微球偶联;
3)接有氨基酸间臂微球的再活化;
4)NGAL抗体偶联至氨基酸间臂。
其制备方法具体包括:
(1)羧基化聚苯乙烯微球的活化:取粒径为100-140nm的聚苯乙烯微球,用活化缓冲液清洗分散后,加入水溶性碳化二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS),室温搅拌反应;离心弃上清,用反应缓冲液分散均匀沉淀颗粒,得到活化的聚苯乙烯微球。
(2)氨基酸间臂与羧基化聚苯乙烯微球偶联:向活化的聚苯乙烯微球中加入适量氨基酸,室温搅拌反应适当时间,离心洗2次,用活化缓冲液分散均匀沉淀颗粒,得到连有氨基酸间壁的聚苯乙烯微球。
(3)接有氨基酸间臂微球的再活化:向步骤(2)中制备的连有氨基酸间壁的聚苯乙烯微球中加入水溶性碳化二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚(Sulfo-NHS)对氨基酸间臂游离羧基进行再活化,室温搅拌反应;离心清洗2次,用反应缓冲液分散均匀沉淀颗粒。
(4)NGAL抗体偶联至氨基酸间臂:向步骤(3)中制备的再活化微球中加入适量抗人NGAL抗体,室温反应2-6h,加入乙醇胺及BSA封闭15-60mim,洗两次后,保存于含保护剂、表面活性剂、防腐剂的生物缓冲液B中,即R2。
步骤(1)(2)中所述活化缓冲液pH4-7,优选pH5.6;步骤(1)(3)(4)中所述反应缓冲液pH4-8,优选pH6.2;步骤(1)(2)(3)(4)中所述乳胶微球活化或反应时占总体系浓度为0.2-2%,优选1%;步骤(4)所述R2中,包被NGAL抗体微球含量为0.05%-0.4%,优选0.2%。
本试剂盒制备过程中所需的各种试剂及生物活性蛋白均可从试剂公司或生物技术公司购得。
本发明同时提供所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)试剂盒检测血清(血浆)或尿液中NGAL含量的使用方法。包括以下步骤:向预热至37℃的400μl R1中加入2.5μl血清(血浆)或尿液样本,混合均匀,加入100μl R2,混匀后插入散射比浊分析仪,在90s内测定散射光强度变化值△A,仪器根据预先写入射频卡中的校准曲线自动计算出样本中NGAL的值。
有益效果:
(1)本发明在乳胶增强比浊法原理的基础上,通过在乳胶微球与抗体之间增加一氨基酸间臂,减小了抗体不定向偶联造成的抗原抗体结合空间位阻,从而提高了检测试剂的灵敏度与线性范围。
(2)由于该试剂灵敏度高、线性范围广,本发明试剂盒可配套散射比浊分析仪,用于快速、准确地测定人血清(血浆)及尿中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)的含量。
附图说明
图1为本发明实施例1所制备试剂的校准曲线;
图2为本发明试剂盒与对比实施例试剂盒的标准曲线的比较;
图3为本发明试剂盒(实施例1)线性范围试验结果;
图4本发明试剂盒(实施例1)37℃热稳定性试验结果;
图5本发明试剂盒(实施例1)检测系统与北京九强试剂盒检测系统检测血清样本的相关性比较;
图6本发明试剂盒(实施例1)检测系统与北京九强试剂盒检测系统检测尿液样本的相关性比较。
具体实施方式
本发明公开了一种含有氨基酸间臂的定量测定中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)的乳胶增强比浊试剂盒及其使用方法,本领域技术人员可以借鉴本文,适当改进工艺参数实现。在不偏离本发明精神和范围下对本发明的替换或修改,均被视为落入本发明保护范围内。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,但不对本发明的范围构成任何限制。
实施例1基于氨基酸间臂的NGAL快速检测试剂盒的制备:
1.NGAL试剂1(R1)的配制
50mM pH7.4的磷酸盐缓冲液中加入Tween-20、BSA、PEG-6000、NaCl、NaN3,使终浓度为Tween-20 0.1%、BSA 0.1%、PEG-6000 2.5%、NaCl 0.8%、NaN3 0.1%,抽滤除菌,即为试剂1(R1)。
2.NGAL试剂2(R2)的配制
(1)羧基化聚苯乙烯微球的活化:
取粒径为110nm,固含量为10%的羧基化聚苯乙烯微球(Bangs Laboratories,Inc.)1ml加入至离心管中,加入活化缓冲液(50mM pH5.5 MES buffer)9ml,离心,倾去上清,反复洗2次。洗涤后加入5ml活化缓冲液重悬微球,接着向其中分别加入2.5ml9.6mg/ml的Sulfo-NHS与2.5ml 12mg/ml的EDC(均溶于活化缓冲液),立即震荡混匀,置于血液混匀仪室温混匀反应20min。将活化微球离心,用反应缓冲液(50mM pH6.2MES buffer)清洗2次。再加入5ml反应缓冲液重悬,超声分散,备用。
