JPS61284661A - ブドウ糖検出用検査体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の技術分野〕 本発明は体液例えば血液や尿の中のブドウ糖を簡単且つ
迅速に検出しうる新規なブドウ糖検出用検査体に関する
ものである。

体液中のブドウ糖の量を迅速、簡単に知ることはいうま
でもなく糖尿病の早期発見、診断、ならびに管理に必要
不可欠である。

このように体液特に尿中のブドウ糖を簡単迅速に検出す
ることは極めて重要であるがこのためには従来主として
検査試薬が含浸された口紙を支持体に貼着してなる試験
片が用いられてきた。この試験片は、使用に際して操作
が簡単でしかも判定が短時間で行なえるとい５利点があ
りた。

ところで体液特に尿中のブドウ糖検出用試験片では、ブ
ドウ糖酸化酵素の作用によシ、ブドウ糖は空気中の酸素
と反応して最終的にグルコン酸と過酸化水素に酸化され
る。この過酸化水素はペルオキシダーゼの作用により発
生期の酸素を産出し、この酸素は直ちにＯ−）リジンな
どの被酸化性指示薬と結び付き、該指示薬を発色させる
。

この原理を利用した体液中のブドウ糖検出用試験片は、
糖酸化酵素、ペルオキシダーゼ、被酸化性指示薬からな
る試薬組成物を水または水−アルコール系溶媒中に溶解
または分散させ、得られた　　′液に口紙を含浸させた
後乾燥し、この口紙なプラスチックフィルムに貼着し適
宜な大きさに裁断して作製されてきた。

近牟、製造工程を簡素化でき大量生産に適した試験片の
開発が進められ、例えば、特公昭４Ａ４ｔ−２！り５３
号公報には、水溶液に酵素類を予め溶解させ、これに指
示薬、ｐＨ緩衝剤、高分子結合剤および吸水性担体など
を混合して、印刷またはコーティング適性を有するイン
キ組成物を調製し、このインキ組成物を支持体上に印刷
（コーティングを含む）した後乾燥して試験片を製造す
る方法が提案されて込る。

更に、特開昭５！−２０２２２５号公報においては、酵
素類をほとんど溶解しない非水系溶媒に酵素類を分散さ
せ、次いで指示薬、緩衝剤、結合剤あるいは吸水性担体
を溶解あるいは分散させてインキ組成物を調製しこのイ
ンキ組成物を支持体上に印刷して試験片を製造する方法
が提案された。

しかしこれらの方法によるときはいずれも長期保存性に
難点かあｐ、或は塗布された試薬層中の残留水分量をで
きるだけ除去する必要があったり、或は大気中に長時間
さらしている間に徐々に着色することがあったシして好
ましくなかった。

〔発明の目的ならびに概要〕

かくて本発明は上記のごとき事情に鑑み試薬乃至インキ
組成物の長期保存性を向上させたブドウ糖検出用検査体
を提供することを目的とするものである。

よって、本発明は、少なくとも糖酸化酵素、ペルオキシ
ダーゼ、／乃至ｌ成分系の被酸化性指示薬、ｐＨ緩衝剤
、吸水性粉末及び結合剤を含む試薬部を支持体上に設け
てなる検査体において、前記試薬部を二層以上に形成し
、前記糖酸化酵素、ペルオキシダーゼ、被酸化性指示薬
を前記試薬部の各層に分けて存在させるようにしたこと
を特徴とするブドウ糖検出用検査体を提供するものであ
る。

〔発明の詳細な説明〕

まず、本発明に係る検査体によるブドウ糖検出反応の原
理とここで用いるブドウ糖検出用インキ組成物について
それぞれ具体的に説明する。

イ）原理 体液中のブドウ糖は、グルコースオキシダーゼなどのプ
ドク糖酸化酵素の作用によシ、空気中の酸素と反応して
最終的にグルコン酸と過酸化水素に酸化される。生成し
た過酸化水素は、ペルオキシダーゼの作用により発生期
の酸素を産生じ、この酸素は直ちにｏ−ト’）ジンなど
の被酸化性指示薬と反応して該指示薬を発色させる。こ
の発色の程度により、体液中のブドウ糖の有無ならびに
その量が半定量的に決定される。

