CN102998265A - 糖化血红蛋白测量用多层试验片及使用其的测量方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的为提供一种用于在诊断现场正确、简便且迅速地对待测试样中的糖化血红蛋白含量进行比色定量的多层试验片以及测量方法。该多层试验片是用于对糖化血红蛋白含量进行比色定量的多层试验片;至少层叠有下述(a)层和(b)层,所述(a)层和(b)层从待测试样点样面按(a)层、(b)层的顺序层叠;在(a)层和(b)层上承载有过氧化物酶和氧化还原类显色试剂,且过氧化物酶和氧化还原类显色试剂分别承载在不同的层上;并且不具有血液分离层,其中,(a)层:至少承载有蛋白酶的高分子基材,(b)层:至少承载有糖化氨基酸氧化酶的高分子基材。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于在诊断现场正确、简便且迅速地对待测试样中的糖化血红蛋白含量进行比色定量的多层试验片以及测量方法。
背景技术
测量糖化蛋白质在进行糖尿病的诊断、预防以及治疗方面非常重要。糖化蛋白质通过在生物体内葡萄糖与血中蛋白质的氨基(主要是末端氨基酸的α-氨基、赖氨酸残基的γ-氨基)发生非酶促反应而生成。由于蛋白质糖化的程度直接与血中葡萄糖浓度(以下称为血糖值)成比例,因此,例如,糖化血红蛋白的情况下,通过测量糖化蛋白质可以掌握约2~3个月内的血糖控制状态,糖化白蛋白的情况下,通过测量糖化蛋白质可以掌握约2~3周内的血糖控制状态。
尤其是作为糖化血红蛋白的一种的血红蛋白A1c在糖尿病的诊断时被认为是最重要的。
作为上述糖化蛋白质的测量方法,已知有高效液相色谱(HPLC)法、免疫法以及酶法等。在现有技术中,高效液相色谱(HPLC)法以及免疫法占据大部分,但是近年来由于酶法可以迅速、大量、正确且廉价地对大量样本进行测量,因此也开始被频繁采用。
有关酶法,例如已知有通过以下的工序对糖化蛋白质进行比色定量的技术(例如,参照专利文献1~4)。
(1)使待测试样中的红细胞溶血以提取出糖化血红蛋白的工序。
(2)使上述糖化血红蛋白与蛋白酶反应从而从糖化血红蛋白的糖化的β链N末端切出糖化氨基酸和/或糖化肽的工序。
(3)使上述糖化氨基酸和/或糖化肽与糖化氨基酸氧化酶反应从而生成过氧化氢的工序。
(4)在过氧化物酶的存在下使上述过氧化氢与氧化还原类显色试剂反应而显色的工序。
(5)根据上述显色对待测试样中的糖化血红蛋白含量进行比色定量的工序。
但是,所涉及的现有技术是稀释待测试样、添加液体状态的试剂、使之在反应容器内发生反应后测量反应液的吸光度的方法,以使用生物化学自动分析装置的方法为主流,但是所述生物化学自动分析装置存在是大型装置且价格昂贵、需要熟练的检测技师来操作、从採血到出报告结果为止的时间较长这些问题,难以适用于POCT(point of care testing(即,临床现场即时检查))。
另一方面,为解决上述问题,发明了糖化蛋白质测量用试验片(例如专利文献5),该试验片利用了所谓的干化学法,在该方法中,通过以干燥状态将试剂承载在基材上,再向其添加液体状态的待测试样,从而将待测试样中的水分作为溶剂而使反应得以进行。该发明改良点如下:装置为小型且廉价,操作简便,从採血到出报告结果为止可以短时间完成。但是,存在得不到能够经得起实际使用的保存稳定性的问题,即糖化氨基酸氧化酶发生失活、分解、氧化还原类显色试剂发生自显色的问题。另外,从POCT的观点出发,待测试样的血液样本必须进行溶血等前处理这一点也存在问题。
另外,还公开了利用了干化学法的由多层构成的试剂试验片的发明(例如参照专利文献6)。该发明也具有如下改良点:装置为小型且廉价,操作简便,从採血到出报告结果为止可以短时间完成,但是,存在得不到能够经得起实际使用的保存稳定性的问题,即氧化还原类显色试剂发生自显色的问题。另外,如从将血液分离层配置在第一层也会获知的那样,该发明仅仅设想对糖化蛋白质中的作为血浆蛋白质的糖化白蛋白进行测量,而没有公开任何有关测量糖化血红蛋白的具体例子。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2002-006519号
专利文献2:特开2004-222570号公报
专利文献3:特开2007-181466号公报
专利文献4:特开2010-148515号公报
专利文献5:特开2004-333452号公报
专利文献6:特开2004-004071号公报
非专利文献
非专利文献1:Clinical Chemistry 43:122390-2396(1997)
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明是以有关现有技术的技术问题为背景进行的。即,本发明的目的为提供一种用于在诊断现场正确、简便且迅速地对待测试样中的糖化血红蛋白含量进行比色定量的多层试验片以及测量方法。更具体而言,本发明的目的在于提供一种保存稳定性优异的、用于对糖化血红蛋白含量进行比色定量的多层试验片以及测量方法。
解决技术问题的手段
本申请发明人发现,当将蛋白酶与糖化氨基酸氧化酶承载在相同层时,在保存中发生由蛋白酶引起的糖化氨基酸氧化酶失活和/或分解,从而导致保存稳定性显著降低。
另外还发现,当将过氧化物酶与氧化还原类显色试剂承载在相同层时,在保存中发生由过氧化物酶引起的氧化还原类显色试剂的自显色,从而导致保存稳定性显著降低。由于与葡萄糖浓度等相比,待测试样中的糖化血红蛋白浓度一般为低浓度,因此在测量糖化血红蛋白时优选使用高灵敏度的无色色素,但无色色素特别不稳定,容易发生自显色。
因而本申请发明人将蛋白酶与糖化氨基酸氧化酶承载在不同层上,并且将蛋白酶承载在比糖化氨基酸氧化酶更靠近待测试样点样面的层上。由此发现,糖化氨基酸氧化酶的保存稳定性显著提高,并且蛋白酶的反应性也提高,测量精度也提高,从而完成了本发明。此外,通过将过氧化物酶与氧化还原类显色试剂分别承载在不同层上,使提高氧化还原类显色试剂的保存稳定性同时获得成功,从而完成了本发明。
即,本发明具有以下构成要素。
1、一种多层试验片,用于对糖化血红蛋白含量进行比色定量,其特征在于:该多层试验片至少层叠有下述(a)层和(b)层,所述(a)层和(b)层从待测试样点样面按(a)层、(b)层的顺序层叠,在(a)层和(b)层中的不同的层上分别承载过氧化物酶和氧化还原类显色试剂,而且所述多层试验片不具有血液分离层,其中,(a)层:至少承载有蛋白酶的高分子基材,(b)层:至少承载有糖化氨基酸氧化酶的高分子基材。
2、根据1所述的多层试验片,其特征在于:所述多层试验片在(a)层和(b)中的至少一层上还承载有表面活性剂。
3、一种多层试验片,用于对糖化血红蛋白含量进行比色定量,其特征在于:所述多层试验片至少层叠有下述(a)层、(b)层和(c)层,所述(a)层、(b)层和(c)层从待测试样点样面按(a)层、(b)层及(c)层、(a)层、(c)层及(b)层或(c)层、(a)层及(b)层的顺序层叠,在(a)层、(b)层和(c)层中的不同层上分别承载过氧化物酶和氧化还原类显色试剂,而且所述多层试验片不具有血液分离层,其中,(a)层:至少承载有蛋白酶的高分子基材,(b)层:至少承载有糖化氨基酸氧化酶的高分子基材,(c)层:至少承载有除蛋白酶和糖化氨基酸氧化酶外的任意试剂的高分子基材。
4、根据3所述的多层试验片,其特征在于:所述多层试验片在(a)层、(b)层和(c)层中的至少一层上还承载有表面活性剂。
5、根据1至4中任一项所述的多层试验片,其特征在于:蛋白酶是选自至少由来自杆状菌(Bacillus)的蛋白酶、来自曲霉菌(Aspergillus)的蛋白酶、来自链霉菌(Streptomyces)的蛋白酶以及来自念球菌(Tritirachium)的蛋白酶组成的组中的一种以上。
6、根据1至5中任一项所述的多层试验片,其特征在于:氧化还原类显色试剂是最大吸收波长为600nm~800nm的无色色素。
7、根据1至6中任一项所述的多层试验片,其特征在于:表面活性剂是亲水亲油平衡值(Hydrophile Lipophile Balance Value:HLB Value)为10~20的非离子性表面活性剂。
8、一种测量方法,其特征在于:所述测量方法使用权利要求1~7中任一项所述的多层试验片,至少经过以下工序(i)~(iii)对糖化血红蛋白含量进行比色定量,工序(i):在上述多层试验片上表面上点样待测试样的工序;工序(ii):从与上述多层试验片的待测试样点样面相反的面利用反射光测量反射率和/或吸光度的工序;以及工序(iii):从所得的反射率和/或吸光度计算出选自由血红蛋白含量、糖化血红蛋白含量、糖化血红蛋白含量与血红蛋白含量的比所组成的组中的一个以上的工序。
9、根据8所述的测量方法,其特征在于:待测试样为全血样本。
