CN104865386A - 一种人体血清中中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量定量测定方法、试剂及试剂盒 - Google Patents

一种人体血清中中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量定量测定方法、试剂及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种定量测定人体血清中中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量的试剂，该试剂由分别放置的试剂I和试剂II组成，其中，所述试剂I含有磷酸盐缓冲液、聚乙二醇-6000；所述试剂II含有鼠抗人NGAL单克隆抗体乳胶颗粒、抗体稳定剂。本发明采用的试剂盒及检测方法只需几微升血清，无需离心或电泳等分离处理，操作简便，可满足全自动化分析的要求，适用于大规模样品的及时准确检测。

Description

一种人体血清中中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量定量测定方法、试剂及试剂盒
技术领域
本申请涉及一种人体血清中中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量定量测定方法、试剂及试剂盒。
背景技术
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白快速检测酶免试剂盒，可用于人尿液、血浆和血清检测。急性肾功能衰竭(ARF)是心脏手术、肾毒性、肾移植常见的并发症。
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin，NGAL)，也称为Lipocalin-2(脂质运载蛋白-2)，是脂质运载蛋白家族的一个新成员，是肾功能损伤早期的生物标志物。NGAL不仅仅存在于嗜中性粒细胞中，也会出现在特定的上皮细胞内，例如发生缺血性和毒性肾损伤过程中，肾小管上皮细胞中的NGAL将显著增加，在开始的两个小时内，尿液和血液中NGAL水平将显著增加，因此NGAL是早期急性肾损伤的敏感标志物。
目前在临床上使用的NGAL检测方法只有酶免疫法(ELISA)，此方法具有操作繁琐、标本需要预处理，检测时间长、价格昂贵、过度浪费资源的缺点，不适于常规检验，尤其是大规模流行病学检查或临床大批量标本诸多项目的同时检测。
发明内容
本申请的目的是提供一种人体血清中中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量定量测定方法、试剂及试剂盒。
本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种定量测定人体血清中中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量的试剂，该试剂由分别放置的试剂I和试剂II组成，其中，所述试剂I含有磷酸盐缓冲液、聚乙二醇-6000；所述试剂II含有鼠抗人NGAL单克隆抗体乳胶颗粒、抗体稳定剂。
进一步的，所述试剂I中磷酸盐缓冲液含量为30-150mmol/L，聚乙二醇-6000含量为30-150mmol/L。
进一步的，所述试剂I中磷酸盐缓冲液含量为100mmol/L，聚乙二醇-6000含量为50mmol/L。
进一步的，所述试剂II中鼠抗人NGAL单克隆抗体乳胶颗粒含量为50-500mL/mol，抗体稳定剂含量为0.05-0.5g/mL。
进一步的，所述试剂II中鼠抗人NGAL单克隆抗体乳胶颗粒含量为300mL/mol，抗体稳定剂含量为0.1g/mL。
进一步的，所述磷酸盐缓冲液PH为6.9。
进一步的，所述鼠抗人NGAL单克隆抗体乳胶颗粒直径为50-300nm。
进一步的，所述抗体稳定剂包括糖类、醇类、蛋白类以及一些氨基酸等，优选为蔗糖。
本申请的另一方面提供一种定量测定人体血清中中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量的试剂盒，其中装有上述定量测定人体血清中中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量的试剂，该试剂由分别放置的试剂I及试剂II组成。
本申请的另一方面提供一种定量测定人体血清中中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量的方法，该方法包括向血清样品中加入所述试剂I，37℃孵育5分钟，在546nm波长下读取样品相对空白管的吸光度A1，然后向样品中加入试剂II，继续孵育5分钟后在上述波长下测定吸光度A2；由下式(1)计算△A样本，用同样的方法测定校准液的吸光度值△A标准；再通过下式(2)计算得到血清样品的中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量：
△A＝A2-A1    (1)
血清中中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量(ng/mL)＝(△A样本)/(△A标准)×标准液浓度    (2)
本方法的原理为：样本中的NGAL可与吸附在乳胶颗粒上的抗体产生抗原抗体的凝集反应，形成抗原抗体复合物，其浊度的变化通过测定特定波长的吸光度值，即可算出样本中NGAL的含量。
本发明直接定量测定人血清样品中中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量的试剂盒，是将分别放置的上述试剂I和试剂II以不同的规格装入试剂盒包装中。该试剂盒具有多种不同的规格，可以分别适用于目前在临床实验室普遍使用的各种国内外品牌的自动生化分析仪器。
本发明采用的试剂盒及检测方法只需几微升血清，无需离心或电泳等分离处理，操作简便，可满足全自动化分析的要求，适用于大规模样品的及时准确检测。
具体实施方式
实施例一
按照下述成分和比例配置下述本发明试剂I及试剂II：
试剂I:
磷酸盐缓冲液  30mmol/L
聚乙二醇8000  30mmol/L
试剂II：
鼠抗人NGAL单克隆抗体乳胶颗粒  50mL/mol
抗体稳定剂  0.05g/mL
