CN104865214A

CN104865214A - 一种人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的定量测定方法、试剂及试剂盒

Info

Publication number: CN104865214A
Application number: CN201510230706.1A
Authority: CN
Inventors: 张益军
Original assignee: Lan Sen Bio Tech Ltd Zhejiang
Current assignee: Lan Sen Bio Tech Ltd Zhejiang
Priority date: 2015-05-08
Filing date: 2015-05-08
Publication date: 2015-08-26

Abstract

本申请涉及一种定量测定人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的试剂，该试剂由分别放置的试剂I和试剂II组成，其中，所述试剂I含有Tris缓冲液、L-天门冬氨酸、苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、c-AST羊抗人抗体、酶稳定剂；所述试剂II含有α-酮戊二酸、还原性辅酶。本发明采用的试剂盒及检测方法只需几十微升血清，无需离心或电泳等分离处理，操作简便，可满足全自动化分析的要求，适用于大规模样品的及时准确检测。

Description

一种人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的定量测定方法、试剂及试剂盒

技术领域

本申请涉及一种人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的定量测定方法、试剂及试剂盒。

背景技术

天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST)广泛存在于人体各种组织细胞中，尤以肝、心组织细胞含量最为丰富，而正常人血清中AST活性很低。人体中AST存在两种同工酶，一种是cAST，主要来源于细胞浆，另一种是mAST，存在于线粒体内。这两种同工酶在基因组成上有差异，在氨基酸组成、免疫学特性以及在体内的半衰期等均不同。

在机体轻度病变时，组织细胞的细胞膜通透性增高，cAST透过细胞膜进入血液系统中，但mAST有两层线粒体膜的保护，不易释放入血；而当机体严重疾病时，出现细胞坏死、线粒体崩解，附着在线粒体上的mAST可迅速释放进入血中。因此，血清mAST活性可反映组织细胞的坏死程度，若血清中检测出高水平mAST，则表明心肌、肝脏严重受损；另外mAST在血中的半衰期比cAST短，当细胞不再破坏或修复时，血清中mAST很快降至正常水平，因此mAST又是心肌、肝脏损害预后的评价指标，对疾病的诊断、治疗具有重要的价值。

目前，血清中mAST测定主要有电泳法、层析法以及免疫抑制法等。这些方法具有操作繁琐、耗时长、价格昂贵、过度浪费资源的缺点，不适于常规检验，尤其是大规模流行病学检查或临床大批量标本诸多项目的同时检测。

发明内容

本申请的目的是提供一种人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性定量测定方法、试剂及试剂盒。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种定量测定人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的试剂，该试剂由分别放置的试剂I和试剂II组成，其中，所述试剂I含有Tris缓冲液、L-天门冬氨酸、苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、c-AST羊抗人抗体、酶稳定剂；所述试剂II含有α-酮戊二酸、还原性辅酶。

进一步的，所述试剂I中Tris缓冲液含量为50-150mmol/L，L-天门冬氨酸含量为100-500mmol/L，苹果酸脱氢酶含量为0.5-2KU/L，乳酸脱氢酶含量为0.2-1.5KU/L，c-AST羊抗人抗体含量为0.5-1.5ml/L，酶稳定剂含量为0.5-5g/L。

进一步的，所述试剂I中Tris缓冲液含量为100mmol/L，L-天门冬氨酸含量为240mmol/L，苹果酸脱氢酶含量为1KU/L，乳酸脱氢酶含量为0.8KU/L，c-AST羊抗人抗体含量为0.8ml/L，酶稳定剂含量为1g/L。

进一步的，所述试剂II中α-酮戊二酸含量为1-50mmol/L，还原性辅酶含量为0.05-1mmol/L。

进一步的，所述试剂II中α-酮戊二酸含量为10mmol/L，还原性辅酶含量为0.2mmol/L。

进一步的，所述Tris缓冲液PH为8.0。

进一步的，所述酶稳定剂包括海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白、甘油、吐温80中的一种或者几种；

进一步的，所述还原型辅酶Ⅰ稳定剂包括海藻糖、牛血清白蛋白、甘油、吐温80中的一种或几种。

本申请的另一方面提供一种定量测定人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的试剂盒，其中装有上述定量测定人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的试剂，该试剂由分别放置的试剂I及试剂II组成。