发明效果
根据本发明,能够提供一种用于对糖化血红蛋白含量进行比色定量的多层试验片,该多层试验片抑制了糖化氨基酸氧化酶的失活或分解,并且抑制了氧化还原类显色试剂的自显色,且保存稳定性优异。
附图说明
图1是本实施例中使用的用于上下夹持试验片将其固定的板状夹具。本夹具设置有两个贯穿孔。
具体实施方式
以下,对本发明进行详细阐述。
(测量对象物)
本发明的测量对象物是糖化血红蛋白,从糖尿病诊断应用的观点出发,优选血红蛋白的β链N末端被糖化的血红蛋白A1c(以下有时也称为HbA1c)。
(待测试样)
作为本发明的待测试样,可以列举出全血、血细胞、血浆、血清、髓液、汗、尿、泪液、唾液、皮肤、粘膜、毛发等生物体试样(即从生物体上采取的试样)或饮料水、调料等食品类。另外,生物体试样不仅限于来自人体,来自狗、猫、牛等哺乳类动物的生物体试样也是对象。其中,从糖尿病诊断应用的观点出发,优选全血或血细胞,从POCT的观点出发,更优选未进行血细胞/血浆或血清分离前处理的全血。
本发明中待测试样的量没有特别限定,例如优选为1μL~50μL,更优选为1μL~40μL,进一步优选为1μL~30μL。如果待测试样量少于1μL,则恐怕无法从多层试验片的最上层展开到最下层。另一方面,如果待测试样量多于50μL,则例如待测试样为血液时,由于患者的负担变大,因此不优选。
(测量原理)
本发明中糖化血红蛋白的测量原理是通过所谓的酶比色法进行测量,在该方法中,借助待测试样中的水分进行酶促反应(所谓的干化学法),从而使多层试验片显色,然后通过测量反射光来测量其显色程度。通过使用上述测量原理,装置的小型、轻量、低价格化成为可能。另外,正确、简便且迅速的测量成为可能。
以下,对测量红细胞中的糖化血红蛋白含量时的反应进行说明,但这并不构成对本发明的任何限制。
(1)使待测试样中的红细胞与表面活性剂反应、使之溶血以提取出糖化血红蛋白的工序。
(2)使上述糖化血红蛋白与蛋白酶反应从而从糖化血红蛋白的糖化的β链N末端切出糖化氨基酸和/或糖化肽的工序。
(3)使上述糖化氨基酸和/或糖化肽与糖化氨基酸氧化酶反应从而生成过氧化氢的工序。
(4)在过氧化物酶的存在下使上述过氧化氢与氧化还原类显色试剂发生反应而显色的工序。
(5)根据上述显色对待测试样中的糖化血红蛋白含量进行比色定量的工序
(多层试验片)
本发明的多层试验片由多个高分子基材(以下有时也称为层)构成。上述多层试验片的层数可以根据实施方式而变化,优选为2~7层,更优选为2~6层,进一步优选为2~5层。另外,除了本发明所需要的承载有试剂(表面活性剂、蛋白酶、糖化氨基酸氧化酶、过氧化物酶、氧化还原类显色试剂等)的高分子基材外,层数中还包括用于展开血液的展开层或透明支撑层等。层数为一层时,蛋白酶和糖化氨基酸氧化酶以及过氧化物酶和氧化还原类显色试剂等不得不承载在同一层,恐怕会产生由蛋白酶引起的糖化氨基酸氧化酶的失活、分解或氧化还原类显色试剂的自显色。即,多层试验片的保存稳定性恐怕会显著降低。另一方面,层数多于7层时,由于从最上层到最下层展开所需的待测试样量变多,因此不优选。
上述多层试验片可以采用任意的工序制作而成。代表性地,可以采用将多个层分别浸渍在一种以上的试剂溶液中后再干燥的惯用工序来制作多个层,然后组装成最终的试验片。
上述多层试验片的特征为不含有血液分离层。另外,血液分离层是指用于通过从全血过滤血细胞而得到血浆或血清的层。本发明的测量对象物不是血浆或血清中所含的糖化白蛋白,而是血细胞中所含的糖化血红蛋白,因此,将血细胞过滤之后则无法测量。
(层结构)
上述多层试验片的层结构需要将蛋白酶承载在比糖化氨基酸氧化酶更靠近待测试样点样面的层(以下,有时也称为上层)上。当将蛋白酶承载在比糖化氨基酸氧化酶更远离待测试样点样面的层(以下,有时也称为下层)上时,恐怕会导致蛋白酶不能充分反应,从而降低灵敏度。
另外,上述多层试验片的层结构需要将蛋白酶与糖化氨基酸氧化酶分别承载在不同的层上,进一步优选将过氧化物酶和氧化还原类显色试剂分别承载在不同层上。当将蛋白酶与糖化氨基酸氧化酶承载在相同层时,恐怕会发生由蛋白酶引起的糖化氨基酸氧化酶的失活、分解,当将过氧化物酶与氧化还原类显色试剂承载在相同层时,恐怕会发生氧化还原类显色试剂的自显色。即,多层试验片的保存稳定性恐怕会显著降低。以下示出层结构的具体例子,但这并不构成对本发明的任何限制。
当设上述多层试验片的第一层侧为待测试样点样面、第二层侧为反射光测量面时,可以列举出蛋白酶承载在比糖化氨基酸氧化酶更上层的以下结构。
1、第一层:蛋白酶、过氧化物酶;以及第二层:糖化氨基酸氧化酶、氧化还原类显色试剂。
2、第一层:蛋白酶、氧化还原类显色试剂;以及第二层:糖化氨基酸氧化酶、过氧化物酶。
3、第一层:蛋白酶;以及第二层:糖化氨基酸氧化酶、过氧化物酶、氧化还原类显色试剂。
4、第一层:蛋白酶、过氧化物酶、氧化还原类显色试剂;以及第二层:糖化氨基酸氧化酶。
其中,更优选将过氧化物酶与氧化还原类显色试剂分别承载在不同层的以下结构。
1、第一层:蛋白酶、过氧化物酶;以及第二层:糖化氨基酸氧化酶、氧化还原类显色试剂。
2、第一层:蛋白酶、氧化还原类显色试剂;以及第二层:糖化氨基酸氧化酶、过氧化物酶。
进一步优选将氧化还原类显色试剂承载在反射光测量面(第二层)上的、可以期待进行高灵敏度的测量的以下结构。
1、第一层:蛋白酶、过氧化物酶;以及第二层:糖化氨基酸氧化酶、氧化还原类显色试剂。
当设上述多层试验片的第一层侧为待测试样点样面、第三层侧为反射光测量面时,可以列举出蛋白酶承载在比糖化氨基酸氧化酶更上层的以下结构。
1、第一层:蛋白酶;第二层:糖化氨基酸氧化酶;以及第三层:过氧化物酶、氧化还原类显色试剂。
2、第一层:蛋白酶;第二层:过氧化物酶;以及第三层:糖化氨基酸氧化酶、氧化还原类显色试剂。
3、第一层:蛋白酶;第二层:氧化还原类显色试剂;以及第三层:糖化氨基酸氧化酶、过氧化物酶。
4、第一层:过氧化物酶;第二层:蛋白酶;以及第三层:糖化氨基酸氧化酶、氧化还原类显色试剂。
5、第一层:氧化还原类显色试剂;第二层:蛋白酶;以及第三层:糖化氨基酸氧化酶、过氧化物酶。
6、第一层:蛋白酶;第二层:糖化氨基酸氧化酶、过氧化物酶;以及第三层:氧化还原类显色试剂。
7、第一层:蛋白酶;第二层:糖化氨基酸氧化酶、氧化还原类显色试剂;以及第三层:过氧化物酶。
8、第一层:蛋白酶;第二层:过氧化物酶、氧化还原类显色试剂;以及第三层:糖化氨基酸氧化酶。
9、第一层:过氧化物酶;第二层:蛋白酶、氧化还原类显色试剂;以及第三层:糖化氨基酸氧化酶。
10、第一层:氧化还原类显色试剂;第二层:蛋白酶、过氧化物酶;以及第三层:糖化氨基酸氧化酶。
11、第一层:蛋白酶、过氧化物酶;第二层:糖化氨基酸氧化酶;以及第三层:氧化还原类显色试剂。
12、第一层:蛋白酶、氧化还原类显色试剂;第二层:糖化氨基酸氧化酶;以及第三层:过氧化物酶。
13、第一层:过氧化物酶、氧化还原类显色试剂;第二层:蛋白酶;以及第三层:糖化氨基酸氧化酶。
14、第一层:蛋白酶、过氧化物酶;第二层:氧化还原类显色试剂;以及第三层:糖化氨基酸氧化酶。
15、第一层:蛋白酶、氧化还原类显色试剂;第二层:过氧化物酶;以及第三层:糖化氨基酸氧化酶。
其中,更优选将过氧化物酶与氧化还原类显色试剂分别承载在不同层上的以下结构。
2、第一层:蛋白酶;第二层:过氧化物酶;以及第三层:糖化氨基酸氧化酶、氧化还原类显色试剂。
3、第一层:蛋白酶;第二层:氧化还原类显色试剂;以及第三层:糖化氨基酸氧化酶、过氧化物酶。
4、第一层:过氧化物酶;第二层:蛋白酶;以及第三层:糖化氨基酸氧化酶、氧化还原类显色试剂。
5、第一层:氧化还原类显色试剂;第二层:蛋白酶;以及第三层:糖化氨基酸氧化酶、过氧化物酶。
6、第一层:蛋白酶;第二层:糖化氨基酸氧化酶、过氧化物酶;以及第三层:氧化还原类显色试剂。
7、第一层:蛋白酶;第二层:糖化氨基酸氧化酶、氧化还原类显色试剂;以及第三层:过氧化物酶。
9、第一层:过氧化物酶;第二层:蛋白酶、氧化还原类显色试剂;以及第三层:糖化氨基酸氧化酶。
10、第一层:氧化还原类显色试剂;第二层:蛋白酶、过氧化物酶;以及第三层:糖化氨基酸氧化酶。
11、第一层:蛋白酶、过氧化物酶;第二层:糖化氨基酸氧化酶;以及第三层:氧化还原类显色试剂。
12、第一层:蛋白酶、氧化还原类显色试剂;第二层:糖化氨基酸氧化酶;以及第三层:过氧化物酶。
14、第一层:蛋白酶、过氧化物酶;第二层:氧化还原类显色试剂;以及第三层:糖化氨基酸氧化酶。
15、第一层:蛋白酶、氧化还原类显色试剂;第二层:过氧化物酶;以及第三层:糖化氨基酸氧化酶。
进一步优选将氧化还原类显色试剂承载在反射光测量面(第三层)上的、可以期待进行高灵敏度的测量的以下结构。