口）糖酸化酵素 糖酸化酵素としてのグルコースオキシダーゼは、精製さ
れた凍結乾燥品の状態で用いられる。この酵素は通常水
溶性であり、従りて非水溶媒には溶けず分散状態となる
。この酵素は、たとえば酵素活性が／　００　ｕｎｉｔ
／ｇの力価のものを用いた場合、インキ組成物の固形分
に対して０．０．２〜コ重量％の量で存在することが望
ましい。

ハ）ペルオキシダーゼ ペルオキシダーゼは、過酸化水素または有機過酸化物に
よる種々の有機物の酸化を接触する酵素であって、主に
西洋ワサビから抽出される。この酵素は、たとえば、活
性が／　００　ｕｎ　ｉ　ｔ／ｕ）の力価の凍結乾燥品
を用いた場合インキ組成物の固形分に対して０．００２
〜／重景チ好ましくは０．０λ〜Ｏ８２重量％の量で存
在することが望ましい。

二）被酸化性指示薬 被酸化性指示薬は、酵素によって酸化されて発色する指
示薬であって、本発明ではｌ乃至−成分系の指示薬でｍ
−られる。

そして本発明ではｌ成分系の指示薬のときはそれ自身、
さらにｌ成分系（顔色剤とカプラーとの組合わせ）のと
きは少なくともその／成分を非水溶媒中で分散状態に存
在させるのが好ましい。

指示薬を製造及び保存中分散不活性状態に保って酵素等
の影響を受けることなく経時安定性を良好ならしめるこ
とができるからである。

尚顕色剤とカプラーの１成分系からなる時も各成分にお
−てたとえば顕色剤において２種又はそれ以上ｍ−るこ
ともあｔ）％るのであり、このように各成分系において
一種乃至それ以上用−る際には各成分毎に分散、溶解の
状態を統一する方がよい。

またｌ成分系指示薬と２成分系指示薬を混合して使用す
ることもできるのであり、かかる混合使用する際は、ｌ
成分系の指示薬を顕色剤とみなし、−成分系（顕色剤と
カプラーとからなる）のカプラーと共に溶解状態で存在
しなりよう注意せねばならない。

このような指示薬は形成されたインキ組成物固形分に対
して０．０２〜ｉｏ重量％、好ましくはｏ、ｔ〜を重量
％で存在させるものとする。

ｌ成分系の指示薬としてはｏ−）Ｊジンも用すうるが、
この外、ｊ、　３／、　ｔ、　ｊ／−テトラメチルベン
ジン、ｐ−アニシジン、Ｎ、　Ｎ、−ジメチルｐフェニ
レンジアミン、λ、　　７−ジアミツフルオレン、λ、
λ′　アジノビス（３エチルベンゾチアゾリン−６スル
フオン酸）、λ、ｔ−ジクロロフェノール、αナフトー
ル、グアヤク脂、Ｋ工、等を用いることができる。この
中ではグアヤク脂が特に好ましい。

顕色剤とカプラーとの組合わせからなるｌ成分系の指示
薬を用いる場合は顕色剤としては≠−アミノアンチピリ
ン ３−メチル−λ−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン Ｎ、Ｎ、　ジメチルｐ−フェニレンジアミンテトラメチ
ルベンジジン 等を用いることができる。

カプラーとしては ・アニリン類、例えばジメチルアニリン、ジエチルアニ
リン、Ｎ−メチルＮ−ヒドロキシエチルアニリン、Ｎ−
メチル−Ｎヒドロキシエチルｍトルイジン、Ｎ、Ｎ、ジ
メチルｍアユジン、等・フェノール類、例えばフェノー
ル、ｐ−クロロフェノール、２．Ａジクロロフェノール
、グアヤコール、ヒロガロール、０−フェニルツブエノ
ール、等 ・ナフトール類、例えば／、７ジヒドロキシナフタレン
、ｌナフトール３．ｂジスルフォン酸、／、？ジヒドロ
キシ３，６ジスルフオン酸ナフタンン、ｒ−アミノ／−
／−ナフトール３，６ジスル７オン酸す７タンン等を用
することができる。

