CN101477129B - 蛋白质的测定方法与蛋白质检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蛋白质测定方法，该方法利用酶比色法及酶联法技术测定蛋白质含量。本发明还涉及蛋白质测定试剂盒。本发明的测定方法具有专一特异性、灵敏度高、误差小，因此本发明的测定方法与试剂盒可以广泛地应用于含有蛋白质的各种产品，尤其是食品的分析。

Description

蛋白质的测定方法与蛋白质检测试剂盒

【技术领域】

本发明涉及食品及医学检验测定技术领域，更具体地，本发明涉及蛋白质测定方法及其试剂盒。

【背景技术】

蛋白质主要由氨基酸组成。蛋白质平均含氮量约16％，而三聚氰胺的含氮量约66％。目前采用的蛋白质测定方法“凯氏定氮法”是通过测定样品中的含氮量，而不是通过直接测定蛋白质来反映蛋白质含量。由于现有食品和饲料蛋白质含量测定方法存在的这种没有专一特异性的缺陷，使用含氮量高的三聚氰胺来提高“虚假”蛋白质含量的成本，是使用实际蛋白原料的1/5，于是一些人故意将三聚氰胺用作食品和饲料添加剂，抬高检测食品和饲料中的蛋白质含量，欺骗国家质检部门和消费者。因此，需要一种具备专一特异性的能够直接测定食品和饲料中的蛋白质含量的方法，本发明人经过大量试验研究，终于做出了本发明。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种具备专一特异性的蛋白质的测定方法。

本发明的另一个目的是提供一种蛋白质检测试剂盒。

[技术方案]

本发明涉及一种蛋白质的测定方法，该方法利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，通过测量还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处的吸光度变化测定蛋白质含量。

本发明的蛋白质测定方法的基本原理如下：

这种方法应用蛋白酶(protease；proteinase；peptidase；EC 3.4家族)酶(偶)联氨基酸脱氢酶(amino-acid dehydrogenase；EC 1.4.1.5；EC 1.4.99.1)酶促反应比色终点法。蛋白质在蛋白酶的作用下进行酶解反应产生氨基酸，再通过(偶)联合氨基酸脱氢酶的作用，将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，这样通过测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升程度就可以测定蛋白质的含量。

所述的辅酶是一种或多种选自NADP⁺、NAD⁺或thio-NAD⁺的辅酶。

所述的蛋白酶是一种或多种选自菠萝蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、α，β，γ，δ-糜蛋白酶、梭菌蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、无花果蛋白酶、激肽释放酶、金属内肽酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、肽酶、内肽酶、N-外肽酶、C-外肽酶、蛋白酶A、蛋白酶K、胰蛋白酶、氨基酸肽酶的蛋白酶。

氨基酸的检测方法很多，本公司已经就使用酶法测定氨基酸的方法提出了80多项发明专利申请，因此氨基酸的检测不仅限于使用氨基酸脱氢酶，也可以是本公司所申请的80多项氨基酸测定方法的发明专利的任何一种。

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种蛋白质的测定方法。该蛋白质测定方法的步骤如下：

A、样品准备：

1)标准样品的制备

将一定量的纯蛋白溶于水或缓冲液中，再将蛋白浓度调整到10-100克/升，得到的溶液作为标准样品；

2)待测样品预处理

以重量计按照1/5-1/500比将固体蛋白样品溶于水或缓冲液中作为待测样品；含有蛋白的液体样品作为待测样品可以直接用于后续步骤；

3)空白样品

所述的水或缓冲液作为空白样品，其蛋白质浓度为0克/升；

B、试剂溶液的制备：

分别移取或称取缓冲液、稳定剂、氨基酸脱氢酶、蛋白酶、辅酶，然后将它们混合均匀，使用时用水将它们溶解得到一种溶液，它们的浓度分别是40-500mmol/L、0.01-7mol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、0.2-5mmol/L；

所述的蛋白酶是一种或多种选自菠萝蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、α，β，γ，δ-糜蛋白酶、梭菌蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、无花果蛋白酶、激肽释放酶、金属内肽酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、肽酶、内肽酶、N-外肽酶、C-外肽酶、蛋白酶A、蛋白酶K、胰蛋白酶、氨基酸肽酶的蛋白酶；

所述的辅酶是一种或多种选自NADP⁺、NAD⁺或thio-NAD⁺的辅酶。

C、待测样品与在步骤B)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/300进行混合，在温度36-38℃下反应2-12分钟，在主波长340nm与副波长405nm下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；

