JP2014190938A - 糖化ヘモグロビンの測定方法、および多層試験片 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の目的は、診断の現場で正確、簡便かつ迅速に測定試料中の糖化ヘモグロビン量を比色定量するための測定方法、および多層試験片を提供する。
【解決手段】
少なくとも下記（ａ）層と（ｂ）層と（ｃ）層とが、測定試料点着面から（ａ）層／（ｂ）層／（ｃ）層の順に積層されてなる多層試験片を用い、
少なくとも下記工程（１）から工程（４）を経て、糖化ヘモグロビン量を比色定量することを特徴とする測定方法。
（ａ）層：少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
（ｂ）層：水不透過性高分子基材
（ｃ）層：少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
工程（１）：前記多層試験片の上面に測定試料を点着させる工程
工程（２）：（ｂ）層を取り除く工程
工程（３）：前記多層試験片の測定試料点着面とは反対面から、反射光を用いて反射率および／または吸光度を測定する工程
工程（４）：得られた反射率および／または吸光度からヘモグロビン量、糖化ヘモグロビン量、糖化ヘモグロビン量のヘモグロビン量に対する割合からなる群より選ばれた１つ以上を算出する工程
【選択図】なし

Description

本発明は、診断の現場で正確、簡便かつ迅速に測定試料中の糖化ヘモグロビン量を比色定量するための測定方法、および多層試験片に関する。

糖尿病の診断、予防、および治療を行う上で、糖化タンパク質の測定は非常に重要である。糖化タンパク質は、生体内でグルコースと血中タンパク質のアミノ基（主に、末端アミノ酸のα−アミノ基、リジン残基のγ−アミノ基）とが非酵素的に反応して生成する。タンパク質の糖化の程度は血中グルコース濃度（以下、血糖値という。）に直接比例するため、糖化タンパク質の測定により、例えば糖化ヘモグロビンの場合は約２〜３カ月間、糖化アルブミンの場合は約２〜３週間の血糖コントロール状態を把握することができる。
特に糖化ヘモグロビンの一種であるヘモグロビンＡ１ｃは、糖尿病の診断に際して最も重要であるとされている。

前記糖化タンパク質の測定法としては、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、免疫法、および酵素法などが知られている。従来は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、および免疫法が大部分を占めていたが、近年では大量検体を迅速、大量、正確、安価に測定できることから酵素法も多用され始めている。

酵素法については、例えば、以下の工程を経て糖化タンパク質を比色定量する技術が知られている。（例えば、特許文献１〜４参照）
（１）測定試料中の赤血球を溶血させ、糖化ヘモグロビンを取り出す工程。
（２）前記糖化ヘモグロビンとプロテアーゼを反応させ、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出す工程。
（３）前記糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドと糖化アミノ酸オキシダーゼを反応させ、過酸化水素を生成する工程。
（４）ペルオキシダーゼ存在下で、前記過酸化水素と酸化還元系発色試薬を反応させ、発色させる工程。
（５）前記発色から測定試料中の糖化ヘモグロビン量を比色定量する工程。
しかし、かかる従来技術は、測定試料中に存在する可能性のある、測定対象である糖化タンパク質に由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響で、見かけ上の測定値が増加（以下、擬高値ともいうことがある。）してしまうという問題があった。

一方、前記問題点を解消すべく、糖化タンパク質をプロテアーゼで処理する前に、前記測定試料中に存在する可能性のある、糖化タンパク質に由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに、糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させることにより、前記糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを分解処理する前処理工程を含むことを特徴とする糖化タンパク質の含有量を測定する方法（本明細書では「消去法」と呼ぶことがある。）の発明がなされた。（例えば、特許文献５〜９）
かかる従来技術は、測定試料を希釈し、液体状態の試薬を添加し、反応容器内で反応させ、反応液の吸光度を測定する方法であり、生化学自動分析装置を用いた方法が主流である。しかし、前記生化学自動分析装置は大型かつ高価である、取扱いには熟練した検査技師が必要である、採血から結果報告までの時間が長い といった問題点があり、ＰＯＣＴ：ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ ｔｅｓｔｉｎｇ（すなわち、臨床現場即時検査）への適用は困難であった。

