CN106483297A - 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂及制备方法 - Google Patents
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂及制备方法,属于借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料技术领域。包括R1试剂、R2试剂和标准样,所述的R1试剂是由PEG600溶解于添加有缓冲液、叠氮钠的纯化水中所形成的溶液;所述的R2试剂是由NGAL抗体包被胶乳解于添加有叠氮钠的纯化水中所形成的溶液;所述的标准样是由中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、牛血清蛋白、缓冲液和叠氮钠溶解于纯化水中形成的溶液。将发明应用于中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的测定,具有快速灵敏、准确性好、特异性高、稳定性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂及制备方法,属于借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料技术领域。
背景技术
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associatedlipocalin,NGAL)在生理条件下少量合成于骨髓中性粒细胞的中幼及晚幼阶段,炎症反应和恶性肿瘤可诱使其在多组织(如前列腺、唾液腺、肺、肾、气道及消化道上皮等)中大量生成。
NGAL是在包括肾小管在内的一些组织器官的中性粒细胞和上皮细胞中表达的小分子蛋白。NGAL蛋白通过受体介导的内吞作用入胞,其β-折叠桶结构可结合并运输铁离子。NGAL入胞后一方面竞争性抑制细菌的铁摄取;另一方面与细菌来源趋化物N-甲酰基蛋亮苯丙肽结合,促进细胞释放趋化因子、白介素,对炎症反应起负反馈作用,参与体内的炎症反应。同时NGAL-铁离子复合物可减轻缺血再灌注损伤中的氧化应激损伤,保护肾组织。NGAL在肾脏中的表达会因不同原因的肾损伤而显著升高,并且释放到尿液和血液中。NGAL水平可在肾损伤的2小时内升高,因此被作为早期敏感的肾损伤生物标志物。
临床证明:肾损伤的生化指标中NGAL比BUN、CREA等试验更敏感,具体如下:
(1)NGAL与狼疮性肾炎
肾脏是系统性红斑狼疮(SLE)最常受累的器官,几乎所有的SLE患者均有不同程度的肾脏病变,表现为狼疮性肾炎(LN)。血清NGAL在LN加重之前而不是在肾外疾病加重前就升高,提示LN在血清NGAL升高中的重要作用。同时由肾损害导致的GFR下降减少了对循环中NGAL的清除,使更多的NGAL在循环池中积聚,从而引起血清NGAL的升高。
(2)NGAL与急性肾损伤
正常情况下,NGAL在肾组织少量表达,缺血、再灌注肾损伤,血、尿中NGAL升高数百倍。在肾移植手术中,尿及肾组织中的NGAL高表达均与术后肾功能延迟恢复(DGF)相关,尿NGAL每上升100ug/L,DGF风险相应上升20%,而血清NGAL的变化则有助于判断患者是否需要透析治疗。
(3)糖尿病肾病的诊断往往根据mALB,血清、尿NGAL水平在1型、2型糖尿病肾病患者尿mALB升高前已显著增加,是诊断糖尿病并发肾损伤的灵敏指标。
目前国内测定中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的方法主要有:
(1)ELISA法,该方法操作时间长,自动化程度低。
(2)化学发光法,该方法虽然灵敏度高,但不稳定。
基于此,做出本申请。
发明内容
针对现有中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白在测试过程中存在的上述缺陷,本发明首先提供一种快速灵敏、准确性好、特异性高、稳定性好、液体双试剂操作简便,采用国内外先进的胶乳增强免疫比浊法,适用于临床全自动或半自动生化分析(手工加样品、试剂)的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂。
为实现上述目的,本申请采取的技术方案如下:
一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的测定试剂,由R1试剂、R2试剂和标准样构成,所述的R1试剂是由PEG600溶解于添加有缓冲液、叠氮钠的纯化水中所形成的溶液;所述的R2试剂是由NGAL抗体包被胶乳解于添加有叠氮钠的纯化水中所形成的溶液;所述的标准样是由中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、牛血清蛋白、缓冲液和叠氮钠溶解于纯化水中形成的溶液。
进一步的,作为优选:
