CN105838775A - 一种测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒及其制备方法，包括的成分及相应含量为：试剂R1：缓冲液20~180 mmol/L、吐温‑20 0.1~1.0 g/L，其溶剂为纯化水，试剂R2：缓冲液20~180 mmol/L、L‑亮氨酰‑P‑硝基苯胺0.1~15.0 mmol/L、复合酶稳定剂0.1~1.0mL/L，其溶剂为纯化水，制备方法和使用方法包括以下步骤：按照组分含量配制好试剂；将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；根据吸光度变化值计算出样本中的亮氨酰氨基肽酶的浓度。本发明具有稳定性好、测定准确度高等优点。

Description

一种测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒及其制备方法。
背景技术
亮氨酰氨基肽酶（LAP）是一种蛋白分解酶，能水解肽链N端并由亮氨酸与其它氨基酸形成肽键的酶，其广泛分布于肝、胰、肾等组织中，其中肝内含量最高,当肝内外胆淤时，亮氨酰氨基肽酶活力显著增高，尤其在恶性胆淤时，其活力随病情进展而持续增高,除了肝脏病变外，亮氨酰氨基肽酶在胆囊、胰腺等组织病变时，亦可出现血清亮氨酰氨基肽酶的升高,亮氨酰氨基肽酶不像其它肝功的酶，只能检测血液样本，亮氨酰氨基肽酶还可以检测尿液,在一些病例中，可以检测尿液中亮氨酰氨基肽酶的变化，而不必采血。
亮氨酰氨基肽酶亦可以反应早期的肾功能的损害和程度，并为临床鉴别肾小球、肾小管损伤提供可能的帮助。
目前，市场上的对亮氨酰氨基肽酶的检测试剂盒不仅操作复杂，而且测定的准确度、精密度均比较差，需要进行改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的技术操作复杂、准确度和精密度均比较差的缺陷，而提供一种测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒及其制备方法。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 20~180 mmol/L
吐温-20 0.1~1.0 g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
缓冲液 20~180 mmol/L
L-亮氨酰-P-硝基苯胺 0.1~15.0 mmol/L
复合酶稳定剂 0.1~1.0mL/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，本发明公开了一种测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 100 mmol/L
吐温-20 0.5 g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
缓冲液 100 mmol/L
L-亮氨酰-P-硝基苯胺 7.5 mmol/L
复合酶稳定剂 0.5mL/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，所述的试剂R1中，所述的缓冲液采用磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、1，4-哌嗪二乙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪丙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、3-（N-吗啉基）-2-羟丙基磺酸缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、磷酸二氢钠缓冲液中的一种或多种的组合，所述的试剂R2中，所述的缓冲液采用磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、1，4-哌嗪二乙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪丙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、3-（N-吗啉基）-2-羟丙基磺酸缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、磷酸二氢钠缓冲液中的一种或多种的组合。
作为优选，所述的试剂R2中，所述的复合酶稳定剂采用聚乙二醇、甘油、海藻糖、山梨醇、牛血清白蛋白中的一种或多种的组合。
作为优选，本发明还公开了上述测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒的制备方法和使用方法，包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
缓冲液 20~180 mmol/L
吐温-20 0.1~1.0 g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
缓冲液 20~180 mmol/L
L-亮氨酰-P-硝基苯胺 0.1~15.0 mmol/L
复合酶稳定剂 0.1~1.0mL/L
其溶剂为纯化水。
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的亮氨酰氨基肽酶的浓度。
本发明的检测原理是：样品中的亮氨酰氨基肽酶催化水解底物L-亮氨酰-P-硝基苯胺，生成亮氨酸和对硝基苯胺，用405nm波长检测吸光度的变化率，求出样品中亮氨酰氨基肽酶的活性。
ΔAU/min
ΔAB/min
样本中LAP的活性（U/L）= CS× （U/L）
式中：ΔAU/min 待测样品平均每分钟的吸光度变化值
ΔAB/min 校准液平均每分钟的吸光度变化值
CS 校准液中亮氨酰氨基肽酶的浓度
与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：本发明所述的测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒通过添加复合酶稳定剂，复合酶稳定剂可以有效的提高L-亮氨酰-P-硝基苯胺的稳定性，这样在测试的过程中，整个反应也就更趋于稳定，因此本发明所述的测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒的稳定性好、测定准确度高，另外本发明制备方法简单、成本低，另外操作也比较方便。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
三羟甲基氨基甲烷缓冲液 100 mmol/L
吐温-20 0.5 g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
2-吗啉乙磺酸缓冲液 100 mmol/L
L-亮氨酰-P-硝基苯胺 7.5 mmol/L
海藻糖 0.5mL/L
其溶剂为纯化水。
实施例2
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
甘氨酸缓冲液 20mmol/L
吐温-20 1.0 g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液 180 mmol/L
L-亮氨酰-P-硝基苯胺 15.0 mmol/L
甘油 0.1mL/L
其溶剂为纯化水。
实施例3
试剂盒的制备和使用方法
1、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
三羟甲基氨基甲烷缓冲液 100 mmol/L
吐温-20 0.5 g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
2-吗啉乙磺酸缓冲液 100 mmol/L
L-亮氨酰-P-硝基苯胺 7.5 mmol/L
海藻糖 0.5mL/L
其溶剂为纯化水。
2、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长405nm、副波长505nm；
（c）反应时间 ：8min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度 A1，3min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：正反应。
3、检测步骤
（a）取200μl试剂R1与12.5μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入50μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，3min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1；
(d) 根据
ΔAU/min
ΔAB/min
样本中LAP的活性（U/L）= CS× （U/L）计算出样本中的亮氨酰氨基肽酶的浓度。
实施例4
试剂盒的制备和使用方法
1、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
甘氨酸缓冲液 20mmol/L
吐温-20 1.0 g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液 180 mmol/L
L-亮氨酰-P-硝基苯胺 15.0 mmol/L
甘油 0.1mL/L
其溶剂为纯化水。
2、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长405nm、副波长505nm；
（c）反应时间 ：8min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度 A1，3min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：正反应。
3、检测步骤
（a）取200μl试剂R1与12.5μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入50μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，3min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1；
(d) 根据
ΔAU/min
ΔAB/min
样本中LAP的活性（U/L）= CS× （U/L）计算出样本中的亮氨酰氨基肽酶的浓度。
表1为实施例1所制得的测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒以及实施例2所制得的测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒分别对质控品1进行测定的结果，其中质控品1中的亮氨酰氨基肽酶的浓度为14U/L，测定结果见表1：
表1
第1次（U/L） 第2次（U/L） 第3次（U/L） 均值（U/L） 偏差（%）
实施例1 15 14 14 14.33 2.36%
实施例2 16 14 14 14.67 4.79%
由表1可知，本发明所制得的测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒对质控品1的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表2为实施例1所制得的测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒以及实施例2所制得的测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒分别对质控品2进行测定的结果，其中质控品2中的亮氨酰氨基肽酶的浓度为21U/L，测定结果见表2：
表2
第1次（U/L） 第2次（U/L） 第3次（U/L） 均值（U/L） 偏差（%）
实施例1 21 20 21 20.67 1.57%
实施例2 22 21 23 22 4.76%
由表2可知，本发明所制得的测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒对质控品2的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表3为实施例3所制得的测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定以及实施例4所制得的测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定，对所得的结果进行SD和CV的计算，结果如下：
表3
由表3可知本发明所制得的测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒的精密度比较好，而且由表1可知，实施例3为最优的选择。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (5)