ホ）ｐＨ緩衝剤 ｐＨ緩衝剤は、前記の指示薬が色彩変化を起こすｐＨの
近くにｐＩ（を保つために用すられる。

ｐＨ緩衝剤としては、所定のｐＩ（値（たとえばｐＨＪ
〜弘）を試薬組成物に与え５るものであればいずれのも
のでもよいが、具体的にはクエン酸とクエン酸ナトリウ
ムとの組合わせが好ましく用いられる。ただしこの酸性
側のＰＨ緩衝剤もしくは指示薬の量が過剰であると、呈
色反応が妨害されることがあるため酸性側のｐＨ緩衝剤
もしくは指示薬の使用量は最小限にとどめるべきである
。

インキ組成物の固形に対して０．０２〜０．１重量％の
量で存在するのが好ましい。

へ）吸水性粉末 吸水性粉末の添加は、支持体上に設けられた試薬組成物
の吸水性を高め、被検体液と試薬組成物との接触が促進
され、指示薬の呈色反応を促進する働きを有する。

このような吸水性粉末としては、水と接触した場合に、
極端な酸性ある込はアルカリ性を示すものは好ましくな
く、しかも白色度の高−ものが好ましい。具体的には、
カオリン、合成シリカ、ガラス、セルロースブロック　
＠結晶セルロース、イオン交換セルロース、イオン交換
樹脂、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、ケイ酸アル
ミニウムなどが用いられうる。

吸水性粉末は、インキ組成物の固形分に対して３０〜９
０重量％の量で存在することが好ましい。

ト）結合剤 結合剤は、被検体液中の成分およびｐＨなどに影響を及
ぼさず、かつ試薬類特に酵素ならびに被酸化性指示薬に
影響を及ぼさず、しかも発色反応を妨げなりものである
ことが要求される。このような要件を満たすことが確、
かめられた結合剤としては、（１）ポリエステル樹脂、
アルキド樹脂、ポリウレタン樹脂、ポリスチレン樹脂、
アクリル樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビ；ル樹脂、塩化ビ
ニル共重合体樹脂、ポリビニルブチラール樹脂、ポリビ
ニルアルコール樹脂、ポリビニルピロリドン樹脂、無水
マレイン酸系共重合体などの合成樹脂類、（１１）メチ
ルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセ
ルロース、カルボキシメチルセルロースナトのセルロー
スＮ導体、　（Ｉｌｌ）テｙフｙ。

多糖類、ゼラチン、カゼインあるいはアルギン酸ナトリ
ウムなどの天然高分子などが用いられる。

またこれらの結合剤を２種以上組合わせてもよ−。

この結合剤はインキ組成物の固形分に対してＯ１ｌ〜ｍ
重量憾好ましくはｏ、５−ｉｏ重量鴫の量で存在させる
ものとする。

チ）溶媒 各成分の溶媒としては水、水−アルコール混合液を用い
ることができるが一般に上記の各成分は、水を実質的に
含むことのない非水溶媒中に溶解あるいは分散されるの
が好ましい゛。このような非水溶媒としては、（ａ）ベ
ンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素、（ｂ）メチル
エチルケトンなどの脂肪族炭化水素、（Ｃ）酢酸エチル
などのエステル類あるいハ（ｄ）　ｎ−ブタノールなど
のアルコール類などが周込られる。アルコール類のうち
０１〜Ｃ２の低級アルコールは酵素の失活を招くため好
ましくない。

上記各成分は溶媒中にできるだけ多く分散されるのが望
ましく１分散の比率が高い程良好である。

従って分散状態にしても必ずしもすべて分散していなく
ともよく、一部溶解していても差支えない。

後述のように本発明ではこれら各成分をすべて一緒に混
合して一つのインキ組成物として用いるのではなく、少
くとも酵素、ペルオキシダーゼ及び指示薬を分けて二つ
以上のインキ組成物として用いるのである。