在样品管中将240μl试剂I和3μl血清样品混合，在37℃下孵育5分钟，使用日立7060型全自动生化分析仪，在波长546nm处测定样品相对空白管的吸光度A1，然后向样品中加入60μl试剂II，混匀，在37℃下孵育5分钟，测定样品相对空白管的吸光度A2。根据如下公式(1)计算△A样本。用同样的方法和条件测定标准液的吸光度值，并计算△A标准。然后根据公式(2)计算得到血清样品的中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量：
△A＝A2-A1          (1)
血清中中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量(ng/mL)＝(△A样本)/(△A标准)×标准液浓度    (2)
本申请所用标准品为朗道标准品。
实施例二
按照下述成分和比例配置下述本发明试剂I及试剂II：
试剂I:
磷酸盐缓冲液  150mmol/L
聚乙二醇8000  150mmol/L
试剂II：
鼠抗人NGAL单克隆抗体乳胶颗粒  500mL/mol
抗体稳定剂  0.5g/mL
在样品管中将240μl试剂I和3μl血清样品混合，在37℃下孵育5分钟，使用奥林帕斯400型全自动生化分析仪，在波长546nm处测定样品相对空白管的吸光度A1，然后向样品中加入60μl试剂II，混匀，在37℃下孵育5分钟，测定样品相对空白管的吸光度A2。根据如下公式(1)计算△A样本。用同样的方法和条件测定标准液的吸光度值，并计算△A标准。然后根据公式(2)计算得到血清样品的中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量：
△A＝A2-A1          (1)
血清中中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量(ng/mL)＝(△A样本)/(△A标准)×标准液浓度    (2)
本申请所用标准品为朗道标准品。
实施例三
按照下述成分和比例配置下述本发明试剂I及试剂II：
试剂I:
磷酸盐缓冲液  100mmol/L
聚乙二醇8000  50mmol/L
试剂II：
鼠抗人NGAL单克隆抗体乳胶颗粒  300mL/mol
抗体稳定剂  0.1g/mL
在样品管中将240μl试剂I和3μl血清样品混合，在37℃下孵育5分钟，使用贝克曼LX20型全自动生化分析仪，在波长546nm处测定样品相对空白管的吸光度A1，然后向样品中加入60μl试剂II，混匀，在37℃下孵育5分钟，测定样品相对空白管的吸光度A2。根据如下公式(1)计算△A样本。用同样的方法和条件测定标准液的吸光度值，并计算△A标准。然后根据公式(2)计算得到血清样品的中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量：
△A＝A2-A1         (1)
血清中中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量(ng/mL)＝(△A样本)/(△A标准)×标准液浓度   (2)
本申请所用标准品为朗道标准品。
实施例四
使用本实施例1中所列的试剂，按照实施例1所述的方法和条件对120例血清样品的血清中中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白行测定，每份血清样品同时以市售中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白检测试剂盒(北京九强生物技术股份有限公司)为对照试剂盒,通过计算本发明试剂盒与对照试剂盒(九强试剂盒)的正常值符合率、异常值符合率、总符合率来证明本发明试剂盒与已批准上市的九强试剂盒等效。
方法：在临床试验单位按对照试剂盒的测定参考范围选取120例临床剩余血清，测定结果70例在参考范围内，50例超出参考范围。然后再用本发明试剂盒对选取好的120例血清进行测定，通过交叉列表分析计算本发明试剂盒与对照试剂盒的正常值符合率、异常值符合率及总符合率。
研究结果：本发明试剂盒与已批准上市的北京九强生物技术股份有限公司生产的中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白检测试剂盒对120例样本进行测定，以九强试剂盒为对照试剂盒，具体结果如下：1、交叉列表分析
以九强试剂盒为对照试剂盒，计算本发明试剂盒与九强试剂盒的正常值符合率、异常值符合率及总符合率：
异常值符合率＝[50/(50+0)]×100％＝100％
正常值符合率＝[70/(70+0)]×100％＝100％
总符合率＝[(70+50)/120]×100％＝100％
2、本发明试剂盒与对照试剂盒的相关系数
数据组 相关系数(r)
两组异常值测定结果的相关系数 0.999556
两组正常值测定结果的相关系数 0.933118
两组数据总的相关系数 0.999485
3、本发明试剂盒与对照试剂盒测定结果不符合和的确认情况
在本实施例中,本发明试剂盒与对照试剂盒的测定结果完全符合。
讨论和结论：本实施例收集了120例血清标本，以九强试剂盒的测定结果为标准选取测定结果在参考范围内的标本70例、测定结果低于参考范围下限的标本50例，将本发明试剂盒与对照试剂盒的测定结果进行统计，计算本发明试剂盒与对照试剂盒的正常值符合率、异常值符合率及总符合率。临床试验结果显示：
1)本试剂盒用于体外定量测定人血清中中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白的浓度。中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白为肾早期损伤的标志物，正常情况下，NGAL在尿液和血清中维持一个较低水平，而肾损伤时则在非常短的时间(24小左右或在血清肌酐显著升高以前)急速升高。临床研究证明NGAL确诊急性肾损伤病人在时间上远远早于血清肌酐。
2)本发明试剂盒与对照产品的异常值符合率、正常值符合率、总符合率及相关系数均能达到方案中规定的标准。
因此，本发明试剂盒能够满足临床性能要求，与已批准上市的北京九强生物技术股份有限公司生产的中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白测定试剂盒等效。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

