CN101226198A - 一种糖化血清蛋白的酶法测定方法及液体稳定试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种糖化血清蛋白的酶法测定方法及液体稳定试剂，可广泛应用在医学及生物化学技术领域。其特点是：糖化血清蛋白被菠萝蛋白酶消化产生果糖氨基酸，果糖氨基酸氧化酶作用于果糖氨基酸产生H2O2，H2O2在过氧化物酶的催化下与色原DA－64反应，使DA－64转变为一种绿色的产物，此产物含量与样本中糖化血清蛋白含量成正比，在自动生化分析仪上以两点终点法的测量模式实现对样本中糖化血清蛋白的含量测定。采用本法制备的液体型测定试剂稳定、方便、抗干扰能力强，对自动生化分析仪管道无污染，特别适合进行糖化血清蛋白的批量自动化检测。

Description

一种糖化血清蛋白的酶法测定方法及液体稳定试剂
技术领域
本发明涉及糖化血清蛋白的果糖氨基酸氧化酶法自动化分析方法及其液体稳定试剂，可广泛应用在医学及生物化学技术领域。
背景技术
糖化血清蛋白是血液中葡萄糖与白蛋白及其他蛋白质分子N末端的氨基上发生非酶促糖化反应形成的具有酮胺链的糖化蛋白，亦称果糖胺，是临床常规检验项目。糖化血清蛋白浓度可有效反映患者过去1-3周内平均血糖的水平，并不受临时血糖浓度波动的影响，为临床糖尿病人的诊断和较长时间血糖控制水平的研究，提供一个较好的指标。因此，准确测定糖化血清蛋白的含量具有重要的临床价值。
目前，临床上测定糖化血清蛋白的方法主要为硝基四氮唑蓝比色法和酮胺氧化酶法。其中硝基四氮唑蓝比色法准确性差、对生化自动分析仪污染严重；酮胺氧化酶法虽准确、简便，但均为冻干型粉末状试剂，价格昂贵，试剂复溶后效期短，浪费严重，临床实际难以开展。
本发明的目的是为了解决上述技术的不足，通过一种果糖氨基酸氧化酶和一种新的水溶性色源N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-二(甲基氨基)-联苯胺(DA-64)的运用，向临床提供一种直接使用、无需复溶、稳定性强、测定结果受外界干扰小，且对自动生化分析的管道无污染的自动化测定技术及其相应的液体稳定试剂。该测定试剂置2-8℃保存可至少可稳定6个月，提供的方法和试剂可以应用于目前广泛使用的临床生化自动分析仪，从而达到大规模测定样本的要求。
发明内容
本发明提供了一种糖化血清蛋白的酶法测定方法及液体稳定试剂，用于糖化血清蛋白的测定。该测定体系主要是通过糖化血清蛋白被菠萝蛋白酶消化产生果糖氨基酸，果糖氨基酸氧化酶作用于果糖氨基酸产生H2O2，H2O2在过氧化物酶的催化下与色原DA-64反应，使DA-64转变为一种绿色的产物，此产物含量与样本中糖化血清蛋白含量成正比，在自动生化分析仪上以两点终点法的测量模式实现对样本中糖化血清蛋白的含量测定。
为了达到理想的检测效果与足够的稳定性，本发明提供的两点终点法糖化血清蛋白自动化检测试剂，特别可以分为A、B二个组份。两个组份的具体成份组成可表述如下。
A组份：
缓冲液            20-200mmol/L
菠萝蛋白酶        2-20KU/L
表面活性剂        0.5-75ml/L
氯化钙            0.1-10mmol/L
防腐剂            0.1-2g/L
稳定剂            2-100g/L
去干扰剂          0.2-100μmol/L
B组份：
缓冲液            20-200mmol/L
果糖氨基氧化酶    2-20KU/L
过氧化物酶        2-50KU/L
DA-64             0.2-12mmol/L
表面活性剂        0.5-75ml/L
EDTA              20-100mmol/L
防腐剂            0.1-2g/L
稳定剂            2-100g/L
为了提高上述测定试剂的准确性和稳定性，消除测定结果受外界的多种干扰，所述的两点终点法测定试剂中用于测定糖化血清蛋白的缓冲液可以为GOOD’S系列缓冲液、甘氨酸缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液、邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液，特别优选的缓冲液为GOOD’S系列缓冲液；表面活性剂可以为SDS、Tween20、Tween80、Brij35、Brij98、乳化剂OP、TritonX-100等非离子型表面活性剂其中的一种或几种的组合；稳定剂可以是氯化钠、抗生素、多元醇、牛血清白蛋白(BSA)、冠醚等。去干扰剂可以是亚铁氰化钾、亚铁氰化钠、铁氰化钾等；防腐剂可以是NaN3、PC系列防腐剂等。
具体实施方式
实施例：糖化血清蛋白酶法两点终点法测定试剂，A组份中缓冲液特别优选pH6.5MES缓冲液，B组份中缓冲液特别优选MOPOS-MOPOSNa缓冲液；A组份中特别优选的表面活性剂是Tween80，B组份中特别优选的表面活性剂是TritonX-100；A组份中特别优选的稳定剂是天门冬氨酸；B组份中特别优选的稳定剂是牛血清白蛋白；防腐剂优选为PC300。在上述试剂组成中，氯化钙用于激活菠萝蛋白酶，Tween80、TritonX-100可使测定体系在测量过程中保持清亮，避免由于蛋白质的浑浊而引起测量体系吸光度的异常升高。
A组份：
pH6.5MES缓冲液         40mmol/L
菠萝蛋白酶             10KU/L
表面活性剂Tween80      7.5ml/L
氯化钙                 5mmol/L
防腐剂PC300            0.5g/L
天门冬氨酸             60g/L
亚铁氰化钠             50μmol/L
B组份：
MOPOS-MOPOSN缓冲液     180mmol/L
果糖氨基氧化酶         6KU/L
过氧化物酶             12KU/L
DA-64                  2.8mmol/L
表面活性剂TritonX-100  5ml/L
EDTA                   50mmol/L
防腐剂PC300            0.5g/L
牛血清白蛋白           5g/L
在实施例的试剂用于测定样本时，采用的测定方法为两点终点法，温度为37℃，R1∶样本∶R2为200∶20∶50，测定主/副波长为700/800nm，R1加入样本或标准后在测定温度孵育300秒后读取第1点吸光度，然后加入R2继续孵育300秒后读取第2点吸光度。
用本法和英国RANDOX酮胺氧化酶法试剂盒同时测定了20例糖化血清蛋白标本。表1为本实施例测定值与酮胺氧化酶法测定值对照表，图1根据表1数据制成。本实施例和原子吸收法的相关系数r为0.9908，两者显示了极好的相关性。
表1
酮胺氧化酶法测定值(μmol/L)   实施例测定值(μmol/L)
  153   156
  162   167
  133   134
  115   123
  125   128
  178   173
  142   145
  142   147
  172   175
  136   133
  142   143
  173   165
  143   148
  112   116
  174   180
  165   160
  173   173
  142   140
  198   193
  150   152
上述实施例试剂的配制方法仅用于说明本发明的原理和其应用，但本发明绝不局限于上述例举的应用范围。
图1是本发明的实施例测得值与英国RANDOX酮胺氧化酶法试剂盒测得值的相关性示意图。