2、第一层:蛋白酶;第二层:过氧化物酶;以及第三层:糖化氨基酸氧化酶、氧化还原类显色试剂。
4、第一层:过氧化物酶;第二层:蛋白酶;以及第三层:糖化氨基酸氧化酶、氧化还原类显色试剂。
6、第一层:蛋白酶;第二层:糖化氨基酸氧化酶、过氧化物酶;以及第三层:氧化还原类显色试剂。
11、第一层:蛋白酶、过氧化物酶;第二层:糖化氨基酸氧化酶;以及第三层:氧化还原类显色试剂。
优选上述各层(第一层、第二层、第三层)中的至少一层进一步承载有表面活性剂。另外,只要蛋白酶和糖化氨基酸氧化酶以及过氧化物酶和氧化还原类显色试剂不存在于同一层,则上述试剂(表面活性剂、蛋白酶、糖化氨基酸氧化酶、过氧化物酶、氧化还原类显色试剂等)可以重复承载于各层(第一层、第二层、第三层)。此外,根据需要各层可以承载有缓冲剂。
(高分子基材)
作为构成本发明的多层试验片的高分子基材,只要能够承载所需量的上述试剂(表面活性剂、蛋白酶、糖化氨基酸氧化酶、过氧化物酶、氧化还原类显色试剂等),并且待测试样能够在水平方向以及竖直方向适当地展开,则可以使用任何形态、组成的材料。以下示出高分子基材的形态、组成的具体例子,但这并不构成对本发明的任何限制。
(形态)
作为上述高分子基材的形态,可以列举出滤纸、纤维结构体、多孔质膜(膜过滤器)、薄膜等可以自支撑的材料或高分子凝胶等不能自支撑的材料。另外,使用高分子凝胶等不能自支撑的材料时,优选设置滤纸、纤维结构体、多孔质膜(膜过滤器)、薄膜等可以自支撑的材料作为支撑体。
(组成)
作为上述高分子基材的组成,可以列举出:作为聚酯树脂的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)和聚萘二甲酸丁二醇酯(PBN)等;作为烯烃树脂的聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)和聚丁烯等;作为乙烯基树脂的聚氯乙烯(PVC)、聚偏氯乙烯和聚醋酸乙烯等;丙烯酸树脂;丙烯酸酯树脂;作为氟树脂的聚四氟乙烯(PTFE)和聚偏氯乙烯(PVDF)等;聚碳酸酯树脂;作为聚醚树脂的聚甲醛(POM)、聚苯醚(PPO)、聚醚酮(PEK)、聚醚醚酮(PEEK)、聚苯硫醚(PPS)、聚砜(PSU)、聚醚砜(PES)和聚醚酰亚胺(PEI)等;作为聚酰胺树脂的尼龙和芳酰胺等;以及作为纤维素类的醋酸纤维素、硝化纤维素和再生纤维素等。
上述高分子基材的形状没有特别限定,例如可以列举出正方形、长方形、圆形、椭圆形等薄板状。
从装置的小型、轻量、低价格化的观点出发,上述高分子基材的面积越小越好,但是例如优选为1mm2~1000mm2,更优选为2mm2~500mm2,进一步优选为5mm2~200mm2。
从待测试样的展开性以及酶(蛋白酶、糖化氨基酸氧化酶、过氧化物酶)反应性的观点出发,上述高分子基材的(一层的)厚度例如优选为10μm~2000μm,更优选为20μm~1000μm,进一步优选为50μm~500μm。
(检测)
对反应进行检测时,最简便的是向已经显色的多层试验片照射光(入射光),然后检测其反射光,但是也可以使用除此以外的方法。作为光源没有特别限定,例如可以列举出UV灯、氙灯、氪灯、水银灯、氘灯、钨丝灯、卤素灯、发光二极管(LED)、激光等。其中,从光波长控制的容易性以及装置的小型、轻量、低价格化的观点出发,优选发光二极管(LED)。上述入射光的角度(入射角)没有特别限定,可以采用任意的角度。另一方面,对反射光的检测没有特别限定,优选垂直于检测面。此外,若使用光电二极管或积分球则可以容易地进行检测。
(蛋白酶)
作为本发明所使用的蛋白酶,只要能够与糖化血红蛋白的糖化的β链N末端作用而切出糖化氨基酸和/或糖化肽,则可以使用任何种类的蛋白酶,例如可以列举出来自动物、植物、微生物的蛋白酶等。以下示出蛋白酶的具体例子,但这并不构成对本发明的任何限制。
(来自动物的蛋白酶)
作为来自动物的蛋白酶,可以列举出因子Xa(factor Xa)、血纤维蛋白溶酶(plasmin)、凝血酶(thrombin)、胃蛋白酶(pepsin)、亮氨酸氨肽酶(leucinaminopeptidase)、胰液素(pancreatin)、胰肽酶(elastase)、胰蛋白酶(trypsin)、糜蛋白酶A(chtmotrypsin A)、氨肽酶M(aminopeptidaseM)、羧肽酶A(carboxypeptidase A)、羧肽酶B(carboxypeptidase B)、钙蛋白酶(calpain)、组织蛋白酶B(cathepsin B)、组织蛋白酶C(cathepsinC)、组织蛋白酶D(cathepsin D)、内切蛋白酶Arg-C(endoprotinaseArg-C)等。
(来自植物的蛋白酶)
作为来自植物的蛋白酶,可以列举出羧肽酶W(carboxypeptidase W)、激肽释放剂(kallikrein)、无花果蛋白酶(ficin)、木瓜蛋白酶(papain)、糜木瓜酶(chimopapain)、菠萝蛋白酶(bromelain)等。
(来自微生物的蛋白酶)
作为来自微生物的蛋白酶,可以列举出:以枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)、分散酶(dispase)、蛋白酶N(proteinase N)等为代表的来自杆状菌(Bacillus)的蛋白酶;以IP酶等为代表的来自曲霉菌(Aspergillus)的蛋白酶;以链霉蛋白酶(pronase)等为代表的来自链霉菌(Streptomyces)的蛋白酶;以蛋白酶K(proteinaseK)等为代表的来自念球菌(Tritirachium)的蛋白酶;以肽酶R(peptidaseR)等为代表的来自根霉(Rhizopus)的蛋白酶;以羧肽酶P(carboxypeptidaseP)、PD酶等为代表的来自青霉菌(Penicillium)的蛋白酶;以内切蛋白酶Glu-C(endoprotinase Glu-C)等为代表的来自葡萄状球菌(Staphylococcus)的蛋白酶;以梭菌蛋白酶(clostripain)等为代表的来自梭菌(Clostridium)的蛋白酶;以内切蛋白酶Lys-C(endoprotinase Lys-C)等为代表的来自溶杆菌(Lysobacter)的蛋白酶;以金属蛋白酶(metalloendopeputidase)等为代表的来自猪苓(Grifola)的蛋白酶;以羧肽酶Y(carboxypeptidaseY)、蛋白酶A(proteinase A)等为代表的来自酵母(Yeast)的蛋白酶;以氨基肽酶T(aminopeptidase T)等为代表的来自栖热菌(Thermus)的蛋白酶;以内切蛋白酶Asp-N(endoprotinase Asp-N)等为代表的来自假单胞杆菌(Pseudomonus)的蛋白酶;以及以质谱级赖氨酸肽链内切酶(lysylendopeputidase)、消色肽键端解酶(achromopeputidase)等为代表的来自无色菌(Achromobacter)的蛋白酶等。
其中,从稳定性、反应性(血红蛋白的切断速度)、获得的容易性、价格等原因出发,优选来自微生物的蛋白酶,更优选为选自由来自杆状菌(Bacillus)的蛋白酶、来自曲霉菌(Aspergillus)的蛋白酶、来自链霉菌(Streptomyces)的蛋白酶以及来自念球菌(Tritirachium)的蛋白酶所组成的组中的一种以上。作为市售品,作为来自杆状菌(Bacillus)的蛋白酶的Toyoteam NEP(トヨチ一ムNEP,东洋纺织公司制)、Type-X(SIGMA公司制)、Type-XXIV(SIGMA公司制)、嗜热菌蛋白酶(大和化成公司制)、高温蛋白酶PC10(大和化成公司制)、作为来自曲霉菌(Aspergillus)的蛋白酶的Type-XIII(SIGMA公司制)、Type-XXIII(SIGMA公司制)、作为来自链霉菌(Streptomyces)的蛋白酶的Type-XIV以及作为来自念球菌(Tritirachium)的蛋白酶的蛋白酶K(Roche公司制)等适于使用。
其中,从测量血红蛋白A1c的观点出发,作为来自杆状菌(Bacillus)的蛋白酶的Toyoteam NEP(东洋纺织公司制)、Type-X(SIGMA公司制)、Type-XXIV(SIGMA公司制)、嗜热菌蛋白酶(大和化成公司制)、高温蛋白酶PC10(大和化成公司制)、作为来自链霉菌(Streptomyces)的蛋白酶的Type-XIV更适于使用。
只要达到目标活性,则上述蛋白酶可以是精制品,也可以是粗精制品。另外,也可以是通过基因操作而制成的物质,而不管有无化学修饰。并且,上述蛋白酶可以单独使用,也可以两种以上组合使用。