す）任意添加成分 上記各成分の外に安定剤その他の成分を必要に応じて添
加することができる。

亀）安定剤 安定剤は、糖酸化酵素、ペルオキシダーゼ、被酸化性指
示薬、吸水性粉末および結合剤からなる試薬組成物の安
定化に寄与するものである。このうち被酸化性指示薬は
前述のごとく大気中の過酸化物質などの作用を受けて変
色する傾向が認められるが、これを防止するのが安定剤
の主たる役割であり、この安定剤としては、適度の抗酸
化活性を有する化合物またはグリセロールエステル類に
代表される特定の界面活性剤あるいはこれらの混合物が
周込られる。

抗酸化作用を示す物質としては、！、７−ジｔ−ブチル
メトキシフェノール、ｐ−メトキシフェノール、／−Ｊ
−フトール、ペンタンメチルフェノール、２．λ、ｔ、
７．ｒ−ペンタメチル６−ヒドロキシクロマン、没食子
酸プロピル、２．Ｊ。

≠−トリヒドロキシベンゾフェノン、ｔ−ブチルハイド
ロキノン、トコフェノール類などのラジカル捕捉剤、す
るいはアスコルビン酸、アスコルビン酸ステアレートな
どの還元剤が用いられうるが。

これらは少なくとも本検査の目的であるグルコース検出
の反応系（被酸化性指示薬の酸化反応）を阻害し、感度
低下をきたす性質をも有している。

したがって、反応層を阻害せず、がっ大気中の過酸化物
質などによる作用を少なくし５るような抗酸化性物質を
用いることが好ましい。抗酸化性物質の選択に際しては
、用いる被酸化性指示薬と酸素（０）との反応性を考慮
する必要がある。抗酸化性物質の添加量としては、イン
キ組成物の固形分に対してＱＯλ〜２重量憾が望ましい
。この場合ｏ、ｏｉ４未満であると大気中での着色現象
を効果的に防止できず、また０、２重量幅を超えると呈
色反応に対する悪影響が認められ始め、感度が低下する
。

さらに、上記抗酸化作用を示す物質とは別に。

試薬反応層の大気中での着色現象を防止するもう一つの
添加剤としてその作用機構は不明であるがグリセロール
エステル類に代表される特定の界面活性剤がある。この
グリセロールエステル類としては、グリセロールモノア
セテート、グリセロールジアセテート、グリセロールモ
ノステアレート、グリセロールモノパルチミーラート、
グリセロールモノオレエート、グリセロールモノアセテ
−ト、などのクリセロール脂肪酸エステルが挙げられる
。

その添加量は、インキ組成物の固形分に対しＱ、！〜３
重量憾が望ましい。ｏ、ｒｔ６１Ｄ少ないと大気中での
着色現象を効果的に防止できない。グリセロールエステ
ル類は呈色反応にほとんど悪影響を及ぼすことがないの
で過剰に用いてもよい。

ｂ）その他の成分 場合によっては、上記各成分のほかに、少量の潤滑剤た
とえば非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、陽イ
オン界面活性剤１両性イオン界面活性剤、ポリエチレン
グリコール類などを、検出用試薬組成物中に配合するこ
ともできる。この潤滑剤は、各試薬の分散に役立ち、均
一な試薬層の形成を促進し、水ぬれ性を向上させること
ができる。潤滑剤は、インキ組成物の固形分に対して、
０、ｊ〜！重量４の量で存在することが好ましい。

また指示薬の呈色色調をさらに見やすくするために、た
とえばソルベントイエローなどの背景色素を添加しても
よい。

上記のようなインキ組成物は、支持体上に塗布されて試
薬部が形成され１本発明に係る体液検査体が得られる。

試薬部の形状は四角形状１円形いづれでもよいが通常正
方形状が好ましい。塗布技術としては、印刷法、コーテ
ィング法（たとえばロールコーティング、スプレーコー
ティング、ティップコーティング、ベタコーティング）
などが用いられうる。本発明においては、インキ組成物
の塗布量が比較的多くかつ塗布量が一定であることが好
ましいため、シルクスクリーン印刷法、凹版印刷法、グ
ラビア印刷法などによって、インキ組成物を支持体上に
設けることが好ましい。塗布量は、インキ組成物の種類
に応じて変化するが。