(2)氨基酸间臂与羧基化聚苯乙烯微球偶联:
称取适量6-氨基己酸溶于反应缓冲液中,使6-氨基己酸浓度为0.3mmol/ml。向步骤①中制备的活化胶乳中加入5ml含6-氨基己酸的反应缓冲液,立即震荡混匀,室温混匀反应1h,离心清洗2次,加入5ml活化缓冲液重悬,超声分散均匀得到活化胶乳,备用。
(3)接有氨基酸间臂微球的再活化:
向步骤(2)中制备的接有氨基酸间臂微球分散液中分别加入2.5ml 9.6mg/ml的Sulfo-NHS与2.5ml 12mg/ml的EDC(均溶于活化缓冲液),立即震荡混匀,室温混匀反应20min,离心清洗2次,加入5ml反应缓冲液重悬,超声分散均匀,备用。
(4)NGAL抗体偶联至氨基酸间臂:
向步骤(3)中制备的分散液中加入5ml 1mg/ml的羊抗人NGAL多克隆抗体(用反应缓冲液稀释后的抗体)(购自上海元升生物科技有限公司),立即震荡混匀,室温混匀反应2h。尔后向反应体系中加入50μl乙醇胺及50mg BSA,封闭反应20min。用保存缓冲液对已致敏乳胶微球清洗3次,超声分散后保存于50ml保存缓冲液(10mM pH 7.4HEPES buffer,其中含0.1%BSA,0.8%NaCl,0.1%Tween-20,0.1%NaN3)中。此即为试剂2(R2)。
实施例2基于氨基酸间臂的NGAL快速检测试剂盒的制备:
1.NGAL试剂1(R1)的配制
50mM pH7.4的磷酸盐缓冲液中加入Tween-20、BSA、PEG-4000、NaCl、NaN3,使终浓度为TritonX-100 0.01%、BSA 0.01%、PEG-4000 1%、NaCl 0.8%、硫柳汞0.01%,抽滤除菌,即为试剂1(R1)。
2.NGAL试剂2(R2)的配制
(1)羧基化聚苯乙烯微球的活化:
取粒径为120nm,固含量为10%的羧基化聚苯乙烯微球(Bangs Laboratories,Inc.)1ml加入至离心管中,加入活化缓冲液(50mM pH5.5 MES buffer)9ml,离心,倾去上清,反复洗2次。洗涤后加入5ml活化缓冲液重悬微球,接着向其中分别加入2.5ml9.6mg/ml的Sulfo-NHS与2.5ml 12mg/ml的EDC(均溶于活化缓冲液),立即震荡混匀,置于血液混匀仪室温混匀反应20min。将活化微球离心,用反应缓冲液(50mM pH6.2MES buffer)清洗2次。再加入5ml反应缓冲液重悬,超声分散得到活化胶乳,备用。
(2)氨基酸间臂与羧基化聚苯乙烯微球偶联:
称取适量4-氨基丁酸溶于反应缓冲液中,使4-氨基丁酸浓度为0.3mmol/ml。向步骤①中制备的活化胶乳中加入5ml含4-氨基丁酸的反应缓冲液,立即震荡混匀,室温混匀反应1h,离心清洗2次,加入5ml活化缓冲液重悬,超声分散均匀,备用。
(3)接有氨基酸间臂微球的再活化:
向步骤(2)中制备的接有氨基酸间臂微球分散液中分别加入2.5ml 9.6mg/ml的Sulfo-NHS与2.5ml 12mg/ml的EDC(均溶于活化缓冲液),立即震荡混匀,室温混匀反应20min,离心清洗2次,加入5ml反应缓冲液重悬,超声分散均匀,备用。
(4)NGAL抗体偶联至氨基酸间臂:
向步骤(3)中制备的分散液中加入5ml 1mg/ml的羊抗人NGAL多克隆抗体(用反应缓冲液稀释后的抗体)(购自上海元升生物科技有限公司),立即震荡混匀,室温混匀反应2h。尔后向反应体系中加入50μl乙醇胺及50mg BSA,封闭反应20min。用保存缓冲液对已致敏乳胶微球清洗3次,超声分散后保存于50ml保存缓冲液(10mM pH 7.4HEPES buffer,其中含0.1%BSA,0.8%NaCl,0.1%Tween-20,0.1%NaN3)中。此即为试剂2(R2)。
实施例3基于氨基酸间臂的NGAL快速检测试剂盒的制备:
1.NGAL试剂1(R1)的配制
50mM pH7.4的磷酸盐缓冲液中加入BL-9、BSA、PEG-4000、NaCl、NaN3,使终浓度为BL-9 5%、BSA 10%、PEG-8000 1%、NaCl 0.8%、proclin300 1%,抽滤除菌,即为试剂1(R1)。
2.NGAL试剂2(R2)的配制
(1)羧基化聚苯乙烯微球的活化:
取粒径为140nm,固含量为10%的羧基化聚苯乙烯微球(Bangs Laboratories,Inc.)1ml加入至离心管中,加入活化缓冲液(50mM pH5.5 MES buffer)9ml,离心,倾去上清,反复洗2次。洗涤后加入5ml活化缓冲液重悬微球,接着向其中分别加入2.5ml9.6mg/ml的Sulfo-NHS与2.5ml 12mg/ml的EDC(均溶于活化缓冲液),立即震荡混匀,置于血液混匀仪室温混匀反应20min。将活化微球离心,用反应缓冲液(50mM pH6.2MES buffer)清洗2次。再加入5ml反应缓冲液重悬,超声分散得到活化胶乳,备用。