ＷＯ２００２−６５１９号公報 特開２００４−２２２５７０号公報 特開２００７−１８１４６６号公報 特開２０１０−１４８５１５号公報 特許２００７−２８９２０２号公報 特開２０１０−１０４３８６号公報 特開２０１０−１１０３３３号公報 特開２０１０−２５２８１４号公報 特開２０１０−２６３９２１号公報

Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：１２ ２３９０−２３９６（１９９７）

本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、本発明の目的は、診断の現場で正確、簡便かつ迅速に測定試料中の糖化ヘモグロビン量を比色定量するための測定方法、および多層試験片を提供することにある。さらに詳しくは、測定試料中に存在する可能性のある、糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響を受けにくく、かつ保存安定性に優れた、糖化ヘモグロビン量を比色定量するための測定方法、および多層試験片を提供することにある。

本発明者らは、消去法に用いる多層試験片において、プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼが同一層に担持されると、保存中にプロテアーゼによる糖化アミノ酸オキシダーゼの失活・分解が生じ、保存安定性が著しく低下することを見出した。
そこで本発明者らは、プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼを異なる層に担持させることにより、糖化アミノ酸オキシダーゼの保存安定性が著しく向上することを見出し本発明に至った。

さらに、本発明者らは、消去法に用いる多層試験片において、プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼをそれぞれ異なる層に担持させた多層試験片を用いて糖化ヘモグロビン量を比色定量すると、糖化アミノ酸オキシダーゼの反応不足により、測定試料中に存在する可能性のある糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響を受けることを見出した。通常、多層試験片の上面に点着させた測定試料は、各層に担持させた試薬成分を溶かすと同時に反応し、下層へと展開する。ここで、糖化アミノ酸オキシダーゼを測定試料点着面に近い層（以下、上層ともいうことがある。）に、プロテアーゼを測定試料点着面から遠い層（以下、下層ともいうことがある。）にそれぞれ担持させた場合、測定試料が上層で糖化アミノ酸オキシダーゼを溶かすと同時に測定試料中に存在する可能性のある、糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを消去するのに十分な滞留時間を稼ぐことができず、未反応のまま下層へと展開してしまうことが、糖化アミノ酸オキシダーゼの反応不足の原因であることを見出した。
そこで本発明者らは、糖化アミノ酸オキシダーゼを担持させた層とプロテアーゼを担持させた層との間に、水不透過性高分子基材を設けることで、上層での測定試料の滞留時間を制御できる、すなわち糖化アミノ酸オキシダーゼの反応時間を制御できることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
１．少なくとも下記（ａ）層と（ｂ）層と（ｃ）層とが、測定試料点着面から（ａ）層／（ｂ）層／（ｃ）層の順に積層されてなる多層試験片を用い、
少なくとも下記工程（１）から工程（４）を経て、糖化ヘモグロビン量を比色定量することを特徴とする測定方法。
（ａ）層：少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
（ｂ）層：水不透過性高分子基材
（ｃ）層：少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
工程（１）：前記多層試験片の上面に測定試料を点着させる工程
工程（２）：（ｂ）層を取り除く工程
工程（３）：前記多層試験片の測定試料点着面とは反対面から、反射光を用いて反射率および／または吸光度を測定する工程
工程（４）：得られた反射率および／または吸光度からヘモグロビン量、糖化ヘモグロビン量、糖化ヘモグロビン量のヘモグロビン量に対する割合からなる群より選ばれた１つ以上を算出する工程
２．さらに、工程（２）と工程（３）との間に下記工程（５）を経る１．の測定方法。
工程（５）：測定試料点着面に水溶液を滴下する工程
３．さらに、（ａ）層と（ｃ）層との少なくとも一層に、ペルオキシダーゼおよび酸化還元系発色試薬がそれぞれ異なる層に担持された多層試験片を用いる１．または２．の測定方法。
４．さらに、（ａ）層と（ｃ）層との少なくとも一層に、界面活性剤が担持された多層試験片を用いる１．から３．いずれかの測定方法。
５．測定試料が全血検体である１．から４．いずれかの測定方法。
６．少なくとも下記（ａ）層と（ｂ）層と（ｃ）層とが、測定試料点着面から（ａ）層／（ｂ）層／（ｃ）層の順に積層されてなる多層試験片であって、「ヘモグロビン量」、「糖化ヘモグロビン量」および「糖化ヘモグロビン量のヘモグロビン量に対する割合」からなる群より選ばれた１つ以上を算出するための多層試験片。
（ａ）層：少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
（ｂ）層：水不透過性高分子基材
（ｃ）層：少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
７．さらに、（ａ）層と（ｃ）層との少なくとも一層にペルオキシダーゼが担持され、かつ、（ａ）層と（ｃ）層との少なくとも一層に酸化還元系発色試薬が担持された６．の多層試験片。
８．さらに、（ａ）層と（ｃ）層との少なくとも一層に、界面活性剤が担持された、６．または７．の多層試験片。
９．６．から８．いずれかの多層試験片を含むプロダクト。