Claims (4)

1.一种糖化血清蛋白的酶法测定方法及液体稳定试剂，其特征是糖化清蛋白被菠萝蛋白酶消化产生果糖氨基酸，果糖氨基酸氧化酶作用于果糖氨基酸产生过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的催化下与水溶性色原N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-二(甲基氨基)-联苯胺(DA-64)反应，使DA-64转变为一种绿色的产物，此产物含量与样本中糖化血清蛋白含量成正比，在自动生化分析仪上以两点终点法的测量模式实现对样本中糖化血清蛋白的含量测定。
2.根据权利要求1所述的糖化血清蛋白的酶法测定方法及液体稳定试剂，其特征是：缓冲液20-200mmol/L，菠萝蛋白酶2-20KU/L，表面活性剂0.5-75ml/L，氯化钙0.1-10mmol/L，防腐剂0.1-2g/L，稳定剂2-100g/L，去干扰剂0.2-100μmol/L。
3.根据权利要求所述的稳定试剂，其特征在于：缓冲液20-200mmol/L，果糖氨基氧化酶2-20KU/L，过氧化物酶2-50KU/L，DA-640.2-12mmol/L，表面活性剂0.5-75ml/L，EDTA20-100mmol/L，防腐剂0.1-2g/L，稳定剂2-100g/L。
4.根据权利要求1糖化血清蛋白的酶法测定方法及液体稳定试剂，其特征是显色所用的显色剂为一种水溶性色原N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-二(甲基氨基)-联苯胺(DA-64)。
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PB01 Publication
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