(2)氨基酸间臂与羧基化聚苯乙烯微球偶联:
称取适量9-氨基壬酸溶于反应缓冲液中,使9-氨基壬酸浓度为0.3mmol/ml。向步骤①中制备的活化胶乳中加入5ml含9-氨基壬酸的反应缓冲液,立即震荡混匀,室温混匀反应1h,离心清洗2次,加入5ml活化缓冲液重悬,超声分散均匀,备用。
(3)接有氨基酸间臂微球的再活化:
向步骤(2)中制备的接有氨基酸间臂微球分散液中分别加入2.5ml 9.6mg/ml的Sulfo-NHS与2.5ml 12mg/ml的EDC(均溶于活化缓冲液),立即震荡混匀,室温混匀反应20min,离心清洗2次,加入5ml反应缓冲液重悬,超声分散均匀,备用。
(4)NGAL抗体偶联至氨基酸间臂:
向步骤(3)中制备的分散液中加入5ml 1mg/ml的羊抗人NGAL多克隆抗体(用反应缓冲液稀释后的抗体)(购自上海元升生物科技有限公司),立即震荡混匀,室温混匀反应2h。尔后向反应体系中加入50μl乙醇胺及50mg BSA,封闭反应20min。用保存缓冲液对已致敏乳胶微球清洗3次,超声分散后保存于50ml保存缓冲液(10mM pH 7.4HEPES buffer,其中含0.1%BSA,0.8%NaCl,0.1%Tween-20,0.1%NaN3)中。此即为试剂2(R2)。
实施例4基于氨基酸间臂的NGAL快速检测试剂盒的检测方法(检测系统):
1、NGAL校准品的配制
将市售的人源性中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)抗原(购至武汉华美生物科技有限公司)溶于以下溶液:0.5%蔗糖,1%BSA,0.1%NaN3,0.8%NaCl,50mMpH7.4 PBS中,制成不同浓度的校准品,用北京九强NGAL试剂配套岛津CL-8000生化仪对不同浓度的校准品分别检测20次(高值需稀释后测定),求出均值,得到NGAL校准品的浓度:0ng/ml,200ng/ml,1000ng/ml,2000ng/ml,4000ng/ml,8000ng/ml。
2、定标卡的制备:在PA8800系类散射比浊分析仪(激光波长650nm)上,根据以下反应体系:R1:400μl,校准品样本:2.5μl,R2:100μl,反应90s后,用Spline函数绘制校准品浓度—散射光光信号变化值(△A)曲线(图1),通过普朗医用设备有限公司开发的上位机将函数写入射频卡。当测定样本时,只需在PA8800散射比浊分析仪上刷卡,机器即自动定标。每批试剂对应一个函数的射频卡,不同批次定标射频卡不可混用。
3、PA8800系列散射比浊分析仪检测:将血清(血浆)或尿液2.5μl加入预热至37℃的R1(400μl),混匀,加入100μl R2,混匀后插入PA8800散射比浊分析仪,在90s内测定散射光强度变化值△A,仪器根据预先写入射频卡中的校准曲线自动计算出样本中NGAL的值。
对比实施例1
基于氨基酸间臂的NGAL快速检测试剂盒的制备:
1.NGAL试剂1(R1)的配制
50mM pH7.4的磷酸盐缓冲液中加入Tween-20、BSA、PEG-6000、NaCl、NaN3,使终浓度为Tween-20 0.1%、BSA 0.1%、PEG-6000 2.5%、NaCl 0.8%、NaN3 0.1%,抽滤除菌,即为试剂1(R1)。
(1)羧基化聚苯乙烯微球的活化:
取粒径为110nm,固含量为10%的羧基化聚苯乙烯微球1ml加入至离心管中,加入活化缓冲液(50mM pH5.5 MES buffer)9ml,离心,倾去上清,反复洗2次。洗涤后加入5ml活化缓冲液重悬微球,接着向其中分别加入2.5ml 9.6mg/ml的Sulfo-NHS与2.5ml12mg/ml的EDC(均溶于活化缓冲液),立即震荡混匀,置于血液混匀仪室温混匀反应20min。将活化微球离心,用反应缓冲液(50mM pH6.2 MES buffer)清洗2次。再加入5ml反应缓冲液,重悬,超声分散,备用。
(2)NGAL抗体偶联至活化微球:
向步骤(1)中制备的分散液中加入5ml 1mg/ml的羊抗人NGAL多克隆抗体(用反应缓冲液稀释后的抗体),立即震荡混匀,室温混匀反应2h,尔后向反应体系中加入50μl乙醇胺及50mg BSA,封闭反应20min。用保存缓冲液对已致敏乳胶微球清洗3次,超声分散后保存于50ml保存缓冲液(10mM pH 7.4 HEPES buffer,其中含0.1%BSA,0.8%NaCl,0.1%Tween-20,0.1%NaN3)中。此即为试剂2(R2)。
试验例1
本发明检测试剂盒与对比实施例试剂盒线性范围及灵敏度的比较:
参照实施例4的方法,对实施例1-3所制备的NGAL试剂盒与对比实施例1制备的乳胶增强比浊试剂盒进行标准工作曲线的绘制。结果如图2所示。由图2可见,本发明NGAL检测试剂盒线性范围及灵敏度均大幅度优于对比实施例检测试剂盒;其中实施例1制备的试剂盒灵敏度及线性范围优于实施例2、实施例3制备的试剂盒。