1.一种测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 20~180 mmol/L
吐温-20 0.1~1.0 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 20~180 mmol/L
L-亮氨酰-P-硝基苯胺 0.1~15.0 mmol/L
复合酶稳定剂 0.1~1.0mL/L
其溶剂为纯化水。
2.根据权利要求1所述的一种测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 100 mmol/L
吐温-20 0.5 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 100 mmol/L
L-亮氨酰-P-硝基苯胺 7.5 mmol/L
复合酶稳定剂 0.5mL/L
其溶剂为纯化水。
3.根据权利要求1或2所述的一种测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R1中，所述的缓冲液采用磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、1，4-哌嗪二乙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪丙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、3-（N-吗啉基）-2-羟丙基磺酸缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、磷酸二氢钠缓冲液中的一种或多种的组合，所述的试剂R2中，所述的缓冲液采用磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、1，4-哌嗪二乙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪丙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、3-（N-吗啉基）-2-羟丙基磺酸缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、磷酸二氢钠缓冲液中的一种或多种的组合。
4.根据权利要求1或2所述的一种测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R2中，所述的复合酶稳定剂采用聚乙二醇、甘油、海藻糖、山梨醇、牛血清白蛋白中的一种或多种的组合。
5.根据权利要求1或2所述的一种测定亮氨酰氨基肽酶的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
缓冲液 20~180 mmol/L
吐温-20 0.1~1.0 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 20~180 mmol/L
L-亮氨酰-P-硝基苯胺 0.1~15.0 mmol/L
复合酶稳定剂 0.1~1.0mL/L
其溶剂为纯化水
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的亮氨酰氨基肽酶的浓度。
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