D、在与步骤C)同样的条件下测定步骤A)标准样品的吸光度随时间的变化；

E、在与步骤C)同样的条件下测定在步骤A)使用的水或缓冲液作为空白溶液的吸光度随时间的变化；

F、数据处理

由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到蛋白质的含量：

式中：

ΔA(样品)表示步骤C)得到的待测样品的吸光度变化；

ΔA(标准)表示步骤D)标准样品的吸光度变化；

ΔA(空白)表示步骤E)得到的空白溶液的吸光度变化。

根据本发明，在所述的蛋白质测定方法中，所述的缓冲液应该理解是能够使其测定介质的pH基本保持稳定(一般是6.5-8.5)的溶液。如果该pH高于8.5或pH低于6.5，则该测定方法使用的酶的活性达不到预期的活性效果，因此需要添加更多的介质与酶，才有可能达到预期的活性效果。

根据本发明的一种优选实施方式，本发明使用的所述缓冲液选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、二乙醇胺缓冲液、咪唑/盐酸缓冲液或2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、双甘氨肽缓冲液或“PBS”缓冲液。

优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、磷酸盐缓冲液或“PBS”缓冲液的缓冲液。

更优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液或磷酸盐缓冲液的缓冲液。

根据本发明，在所述的蛋白质测定方法中，所述的稳定剂应该理解是一种能保护试剂中的介质(底物)与酶不会随着时间推移而改变其性质，进而失去活性的物质，它会使得试剂具备很长的活性寿命，通常长达数月，甚至一、二年。如果没有所述的稳定剂，则试剂的活性在溶液中只能维持数小时，顶多数天，就会失去活性而不再具备检测性能。在本发明中，所述的稳定剂使用量是0.01-7mol/L。如果所述的稳定剂使用量不够，则试剂活性的寿命就会缩短；如果所述的稳定剂使用量过高，则会增加成本。

根据本发明的另一种优选实施方式，本发明使用的所述稳定剂是一种或多种选自硫酸铵、氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油的稳定剂。

优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自硫酸铵、丙二醇、甘油或氯化钠的稳定剂。

更优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自硫酸铵或甘油的稳定剂。

在本发明中，使用全自动生化分析仪测定时，待测样品、所述标准样品与所述空白溶液由该分析仪在设定条件下自动取样，然后在下述条件下进行测定：

反应温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm，待测蛋白质样品与试剂的体积比例为1/10-1/300，计量方法为两点终点法，反应方向为正反应，延迟时间0分钟，检测时间5分钟。

在本发明中，所述的纯蛋白是酪蛋白、白蛋白、血清蛋白与含有蛋白的其它蛋白物质；所述的固体蛋白样品是奶粉、奶糖、奶酪或其它含奶样品；所述的含有蛋白的液体样品是牛奶、马奶、羊奶、骆驼奶、人奶、人血清、人血浆或其它含奶液体样品。所述的其它蛋白物质、其它有奶样品、其它含奶液体样品也都在本发明的保护范围内。

根据本发明的另一种优选实施方式，本发明使用的所述缓冲液、稳定剂、氨基酸脱氢酶、蛋白酶、辅酶可以配制成双剂试剂或三剂试剂，即将这些试剂分成两组或三组试剂，其中氨基酸脱氢酶、蛋白酶或辅酶在这些试剂组中的位置是不限定的，即可以相互交换。

在本发明蛋白质测定方法中使用的试剂都是目前在市场上获得或购买到的试剂。

采用本发明的蛋白质测定方法时，可以使用紫外/可见光分析仪，例如上海精密仪器仪表有限公司销售的紫外可见分光光度计、天津喀纳斯光学分析仪器有限公司销售的723可见分光光度计；半自动生化分析仪，例如上海伟思医用设备有限公司的BTS-330半自动生化分析仪；全自动生化分析仪，例如：由迈瑞公司以商品名BS300、奥林帕斯公司以商品名AU400、东芝公司以商品名120、日立公司以商品名7600、雅培公司以商品名CB8000或贝克曼公司以商品名CX20销售的全自动生化分析仪。

本发明还涉及一种蛋白质检测试剂盒。该蛋白质检测试剂盒由下述粉状试剂组成，这些粉状试剂在使用时用水溶解得到具有下述浓度范围的可直接使用的液体试剂：

缓冲液          40-500mmol/L

稳定剂          0.01-7mol/L

蛋白酶          1000-80000U/L

氨基酸脱氢酶    1000-80000U/L

辅酶            0.2-5mmol/L

所述的蛋白酶是一种或多种选自菠萝蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、α，β，γ，δ-糜蛋白酶、梭菌蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、无花果蛋白酶、激肽释放酶、金属内肽酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、肽酶、内肽酶、N-外肽酶、C-外肽酶、蛋白酶A、蛋白酶K、胰蛋白酶、氨基酸肽酶的蛋白酶；

所述的辅酶是一种或多种选自NADP⁺、NAD⁺或thio-NAD⁺的辅酶。

根据本发明蛋白质检测试剂盒的一种优选实施方式，本发明使用的所述缓冲液选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、二乙醇胺缓冲液、咪唑/盐酸缓冲液或2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、双甘氨肽缓冲液或“PBS”缓冲液。