所述的R1试剂中,缓冲液为甘氨酸缓冲液。更优选的,PEG600的浓度为2%,叠氮钠的浓度为0.01%,所述的甘氨酸缓冲液的浓度为50mmol/L。
所述的R2试剂中,NGAL抗体包被胶乳的浓度0.2%,叠氮钠的浓度为0.01%。
所述的标准样中,缓冲液为磷酸盐缓冲液。更优选的,叠氮钠的浓度为0.1%,牛血清蛋白浓度为3%,所述的磷酸盐缓冲液的浓度为50mmol/L。
同时,本申请还提供了一种具有上述特征中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂的制备方法,包括如下步骤:
(1)R1试剂配制:向纯化水中加入聚乙二醇600,搅拌至完全溶解;加入甘氨酸缓冲液搅拌至溶解,添加叠氮钠搅拌至完全溶解,继续搅拌后定容;
(2)R2试剂配制:向纯化水中加入叠氮钠,搅拌至完全溶解;加入NGAL抗体包被胶乳,搅拌至完全溶解,继续搅拌后定容;
(3)标准样配制:向纯化水中加入中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白,搅拌至完全溶解;加入缓冲液搅拌至溶解,加入牛血清蛋白搅拌至溶解,加入叠氮钠搅拌至完全溶解,继续搅拌后定容;
(4)对上述制备的R1试剂和R2试剂及标准样的灵敏度、线性范围、精密度和准确度进行测定。
进一步的,作为优选:
所述的搅拌速度为450转/分。搅拌速度过高会导致剪切力过大,影响所配制溶体的表面张力和粘合力,搅拌速度过低则影响其混配效果,控制在450转/分时,在确保搅拌剪切适中的同时,也促进了其内所添加物质的融合。
步骤(1)中,所述的纯化水的初始体积为1500ml,定容体积为1600ml。定容前后体积变化在20-30%,可以很好的保证其内所添加其他物质良好的融合性,确保所配置的R1试剂浓度、溶液稳定性最佳。
步骤(2)中,所述的纯化水的初始体积为300ml,定容体积为400ml。定容前后体积变化在25-35%,可以很好的保证其内所添加其他物质良好的融合性,确保所配置的R2试剂浓度、溶液稳定性最佳。
步骤(3)中,所述的纯化水的初始体积为200ml,定容体积为300ml。定容前后体积变化在40-50%,可以很好的保证其内所添加其他物质良好的融合性,确保所配置的标准样浓度、溶液稳定性最佳。
本发明的工作原理如下:
血清样品中的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)能与试剂盒中的抗原-微球蛋白试剂发生抗原-抗体反应,使加入抗原的量呈线性相关,采用比浊法,使用光学监测仪器测定反应液吸光度值。通过不同浓度的标准品绘制标准曲线定量监测血清中NGAL的浓度。
(1)灵敏度评价试验
根据GB/T26124-2011《临床化学体外诊断试剂(盒)》中对“分析灵敏度”检测的要求,以试剂盒在规定参数下对分析灵敏度评价用样本进行检测产生的吸光度改变,换算为n单位的吸光度的差值(ΔA)作为分析灵敏度。分析灵敏度评价试验对分析灵敏度评价用样本重复测定20次。评估结果:分析灵敏度600ng/ml吸光度差值(ΔA)≥0.0200ABS。
(2)线性范围评价试验
根据GB/T26124-2011《临床化学体外诊断试剂(盒)》和《体外诊断试剂分析性能评估指导原则——线性范围(征求意见稿)》中的建议,对试剂线性范围进行验证时,在待验证线性范围内选择5个浓度水平,每个浓度水平重复测定3次。
(3)精密度评价试验
精密度评价包括重复性和批间差,且至少评估二个浓度水平样本的精密度,其中有一个浓度在医学决定水平左右。因此,重复性评价采用在重复性条件下,用二个浓度水平的控制物质(其中一个浓度接近医学决定水平)测试,每个浓度重复测试10次;批间差评价采用二个浓度水平的控制物质(其中一个浓度接近医学决定水平)分别测试3个不同批号的试剂盒,每个批号测试3次。
(4)准确度评价试验
用不少于40个在检测浓度范围内的不同浓度的人源样品,以指定的分析系统作为比对方法,每份样品按待测试剂操作方法及比对方法分别检测。用线性回归方法计算两组结果的相关系数(r)及每个浓度点的相对偏差。
评估结果:三批试剂的重复性变异系数CV≤10%;相对偏差≤15%,试剂线性可达5000ng/ml,分析灵敏度600ng/ml吸光度差值(ΔA)≥0.0200ABS。
本申请利用胶乳增强免疫比浊法测定中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的方法,其优点是快速灵敏,准确性好,特异性高,稳定性好,操作简便,可适用于临床全自动或半自动生化分析仪配套使用。
附图说明
图1为本申请中抗原-吸光度曲线图;
图2为本申请中抗体-吸光度曲线图;
图3为本申请中测定试剂的准确度柱状图。
具体实施方式
实施例1
本实施例所用主要试剂:
R1试剂:甘氨酸缓冲液:50mmol/L;PEG600:2%;叠氮钠:0.01%。
R1试剂:NGAL抗体包被胶乳:0.2%;叠氮钠:0.01%。
标准样:磷酸盐缓冲液:50mmol/L;叠氮钠:0.1%;牛血清蛋白:3%。
1)R1试剂的配制
①将1500ml纯化水加入到适当容器中。