本発明により、診断の現場で正確、簡便かつ迅速に測定試料中の糖化ヘモグロビン量を比色定量するための測定方法、および多層試験片を提供することができる。さらに詳しくは、測定試料中に存在する可能性のある糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響を受けにくく、かつ保存安定性に優れた、糖化ヘモグロビン量を比色定量するための測定方法、および多層試験片を提供することができる。

試験片を上下から挟んで固定するための治具。

以下、本発明を詳述する。
（測定対象物）
本発明における測定対象物は、糖化ヘモグロビンであり、糖尿病診断への応用の観点から、ヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端が糖化されたヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃともいうことがある。）が好ましい。なお、測定対象物である糖化へモグロビンに由来する糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを測定対象糖化物といい、測定対象物である糖化へモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを非測定対象糖化物ともいうことがある。

（測定試料）
本発明における測定試料としては、特に限定されないが、全血、血球、血漿、血清、髄液、汗、尿、涙液、唾液、皮膚、粘膜、毛髪等の生体試料（すなわち生体から採取された試料）や、飲料水、調味料等の食品類が挙げられる。また、生体試料はヒト由来に限らず、イヌ、ネコ、ウシ等の哺乳類動物由来の生体試料も対象である。これら中でも、糖尿病診断への応用の観点から、全血または血球が好ましく、ＰＯＣＴの観点から、前処理として血球／血漿または血清分離を行わない全血がより好ましい。

本発明における測定試料の量は、特に限定されないが、例えば１〜５０μＬが好ましく、１〜４０μＬがより好ましく、１〜３０μＬがさらに好ましい。測定試料量が１μＬより少ないと、多層試験片の最上層から最下層まで展開できない恐れがある。一方、測定試料量が５０μＬより多いと、例えば測定試料が血液の場合、患者の負担が大きくなるため好ましくない。

（測定原理）
本発明における糖化ヘモグロビンの測定原理は、酵素反応を測定試料中の水分によって行う（いわゆる、ドライケミストリー）ことで多層試験片を呈色させ、その呈色の程度を反射光測定によって検知する方法（いわゆる、酵素比色法）によって行なわれる。前記測定原理を用いることで、装置の小型・軽量・低価格化が可能となる。また、正確、簡便かつ迅速な測定が可能となる。
以下に赤血球中の糖化ヘモグロビン量を測定する場合の反応について説明するが、本発明を何ら限定するものではない。
（１）測定試料中の赤血球と界面活性剤を反応させ、溶血させ、糖化ヘモグロビンを取り出す工程。
（２）非測定対象糖化物と糖化アミノ酸オキシダーゼを反応させ、非測定対象糖化物の影響を低減する工程。
（３）前記糖化ヘモグロビンとプロテアーゼを反応させ、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端から測定対象糖化物を切り出す工程。
（４）前記測定対象糖化物と糖化アミノ酸オキシダーゼを反応させ、過酸化水素を生成する工程。
（５）ペルオキシダーゼ存在下で、前記過酸化水素と酸化還元系発色試薬を反応させ、発色させる工程。
（６）前記発色から測定試料中の糖化ヘモグロビン量を比色定量する工程。

（多層試験片）
本発明で用いる多層試験片は、複数の高分子基材（以下、層ともいうことがある。）からなり、少なくとも下記（ａ）層と（ｂ）層と（ｃ）層とが、測定試料点着面から（ａ）層／（ｂ）層／（ｃ）層の順に積層されてなる。
（ａ）層：少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
（ｂ）層：水不透過性高分子基材
（ｃ）層：少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材