根据本发明蛋白质检测试剂盒的另一种优选实施方式，本发明使用的所述稳定剂是一种或多种选自硫酸铵、氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油的稳定剂。

在本发明中，在本发明测定蛋白质的方法中，无论是单剂试剂、双剂试剂还是三剂试剂，所述的辅酶是一种或多种选自NADP⁺、NAD⁺或thio-NAD⁺的辅酶。

在采用本发明方法测定蛋白质时，可以根据下式要求进行多次试验，然后将得到的这些试验结果按照下式计算出精密度(CV)：

$S=\sqrt{\mathrm{\Σ}{(\stackrel{\‾}{X}-X_i)}^2/n-1}$

式中：

X-试验结果平均值；

Xi-各次试验结果；

n-试验次数.N≥10

CV＝S/X*100％

将得到的这些试验结果按照下式计算出相对极差：

$\mathrm{\Δ}=\frac{\stackrel{\‾}{U}-\stackrel{\‾}{V}}{(\stackrel{\‾}{X}+\stackrel{\‾}{Y}+\stackrel{\‾}{Z})\÷3}$

X——第一批各次试验结果平均值

Y——第二批各次试验结果平均值

Z——第三批各次试验结果平均值

U——为X，Y，Z中的最大值

V——为X，Y，Z中的最小值

每批试样数取n≥3

经过大量试验确定，对于蛋白质含量为0.1-2.0克/升的样品，其分析误差可以达到≤4％；对于蛋白质含量为2-150克/升的样品，其分析误差可以一般达到≤2％；而现有测定方法，例如“凯氏定氮法”方法分析误差达到≤5％，因此与现有技术相比，本发明方法的误差小得多。

本发明方法的灵敏度可以达到0.1克/升。

由于本发明是具有底物专一特性的酶法试剂，因此影响本发明测定结果的干扰物应该没有；三聚氰胺不会发生反应。

通过大量试验确定，本发明方法测定蛋白质含量范围是0-150克/升，高于这个值时，样品需要进行稀释，再行测试，因此本发明的测定方法适用范围宽。

采用本发明方法测定其测定蛋白质时，使用全自动生化分析仪时，一般可以达到每小时测定样品达到1800个。

本发明的方法也可以应用于人血清、人血浆等医学临床检验技术领域。

使用紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行蛋白质含量测定，可以达到测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

[有益效果]

本发明具有下述积极效果：

本发明的方法具备蛋白质底物专一特异性，不受其它物资干扰，三聚氰胺不会发生反应作用，结果准确可靠，不会发生虚假结果；本发明的方法测定速度快，每小时可测试120-3600个样品，每毫升试剂可测试4-8个样品；灵敏度高，可测到0.1克/升；精确度可达到(误差≤2％)，再现性好，测定成本低，因而具有广泛应用的前景。

【具体实施方式】

下述实施例说明本发明而不限制本发明的保护范围。

实施例1：牛奶样品中蛋白质含量的测定

A、样品的准备

1)标准样品的制备

将一定量的纯酪蛋白溶于水中，再使用该纯酪蛋白将浓度调整到20克/升，得到的溶液作为标准样品；

2)待测样品预处理

以鲜牛奶作为待测样品；

3)空白样品

所述的水作为空白样品，其蛋白质浓度为0克/升；

B、试剂溶液的制备：

分别移取或称取三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、甘油、氨基酸脱氢酶、菠萝蛋白酶、NAD⁺，然后将它们混合均匀，使用时用水将它们溶解得到试剂溶液，它们的浓度分别是100mmol/L、3mol/L、12000U/L、10000U/L、3mmol/L；

C、鲜牛奶与在步骤B)得到的试剂溶液按照体积比3/300进行混合，在温度37℃下反应5分钟，在主波长340nm与副波长405nm下进行测定，测定其吸光度随时间的变化ΔA(样品)为0.4754；