一般にλ〜／！０．９　／ゴ（乾燥時）であることが好
ましい。

支持体は、試薬組成物と反応せずしかも試薬の呈色を阻
害しないものであることが好ましく、具体的には、たと
えば紙１合成紙、不織布または合成樹脂フィルムあるい
は紙と合成樹脂フィルムとの積層体などが用いられる。

このような支持体上にブドウ糖検査試薬部が設けられた
本発明に係る検査体は、ス）＋７ツプ状、ロール状、テ
ープ状などの各形態に形成されていてもよい。あるいは
支持体自体が被検体液を採取しうるよ５な形態たとえば
、コツプ状、試験管状。

皿状、トレイ状、スポイト状１袋状に形成され、その支
持体上に検査領域を設けて１本発明に係る検査体として
もよい。

本発明では前記のような各成分を支持体上に塗布してな
る試薬部を有するブドウ糖検出用検査体をつくるに当っ
て、該試薬部を二層以上に形成して、前記成分の中糖讃
化酵素ペルオキシダーゼと／乃至コ成分系被酸化性指示
薬を各層に分けて存在させ、以て該検査体の長期保存性
を向上せしめるのである。

これらの成分の分は方は種々あり、含糖酸化酵素をＡ、
ペルオキシダーゼをＢ、被酸化性指示薬をＣ１但し二成
分系指示薬を用いるときは夫々をｃｌ、ｃ２として表わ
した場合これらの分は方、組合わせ方として次のような
例を挙げることができる。

■　二層で形成する場合 （勿論、下層は直接支持体にふれる側である）■　三層
で形成する場合 この外の成分、ｐＨ緩衝剤、吸水性粉末、結合剤等は適
宜各層に含有せしめる。これらは非水溶媒に分散せしめ
て各雇用のインキ組成物をっ＜シ。

支持体上にまず下層用のインキ組成物を印刷乃至塗布し
、ついで上層、又は中層と上層を順次積層して試薬部を
形成する。

上記Ｎｎ　／　−Ｎｎ　！の分は方はあくまで一部の例
示でしかなく他に任意の分は方をとることができる。

しかし実際の検査時、試薬部の上側から色変化を観察し
よ５とするときは、■被酸化性指示薬Ｃを含む層を上層
とすること、■指示薬Ｃが下層になる場合は上層の透明
性、塗布量に留意することが必要である。逆に支持体を
透明にし支持体の裏面から観察しようとするときは上記
の逆とするのが望ましい。

各試薬層間は厳密に分離されたものではなく、接触面は
一部融合していても差支えない。

このようにして見られた本発明のブドウ糖検出用検査体
を尿等の体液中に浸漬するとその体液中のブドウ糖濃度
に応じた呈色反応を呈する。濃度既知の体液について予
め呈色せしめて測定した色相等と比較して、被検体液中
のブドウ糖濃度を知ることができる。その呈色反応は迅
速且つ鮮明であり、製造後長期保存のものであってもそ
の反応は安定である。

〔発明の効果〕

本発明ではこのように、試薬部を二層以上に形成し、糖
酸化酵素、ペルオキシダーゼと／乃至λ成分系指示薬を
前記試薬部の各層に分けて存在さざたので、これらを一
層に存在させた場合のように長期保存中に各成分間で反
応を生じて着色など生成する惧れなく、試薬層乃至イン
キ組成物の保存性を著しく向上させることができる。

〔実施例〕

実施例 下記組成のＡ、８１種のインキ組成物をホモミキサーで
微細分散および溶解した。

Ａ、ｔ　　グルコースオキシダーゼ （東洋紡Ｇｒａｄｅ　Ｕ　）　　　　０．！重量部ユ　
パーオキシダーゼ （東洋紡Ｇｒａｄｓ　ＩＩＩ　）　　　０．　／３　イ
ソブチレン／無水フレイ ン酸共重合体のブタノール エステル化物　　　　　　　　１．ｌｒ弘　ポリオキシ
エチレンソルビ タンモノオレエート（花王 石ケン、トウィーンＸ）　　　　ｌ、Ｚま　微結晶セル
ロース （旭化成アビセル８Ｆ）ｉ。