前記多層試験片の層数は、実施形態に合わせて変化し得るが、３〜８層が好ましく、３〜７層がより好ましく、３〜６層がさらに好ましい。なお、層数には、本発明に必要な試薬（界面活性剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬等）が担持された高分子基材（以下、試薬担持用高分子基材ということがある。）に加え、血液を展開するための展開層や水不透過性高分子基材、透明支持層なども含む。層数が１層だと、プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼ、およびペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬等を同一層に担持せざるを得なくなり、プロテアーゼによる糖化アミノ酸オキシダーゼの失活・分解や、酸化還元系発色試薬の自己発色が生じる恐れがある。つまり、多層試験片の保存安定性が著しく低下する恐れがある。また、層数が２層だと、水不透過性高分子基材を配することができず、糖化アミノ酸オキシダーゼ反応時間の制御が困難となり、非測定対象糖化物の影響を受け、擬高値となる恐れがある。一方、層数が８層より多いと、最上層から最下層まで展開するのに必要な測定試料量が多くなるため、好ましくない。

前記多層試験片は、任意の手順を用いて作製することができる。典型的には、複数の層を別個に、一種以上の試薬溶液に浸漬し、乾燥する慣用の手順を用いることにより作製し、次いで最終的な試験片に組み立てることができる。

（層構成）
前記多層試験片の層構成は、糖化アミノ酸オキシダーゼがプロテアーゼより測定試料点着面に近い層（以下、上層ともいうことがある。）に担持されることが必要である。糖化アミノ酸オキシダーゼがプロテアーゼよりも測定試料点着面から遠い層（以下、下層ともいうことがある。）に担持されると、糖化アミノ酸オキシダーゼ反応時間の制御が困難となり、非測定対象糖化物の影響を受け、擬高値となる恐れがある。

また、前記多層試験片の層構成は、プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼがそれぞれ異なる層に担持されることが必要であり、さらにペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬がそれぞれ異なる層に担持されることが好ましい。プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼが同一層に担持されるとプロテアーゼによる糖化アミノ酸オキシダーゼの失活・分解が生じる恐れがあり、ペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬が同一層に担持されると酸化還元系発色試薬の自己発色が生じる恐れがある。つまり、多層試験片の保存安定性が著しく低下する恐れがある。

さらに、糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された層と、プロテアーゼが担持された層との間には、水不透過性高分子基材を配する必要がある。水不透過性層を配さないと、糖化アミノ酸オキシダーゼ反応時間の制御が困難となり、非測定対象糖化物の影響を受け、擬高値となる恐れがある。
以下に層構成の具体例を示すが、本発明を何ら限定するものではない。

前記多層試験片は、１層目の側が測定試料点着面、２層目が水不透過性高分子基材、３層目の側が反射光測定面とすると、糖化アミノ酸オキシダーゼがプロテアーゼよりも上層に担持された以下の構成が挙げられる。
１．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、２層目：水不透過性高分子基材、３層目：プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬』
２．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、２層目：水不透過性高分子基材、３層目：プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ』
３．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：水不透過性高分子基材、３層目：プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬』
４．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、２層目：水不透過性高分子基材、３層目：プロテアーゼ』

これらの中でも、さらにペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬がそれぞれ異なる層に担持されている以下の構成が好ましい。
１．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、２層目：水不透過性高分子基材、３層目：プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬』
２．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、２層目：水不透過性高分子基材、３層目：プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ』

さらに酸化還元系発色試薬が反射光測定面（３層目）に担持されており、高感度な測定が期待できる以下の構成がより好ましい。
１．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、２層目：水不透過性高分子基材、３層目：プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬』

前記の各層（１層目、２層目、３層目）の少なくとも一層に、さらに界面活性剤が担持されるのが好ましい。加えて、各層には緩衝剤を必要に応じて担持させることができる。

（試薬担持用高分子基材）
本発明の多層試験片を構成する試薬担持用高分子基材としては、前記試薬（界面活性剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬等）を必要量担持でき、かつ測定試料を水平方向および垂直方向に適切に展開できれば、いかなる形態、組成のものを用いてもよい。以下に高分子基材の形態、組成の具体例を示すが、本発明を何ら限定するものではない。