上述蛋白酶的浓度没有特别限定,优选为0.1U/cm2~10000U/cm2,更优选为1U/cm2~1000U/cm2。蛋白酶浓度低于0.1U/cm2时,由于反应性降低而延长测量时间,因此不优选。另一方面,蛋白酶浓度高于10000U/cm2时,有时会导致背景升高或导致高价格化。
进行上述蛋白酶反应时的pH可以不进行调整,但优选通过适当的pH调整剂、例如下列缓冲剂进行调整,以使所使用的蛋白酶达到最合适的pH。
(糖化氨基酸氧化酶)
本发明所使用的糖化氨基酸氧化酶(以下有时也称为果糖基氨基酸氧化酶FAOD)在公知文献中被称为以下各种名称:果糖基胺氧化酶、果糖基氨基酸氧化酶、果糖基缩氨酸氧化酶、果糖基胺氧化酶、果糖基氨基酸氧化酶、果糖基缩氨酸氧化酶、糖化胺氧化酶、糖化氨基酸氧化酶、糖化缩氨酸氧化酶、糖化胺氧化酶、糖化氨基酸氧化酶、糖化缩氨酸氧化酶、阿马多里酶(amadoriase)、酮胺氧化酶、酮胺氧化酶等。
作为本发明所使用的糖化氨基酸氧化酶,只要是与糖化氨基酸和/或糖化肽产生特异性作用而生成过氧化氢的酶,则可以使用任何种类的酶。以下示出糖化氨基酸氧化酶的具体例子,但这并不构成对本发明的任何限制。
作为糖化氨基酸氧化酶,可以列举出:来自赤霉菌(Gibberella)的酶、来自曲霉菌(Aspergillus)的酶、来自青霉菌(Penicillium)的酶、来自镰刀菌(Fusarium)的酶、来自棒状杆菌(Corynebacterium)的酶、来自子囊壳菌(Coniochaeta)的酶、来自正青霉菌(Eupenicillium)的酶、来自Achaetomiella的酶、来自毛壳菌(Chaetomium)的酶、来自大肠菌的酶、来自德巴利氏酶(Debaryomyces)的酶、来自弯孢菌(Curvularia)的酶、来自新赤壳菌(Neocosmospora)的酶、来自隐球菌(Cryptococcus)的酶、来自暗球腔菌(phaeosphaeria)的酶、来自念珠菌(Candida)的酶以及来自顶苞霉菌(Acremonium)的酶等。
其中,从稳定性、反应性(糖化氨基酸和/或糖化肽的氧化速度)、获得的容易性、价格等原因出发,优选为选自由来自子囊壳菌(Coniochaeta)的酶、来自正青霉菌(Eupenicillium)的酶、来自弯孢菌(Curvularia)的酶、来自新赤壳菌(Neocosmospora)的酶、来自曲霉菌(Aspergillus)的酶、来自隐球菌(Cryptococcus)的酶和来自暗球腔菌(phaeosphaeria)的酶所组成的组中的一种以上,更优选为选自由来自子囊壳菌(Coniochaeta)的酶、来自曲霉菌(Aspergillus)的酶、来自隐球菌(Cryptococcus)的酶和来自暗球腔菌(phaeosphaeria)的酶所组成的组中的一种以上。
其中,从测量血红蛋白A1c的观点出发,优选为选自由来自子囊壳菌(Coniochaeta)的酶和来自暗球腔菌(phaeosphaeria)的酶所组成的组中的一种以上。
只要达到目标活性,则上述糖化氨基酸氧化酶可以是精制品,也可以是粗精制品。另外,也可以是由基因操作所制成的物质,而不管有无化学修饰。并且,上述糖化氨基酸氧化酶可以单独使用,也可以两种以上组合使用。
上述糖化氨基酸氧化酶的浓度没有特别限定,优选为0.01U/cm2~1000U/cm2,更优选为0.1U/cm2~100U/cm2。糖化氨基酸氧化酶浓度低于0.01U/cm2时,由于反应性降低而延长测量时间,因此不优选。另一方面,糖化氨基酸氧化酶浓度高于1000U/cm2时,有时会导致背景升高或导致高价格化。
进行上述糖化氨基酸氧化酶反应时的pH可以不进行调整,但优选通过适当的pH调整剂、例如下列缓冲剂进行调整,以使所使用的糖化氨基酸氧化酶达到最合适的pH。
(过氧化物酶)
作为本发明所使用的过氧化物酶,只要是能够催化过氧化氢和氧化还原类显色试剂反应的酶,则可以使用任何种类的酶,可以列举出例如来自植物、来自细菌、来自担子菌的过氧化物酶。其中,从纯度、获得的容易性、价格等原因出发,优选为来自西洋芥末、稻子、大豆的过氧化物酶,更优选为来自西洋芥末的过氧化物酶。作为市售产品,PEO-131(东洋纺织公司制)、PEO-301(东洋纺织公司制)、PEO-302(东洋纺织公司制)等适于使用。
上述过氧化物酶的浓度没有特别限定,优选为0.01U/cm2~1000U/cm2,更优选为0.1U/cm2~100U/cm2。过氧化物酶浓度低于0.01U/cm2时,由于反应性降低而延长测量时间,因此不优选。另一方面,过氧化物酶浓度高于1000U/cm2时,有时会导致背景升高或导致高价格化。
进行上述过氧化物酶反应时的pH可以不进行调整,但优选通过适当的pH调整剂、例如下列缓冲剂进行调整,以使所使用的过氧化物酶达到最合适的pH。
(氧化还原类显色试剂)
作为本发明所使用的氧化还原类显色试剂,只要能够与过氧化氢反应而呈色,则可以使用任何种类的色素,可以列举出例如氢供体和偶联剂、隐色体等。另外,使用氢供体和偶联剂的代表例子是在过氧化物酶存在下通过过氧化氢使氢供体和偶联剂进行氧化缩合而形成色素的Trinder法。
以下示出氧化还原类显色试剂的具体例子,但这并不构成对本发明的任何限制。
(氢供体)
作为氢供体,可以列举出酚、酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺衍生物等。具体而言,可以列举出:N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺(ALPS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺(ADPS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)苯胺(ALOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-乙酰乙二胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰乙二胺、N-(2-羟基-3-磺丙基)-2,5-二甲基苯胺、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N-磺丙基苯胺、N-磺丙基-3,5-二甲氧基苯胺等。
(偶联剂)
作为偶联剂,可以列举出4-氨基安替吡啉(4AA)、氨基安替吡啉衍生物、香兰素二胺磺酸(vanillin diamine sulfonic acid)、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物(MBTH:methybenzthiazoline hydrazone)、磺化3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物(SMBTH:sulphonatedmethybenzthiazoline hydrazone)等。
(隐色体)
作为隐色体,可以列举出三苯基甲烷衍生物、吩噻嗪衍生物、二苯胺衍生物等。具体而言,可以列举出:4,4’-亚苄双(N,N-二甲基苯胺)、4,4’-双(N-乙基-N-(3-磺丙基氨基)-2,6-二甲基苯胺)甲烷、1-(乙基氨基硫代羰基)-2-(3,5-二甲氧基-4-羟基苯基)-4,5-双(4-二乙氨基苯基)咪唑、4,4’-双(二甲氨基)二苯胺、N-(羧甲基氨基羰基)-4,4’-双(二甲氨基)二苯胺钠盐(DA64)、10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪钠盐(DA67)等。
其中,从摩尔吸光系数、最大吸收波长等原因出发,优选为隐色体,更优选为N-(羧甲基氨基羰基)-4,4’-双(二甲氨基)二苯胺钠盐(DA64)、10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪钠盐(DA67)。
上述氧化还原类显色试剂的最大吸收波长优选为600nm~800nm,更优选为650nm~750nm。从测量血红蛋白A1c的观点出发,最大吸收波长在小于600nm的低波长一侧时,由于氧化还原类显色试剂的显色光谱与血红蛋白的光谱重合,恐怕会降低灵敏度。另一方面,最大吸收波长在大于800nm的高波长一侧时,检测设备恐怕会大型化。
上述氧化还原类显色试剂的浓度没有特别限定,优选为0.0001mg/cm2~10mg/cm2,更优选为0.001mg/cm2~1mg/cm2。氧化还原类显色试剂浓度低于0.0001mg/cm2时,恐怕会降低灵敏度。另一方面,氧化还原类显色试剂浓度高于10mg/cm2时,有时会导致背景升高或导致高价格化。
(表面活性剂)
作为本发明所使用的表面活性剂,只要起溶血剂和/或蛋白酶反应促进剂的作用,则可以使用任何种类的表面活性剂,优选起溶血剂和蛋白酶反应促进剂的作用的表面活性剂。