试验例2
本发明检测试剂盒(实施例1)线性范围确定:
将接近线性范围上限的NGAL高浓度样本(8050.3mg/L),用生理盐水将其按1/2、1/4、1/8、1/32、1/64、1/128、1/256稀释,制成8个浓度梯度(Xi)的溶液,用PA8800系类散射比浊分析仪测定各稀释梯度样本的浓度,每个浓度测定3次,分别求出其平均值(Yi);以稀释浓度(Xi)为自变量,实际测定结果平均值(Yi)为应变量,求出线性回归方程及相关系数。结果显示回归方程为y=1.01258x-3.42094,相关系数r=0.9999。表明本发明试剂在0-8000ng/L范围内线性相关性较好(图3)。
试验例3
本发明检测试剂盒(实施例1)灵敏度(最低检测限)确定:
以5%BSA溶液作为空白样本,按所述散射比浊分析仪检测方法重复检测20次,以空白均值加2倍标准差作为最低检测限,结果显示,本发明试剂盒最低检测限为1.88ng/ml。
试验例4
本发明检测试剂盒(实施例1)测量精密度确定:
在重复性条件下,用两个不同水平浓度的质血清测试试剂盒,重复测试10次,分
别计算测量值的平均值和标准差(s)。按公式(1)计算变异系数(CV)。
结果显示(表1),本发明试剂盒精密度良好,低值CV值为1.18%,高值CV值为0.55%。
表1本发明检测试剂盒(实施例1)测量精密度结果
试验例5
本发明检测试剂盒(实施例1)的稳定性:
1.长期稳定性
按所述散射比浊分析仪测定方法,用2-8℃贮存前与贮存12个月后的本发明检测试剂盒分别对校准品1(标示值200ng/ml)与校准品2(标示值2000ng/ml)进行测定5次。计算检测结果的平均值与校准品标示值的相对偏差,并计算试剂盒贮存前后测定数据t检验的P值。由表2可见,对于校准品1,本试剂盒贮存前后测定相对偏差分别为0.250%和0.555%,两组重复测定数据比较分析的P值>0.05;对于校准品2,本试剂盒贮存前后测定相对偏差分别为-0.190%和-1.115%,两组重复测定数据比较分析的P值>0.05;说明2-8℃贮存12个月后的测定结果比较可靠,且贮存前后结果无显著差异,该试剂至少可稳定保存12个月。
表2本发明检测试剂盒(实施例1)长期稳定性测定考察
2.热稳定性
将本发明NGAL检测试剂盒于37℃处理7天,期间0天、2天、5天、7天分别测定NGAL校准品,记录其△A值,绘制其NGAL浓度-△A值曲线。如图4可见,本发明试剂盒37℃热处理稳定性良好。
试验例6
本发明试剂检测系统与现有生化检测系统比较:
南京市第一医院提供的住院患者血清及尿液样本各50例。用本发明NGAL检测试剂盒配套PA8800散射比浊分析仪检测系统与北京九强公司NGAL乳胶增强比浊试剂盒配套岛津CL-8000检测系统进行测定结果比对。每个样本测定2次,分别计算平均值。对血清及尿液各50例样本测定结果进行线性回归分析,计算两个测定系统的相关系数;并对两系统测定结果进行配对t检验分析。
结果显示,测定血清样本时,两检测试剂系统相关系数为:r=0.9996,线性回归方程为:y=1.00527-1.27279(图5);测定尿液样本时,两检测系统相关系数为:r=0.9998,线性回归方程为:y=0.99927x+0.93502(图6)。两系统测定样本数据配对t检验结果:P=0.4413>0.05(测定血清样本);P=0.8056>0.05(测定尿液样本)。这就说明本发明试剂盒配套PA8800散射比浊分析仪检测系统与北京九强公司NGAL乳胶增强比浊试剂盒配套岛津CL-8000检测系统具有较好的相关性,两者之间无显著差异。由此可见,本发明NGAL快速检测试剂系统可以替代生化仪检测系统,对人血清(血浆)及尿液中的NGAL含量进行快速、准确的测定。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于氨基酸间臂的NGAL快速检测试剂盒,其特征在于,包括试剂R1与试剂R2,所述R1包括生物缓冲液A、表面活性剂、保护剂、促凝剂、防腐剂;所述R2包括包被抗人NGAL抗体的乳胶颗粒、生物缓冲液B、保护剂、表面活性剂、防腐剂。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述抗人NGAL抗体是多克隆抗体或单克隆抗体或两者的混合。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述包被抗人NGAL抗体的乳胶颗粒是通过氨基酸间臂介导连接乳胶微球与抗人NGAL抗体制备得到。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒,其特征在于,所述氨基酸间臂为α-氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸、δ-氨基酸或其他具有氨基及羧基的脂肪链。