（形態）
前記試薬担持用高分子基材の形態としては、ろ紙、繊維構造体、多孔質膜（メンブレンフィルター）、フィルム等が挙げられる。

（組成）
前記試薬担持用高分子基材の組成としては、ポリエステル樹脂であるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、ポリブチレンナフタレート（ＰＢＮ）等、オレフィン樹脂であるポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリブテン等、ビニル樹脂であるポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル等、アクリル樹脂、アクリレート樹脂、フッ素樹脂であるポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）等、ポリカーボネート樹脂、ポリエーテル樹脂であるポリオキシメチレン（ＰＯＭ）、ポリフェニレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリエーテルケトン（ＰＥＫ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリフェニレンスルフィド（ＰＰＳ）、ポリスルホン（ＰＳＵ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）等、ポリアミド樹脂であるナイロン、アラミド等、セルロース類であるセルロースアセテート、ニトロセルロース、再生セルロース等が挙げられる。

前記試薬担持用高分子基材の形状は、特に限定されないが、例えば正方形、長方形、円形、楕円形等の薄板状が挙げられる。
前記試薬担持用高分子基材の面積は、装置の小型・軽量・低価格化の観点から小さければ小さいほどよいが、例えば１〜１０００ｍｍ^２が好ましく、２〜５００ｍｍ^２がより好ましく、５〜２００ｍｍ^２がさらに好ましい。
前記試薬担持用高分子基材の（１層の）厚みは、測定試料の展開性、および酵素（プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ）反応性の観点から、例えば１０〜２０００μｍが好ましく、２０〜１０００μｍがより好ましく、５０〜５００μｍがさらに好ましい。

（水不透過性高分子基材）
本発明の多層試験片を構成する水不透過性高分子基材としては、多層試験片の上面に点着させた測定試料の下層への展開を実質的に遮断する高分子基材であれば、いかなる形態、組成のものを用いてもよい。以下に水不透過性高分子基材の形態、組成の具体例を示すが、本発明を何ら限定するものではない。

（形態）
前記水不透過性高分子基材の形態としては、ろ紙、繊維構造体、多孔質膜（メンブレンフィルター）、フィルム等が挙げられる。これらの中でも、ろ紙、繊維構造体、多孔質膜（メンブレンフィルター）は通常 水を透過するため、フィルムが好ましい。

（組成）
前記水不透過性高分子基材の組成としては、ポリエステル樹脂であるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、ポリブチレンナフタレート（ＰＢＮ）等、オレフィン樹脂であるポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリブテン等、ビニル樹脂であるポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル等、アクリル樹脂、アクリレート樹脂、フッ素樹脂であるポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）等、ポリカーボネート樹脂、ポリエーテル樹脂であるポリオキシメチレン（ＰＯＭ）、ポリフェニレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリエーテルケトン（ＰＥＫ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリフェニレンスルフィド（ＰＰＳ）、ポリスルホン（ＰＳＵ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）等、ポリアミド樹脂であるナイロン、アラミド等、セルロース類であるセルロースアセテート、ニトロセルロース、再生セルロース等が挙げられる。これらの中でも、入手の容易性、価格の観点から、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）が好ましい。

前記水不透過性高分子基材の形状は、特に限定されないが、例えば正方形、長方形、円形、楕円形等の薄板状が挙げられる。
前記水不透過性高分子基材の面積は、取り除き易さの観点から、前記試薬担持用高分子基材よりも大きいこと好ましい。
前記水不透過性高分子基材の厚みは、ハンドリング性の観点から、例えば１０〜２０００μｍが好ましく、２０〜１０００μｍがより好ましく、５０〜５００μｍがさらに好ましい。

（その他の高分子基材）
本発明の多層試験片を構成する試薬担持用高分子基材または水不透過性高分子基材のいずれにも該当しない層としては、血液を展開するための展開層として用いたり、透明支持層として用いる等、その目的を満たすものであれば何ら限定されず、いかなる形態、組成のものを用いてもよい。