作为上述表面活性剂,可以列举出:聚氧乙烯烷基苯基醚(Triton(注册商标)系表面活性剂等)、聚氧乙烯烷基醚(Brij(注册商标)系表面活性剂等)、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(Tween(注册商标)系表面活性剂等)、聚氧乙烯脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、烷基葡糖苷、脂肪酸蔗糖酯等非离子性表面活性剂。其中,从作为溶血剂的反应性(溶血速度)、作为蛋白酶反应促进剂的作用性、价格等原因出发,优选聚氧乙烯烷基苯基醚(Triton(注册商标)系表面活性剂等)。作为市售商品,TritonX(注册商标)-100(Nacalai Tesque公司制)、TritonX(注册商标)-114(NacalaiTesque公司制)、Nonidet(注册商标)P-40(Nacalai Tesque公司制)等适于使用。另外,上述表面活性剂可以单独使用,也可以两种以上组合使用。
上述表面活性剂的亲水亲油平衡值(Hydrophile Lipophile BalanceValue:HLB Value)优选为10~20,更优选为12~20,进一步优选为14~20。HLB值小于10时,恐怕得不到足够的溶血效果以及促进蛋白酶反应的效果。另一方面,HLB值大于20的表面活性剂在HLB的定义上不存在。
上述表面活性剂的浓度没有特别限定,优选为0.0001mg/cm2~10mg/cm2,更优选为0.001mg/cm2~1mg/cm2。表面活性剂浓度低于0.0001mg/cm2时,恐怕得不到足够的溶血效果以及蛋白酶反应促进效果。另一方面,表面活性剂浓度高于10mg/cm2时,并未发现效果提高。
(缓冲剂)
作为可用于本发明的缓冲剂,只要在pH的目标范围内具有充分的缓冲能力,则可以使用任何种类的缓冲剂,例如可以列举出:Tris、磷酸、邻苯二甲酸、柠檬酸、马来酸、琥珀酸、硝酸、硼酸、酒石酸、醋酸、碳酸以及Good’s buffer(MES、ADA、PIPES、ACES、盐酸胆胺(cholamine)、BES、TES、HEPES、乙酰甘氨酸、麦黄酮、甘氨酰胺、蚕豆嘧啶葡糖苷)等。
其中,从在本发明所使用的蛋白酶、糖化氨基酸氧化酶以及过氧化物酶的最合适pH范围6.0~8.5(优选为6.0~7.5)内具有充分的缓冲能力等理由出发,优选为Tris、磷酸、MES、、PIPES、TES、HEPES,更优选为MES、PIPES。
上述缓冲剂的浓度没有特别限定,相对于多层试验片制作时的试剂优选为50mM~100mM左右。
(其他试剂)
本发明中除了上述试剂(表面活性剂、蛋白酶、糖化氨基酸氧化酶、过氧化物酶、氧化还原类显色试剂等)外,还可以根据需要添加血红蛋白的氧化剂(亚铁氰化物、迭氮化物、亚硝酸盐、硝酸盐等)、捕捉妨碍酶反应的离子的螯合试剂(乙二胺、联二吡啶、乙二胺四醋酸、菲绕啉、卟啉、冠醚等)、用于去除作为妨碍过氧化氢的定量的物质的抗坏血酸的抗坏血酸氧化酶、盐类(氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、氯化铝等)、酶稳定化剂(单糖类、低聚糖类、多糖类、糖醇、甘油、葡糖酸盐、氨基酸类、白蛋白类、球蛋白类、纤维性蛋白质等)、氧化还原类显色试剂稳定化剂(环糊精(cyclodextrin)类、还原性硫醇类、还原性硫酸盐类等)。这些可以单独使用,也可以两种以上组合使用。
实施例
以下通过实施例对本发明进行具体说明,但这并不构成对本发明的任何限制。另外,说明书中的评价方法如下所述。
[各种评价方法]
<1、蛋白酶的活性测量>
蛋白酶的活性通过使用了Folin-Ciocalteu试剂的酪蛋白Folin法计算得出。在此,在蛋白酶的最适pH下,在37℃对酪蛋白加水分解1分钟,将产生相当于1.0μmol的酪氨酸的呈色的酶量定义为IU。
<2、糖化氨基酸氧化酶的活性测量>
糖化氨基酸氧化酶的活性通过在过氧化物酶的存在下,使由糖化缬氨酰组氨酸(valyl histidine)和糖化氨基酸氧化酶反应而产生的过氧化氢与氧化还原类显色试剂产生反应,从其吸光度的变化而计算得出。在此,在糖化氨基酸氧化酶的最合适pH(pH=6.5)下,在37℃对糖化缬氨酰组氨酸加水分解1分钟,将产生相当于1.0μmol的过氧化氢的酶量定义为IU。
<3、过氧化物酶的活性测量>
过氧化物酶的活性通过在过氧化物酶存在下,使过氧化氢和焦棓酚(Pyrogallol)反应,从来自生成的红紫棓精(Purpurogallin)的吸光度的变化而计算得出。在此,在过氧化物酶的最合适pH(pH=6.0)下,在20℃反应20秒,将产生相当于1.0mg的红紫棓精(Purpurogallin)的呈色的酶量定义为IU。
<4、亲水亲油平衡值((Hydrophile Lipophile Balance Value:HLBValue))的测量>
HLB值是通过采用Griffin法,由HLB值=20×(亲水部分的式量的总和/分子量)而计算得出。另外,表面活性剂的混合物的HLB值以各成分的HLB值的加权平均表示。
<5、糖化氨基酸氧化酶的保存稳定性>
在8mmφ的桐山滤纸NO.5A(东京硝子器械公司制)上,滴10μL下述试剂1,在25℃的遮光干燥器3909-04(东京硝子器械公司制)中干燥2小时,制作成空白试验片。
<试剂1>
100mM PIPES(同仁化学研究所公司制)pH 6.5
500U/mL糖化氨基酸氧化酶FPO-301(东洋纺织公司制)
接着,作为加速试验,将空白试验片在37℃的可编程低温恒温器IN604(Yamato科学公司制)中培育5小时。然后,将上述空白试验片和1000μL下述试剂2添加至离心管(microtube)内,通过用涡流搅拌器(vortexmixer)(MS仪器公司制)搅拌1分钟,从而提取出空白试验片中的糖化氨基酸氧化酶。接着,将上述提取液在离心超滤管(MICROCON)3(Millipore公司制)中以14000G进行离心浓缩,从而获得200μL浓缩液。接着,将上述浓缩液50μL与Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad Laboratiories公司制)47.5μL、2-巯基乙醇(Bio-Rad Laboratiories公司制)2.5μL混合,在95℃下沸腾5分钟,从而制得空白溶液。
<试剂2>
100mM PIPES(同仁化学研究所公司制)pH 6.5
100倍稀释的一般用的蛋白酶抑制剂混合物,100倍浓缩(NacalaiTesque公司制)
接着,作为加速试验,将本发明的多层试验片在37℃的可编程低温恒温器IN 604(Yamato科学公司制)中培育5小时。然后,将上述多层试验片和1000μL上述试剂2添加至离心管(microtube)内,通过用漩涡混合器(vortex mixer)(MS仪器公司制)搅拌1分钟,从而提取出多层试验片中的表面活性剂、蛋白酶、糖化氨基酸氧化酶、过氧化物酶、氧化还原类显色试剂。其次,将上述提取液在离心超滤管(MICROCON)3(Millipore公司制)中以14000G离心浓缩,除去分子量3000以下的低分子量成分(表面活性剂、氧化还原类显色试剂等),从而制得200μL浓缩液。接着,将上述浓缩液50μL与Laemmli样品缓冲液(Bio-RadLaboratiories公司制)47.5μL、2-巯基乙醇(Bio-Rad Laboratiories公司制)2.5μL混合,在95℃下沸腾5分钟,从而制得样品溶液。
使用电泳最佳组合套件(best package)(预制胶用(Bio-RadLaboratiories公司制)),在下列条件1下,对所制得的空白溶液以及样品溶液实施SDS-PAGE。另外,空白溶液以及样品溶液流过相同凝胶的不同孔道。
<条件1>
预制凝胶:预制胶J 10%T、12well
电泳系统:小型垂直电泳槽(mini protean Tetra cell)
电源:基础电泳仪电源(power pac Basic)
标准:高精度双标(precision Plus dual standard)
电泳缓冲液:预混合缓冲液 Tris/甘氨酸/SDS
标准量:10μL
电泳上样量:20μL
电泳条件:100V固定电压、90分钟
温度:25℃
接着,在密闭箱(tight box)NO.3(AS ONE公司制)中添加电泳后的凝胶和200mL蒸馏水,用摇摆式混合机(rocking mixer)RM-80(AS ONE公司制)振荡5分钟后除去蒸馏水,进行三次这样的清洁操作。接着,添加50mL Bio-Safe CBB G-250染色剂(Bio-Rad Laboratiories公司制)的染色液,用上述摇摆式混合机振荡1小时后除去上述染色液。最后,添加200mL蒸馏水,用上述摇摆式混合机振荡1小时后除去蒸馏水,可以得到电泳图谱。