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述生物缓冲液A为磷酸盐缓冲液、Tris–盐酸缓冲液、硼酸–硼砂缓冲液或甘氨酸缓冲液中的一种。
6.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述表面活性剂为TritonX-100,BL-9,Tween-20,Tween-80,皂素中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述保护剂为糖类、醇类、蛋白类以及多聚氨基酸类中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述促凝剂为PEG4000、PEG6000 、PEG8000、PEG20000中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述防腐剂为NaN3、硫柳汞、proclin300中的一种或多种。
10.一种权利要求1所述的包被抗人NGAL抗体的乳胶颗粒的制备方法,包括以下步骤:
1)羧基化聚苯乙烯微球的活化;
2)氨基酸间臂与羧基化聚苯乙烯微球偶联;
3)接有氨基酸间臂微球的再活化;
4)NGAL抗体偶联至氨基酸间臂。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410393375.9A CN104198723A (zh) | 2014-08-11 | 2014-08-11 | 一种基于氨基酸间臂的ngal快速检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410393375.9A CN104198723A (zh) | 2014-08-11 | 2014-08-11 | 一种基于氨基酸间臂的ngal快速检测试剂盒 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104198723A true CN104198723A (zh) | 2014-12-10 |
Family
ID=52084042
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410393375.9A Pending CN104198723A (zh) | 2014-08-11 | 2014-08-11 | 一种基于氨基酸间臂的ngal快速检测试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104198723A (zh) |
Cited By (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105259150A (zh) * | 2015-11-02 | 2016-01-20 | 深圳市锦瑞电子有限公司 | 一种荧光分析仪定标系统 |
CN105758835A (zh) * | 2016-05-04 | 2016-07-13 | 成都爱兴生物科技有限公司 | 一种均相免疫分析poct检测技术及使用该技术的系统 |
CN105891497A (zh) * | 2014-12-19 | 2016-08-24 | 北京科美生物技术有限公司 | 一种降钙素原胶体金免疫比色法定量检测试剂盒及其制备方法 |
CN105891508A (zh) * | 2016-04-12 | 2016-08-24 | 上海奥普生物医药有限公司 | 一种快速定量检测h-fabp的时间分辨荧光免疫层析试剂及制备方法 |
CN106153927A (zh) * | 2016-04-12 | 2016-11-23 | 上海奥普生物医药有限公司 | 一种快速定量同时检测cTnI、CKMB、Myo的时间分辨荧光免疫层析试剂及制备方法 |
CN106248958A (zh) * | 2016-07-21 | 2016-12-21 | 上海奥普生物医药有限公司 | 一种定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂及制备方法 |
CN106248927A (zh) * | 2016-07-21 | 2016-12-21 | 上海奥普生物医药有限公司 | 一种快速定量检测ck‑mb的时间分辨荧光免疫层析试剂及制备方法 |
CN106443004A (zh) * | 2016-04-12 | 2017-02-22 | 上海奥普生物医药有限公司 | 一种快速定量同时检测cTnI、H‑FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂及制备方法 |