（測定方法）
本発明の多層試験片を用いて、下記工程（１）から工程（４）を経ることで、糖化ヘモグロビン量を比色定量することができる。
工程（１）：前記多層試験片の上面に測定試料を点着させる工程
工程（２）：水不透過性高分子基材を取り除く工程
工程（３）：前記多層試験片の測定試料点着面とは反対面から、反射光を用いて反射率および／または吸光度を測定する工程
工程（４）：得られた反射率および／または吸光度からヘモグロビン量、糖化ヘモグロビン量、糖化ヘモグロビン量のヘモグロビン量に対する割合からなる群より選ばれた１つ以上を算出する工程

工程（１）において、「上面」の語における「上」は、液体が流れる方向を基準に上流の位置にあることを示すが、その向きは重力方向に一致することを必ずしも意味しない。例えば毛細管現象などを利用した場合、重力方向と反対向きや異なる向きが基準になりうる。
工程（１）における点着方法は特に限定されず、例えば、ピペッティングによる滴下や、キャピラリーなどを利用したスポッティング等が挙げられる。

工程（２）の水不透過性高分子基材を取り除く方法としては、水不透過性高分子基材により、下層への展開が実質的に遮断されていた測定試料が、再び下層へ展開するようになる方法であれば、いかなる方法を用いてもよく、例えば水不透過性高分子基材を多層試験片から引き抜く、裂く、溶解する等が挙げられる。

前記、工程（２）と工程（３）との間に下記工程（５）を経ることが、好ましい。
工程（５）：測定試料点着面に水溶液を滴下する工程
工程（５）を経ないと、水不透過性高分子基材によって上層に滞留していた測定試料が、水不透過性高分子基材を取り除いても、下層へ展開しない恐れがある。

（検出）
工程（３）における反応の検出には、発色した多層試験片に対して光（入射光）をあて、その反射光を検出することが最も簡便であるが、これ以外の方法を用いても良い。光源としては、特に限定されないが、例えばＵＶランプ、キセノンランプ、クリプトンランプ、水銀ランプ、重水素ランプ、タングステンランプ、ハロゲンランプ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、レーザー等が挙げられる。これらの中でも、光波長の制御の容易さ、および装置の小型・軽量・低価格化の観点から、発光ダイオード（ＬＥＤ）が好ましい。前記入射光の角度（入射角）は、特に限定されず、任意の角度を用いることができる。一方、反射光の検出は、特に限定されないが、検出面に対して垂直が好ましい。なお、検出には、フォトダイオードや積分球等を用いれば簡便に行う事ができる。

工程（４）における「ヘモグロビン量」、「糖化ヘモグロビン量」または「糖化ヘモグロビン量のヘモグロビン量に対する割合」の算出方法は特に限定されない。

（プロテアーゼ）
本発明に用いるプロテアーゼとしては、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端に作用して測定対象糖化物を切り出すものであれば、いかなる種類のプロテアーゼを用いてもよく、例えば動物、植物、微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。以下にプロテアーゼの具体例を示すが、本発明を何ら限定するものではない。

（動物由来プロテアーゼ）
動物由来のプロテアーゼとしては、ファクターＸａ（ｆａｃｔｏｒＸａ）、プラスミン（ｐｌａｓｍｉｎ）、スロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、ペプシン（ｐｅｐｓｉｎ）、ロイシンアミノペプチダーゼ（ｌｅｕｃｉｎａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、パンクレアチン（ｐａｎｃｒｅａｔｉｎ）、エラスターゼ（ｅｌａｓｔａｓｅ）、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）、キモトリプシンＡ（ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎＡ）、アミノペプチダーゼＭ（ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＭ）、カルボキシペプチダーゼＡ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅＡ）、カルボキシペプチダーゼＢ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅＢ）、カルパイン（ｃａｌｐａｉｎ）、カテプシンＢ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎＢ）、カテプシンＣ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎＣ）、カテプシンＤ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎＤ）、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＡｒｇ−Ｃ）等が挙げられる。

（植物由来プロテアーゼ）
植物由来のプロテアーゼとしては、カルボキシペプチダーゼＷ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅＷ）、カリクレイン（ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ）、フィシン（ｆｉｃｉｎ）、パパイン（ｐａｐａｉｎ）、キモパパイン（ｃｈｉｍｏｐａｐａｉｎ）、ブロメライン（ｂｒｏｍｅｌａｉｎ）等が挙げられる。