使用GS-800 Calibrated Densitometer(Bio-Rad Laboratiories公司制)根据通常的方法对所得到的电泳图谱中50kDa附近的来自糖化氨基酸氧化酶的谱带粗细(泳动方向的谱带的尺寸)以及浓度(谱带的吸光度)进行测量。分别从所得的空白以及样品的谱带粗细计算出下式(1)中的谱带保持率1,从所得的空白以及样品的谱带浓度计算出下式(2)中的谱带保持率2,将谱带保持率1以及谱带保持率2≥90%设定为◎(优),将谱带保持率1以及谱带保持率2<90%设定为×(不良),对糖化氨基酸氧化酶的保存稳定性(即,耐分解性)进行评价。
[数学式1]
谱带保持率1(%)=(样品谱带粗细/空白谱带粗细)×100 式(1)
[数学式2]
谱带保持率2(%)=(样品谱带浓度/空白谱带浓度)×100 式(2)
<6、氧化还原类显色试剂的保存稳定性>
将本发明的多层试验片放入铝制封口袋(Alumi lamizip)AL-9(东京硝子器械公司制)中,封入氮气后,在可编程低温恒温器IN 604(Yamato科学公司制)中,在4℃下培育0、24、48、72、96、120、144、168、336、504小时,或在25℃下培育0、24、48、72、96、120、144、168、336、504小时。接着,用夹具(参照图1)将上述多层试验片从上下夹住固定,在下列条件2下,对承载有氧化还原类显色试剂的层的一侧的反射率进行测量。
<条件2>
装置名称:分光光度计UV-2450(岛津制作所公司制)
附属装置名称:积分球ISR-2200(岛津制作所公司制)
标准白板:硫酸钡标准白板
测量波长:666nm(DA67的λmax)
入射角:0°
狭缝(slit)宽度:2.0nm
光束尺寸:3mm×5mm
温度:25℃
由所得的反射率通过下式(3)的Kubelka-Munk转换计算出K/S值,对于3周(504小时)之后的K/S值,将K/S值(4℃)≤0.25且K/S值(25℃)≤0.50设定为◎(优),将0.25<K/S值(4℃)≤0.35且0.50<K/S值(25℃)≤0.60设定为○(良),将0.35<K/S值(4℃)≤0.40且0.60<K/S值(25℃)≤1.30设定为△(尚可),将0.40<K/S值(4℃)且1.30<K/S值(25℃)设定为×(不良),对氧化还原类显色试剂的保存稳定性(即,耐自显色性)进行评价。如果氧化还原类显色试剂自显色则K/S值上升是公知的。此外,式(3)中的%R是反射率的意思。
[数学式3]
K/S值=(1-%R)2/(2×%R) 式(3)
<7、蛋白酶的反应性>
在本发明的多层试验片上,将100g/L的人类血红蛋白H7379(SIGMA公司制)水溶液20μL点样在第一层,在可编程低温恒温器IN 604(Yamato科学公司制)中,在37℃下培育0、5、10、15、30、60分钟。接着,将上述多层试验片和1000μL上述试剂2添加至离心管(microtube)内,通过用漩涡混合器(vortex mixer)(MS仪器公司制)搅拌1分钟,从而提取出多层试验片中的表面活性剂、蛋白酶、糖化氨基酸氧化酶、过氧化物酶、氧化还原类显色试剂。接着,将上述提取液在离心超滤管(MICROCON)3(Millipore公司制)中以14000G离心浓缩,除去分子量3000以下的低分子量成分(表面活性剂、氧化还原类显色试剂),从而制得200μL浓缩液。接着,将上述浓缩液2.5μL与蒸馏水47.5μL、Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad Laboratiories公司制)47.5μL、2-巯基乙醇(Bio-RadLaboratiories公司制)2.5μL混合,在95℃下沸腾5分钟,从而制得样品溶液1~6。
使用电泳最佳组合套件(best package)(预制胶用(Bio-RadLaboratiories公司制)),在上述条件1下,对所制得的样品溶液1~6实施SDS-PAGE。另外,样品溶液1~6流过相同凝胶的不同孔道。
接着,在密闭箱(tight box)NO.3(AS ONE公司制)中添加电泳后的凝胶和200mL蒸馏水,用摇摆式混合机(rocking mixer)RM-80(AS ONE公司制)振荡5分钟后除去蒸馏水,进行三次这样的清洁操作。接着,添加50mL Bio-Safe CBB G-250染色剂(Bio-Rad Laboratiories公司制)的染色液,用上述摇摆式混合机振荡1小时后除去上述染色液。最后,添加200mL蒸馏水,用上述摇摆式混合机振荡1小时后除去蒸馏水,可以得到电泳图谱。
使用GS-800 Calibrated Densitometer(Bio-Rad Laboratiories公司制)根据通常的方法对所得到的电泳图谱中16kDa附近的来自血红蛋白亚基的谱带粗细(泳动方向的谱带的尺寸)以及浓度(谱带的吸光度)进行测量。分别从所得的37℃下培育0分钟至60分钟之后的谱带粗细计算出下式(4)中的谱带消失率1,从所得的37℃下培育0分钟至60分钟之后的谱带浓度计算出下式(5)中的谱带消失率2,对于谱带消失率1以及谱带保持率达到90%以上的时间(以下,也称为谱带消失时间),将0分钟<谱带消失时间≤5分钟设定为◎(优),将5分钟<谱带消失时间≤15分钟设定为○(良),将15分钟<谱带消失时间≤30分钟设定为△(尚可),将30分钟<谱带消失时间设定为×(不良),对蛋白酶的反应性进行评价。
[数学式4]
谱带消失率1(%)={1-(谱带粗细(0分钟至60分钟)/谱带粗细(0分钟))}×100 式(4)
[数学式5]
谱带消失率2(%)={1-(谱带浓度(0分钟至60分钟)/谱带浓度(0分钟))}×100 式(5)
<8、氧化还原类显色试剂的灵敏度、相关性>
使合成的果糖基缬氨酰组氨酸(fructosyl-valyl-histidine)(以下,有时也称为F-VH)溶解在100g/L的人类血红蛋白H7379(SIGMA公司制)水溶液中,使其形成0μm、50μm、100μm、200μm、500μM,调制成5个水平的测量试样。接着,用夹具(参照图1)将本发明的多层试验片从上下夹住固定,将20μL上述测量样本点样在第一层,在室温下培育1分钟之后,在下列条件3下,对与测量试样点样面相反的面的反射率进行测量。
<条件3>
测量试样:人类血红蛋白H7379 100g/L
F-VH 0μM、50μM、100μM、200μM、500μM
装置名称:分光光度计UV-2450(岛津制作所公司制)
附属装置名称:积分球ISR-2200(岛津制作所公司制)
标准白板:硫酸钡标准白板
测量波长:666nm(DA67)、727nm(DA64)、555nm(TOOS)、630nm(MAOS)
入射角:0°
狭缝(slit)宽度:2.0nm
光束尺寸:3mm×5mm
温度:25℃
由所得的F-VH在0μM~500μM的反射率通过上式(3)的Kubelka-Munk转换而得到F-VH在0μM~500μM的K/S值。由所得到的F-VH在0μM的K/S值和F-VH在500μM的K/S值计算出下式(6)的K/S波动率,将K/S变动率≥2.0设定为◎(优),将K/S变动率<2.0设定为×(不良),对氧化还原类显色试剂的灵敏度进行评价。此外,式(6)中的K/S值(0μM)、K/S值(500μM)分别是F-VH在0μM的K/S值、F-VH在500μM的K/S值的意思。
[数学式6]
K/S变动率=K/S值(500μM)/K/S值(0μM) 式(6)
另外,计算出所得到的K/S值和F-VH浓度的Pearson相关系数r,将r>0.95设定为◎(优),将0.95≤r<0.90设定为○(良),将0.90≤r<0.85设定为△(尚可),将r≤0.85设定为×(不良),对相关性进行评价。
<9、血红蛋白A1c值校准曲线的制作>
用夹具(参照图1)将本发明的多层试验片从上下夹住固定,将HbA1c测量性能评价用试样QRM HbA1c 2007-1(一般社团法人检查医学标准物质机构公司制)20μL点样在第一层,在37℃的可编程低温恒温器IN 604(Yamato科学公司制)中培育15分钟之后,在下列条件4下,对与测量试样点样面相反的面的反射率进行测量。
<条件4>
测量试样:HbA1c测量性能评价用试样QRM
LEVEL 1、2、3、4、5
装置名称:分光光度计UV-2450(岛津制作所公司制)
附属装置名称:积分球ISR-2200(岛津制作所公司制)
标准白板:硫酸钡标准白板
测量波长:480nm、666nm
入射角:0°
狭缝(slit)宽度:2.0nm
