CN102864206A

CN102864206A - 抗肝素干扰的亮氨酸氨基肽酶测定试剂

Info

Publication number: CN102864206A
Application number: CN2012103351142A
Authority: CN
Inventors: 邹炳德; 邹继华; 沃燕波
Original assignee: NINGBO MEIKANG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: NINGBO MEIKANG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-09-11
Filing date: 2012-09-11
Publication date: 2013-01-09

Abstract

本发明公开一种抗肝素干扰的亮氨酸氨基肽酶测定试剂，该试剂由试剂1和试剂2组成，其中试剂1、试剂2中的各组分及组分浓度范围为：试剂1：缓冲液（pH 7.0~8.5）50-500mmol/L，抗干扰剂1-100ml/L，防腐剂0.1-100g/L；试剂2：缓冲液(pH 3.0-6.0）50-500mmol/L，L-亮氨酰-p-硝酰基苯胺1-100mmol/L，稳定剂1-100g/L，防腐剂0.1-100g/L。本发明具有良好的抗肝素干扰性能和良好的稳定性，能完全满足临床检验要求的优点。

Description

抗肝素干扰的亮氨酸氨基肽酶测定试剂

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种抗肝素干扰的亮氨酸氨基肽酶测定试剂。

背景技术

亮氨酸氨基肽酶（Leucine aminopeptidase，LAP，EC 3.4.11.1）是一种蛋白分解酶,能水解肽链N端并由亮氨酸与其他氨基酸形成肽键的酶,广泛分布于肝、胰、肾等组织中。当人体肝、胆、胰等组织有病变时,均可出现血清LAP水平升高。测定血清亮氨酸氨基转肽酶可作为肝病诊断的又一项指标,对淤胆性肝炎的鉴别诊断、肝道梗阻及胰腺癌的诊断有价值。LAP不像其他肝功的酶，只能检测血液样本，LAP还可以检测尿液。在一些病例中可以检测尿液中LAP的变化，而不必采血。其肝癌的检出阳性率较ADA（腺苷脱氨酶）高，比GGT（谷酰转肽酶）反映肝脏疾病更加灵敏。LAP的检测也可早期反映肾损害的性质和程度，并为临床鉴别肾小球、肾小管损伤提供可能的帮助；其亦可作为妊娠合并ICP及孕妇和胎儿健康情况动态监测的一项有效指标。

目前，LAP的检测方法是样本中的LAP经催化水解底物L-亮氨-P-硝基苯胺，生成亮氨酸和对硝基苯胺，反应系统在405nm处吸光度上升，通过检测其上升的速率即可得出样本中LAP的活性。而在日常工作中,为缩短样本周转时间和防止仪器样品针被堵,不少医院使用肝素锂或肝素钠抗凝管采集常规生化项目血样本。由于肝素在LAP催化反应过程中起类似加速剂的作用，使得检测结果假性增高，所以实验室测定LAP浓度只能用血清,而肝癌肝硬化患者分离血清需要时间长,不能满足临床对检验结果的快速回报要求,这给实验室及临床工作带来许多不便。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种具有良好的抗肝素干扰性能和良好的稳定性，能完全满足临床检验要求的抗肝素干扰的亮氨酸氨基肽酶测定试剂。

为了解决上述问题，本发明采用的技术方案为：一种抗肝素干扰的亮氨酸氨基肽酶测定试剂，该试剂由试剂1和试剂2组成，其中试剂1、试剂2中的各组分及组分浓度范围为：

试剂1：

缓冲液(pH7.0-8.5) 50-500 mmol/L

抗干扰剂 1-100 ml/L

防腐剂 0.1-100 g/L；

试剂2：

本发明上述的试剂可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以制成液体试剂，直接使用；上述试剂的配置均采用行业常规技术。

其中所述缓冲液可以是磷酸缓冲液、三羟甲基氨基缓冲液、甘氨酸-Na0H缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪一N’-2-乙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸缓冲液、哌嗪-N，N-双(2-羟基乙烷磺酸)缓冲液、3-吗啉-2-羟基丙磺酸钠缓冲液、3-(N-吗啡啉)乙磺酸钠缓冲液、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-4-丁磺酸缓冲液、3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸缓冲液、3-(环己胺)-1-丙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液，柠檬酸一柠檬酸三钠缓冲液、咪唑缓冲液、醋酸一醋酸钠缓冲液，2-吗啉乙磺酸缓冲液中的一种或几种。

所述防腐剂选白山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、叠氮钠、proclin系列防腐剂(如Proclin300)中的一种或几种。

所述稳定剂选自聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇、BSA(牛血清白蛋白)中的一种或者几种。

所述的抗干扰剂，优选非离子表面活性剂，为更优选地，所述非离子表面活性剂选白TWEEN系列(如Tween20)、SPAN系列(如Span-80)、TRITON系列(如TritonX-100)中的一种。

本发明的突出实质性特点及显著进步主要表现在：

(1)本发明的试剂为双试剂，通过试剂l中的抗干扰剂先将样本中的肝素干扰效应去除，再加入试剂2进行反应，因此本发明试剂具有良好的抗肝素干扰性能。

（2）本发明的试剂通过加入选定的稳定剂，使得试剂具有良好的稳定性：本发明试剂盒2-8℃避光保存至少稳定12个月，能完全满足临床检验要求。

具体实施方式

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明作出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述试剂的配置方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