（微生物由来プロテアーゼ）
微生物由来のプロテアーゼとしては、ズブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、サーモリシン（ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）、ディスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）、プロテイナーゼＮ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＮ）等に代表されるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、ＩＰ酵素等に代表されるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、プロナーゼ（ｐｒｏｎａｓｅ）等に代表されるストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼ、プロテイナーゼＫ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ）等に代表されるトリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）由来プロテアーゼ、ペプチダーゼＲ（ｐｅｐｔｉｄａｓｅＲ）等に代表されるリゾバス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）由来プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼＰ、（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅＰ）、ＰＤ酵素等に代表されるペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＧｌｕ−Ｃ）等に代表されるスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）由来プロテアーゼ、クロストリパイン（ｃｌｏｓｔｒｉｐａｉｎ）等に代表されるクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＬｙｓ−Ｃ）等に代表されるリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）由来プロテアーゼ、メタロエンドペプチダーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｅｎｄｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ）等に代表されるグリフォラ（Ｇｒｉｆｏｌａ）由来プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼＹ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅＹ）、プロテイナーゼＡ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＡ）等に代表される酵母（Ｙｅａｓｔ）由来プロテアーゼ、アミノペプチダーゼＴ（ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＴ）等に代表されるサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＡｓｐ−Ｎ）等に代表されるシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓ）由来プロテアーゼ、リジルエンドペプチダーゼ（ｌｙｓｙｌｅｎｄｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ）、アクロモペプチダーゼ（ａｃｈｒｏｍｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ）等に代表されるアクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）由来プロテアーゼ等が挙げられる

これらの中でも、安定性、反応性（ヘモグロビンの切断速度）、入手の容易性、価格等の理由から、微生物由来のプロテアーゼが好ましく、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼ、およびトリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）由来プロテアーゼからなる群より選ばれた１種以上であることがより好ましい。市販品としては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼのトヨチームＮＥＰ（東洋紡績社製）、Ｔｙｐｅ−Ｘ（シグマ社製）、Ｔｙｐｅ−ＸＸＩＶ（シグマ社製）、サーモリシン（大和化成社製）、サモアーゼＰＣ１０（大和化成社製）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼのＴｙｐｅ−ＸＩＩＩ（シグマ社製）、Ｔｙｐｅ−ＸＸＩＩＩ（シグマ社製）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼのＴｙｐｅ−ＸＩＶ、トリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）由来プロテアーゼのプロテイナーゼＫ（ロシュ社製）等が好適に用いられる。

これらの中でも、ヘモグロビンＡ１ｃ測定の観点から、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼのトヨチームＮＥＰ（東洋紡績社製）、Ｔｙｐｅ−Ｘ（シグマ社製）、Ｔｙｐｅ−ＸＸＩＶ（シグマ社製）、サーモリシン（大和化成社製）、サモアーゼＰＣ１０（大和化成社製）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼのＴｙｐｅ−ＸＩＶがより好適に用いられる。

前記プロテアーゼの濃度は、特に限定されないが、０．１〜１００００Ｕ／ｃｍ^２であることが好ましく、１〜１０００Ｕ／ｃｍ^２がより好ましい。プロテアーゼ濃度が０．１Ｕ／ｃｍ^２より少ないと、反応性の低下により測定時間が長くなるため好ましくない。一方、プロテアーゼ濃度が１００００Ｕ／ｃｍ^２より多いと、バッククラウンドの上昇や、高価格化の恐れがある。

前記プロテアーゼの反応を行う際のｐＨは、無調整でもよいが、使用するプロテアーゼの至適ｐＨとなるよう適当なｐＨ調整剤、例えば下記の緩衝剤によって調整するのが好ましい。

（糖化アミノ酸オキシダーゼ）
本発明に用いる糖化アミノ酸オキシダーゼ（以下、ＦＡＯＤともいうことがある。）としては、測定対象糖化物または非測定対象糖化物に特異的に作用し、過酸化水素を生成する酵素であれば、いかなる種類の酵素を用いてもよい。以下に糖化アミノ酸オキシダーゼの具体例を示すが、本発明を何ら限定するものではない。