本申请的另一方面提供一种定量测定人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的方法，该方法包括向血清样品中加入所述试剂I，37℃孵育5分钟，然后向样品中加入试剂II，继续孵育1-2分钟后，在340nm波长下连续监测1-2分钟样本吸光度变化，计算样本每分钟平均吸光度变化值△A_样本/min；用同样的方法测定空白管每分钟平均吸光度变化值△A_空白/min；再通过下式(1)计算得到血清样品的线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性：

m-AST活性(U/L)＝(△A_样本/min-△A_空白/min)×K (1)

K＝2090

本方法的原理为：血清中天门冬氨酸氨基转移酶的活性为胞浆型AST(c-AST)和线粒体型AST(m-AST)之和。本法用免疫抑制法酶动力学测定m-AST活性，在羊抗人的c-AST抗体存在的条件下，标本中c-AST活性被抑制，而m-AST活性不受影响。可用速率法进行测定，标本中m-AST的活性与NADH下降的速率呈正比。

本发明直接定量测定人血清样品中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的试剂盒，是将分别放置的上述试剂I和试剂II以不同的规格装入试剂盒包装中。该试剂盒具有多种不同的规格，可以分别适用于目前在临床实验室普遍使用的各种国内外品牌的自动生化分析仪器。

本发明采用的试剂盒及检测方法只需几十微升血清，无需离心或电泳等分离处理，操作简便，可满足全自动化分析的要求，适用于大规模样品的及时准确检测。

具体实施方式

实施例一

按照下述成分和比例配置下述本发明试剂I及试剂II：

试剂I:

试剂II：

α-酮戊二酸 1mmol/L

还原性辅酶 0.05mmol/L

在样品管中将200μl试剂I和20μl血清样品混合，在37℃孵育5分钟，使用日立7060型全自动生化分析仪，空白管调零，然后向样品中加入40μL试剂II，继续孵育1-2分钟后，在340nm波长下连续监测1-2分钟样本吸光度变化，计算样本每分钟平均吸光度变化值△A_样本/min；用同样的方法测定空白管每分钟平均吸光度变化值△A_空白/min；再通过下式(1)计算得到血清样品的线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性：

m-AST活性(U/L)＝(△A_样本/min-△A_空白/min)×K (1)

K＝2090

R1:R2:样本/空白＝200:40:20

实施例二

按照下述成分和比例配置下述本发明试剂I及试剂II：

试剂I:

试剂II：

α-酮戊二酸 50mmol/L

还原性辅酶 1mmol/L

在样品管中将200μl试剂I和20μl血清样品混合，在37℃孵育5分钟，使用奥林帕斯400型全自动生化分析仪，空白管调零，然后向样品中加入40μL试剂II，继续孵育1-2分钟后，在340nm波长下连续监测1-2分钟样本吸光度变化，计算样本每分钟平均吸光度变化值△A_样本/min；用同样的方法测定空白管每分钟平均吸光度变化值△A_空白/min；再通过下式(1)计算得到血清样品的线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性：

m-AST活性(U/L)＝(△A_样本/min-△A_空白/min)×K (1)

K＝2090

R1:R2:样本/空白＝200:40:20

实施例三

按照下述成分和比例配置下述本发明试剂I及试剂II：

试剂I:

试剂II：

α-酮戊二酸 10mmol/L

还原性辅酶 0.2mmol/L

在样品管中将200μl试剂I和20μl血清样品混合，在37℃孵育5分钟，使用贝克曼LX20型全自动生化分析仪，空白管调零，然后向样品中加入40μL试剂II，继续孵育1-2分钟后，在340nm波长下连续监测1-2分钟样本吸光度变化，计算样本每分钟平均吸光度变化值△A_样本/min；用同样的方法测定空白管每分钟平均吸光度变化值△A_空白/min；再通过下式(1)计算得到血清样品的线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性：

m-AST活性(U/L)＝(△A_样本/min-△A_空白/min)×K (1)

K＝2090

R1:R2:样本/空白＝200:40:20

实施例四

使用本实施例1中所列的试剂，按照实施例1所述的方法和条件对120例血清样品的血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶进行测定，每份血清样品同时以市售线粒体天冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒(宁波瑞源生物科技有限公司)为对照试剂盒,通过计算本发明试剂盒与对照试剂盒(瑞源试剂盒)的正常值符合率、异常值符合率、总符合率来证明本发明试剂盒与已批准上市的瑞源试剂盒等效。