实施例1：

试剂1：

三羟甲基氨基缓冲液（pH 7.0） 50mmol/L

Tween 20 5ml/L

叠氮钠 0.1g/L；

试剂2：

2-吗啉乙磺酸缓冲液（pH 4.0） 100mmol/L

L-亮氨酰-p-硝酰基苯胺 2mmol/L

蔗糖 5g/L

叠氮钠 0.1g/L。

试剂1和试剂2可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以制成液体试剂，直接使用；

实施例2：

试剂1：

N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸缓冲液（pH 8.0）100mmol/L

Span-80 10ml/L

山梨酸钾 1g/L；

试剂2：

醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 3.0） 100mmol/L

L-亮氨酰-p-硝酰基苯胺 5mmol/L

BSA 2g/L

叠氮钠 0.1g/L。

实施例3：

试剂1：

N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-4-丁磺酸缓冲液（pH 8.5）500mmol/L

Triton X-100 20ml/L

Proclin300 1g/L；

试剂2：

咪唑缓冲液（pH 6.0） 100mmol/L

L-亮氨酰-p-硝酰基苯胺 20mmol/L

山梨醇 5g/L

Proclin300 0.1g/L。

本发明试剂盒测定样本中的LAP的测试条件如下：温度：30-37℃；比色杯光径为1.0cm。检测主波长405nm。

应用本发明LAP测定试剂盒测定样本中LAP的方法如下：样品（校准管以校准品做样品）加R1混匀，30-37℃孵育3-5min后，立即加入R2混匀，30-37℃反应2min后，连续检测3min，计算ΔA/min。其中样本用量15μl，试剂1用量240μl，试剂2用量60μl。

本发明试剂盒测定样本中LAP含量按以下公式进行计算：

下面结合表格对本发明实施例所得试剂盒的性能进行说明。

1、试剂盒稳定性实验

（1）37℃加速稳定性实验

将实施例1配制的试剂进行37℃加速稳定性实验（37℃加速稳定性试验7天可模拟现实4-8℃保存1年），检测结果如表1所示：

表1本发明液体试剂进行37℃加速稳定性实验

（2）4-8℃稳定性实验

如表2所示：

表2本发明实施例3的试剂在4-8℃保存1年的实验结果

（3）开盖稳定性实验

试剂定标后开盖放置试剂仓中，定期检测固定质控品。检测试剂在使用过程中的稳定性性能。结果具体如表3所示：

表3本发明试剂使用过程中的稳定性性能

时间（天）	质控品Ⅰ17（14—20）	质控品Ⅱ16（14—18）
			1	16.8	16.5
3	17.3	15.9
			5	16.6	16.2
7	17.4	16.3
			9	16.3	15.6
11	16.4	15.7
			13	16.2	15.4
15	16.3	15.4

以上数据明显显示，本发明的试剂盒在4℃开盖稳定性能指标表现卓越（4）运输条件下的稳定性实验

如表4：

表4实施例3试剂盒在运输条件下的稳定性

由以上数据明显显示，本发明实施例1配制的试剂稳定性好。

2、试剂盒的抗干扰实验

（1）胆红素、血红蛋白、抗坏血酸、甘油三酯的干扰

分别按照本领域的常规技术配制含有胆红素、血红蛋白、抗坏血酸、甘油三酯不同浓度的待测样品，测定实施例1的试剂盒对各种干扰物的抗干扰能力（每个样品一式三份，取其平均值）。检测结果（平均值）如表5所示：

表5

（2）肝素的干扰

分别按照本领域的常规技术配制含有不同浓度的肝素待测样品，测定实施例1的试剂盒对肝素的抗干扰能力（每个样品一式三份，取其平均值）。检测结果（平均值）如表6所示：

表6：

从上述检测结果可知，本发明试剂具有良好的抗肝素干扰性能，且试剂具有良好的稳定性：试剂盒2-8℃避光保存至少稳定12个月，能完全满足临床检验要求。

Claims

1.一种抗肝素干扰的亮氨酸氨基肽酶测定试剂，其特征在于：该试剂由试剂1和试剂2组成，其中试剂1、试剂2中的各组分及组分浓度范围为：

试剂1：

缓冲液（pH 7.0~8.5） 50-500mmol/L

抗干扰剂 1-100ml/L

防腐剂 0.1-100g/L；

试剂2：

2.根据权利要求1所述的抗肝素干扰的亮氨酸氨基肽酶测定试剂，其特征在于：所述的抗干扰剂为非离子表面活性剂。

3.根据权利要求2所述的抗肝素干扰的亮氨酸氨基肽酶测定试剂，其特征在于：所述的非离子表面活性剂为TWEEN系列、SPAN系列、TRITON系列中的一种。

4.根据权利要求1所述的抗肝素干扰的亮氨酸氨基肽酶测定试剂，其特征在于：所述缓冲液为磷酸缓冲液、三羟甲基氨基缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸缓冲液、哌嗪-N,N-双(2-羟基乙烷磺酸)缓冲液、3-吗啉-2-羟基丙磺酸钠缓冲液、3-(N-吗啡啉)乙磺酸钠缓冲液、4-（2-羟乙基）哌嗪-1-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-4-丁磺酸缓冲液、3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸缓冲液、3-(环己胺)-1-丙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液，柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液、咪唑缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液，2-吗啉乙磺酸缓冲液中的一种或几种。

5.根据权利要求1所述的抗肝素干扰的亮氨酸氨基肽酶测定试剂，其特征在于：所述防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、叠氮钠、proclin系列防腐剂中的一种或几种。

6.根据权利要求1所述的抗肝素干扰的亮氨酸氨基肽酶测定试剂，其特征在于：所述稳定剂为聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇、BSA中的一种或者几种。