Claims (7)

1.一种定量测定人体血清中中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量的试剂，该试剂由分别放置的试剂I和试剂II组成，其中，所述试剂I含有磷酸盐缓冲液、聚乙二醇-6000；所述试剂II含有鼠抗人NGAL单克隆抗体乳胶颗粒、抗体稳定剂。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂I中磷酸盐缓冲液含量为30-150mmol/L，聚乙二醇-6000含量为30-150mmol/L。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述试剂I中磷酸盐缓冲液含量为100mmol/L，聚乙二醇-6000含量为50mmol/L。
4.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂II中鼠抗人NGAL单克隆抗体乳胶颗粒含量为50-500mL/mol，抗体稳定剂含量为0.05-0.5g/mL。
5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述试剂II中鼠抗人NGAL单克隆抗体乳胶颗粒含量为300mL/mol，抗体稳定剂含量为0.1g/mL。
6.一种定量测定人体血清中中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量的试剂盒，其特征在于，其中装有权利要求1至5中任一所述的定量测定人体血清中中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量的试剂，该试剂由分别放置的试剂I及试剂II组成。
7.一种定量测定人体血清中中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量的方法，该方法包括向血清样品中加入所述试剂I，37℃孵育5分钟，在546nm波长下读取样品相对空白管的吸光度A1，然后向样品中加入试剂II，继续孵育5分钟后在上述波长下测定吸光度A2；由下式(1)计算△A样本，用同样的方法测定校准液的吸光度值△A标准；再通过下式(2)计算得到血清样品的中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量：
△A＝A2-A1    (1) 
血清中中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白含量(ng/mL)＝(△A样本)/(△A标准)×标准液浓度  (2)。
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