CN106483297A (zh) * | 2016-09-29 | 2017-03-08 | 浙江达美生物技术有限公司 | 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂及制备方法 |
CN107167586A (zh) * | 2017-07-06 | 2017-09-15 | 四川新健康成生物股份有限公司 | 一种抗链球菌溶血素o检测试剂盒及其制备方法 |
CN107656070A (zh) * | 2017-11-16 | 2018-02-02 | 山东诺安爱迪尔生物工程有限公司 | 一种稳定、特异性高的降钙素原检测试剂盒 |
CN110133276A (zh) * | 2019-04-01 | 2019-08-16 | 芜湖森爱驰生物科技有限公司 | 一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒 |
CN110749731A (zh) * | 2019-10-18 | 2020-02-04 | 北京协和洛克生物技术有限责任公司 | 定量检测氧化低密度脂蛋白的时间分辨免疫层析试剂盒及应用 |
CN111912990A (zh) * | 2020-08-12 | 2020-11-10 | 山东博科生物产业有限公司 | 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒 |
CN112269024A (zh) * | 2020-10-15 | 2021-01-26 | 上海捷门生物技术有限公司 | 白细胞介素-6的检测试剂、试纸、试剂盒及其应用 |
CN113030461A (zh) * | 2021-03-12 | 2021-06-25 | 北京华科泰生物技术股份有限公司 | 含氨基或羧基基团物质标记的IgG抗体、人IgG磁微粒化学检测试剂盒及其制备方法 |
CN113024669A (zh) * | 2021-03-12 | 2021-06-25 | 北京华科泰生物技术股份有限公司 | 含氨基或羧基基团物质标记的rbp抗体、人rbp免疫层析检测试剂盒及其制备方法 |
CN114200126A (zh) * | 2021-12-09 | 2022-03-18 | 牟奕 | N型青霉素类与头孢菌素类抗生素抗体检测的固相矩阵及其制备方法 |
CN116200414A (zh) * | 2022-08-31 | 2023-06-02 | 天津华科泰生物技术有限公司 | 一种重组人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白及其制备方法和应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011017682A1 (en) * | 2009-08-07 | 2011-02-10 | Rules-Based Medicine, Inc. | Devices for detecting renal disorders |
CN102243241A (zh) * | 2011-04-07 | 2011-11-16 | 武汉生之源生物科技有限公司 | 一种匀相溶胶颗粒型中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂盒及其制备方法 |
CN102492075A (zh) * | 2011-12-08 | 2012-06-13 | 天津医科大学 | 具有间隔臂的纳米级羧化聚苯乙烯微球及制备方法 |
CN102621296A (zh) * | 2012-01-06 | 2012-08-01 | 天津医科大学 | 一种带有间隔臂的羧化聚苯乙烯微球上偶联蛋白质的方法 |
CN103048464A (zh) * | 2012-10-17 | 2013-04-17 | 武汉生之源生物科技有限公司 | 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒及其制备方法 |
-
2014
- 2014-08-11 CN CN201410393375.9A patent/CN104198723A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011017682A1 (en) * | 2009-08-07 | 2011-02-10 | Rules-Based Medicine, Inc. | Devices for detecting renal disorders |
CN102243241A (zh) * | 2011-04-07 | 2011-11-16 | 武汉生之源生物科技有限公司 | 一种匀相溶胶颗粒型中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂盒及其制备方法 |