Ａ、　　ｎ−ブタノール　　　　　　ｔＡＯ２クエン酸
　　　　　　　　　　３＋２？　クエン酸ナトリウム　
　　　／２．ＯＢ、　　／、　　ＩＡアミノアンチピリ
ン　　　　２．０重量部ユ　／ナフトヤルＪ、Ｇジスル
フ オン酸ナトリウム　　　　　　２．０ ３　イソブチレン／無水フレイ ン酸共重合体のブタノール エステル化物　　　　　　　　２．！ 弘　ポリオキシエチレンソルビ タンモノオレエート（花王 石ケン、トウィーンｓ）　　　　／、ｚよ　カルボキシ
メチルセルロー スカルシウム塩　　　　　　　６ ｔ、微結晶セルロース （旭化成アビセル５Ｆ）３０ ７．１−ブタノール　　　　　　４Ｌｔ乙　ソルベント
イエロー１ｒ　　　　　ｏ、ｏｓＺ　クエン酸　　　　
　　　　　　３．２１０、　　クエン酸ナトリウム　　
　　／２．。

次にインキＢをスクリーン印刷法によシ厚み２ｊＯμｍ
の白色ポリスチレンシート上に１辺がよ頭角の参角形と
なるように印刷した。塗布量は約／−２０，９／７７Ｌ
″であった。このものをｔｓｃで３０分間乾燥し、イン
キ層Ｂを有する印刷物を得た。この印刷物の上にさらに
インキＡを用いて同様にスクリーン印刷を施した。この
塗布量は約♂ｏ　ｉ　、／　ｍ”であった。同様に乾燥
し、これによりＡｌ３２層から成るブドウ糖検査用試薬
部を得て、さらにストリップ状に断才して検査体を得た
。

比較例 実施例に対応した水系含浸液を下記組成で調整し、Ｐ紙
（東洋Ｆ紙ｆｉＮＱｊ／）に含浸さく３０　’Ｃテ２時
間乾燥させ検査体（Ｐ紙片）を得た。

ｔ　グルコースオキシダーゼ （東洋紡−Ｇｒａｄｓ　ＩＩ　）　　　　０．Ａ　Ｉユ
　ペルオキシダーゼ （東洋紡Ｇｒａｄｅ　Ｉ［［）　　　０．　／ｊ　ｌ３
　≠アミノアンチピ１１ン　　　　　　２．０１１１Ａ
／ナフトール３．６ジスルホン酸 ナトリウム　　　　　　　　　　　２，０１１よ　クエ
ン！ｌ／クエン酸ナトリウム 緩衝液（ＰＨｊ）　　　　　　　　　　１０ｙｔ、　ゼ
ラチン水溶液（ｊ４）　　　　　　５０ｍ１２　蒸留水
　　　　　　　　　　　　　よＯｄ実験例 比較例で得られた検査体を濃度既知のグルコース水溶液
（ｚｏｏｍｙ７ａｉ）に浸漬しその呈色色調を観察した
。

次にこれらの検査体の保存促進テスト（ｌ／−０℃２０
４ＲＨ中に放置）を行い、７０日間その性能低下を調べ
た。

さらに上記インキ及び含浸液の保存（１１）℃３；！４
ＲＨ中密ペイ容器中で保存）テストを行い（実施例、比
較例）と同様の方法で検査体を製造し、ｉｓＢ間その性
能低下を調べた。性能低下の度合は、調整製造直後に調
べた呈色濃度（反射濃度）をｉｏｏとし表示した。

上記、実験例から明らかなように、各成分をすべて一層
の試薬部に形成してなる比較例の場合は保存期間に応じ
てかなシの性能低下が認められたのに対し、各成分を二
層に分けて試薬部を形成した実施例の場合、事実上性能
の低下は認められなかった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、少なくとも糖酸化酵素、ペルオキシダーゼ、１乃至
   ２成分系の被酸化性指示薬、ｐＨ緩衝剤、吸水性粉末及
   び結合剤を含む試薬部を支持体上に設けてなる検査体に
   おいて、前記試薬部を二層以上に形成し、前記糖酸化酵
   素、ペルオキシダーゼ、被酸化性指示薬を前記試薬部の
   各層に分けて存在させるようにしたことを特徴とするブ
   ドウ糖検出用検査体。