②开启电动搅拌器,搅拌速度均为450转/分。
③量取40ml聚乙二醇6000加入上述纯化水中,搅拌至完全溶解。
④称取0.1g甘氨酸加入上述溶液中,搅拌至完全溶解。
⑤称取0.2g叠氮钠加入上述溶液中,搅拌至完全溶解。
⑥搅拌十分钟以上。
⑦定容至1600ml。
2)R2试剂的配制
①将300ml纯化水加入到适当容器中。
②开启电动搅拌器,搅拌速度均为450转/分。
③称取0.2g叠氮钠加入上述纯化水中,搅拌至完全溶解。
④量取4mlNGAL抗体包被胶乳加入上述溶液中,搅拌至完全溶解。
⑤搅拌十分钟以上。
⑥定容至400ml。
3)标准样的配制
①将200ml纯化水加入到适当容器中。
②开启电动搅拌器,搅拌速度均为450转/分。
③量取5ml中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白加入上述纯化水中,搅拌至完全溶解。
④称取54.6g磷酸氢二钾加入上述纯化水中,搅拌至完全溶解。
⑤称取43.5g磷酸二氢钾加入上述溶液中,搅拌至完全溶解。
⑥称取2g叠氮钠加入上述溶液中,搅拌至完全溶解。
⑦量取6ml牛血清白蛋白加入上述溶液中,搅拌至完全溶解。
⑧搅拌十分钟以上。
⑨定容至300ml。
4)试剂检验
①仪器配置:仪器使用日立7100全自动生化分析仪。
A.测定参数严格按照产品说明书在仪器中设定,基本测定参数如下:
a.方法:两点终点法,反应方向:向上;波长:570nm(主波长),670nm(副波长),温度37℃。
b.比色杯光径:1cm。
c.R1试剂:240μl,R2试剂:60μl,标准样:10μl。
B.第一测光点:在R1加入后5分钟读取;第二测光点:在R2加入后5分钟读取。
②试剂外观检查:目测检查。
③装量检查:用通用量具测量。
④试剂空白测定:
用蒸馏水或去离子水作为空白样品测试试剂盒,在测试主波长下,记录测试启动时吸光度(A1试剂)和约5分钟后的吸光度(A2试剂),A2即为工作试剂的空白吸光度。
⑤线性范围测定:
取接近线性范围上限的高值样本用生理盐水倍比稀释配制成不同浓度梯度的样本系列。以H值与稀释比例计算出预期值。稀释方法参照表1所示(根据高值的大小可相应调整稀释梯度)。
表1样本稀释表
实施例 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
生理盐水(ml) | 0 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
高值标本H(ml) | 1 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
稀释比例 | 原倍 | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 |
表1中:实施例1样本的浓度为已知定值CH,实施例2-5样本浓度按公式:样本浓度=CH×稀释比例,计算作为预期值,将稀释好的样本系列充分混匀,在校正后的测定系统上按从低值到高值顺序平行测定2次,均值作为对应实施例样本实测值(如2次测定结果有明显偏差应剔除重测),具体参见表1。
统计学分析:以预期值为横坐标,样本实测值为纵坐标作图及直线回归分析,见图1所示,确定线性区间计算出直线方程y=a+bx及相关系数,当相关系数r≥0.990时为线性良好。
数据分析处理采用Microsoft Excel软件。
相关公式如下:
式中,C:浓度;V:容积;b:回归线的斜率;∣a∣:回归线截距的绝对值;r:相关系数;Xi:各管预期值;Yi:各管测定值;i:1、2、3.……、n;n:测定样本数。
⑥精密度测定:
a.重复性测定:
用临床标本或质控血清测试试剂盒,重复测试10次,计算测量值的平均值和标准差(s)。按如下公式计算变异系数(CV)。
与变异系数CV(%):
式中:——待测血清样本的均值;
Xi——测定血清样本的测定结果;
n——测定次数;
CV——变异系数。
b.批间差测定
取三个批号送检试剂,每个批号取3瓶,分别测定1份临床样本或质控血清,可选用罗氏质控品,分别计算9份试剂测定均值和每个批号3份试剂的测定均值并用Microsoft Excel软件统计三个批号试剂测定的变异系数。
相关公式如下:
式中:
——中的最大值;
——中的最小值;
——总均值。
⑦准确性测定:
比对试验:相关系数r≥0.975。相对偏差≤15%;
⑧分析灵敏度:
用已知浓度或活性的样品测试试剂盒,记录在试剂盒规定参数下产生的吸光度改变,换算为n单位的吸光度差值(ΔA)。
根据表1计算得到的预期值、实测值、a、b、相关系数r、变异系数CV、批间极差、相对偏差B以及吸光度差值ΔA汇总入表2。
表2测试结果汇总表
表3分析灵敏度对照表(1-20为平行实验序号)
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
0.0326 | 0.0311 | 0.0309 | 0.0298 | 0.0297 | 0.0286 | 0.0284 | 0.0302 | 0.0316 | 0.0319 |