CN102492075A (zh) * | 2011-12-08 | 2012-06-13 | 天津医科大学 | 具有间隔臂的纳米级羧化聚苯乙烯微球及制备方法 |
CN102621296A (zh) * | 2012-01-06 | 2012-08-01 | 天津医科大学 | 一种带有间隔臂的羧化聚苯乙烯微球上偶联蛋白质的方法 |
CN103048464A (zh) * | 2012-10-17 | 2013-04-17 | 武汉生之源生物科技有限公司 | 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒及其制备方法 |
Cited By (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105891497A (zh) * | 2014-12-19 | 2016-08-24 | 北京科美生物技术有限公司 | 一种降钙素原胶体金免疫比色法定量检测试剂盒及其制备方法 |
CN105259150A (zh) * | 2015-11-02 | 2016-01-20 | 深圳市锦瑞电子有限公司 | 一种荧光分析仪定标系统 |
CN105891508A (zh) * | 2016-04-12 | 2016-08-24 | 上海奥普生物医药有限公司 | 一种快速定量检测h-fabp的时间分辨荧光免疫层析试剂及制备方法 |
CN106153927A (zh) * | 2016-04-12 | 2016-11-23 | 上海奥普生物医药有限公司 | 一种快速定量同时检测cTnI、CKMB、Myo的时间分辨荧光免疫层析试剂及制备方法 |
CN106443004A (zh) * | 2016-04-12 | 2017-02-22 | 上海奥普生物医药有限公司 | 一种快速定量同时检测cTnI、H‑FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂及制备方法 |
CN105758835B (zh) * | 2016-05-04 | 2018-03-27 | 成都爱兴生物科技有限公司 | 一种均相免疫分析poct检测方法及使用该检测方法的系统 |
CN105758835A (zh) * | 2016-05-04 | 2016-07-13 | 成都爱兴生物科技有限公司 | 一种均相免疫分析poct检测技术及使用该技术的系统 |
CN106248958A (zh) * | 2016-07-21 | 2016-12-21 | 上海奥普生物医药有限公司 | 一种定量检测cTnI的荧光免疫层析试剂及制备方法 |
CN106248927A (zh) * | 2016-07-21 | 2016-12-21 | 上海奥普生物医药有限公司 | 一种快速定量检测ck‑mb的时间分辨荧光免疫层析试剂及制备方法 |
CN106483297A (zh) * | 2016-09-29 | 2017-03-08 | 浙江达美生物技术有限公司 | 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂及制备方法 |
CN107167586A (zh) * | 2017-07-06 | 2017-09-15 | 四川新健康成生物股份有限公司 | 一种抗链球菌溶血素o检测试剂盒及其制备方法 |
CN107656070A (zh) * | 2017-11-16 | 2018-02-02 | 山东诺安爱迪尔生物工程有限公司 | 一种稳定、特异性高的降钙素原检测试剂盒 |
CN110133276A (zh) * | 2019-04-01 | 2019-08-16 | 芜湖森爱驰生物科技有限公司 | 一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒 |
CN110749731A (zh) * | 2019-10-18 | 2020-02-04 | 北京协和洛克生物技术有限责任公司 | 定量检测氧化低密度脂蛋白的时间分辨免疫层析试剂盒及应用 |
CN111912990A (zh) * | 2020-08-12 | 2020-11-10 | 山东博科生物产业有限公司 | 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒 |
CN111912990B (zh) * | 2020-08-12 | 2023-12-29 | 山东博科生物产业有限公司 | 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒 |
CN112269024A (zh) * | 2020-10-15 | 2021-01-26 | 上海捷门生物技术有限公司 | 白细胞介素-6的检测试剂、试纸、试剂盒及其应用 |