光束尺寸:3mm×5mm
温度:25℃
由所得的在480nm处的反射率以及在666nm处的反射率通过上式(3)的Kubelka-Munk转换而得到在480nm处的K/S值以及在666nm处的K/S值。接着,由所得到的在480nm处的K/S值以及在666nm处的K/S值计算出下式(7)的K/S比。K/S比与血红蛋白A1c值成比例(参照非专利文献1)是公知的。另外,式中的K/S值(480nm)、K/S值(666nm)分别是在480nm处的K/S值、在666nm处的K/S值的意思。
K/S比=K/S值(666nm)/K/S值(480nm) 式(7)
计算出所得到的K/S比与HbA1c测量性能评价用试样QRM中所规定的HbA1c值(LEVEL 1=4.67%、LEVEL 2=5.29%、LEVEL 3=6.96%、LEVEL 4=9.08%、LEVEL 5=10.79%)的Pearson相关系数r,将r>0.95设定为◎(优),将0.95≤r<0.90设定为○(良),将0.90≤r<0.85设定为△(尚可),将r≤0.85设定为×(不良),对相关性进行评价。
<10、血红蛋白A1c值的测量>
用夹具(参照图1)将本发明的多层试验片从上下夹住固定,将20μL健康人的全血或糖尿病患者的全血点样在第一层,在37℃的可编程低温恒温器IN 604(Yamato科学公司制)中培育15分钟之后,在下列条件5下,对与测量试样点样面相反的面的反射率进行测量。另外,对健康人的血液以及糖尿病患者的血液,使用作为市售的自动分析仪的日立自动分析仪7180(日立高科公司制)以及作为市售的血红蛋白A1c测量试剂的NordiaN HbA1c(积水医疗科技公司制)按照通常的方法进行了测量,计算出血红蛋白A1c值。
<条件5>
测量试样:健康人的血液5个水平;糖尿病患者的血液5个水平
装置名称:分光光度计UV-2450(岛津制作所公司制)
附属装置名称:积分球ISR-2200(岛津制作所公司制)
标准白板:硫酸钡标准白板
测量波长:480nm、666nm
入射角:0°
狭缝(slit)宽度:2.0nm
光束尺寸:3mm×5mm
温度:25℃
由所得的在480nm处的反射率以及在666nm处的反射率通过上式(3)的Kubelka-Munk转换而得到在480nm处的K/S值以及在666nm处的K/S值。接着,由所得到的在480nm处的K/S值以及在666nm处的K/S值计算出上式(7)的K/S比。由所得到的K/S和上一项所得到的校准曲线计算出血红蛋白A1c值。计算出所得到的血红蛋白A1c值在n=10处的CV,将0%≤CV<5%设定为◎(优),将5%≤CV<10%设定为○(良),将10%≤CV<15%设定为△(尚可),将15%≤CV设定为×(不良),对差异进行评价。
[试验片的制作]
[实施例1]
在8mmφ的桐山滤纸NO.5A(东京硝子器械公司制)上滴10μL下述试剂3,接着在其他的8mmφ的桐山滤纸NO.5A(东京硝子器械公司制)上滴10μL下述试剂4,分别在25℃的遮光干燥器3909-04(东京硝子器械公司制)中对其干燥2小时,制作成两种单层试验片。通过对所得到的两种单层试验片进行层叠,而制作成多层试验片。另外,所承载的表面活性剂浓度为0.1mg/cm2,蛋白酶浓度为10U/cm2,糖化氨基酸氧化酶浓度为10U/cm2,过氧化物酶浓度为40U/cm2,氧化还原类显色试剂浓度为0.1mg/cm2。
所得到的多层试验片的详细情况示于表1。另外,表中的NP40、XIV、FPO、PEO、DA67是Nonidet(注册商标)P-40、蛋白酶Type-XIV、糖化氨基酸氧化酶FPO-301、过氧化物酶PEO-302、DA67分别承载于各层的意思。以下相同。
<试剂3>
100mM PIPES(同仁化学研究所公司制)pH 6.5
5.0mg/mL Nonidet(注册商标)P-40(Nacalai Tesque公司制)
500U/mL蛋白酶Type-XIV(SIGMA公司制)
<试剂4>
100mM PIPES(同仁化学研究所公司制)pH 6.5
5.0mg/mL Nonidet(注册商标)P-40(Nacalai Tesque公司制)
500U/mL糖化氨基酸氧化酶FPO-301(东洋纺织公司制)
2000U/mL过氧化物酶PEO-302(东洋纺织公司制)
5.0mg/mL DA67(和光纯药工业公司制)
[实施例2~4]
除了表面活性剂、蛋白酶、糖化氨基酸氧化酶、过氧化物酶、氧化还原类显色试剂被承载的层不同外,其余与实施例1同样地操作,制作成多层试验片。所得到的多层试验片具体示于表1。
表1
[实施例5]
在8mmφ的桐山滤纸NO.5A(东京硝子器械公司制)上滴10μL下述试剂5,接着在其他的8mmφ的桐山滤纸NO.5A(东京硝子器械公司制)上滴10μL下述试剂6,再在其他的8mmφ的桐山滤纸NO.5A(东京硝子器械公司制)上滴10μL下述试剂7,分别在25℃的遮光干燥器3909-04(东京硝子器械公司制)中对其干燥2小时,制作成三种单层试验片。通过对所得到的三种单层试验片进行层叠,而制作成多层试验片。另外,所承载的表面活性剂浓度为0.1mg/cm2,蛋白酶浓度为10U/cm2,糖化氨基酸氧化酶浓度为10U/cm2,过氧化物酶浓度为40U/cm2,氧化还原类显色试剂浓度为0.1mg/cm2。
所得到的多层试验片的详细情况示于表2。
<试剂5>
100mM PIPES(同仁化学研究所公司制)pH 6.5
5.0mg/mL Nonidet(注册商标)P-40(Nacalai Tesque公司制)
500U/mL蛋白酶Type-XIV(SIGMA公司制)
<试剂6>
100mM PIPES(同仁化学研究所公司制)pH 6.5
5.0mg/mL Nonidet(注册商标)P-40(Nacalai Tesque公司制)
500U/mL糖化氨基酸氧化酶FPO-301(东洋纺织公司制)
<试剂7>
100mM PIPES(同仁化学研究所公司制)pH 6.5
5.0mg/mL Nonidet(注册商标)P-40(Nacalai Tesque公司制)
2000U/mL过氧化物酶PEO-302(东洋纺织公司制)
5.0mg/mL DA67(和光纯药工业公司制)
[实施例6~9]
除了表面活性剂、蛋白酶、糖化氨基酸氧化酶、过氧化物酶、氧化还原类显色试剂被承载的层不同外,其余与实施例5同样地操作,制作成多层试验片。所得到的多层试验片示于表2。
表2
[比较例1]
在8mmφ的桐山滤纸NO.5A(东京硝子器械公司制)上滴10μL下述试剂8,在25℃的遮光干燥器3909-04(东京硝子器械公司制)中对其干燥2小时,制作成单层试验片。另外,所承载的表面活性剂浓度为0.1mg/cm2,蛋白酶浓度为10U/cm2,糖化氨基酸氧化酶浓度为10U/cm2,过氧化物酶浓度为40U/cm2,氧化还原类显色试剂浓度为0.1mg/cm2。
所得到的多层试验片的详细情况示于表3。
表3
<试剂8>
100mM PIPES(同仁化学研究所公司制)pH 6.5
5.0mg/mL Nonidet(注册商标)P-40(Nacalai Tesque公司制)
500U/mL蛋白酶Type-XIV(SIGMA公司制)
500U/mL糖化氨基酸氧化酶FPO-301(东洋纺织公司制)
2000U/mL过氧化物酶PEO-302(东洋纺织公司制)
5.0mg/mL DA67(和光纯药工业公司制)
[比较例2~7]
除了表面活性剂、蛋白酶、糖化氨基酸氧化酶、过氧化物酶、氧化还原类显色试剂被承载的层不同外,其余与实施例1同样地操作,制作成多层试验片。所得到的多层试验片的详细情况示于表4。
表4
[比较例8、9]
除了表面活性剂、蛋白酶、糖化氨基酸氧化酶、过氧化物酶、氧化还原类显色试剂被承载的层不同外,其余与实施例5同样地操作,制作成多层试验片。所得到的多层试验片的详细情况示于表5。
表5
<糖化氨基酸氧化酶、氧化还原类显色试剂的保存稳定性>
使用实施例1~9、比较例1~9的多层试验片,对糖化氨基酸氧化酶的保存稳定性、氧化还原类显色试剂的保存稳定性进行评价。
所得到的评价结果示于表6、7。
根据糖化氨基酸氧化酶的保存稳定性评价结果,当蛋白酶与糖化氨基酸氧化酶承载在同一层时,发生由蛋白酶引起的糖化氨基酸氧化酶的失活、分解,而导致保存稳定性显著降低。此外,由于糖化氨基酸氧化酶发生失活、分解,有时会导致无法测量。
另外,根据氧化还原类显色试剂的保存稳定性评价结果,当过氧化物酶与氧化还原类显色试剂承载在同一层时,氧化还原类显色试剂发生自显色,而导致保存稳定性显著降低。此外,由于氧化还原类显色试剂自显色,有时会导致灵敏度降低。根据以上结果,作为保存安定性优异的多层试验片的层结构,需要将蛋白酶与糖化氨基酸氧化酶分别承载在不同的层,例如可以列举出实施例1~9的多层试验片。更优选将过氧化物酶与氧化还原类显色试剂分别承载在不同的层,例如可以列举出实施例2、3、6~9的多层试验片。