方法：在临床试验单位按对照试剂盒的测定参考范围选取120例临床剩余血清，测定结果70例在参考范围内，50例超出参考范围。然后再用本发明试剂盒对选取好的120例血清进行测定，通过交叉列表分析计算本发明试剂盒与对照试剂盒的正常值符合率、异常值符合率及总符合率。

研究结果：本发明试剂盒与已批准上市的宁波瑞源生物科技有限公司生产的线粒体天冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒对120例样本进行测定，以瑞源试剂盒为对照试剂盒，具体结果如下：

1、交叉列表分析

以瑞源试剂盒为对照试剂盒，计算本发明试剂盒与瑞源试剂盒的正常值符合率、异常值符合率及总符合率：

异常值符合率＝[50/(50+0)]×100％＝100％

正常值符合率＝[70/(70+0)]×100％＝100％

总符合率＝[(70+50)/120]×100％＝100％

2、本发明试剂盒与对照试剂盒的相关系数

数据组	相关系数(r)
		两组异常值测定结果的相关系数	0.993804
两组正常值测定结果的相关系数	0.912409
		两组数据总的相关系数	0.996931

3、本发明试剂盒与对照试剂盒测定结果不符合和的确认情况

在本实施例中,本发明试剂盒与对照试剂盒的测定结果完全符合。

讨论和结论：本实施例收集了120例血清标本，以瑞源试剂盒的测定结果为标准选取测定结果在参考范围内的标本70例、测定结果高于参考范围上限的标本50例，将本发明试剂盒与对照试剂盒的测定结果进行统计，计算本发明试剂盒与对照试剂盒的正常值符合率、异常值符合率及总符合率。临床试验结果显示：

1)本试剂盒用于体外定量测定人血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶的活性。血清ASTm增高可反映亚细胞结构损害的严重性，是诊断肝细胞损害和心肌梗死的敏感指标，并可作为临床判断肝细胞和心肌细胞损害程度及临床疗效评估、预后判断的参考指标。

2)本试剂盒与对照产品的异常值符合率、正常值符合率、总符合率及相关系数均能达到方案中规定的标准。

因此，本发明试剂盒能够满足临床性能要求，与已批准上市的宁波瑞源生物科技有限公司生产的线粒体天冬氨酸氨基转移酶试剂盒等效。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

Claims

1.一种定量测定人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的试剂，该试剂由分别放置的试剂I和试剂II组成，其中，所述试剂I含有Tris缓冲液、L-天门冬氨酸、苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、c-AST羊抗人抗体、酶稳定剂；所述试剂II含有α-酮戊二酸、还原性辅酶。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂I中Tris缓冲液含量为50-150mmol/L，L-天门冬氨酸含量为100-500mmol/L，苹果酸脱氢酶含量为0.5-2KU/L，乳酸脱氢酶含量为0.2-1.5KU/L，c-AST羊抗人抗体含量为0.5-1.5ml/L，酶稳定剂含量为0.5-5g/L。

3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述试剂I中Tris缓冲液含量为100mmol/L，L-天门冬氨酸含量为240mmol/L，苹果酸脱氢酶含量为1KU/L，乳酸脱氢酶含量为0.8KU/L，c-AST羊抗人抗体含量为0.8ml/L，酶稳定剂含量为1g/L。

4.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂II中α-酮戊二酸含量为1-50mmol/L，还原性辅酶含量为0.05-1mmol/L。

5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述试剂II中α-酮戊二酸含量为10mmol/L，还原性辅酶含量为0.2mmol/L。

6.一种定量测定人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的试剂盒，其特征在于，其中装有权利要求1至5中任一所述的定量测定人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的试剂，该试剂由分别放置的试剂I及试剂II组成。

7.一种定量测定人体血清中线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性的方法，该方法包括向血清样品中加入所述试剂I，37℃孵育5分钟，然后向样品中加入试剂II，继续孵育1-2分钟后，在340nm波长下连续监测1-2分钟样本吸光度变化，计算样本每分钟平均吸光度变化值△A_样本/min；用同样的方法测定空白管每分钟平均吸光度变化值△A_空白/min；再通过下式(1)计算得到血清样品的线粒体天冬氨酸氨基转移酶活性：

m-AST活性(U/L)＝(△A_样本/min-△A_空白/min)×K (1)

K＝2090。