CN113030461A (zh) * | 2021-03-12 | 2021-06-25 | 北京华科泰生物技术股份有限公司 | 含氨基或羧基基团物质标记的IgG抗体、人IgG磁微粒化学检测试剂盒及其制备方法 |
CN113024669A (zh) * | 2021-03-12 | 2021-06-25 | 北京华科泰生物技术股份有限公司 | 含氨基或羧基基团物质标记的rbp抗体、人rbp免疫层析检测试剂盒及其制备方法 |
CN113030461B (zh) * | 2021-03-12 | 2022-04-22 | 北京华科泰生物技术股份有限公司 | 含氨基或羧基基团物质标记的IgG抗体、人IgG磁微粒化学检测试剂盒及其制备方法 |
CN113024669B (zh) * | 2021-03-12 | 2022-06-14 | 北京华科泰生物技术股份有限公司 | 含氨基或羧基基团物质标记的rbp抗体、人rbp免疫层析检测试剂盒及其制备方法 |
CN114200126A (zh) * | 2021-12-09 | 2022-03-18 | 牟奕 | N型青霉素类与头孢菌素类抗生素抗体检测的固相矩阵及其制备方法 |
CN116200414A (zh) * | 2022-08-31 | 2023-06-02 | 天津华科泰生物技术有限公司 | 一种重组人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白及其制备方法和应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104198723A (zh) | 一种基于氨基酸间臂的ngal快速检测试剂盒 | |
CN102759631B (zh) | 一种定量检测降钙素原pct的胶乳增强免疫比浊试剂盒 | |
CN102253217B (zh) | 一种胶乳颗粒增强型中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒 | |
CN103604930B (zh) | 一种脂蛋白(a)检测试剂盒 | |
CN103852584B (zh) | 一种定量检测c肽的胶乳增强免疫比浊试剂盒 | |
CN111337691B (zh) | 一种灵敏、稳定的血清降钙素原测定试剂盒及其制备方法和应用 | |
CN101699287B (zh) | 匀相溶胶颗粒型胱抑素c测定试剂盒及其制备方法 | |
CN107727869A (zh) | 一种测定血清中抗核抗体的试剂盒及其制备方法 | |
CN104237525A (zh) | 一种用于测定降钙素原的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和应用 | |
CN104198732A (zh) | 一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒 | |
CN103123319A (zh) | 心型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒及其制备方法 | |
CN109725160B (zh) | 一种降钙素原(pct)检测试剂盒 | |
CN104849473A (zh) | 一种尿微量白蛋白检测试剂盒及其制备 | |
WO2022100240A1 (zh) | 一种抗链球菌溶血素o检测试剂盒 | |
CN104407159A (zh) | 一种免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒 | |
CN103323596B (zh) | 髓过氧化物酶含量检测试剂盒及其制备方法 | |
CN102128924A (zh) | 乳胶增强免疫比浊法测定尿液转铁蛋白试剂盒及其制备方法 | |
CN106324254A (zh) | 一种抗胰岛素抗体检测试剂盒及其检测方法 | |
CN102866256A (zh) | 一种超敏c反应蛋白检测方法及检测试剂 | |
CN109521200A (zh) | 一种同时检测血浆中多种成分含量的试剂盒、方法及其应用 | |
CN104833810A (zh) | 一种补体c3检测方法 | |
CN108362892B (zh) | 一种降钙素原胶体金免疫比浊法检测试剂 | |
CN104215778B (zh) | 一种c肽单克隆抗体交联磁微粒及其制备方法和包括其的检测试剂盒 | |
CN106324234B (zh) | 修饰的n-乙酰神经氨酸醛缩酶及其制备方法和应用 | |
CN106290871A (zh) | 一种用于检测血清中sod的胶乳增强免疫比浊法试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20141210 |