11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 |
0.0324 | 0.0316 | 0.0319 | 0.0346 | 0.0312 | 0.0333 | 0.0362 | 0.0295 | 0.0324 | 0.0323 |
表4批内重复性对照表
表5批间精密度对照表
评估结果及表2结果表明:三批试剂的重复性变异系数CV≤10%;相对偏差≤15%,试剂线性可达5000ng/ml,分析灵敏度600ng/ml吸光度差值(ΔA)≥0.0200ABS。
本申请利用胶乳增强免疫比浊法测定中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的方法,其优点是快速灵敏,准确性好,特异性高,稳定性好,操作简便,可适用于临床全自动或半自动生化分析仪配套使用。
以上内容是结合本发明创造的优选实施方式对所提供技术方案所作的进一步详细说明,不能认定本发明创造具体实施只局限于上述这些说明,对于本发明创造所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明创造构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明创造的保护范围。
Claims (10)
1.中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的测定试剂,其特征在于:由R1试剂、R2试剂和标准样构成,所述的R1试剂是由PEG600溶解于添加有缓冲液、叠氮钠的纯化水中所形成的溶液;所述的R2试剂是由NGAL抗体包被胶乳解于添加有叠氮钠的纯化水中所形成的溶液;所述的标准样是由中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、牛血清蛋白、缓冲液和叠氮钠溶解于纯化水中形成的溶液。
2.如权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的测定试剂,其特征在于:所述的R1试剂中,缓冲液为甘氨酸缓冲液。
3.如权利要求2所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的测定试剂,其特征在于:所述的甘氨酸缓冲液的浓度为50 mmol/L,PEG600的浓度为2%,叠氮钠的浓度为0.01%。
4.如权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的测定试剂,其特征在于:所述的R2试剂中,NGAL抗体包被胶乳的浓度0.2%,叠氮钠的浓度为0.01%。
5.如权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的测定试剂,其特征在于:所述的标准样中,缓冲液为磷酸盐缓冲液。
6.如权利要求5所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的测定试剂,其特征在于:所述的磷酸盐缓冲液的浓度为50 mmol/L,叠氮钠的浓度为0.1%,牛血清蛋白浓度为3%。
7.如权利要求1-6任一项所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)R1试剂配制:向纯化水中加入聚乙二醇600,搅拌至完全溶解;加入缓冲液搅拌至溶解,添加叠氮钠搅拌至完全溶解,继续搅拌后定容;
(2)R2试剂配制:向纯化水中加入叠氮钠,搅拌至完全溶解;加入NGAL抗体包被胶乳,搅拌至完全溶解,继续搅拌后定容;
(3)标准样配制:向纯化水中加入中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白,搅拌至完全溶解;加入缓冲液搅拌至溶解,加入牛血清蛋白搅拌至溶解,加入叠氮钠搅拌至完全溶解,继续搅拌后定容;
(4)对上述制备的R1试剂和R2试剂及标准样的灵敏度、线性范围、精密度和准确度进行测定。
8.如权利要求7所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂的制备方法,其特征在于:步骤(1)中,所述的纯化水的初始体积为1500ml,定容体积为1600ml。
9.如权利要求7所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂的制备方法,其特征在于:步骤(2)中,所述的纯化水的初始体积为300ml,定容体积为400ml。
10.如权利要求7所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂的制备方法,其特征在于:步骤(3)中,所述的纯化水的初始体积为200ml,定容体积为300ml。
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