D、在与步骤C)同样的条件下测定步骤A)标准样品的吸光度随时间的变化ΔA(标准)为0.3162；

E、在与步骤C)同样的条件下测定在步骤A)使用的水作为空白溶液的吸光度随时间的变化ΔA(空白)为0.0009；

F、数据处理

由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化ΔA，根据下式计算得到蛋白质的含量：

通过上式计算得到该鲜牛奶样品的蛋白质含量为30.1克/升，其分析误差是±0.3。该牛奶的蛋白质含量为3.01％。

实施例2：奶粉样品中蛋白质含量的测定

A、样品的制备

1)标准样品的制备

将一定量的纯酪蛋白溶于水中，再使用该纯酪蛋白将浓度调整到20.0克/升，得到的溶液作为标准样品；

2)待测样品预处理

以重量计按照1/10比将奶粉样品溶于水中作为待测样品；

3)空白样品

所述的水作为空白样品，其蛋白质浓度为0.0克/升；

B、试剂溶液的制备：

该蛋白质测定试剂为双剂试剂，它含有：

组成如下的试剂1：

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L

NADP⁺                            3mmol/L

组成如下的试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L

乙二醇                           5mol/L

胃蛋白酶                         40000U/L

内肽酶                           40000U/L

氨基酸脱氢酶                     48000U/L

C、样品使用日立7080全自动生化分析仪测定

该全自动生化分析仪主要操作参数如下：

计量方法：两点终点法

测试计量时间点：16，31

主波长        ：340

副波长        ：405

反应温度      ：37

样品体积      ：3

试剂1(R1)体积 ：200

试剂2(R2)体积 ：0

试剂3(R3)体积 ：50

反应方向      ：正

标准样品1     ：0.0

标准样品2     ：20.0

定标得到K值结果为：101，换算成灵敏度为：0.099ΔA/克/升。

测试结果显示该奶粉样品中含有蛋白质17.9克/升，换句话说，该奶粉样品的蛋白质含量为17.9％，其分析误差是±0.27％。

实施例3：血清蛋白样品中蛋白质含量的测定

该实施例的操作方式与实施例1相同，只是本实施例：

A、样品的制备

1)标准样品的制备

将一定量的纯血清蛋白溶于缓冲液中，再使用该纯血清蛋白将浓度调整到90克/升，得到的溶液作为标准样品；

2)待测样品预处理

以人血清作为待测样品；

3)空白样品

所述的水作为空白样品，其蛋白质浓度为0克/升；

B、试剂溶液的制备：

该蛋白质测定试剂为三剂试剂，它含有：

组成如下的试剂1：

磷酸盐缓冲液    100mmol/L

NAD⁺            2mmol/L

组成如下的试剂2

磷酸盐缓冲液    100mmol/L

硫酸铵          1mol/L

氨基酸脱氢酶    60000U/L

组成如下的试剂3

磷酸盐缓冲液    100mmol/L

氯化钠          1mol/L

木瓜凝乳蛋白酶  36000U/L

外肽酶          36000U/L

胰蛋白酶        36000U/L

C、样品使用日立7080全自动生化分析仪测定

该全自动生化分析仪主要操作参数如下：

计量方法          ：两点终点法

测试计量时间点    ：16，31

主波长            ：340

副波长            ：405

反应温度          ：37

样品体积          ：3

试剂1(R1)体积     ：200

试剂2(R2)体积     ：50

试剂3(R3)体积     ：50

反应方向          ：正

标准样品1         ：0.00

标准样品2         ：90.00

定标得到K值结果为：989，换算成灵敏度为：0.101ΔA/克/升。

测试结果显示该血清样品中的蛋白质含量为79.99克/升，其误差是±0.88。

实施例4：稳定性试验

该实施例的操作方式与实施例2相同，只是在实施例2实施后，实施例2使用的试剂在密闭试剂瓶中在2-8℃下存放了半年与一年。

使用同样的鲜奶，使用与实施例2同样的新试剂与上述存放半年与一年的试剂分布进行了测定，其它条件都与实施例相同，其测定结果如下：

表1

上表结果表明，使用本发明的试剂盒采用本发明的测定方法可以保证获得稳定的结果，其稳定性至少一年以上。

实施例5：线性试验

该实施例的操作方式与实施例2相同，只是配制新的标准样品浓度达到200克/升，将200克/升的纯酪蛋白依倍比稀释，然后进行测试，其测定结果如下：

表2

表2结果表明，使用本发明的试剂盒，采用本发明的测定方法可以保证线性可以达到150克/升。

申请人经过实验验证，采用本发明说明书中记载的其他测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。

总之，实验证明：采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(ΔA/min)≤0.001；吸光度时间反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(R≥0.99)线形范围可达150克/升；试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±3％；试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)≤2％；试剂的灵敏度可达0.1±0.01ΔA/克/升；试剂在2-8℃下保存，活性可以稳定一年以上；本发明特异性高，非蛋白质不会有反应，灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。

Claims (1)

1.一种蛋白质检测试剂盒，其特征在于它由粉状试剂组成，这些粉状试剂在使用时用水溶解得到具有下述浓度范围的可直接使用的液体试剂,所述试剂盒为三剂试剂，它含有：

试剂1，组成如下:

磷酸盐缓冲液    100mmol/L

NAD⁺            2mmol/L

试剂2，组成如下：

磷酸盐缓冲液    100mmol/L

硫酸铵          1mol/L

氨基酸脱氢酶    60000U/L

试剂3，组成如下：