[实施例10~13]
除了将蛋白酶由Type-XIV(SIGMA公司制)更改为Toyoteam NEP(东洋纺织公司制)、Type-X(SIGMA公司制)、蛋白酶K(Roche公司制)、Type-XIII(SIGMA公司制)外,其余与实施例2同样地操作,制作成多层试验片。所得到的多层试验片的详细情况示于表8。另外,表中的NEP、X、K、XIII是表示Toyoteam NEP、Type-X、蛋白酶K、Type-XIII分别承载在各层的意思。
[比较例10]
除了将蛋白酶由Type-XIV(SIGMA公司制)更改为Type-I(SIGMA公司制)外,其余与实施例2同样地操作,制作成多层试验片。所得到的多层试验片的详细情况示于表8。另外,表中的I是表示Type-I承载在各层的意思。
表8
<蛋白酶的反应性>
使用实施例2、10~13、比较例10的多层试验片,对蛋白酶的反应性进行评价。
所得到的评价结果示于表9。
表9
根据蛋白酶反应性的评价结果,作为蛋白酶优选选自由来自杆状菌(Bacillus)的蛋白酶、来自曲霉菌(Aspergillus)的蛋白酶、来自链霉菌(Streptomyces)的蛋白酶以及来自念球菌(Tritirachium)的蛋白酶所组成的组中的一种以上。
[实施例14]
除了将氧化还原类显色试剂由λmax=666nm的DA67(和光纯药工业公司制)更改为λmax=727nm的DA64(和光纯药工业公司制)外,其余与实施例2同样地操作,制作成多层试验片。
所得到的多层试验片的详细情况示于表10。另外,表中的DA64是表示DA64承载在各层的意思。
[比较例11、12]
除了将氧化还原类显色试剂由λmax=666nm的DA67(和光纯药工业公司制)更改为λmax=555nm的4AA(Nacalai Tesque公司制)和TOOS(同仁化学研究所公司制)以及λmax=630nm的4AA(Nacalai Tesque公司制)和MAOS(同仁化学研究所公司制)外,其余与实施例2同样地操作,制作成多层试验片。此外,所承载的4AA浓度为0.06mg/cm2、TOOS浓度为0.09mg/cm2、MAOS浓度为0.09mg/cm2。
所得到的多层试验片的详细情况示于表10。另外,表中的4AA、TOOS、MAOS是表示4-氨基安替吡啉、TOOS、MAOS分别承载在各层的意思。
表10
<氧化还原类显色试剂的灵敏度、相关性>
使用实施例2、14、比较例11、12的多层试验片,对氧化还原类显色试剂的灵敏度、相关性进行评价。
所得到的评价结果示于表11。
表11
根据氧化还原类显色试剂的灵敏度、相关性的评价结果,作为氧化还原类显色试剂优选摩尔吸光系数高、且不易受血红蛋白的色调的影响的、在650nm~800nm处具有最大吸收波长的无色色素。
[实施例15~17]
除了将表面活性剂由HLB值=17.6的Nonidet(注册商标)P-40(Nacalai Tesque公司制)更改为HLB值=13.5的Triton(注册商标)X-100(Nacalai Tesque公司制)、HLB值=16.7的Tween(注册商标)20(和光纯药工业公司制)、HLB值=16.9的Brij(注册商标)35(和光纯药工业公司制)外,其余与实施例10同样地操作,制作成多层试验片。
所得到的多层试验片的详细情况示于表12。另外,表中的TX100、Tw20、Br35是表示Triton(注册商标)X-100、Tween(注册商标)20、Brij(注册商标)35分别承载在各层的意思。
[比较例13、14]
除了将HLB值=17.6的表面活性剂Nodidet(注册商标)P-40(NacalaiTesque公司制)更改为HLB值=6.0的DK Ester(DKエステル,注册商标)F50(第一工业制药公司制)、HLB值=8.0的DK Ester(注册商标)F70(第一工业制药公司制)外,其余与实施例10同样地操作,制作成多层试验片。
所得到的多层试验片的详细情况示于表12。另外,表中的F50、F70是表示DK Ester(注册商标)F50(第一工业制药公司制)、DK Ester(注册商标)F70分别承载在各层的意思。
表12
<蛋白酶的反应性>
使用实施例10、15~17、比较例13、14的多层试验片,对蛋白酶的反应性进行评价。
所得到的评价结果示于表13。
表13
根据蛋白酶反应性的评价结果,作为表面活性剂优选促进蛋白酶反应的效果优异、HLB值为10~20的非离子性表面活性剂。
<血红蛋白A1c值校准曲线的制作:HbA1c测量性能评价用试样>
使用实施例1~4的多层试验片,制作HbA1c值的校准曲线,对相关性进行评价。所得到的评价结果示于表14。
表14
<血红蛋白A1c值的测量>
使用实施例1~4的多层试验片,使用上一项所得到的HbA1c值的校准曲线,计算出HbA1c值。所得到的评价结果示于表15。
表15
根据以上结果,使用本发明的多层试验片测量的血红蛋白A1c值与使用生物化学自动分析装置测量的血红蛋白A1c值非常一致。并且,由于本发明的多层试验片具有优异的保存稳定性,因此通过使用本发明的多层试验片,能够正确、简便且迅速地对测量试样中的糖化血红蛋白量进行比色定量。
工业上的可利用性
通过使用本发明的多层试验片,能够在诊断现场正确、简便且迅速地对测量试样中的糖化血红蛋白量进行比色定量,进而由于还具有优异的保存稳定性,因此希望对以基于预防医学的临床检查领域、诊断医疗领域、治药领域以及保健医学领域为首的生命科学领域的产业界作出较大贡献。
Claims (9)
1.一种多层试验片,用于对糖化血红蛋白含量进行比色定量,其特征在于:
所述多层试验片至少层叠有下述(a)层和(b)层,所述(a)层和(b)层从待测试样点样面按(a)层、(b)层的顺序层叠,
在(a)层和(b)层中的不同的层上分别承载过氧化物酶和氧化还原类显色试剂,而且
所述多层试验片不具有血液分离层,其中,
(a)层:至少承载有蛋白酶的高分子基材,
(b)层:至少承载有糖化氨基酸氧化酶的高分子基材。
2.根据权利要求1所述的多层试验片,其特征在于:
所述多层试验片在(a)层和(b)中的至少一层上还承载有表面活性剂。
3.一种多层试验片,用于对糖化血红蛋白含量进行比色定量,其特征在于:
所述多层试验片至少层叠有下述(a)层、(b)层和(c)层,所述(a)层、(b)层和(c)层从待测试样点样面按(a)层、(b)层及(c)层、(a)层、(c)层及(b)层或(c)层、(a)层及(b)层的顺序层叠,
在(a)层、(b)层和(c)层中的不同层上分别承载过氧化物酶和氧化还原类显色试剂,而且
所述多层试验片不具有血液分离层,其中,
(a)层:至少承载有蛋白酶的高分子基材,
(b)层:至少承载有糖化氨基酸氧化酶的高分子基材,
(c)层:至少承载有除蛋白酶和糖化氨基酸氧化酶外的任意试剂的高分子基材。
4.根据权利要求3所述的多层试验片,其特征在于:
所述多层试验片在(a)层、(b)层和(c)层中的至少一层上还承载有表面活性剂。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多层试验片,其特征在于:
蛋白酶是选自至少由来自杆状菌(Bacillus)的蛋白酶、来自曲霉菌(Aspergillus)的蛋白酶、来自链霉菌(Streptomyces)的蛋白酶以及来自念球菌(Tritirachium)的蛋白酶组成的组中的一种以上。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的多层试验片,其特征在于:
氧化还原类显色试剂是最大吸收波长为600nm~800nm的无色色素。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的多层试验片,其特征在于:
表面活性剂是亲水亲油平衡值为10~20的非离子性表面活性剂。
8.一种测量方法,其特征在于:
所述测量方法使用权利要求1至7中任一项所述的多层试验片,至少经过以下工序(i)~(iii)对糖化血红蛋白含量进行比色定量,
工序(i):在上述多层试验片上表面上点样待测试样的工序;
工序(ii):从与上述多层试验片的待测试样点样面相反的面利用反射光测量反射率和/或吸光度的工序;以及
工序(iii):从所得的反射率和/或吸光度计算出选自由血红蛋白含量、糖化血红蛋白含量、糖化血红蛋白含量与血红蛋白含量的比所组成的组中的一个以上的工序。
9.根据权利要求8所述的测量方法,其特征在于:
待测试样为全血样本。
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130327 |