糖化アミノ酸オキシダーゼとしては、ギベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）由来酵素、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来酵素、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）由来酵素、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）由来酵素、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来酵素、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）由来酵素、ユウペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）由来酵素、アカエトミエラ（Ａｃｈａｅｔｏｍｉｅｌｌａ）由来酵素、カエトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）由来酵素、大腸菌由来酵素、酵母属デバリオマイゼス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）由来酵素、カーブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）由来酵素、ネオコスモスポラ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ）由来酵素、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来酵素、ファエオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）由来酵素、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）由来酵素、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）由来酵素等が挙げられる。

これらの中でも、安定性、反応性（測定対象糖化物または非測定対象糖化物の酸化速度）、入手の容易性、価格等の理由から、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）由来酵素、ユウペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）由来酵素、カーブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）由来酵素、ネオコスモスポラ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ）由来酵素、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来酵素、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来酵素、ファエオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）由来酵素からなる群より選ばれた１種以上であることが好ましく、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）由来酵素、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来酵素、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来酵素、ファエオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）由来酵素からなる群より選ばれた１種以上であることがより好ましい。

これらの中でも、ヘモグロビンＡ１ｃ測定の観点から、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）由来酵素、ファエオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）由来酵素からなる群より選ばれた１種以上であることがさらに好ましい。

前記糖化アミノ酸オキシダーゼの濃度は、特に限定されないが、０．０１〜１０００Ｕ／ｃｍ^２であることが好ましく、０．１〜１００Ｕ／ｃｍ^２がより好ましい。糖化アミノ酸オキシダーゼ濃度が０．０１Ｕ／ｃｍ^２より少ないと、反応性の低下により測定時間が長くなるため好ましくない。一方、糖化アミノ酸オキシダーゼ濃度が１０００Ｕ／ｃｍ^２より多いと、バッククラウンドの上昇や、高価格化の恐れがある。

前記糖化アミノ酸オキシダーゼの反応を行う際のｐＨは、無調整でもよいが、使用する糖化アミノ酸オキシダーゼの至適ｐＨとなるよう適当なｐＨ調整剤、例えば下記の緩衝剤によって調整するのが好ましい。

（ペルオキシダーゼ）
本発明に用いるペルオキシダーゼとしては、過酸化水素と酸化還元系発色試薬との反応を触媒する酵素であれば、いかなる種類の酵素を用いてもよく、例えば植物由来、細菌由来、担子菌由来のペルオキシダーゼが挙げられる。これらの中でも、純度、入手の容易性、価格等の理由から、西洋ワサビ、イネ、大豆由来のペルオキシダーゼが好ましく、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼがより好ましい。市販品としては、ＰＥＯ−１３１（東洋紡績社製）、ＰＥＯ−３０１（東洋紡績社製）、ＰＥＯ−３０２（東洋紡績社製）等が好適に用いられる。

前記ペルオキシダーゼの濃度は、特に限定されないが、０．０１〜１０００Ｕ／ｃｍ^２であることが好ましく、０．１〜１００Ｕ／ｃｍ^２がより好ましい。ペルオキシダーゼ濃度が０．０１Ｕ／ｃｍ^２より少ないと、反応性の低下により測定時間が長くなるため好ましくない。一方、ペルオキシダーゼ濃度が１０００Ｕ／ｃｍ^２より多いと、バッククラウンドの上昇や、高価格化の恐れがある。

前記ペルオキシダーゼの反応を行う際のｐＨは、無調整でもよいが、使用するペルオキシダーゼの至適ｐＨとなるよう適当なｐＨ調整剤、例えば下記の緩衝剤によって調整するのが好ましい。

（酸化還元系発色試薬）
本発明に用いる酸化還元系発色試薬としては、過酸化水素と反応して呈色するものであれば、いかなる種類の色素を用いてもよく、例えば水素供与体とカップラー、ロイコ体等が挙げられる。なお、水素供与体とカップラーを用いた代表例は、水素供与体とカップラーとをペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素によって酸化縮合させて色素を形成させるトリンダー（Ｔｒｉｎｄｅｒ）法である。
以下に酸化還元系発色試薬の具体例を示すが、本発明を何ら限定するものではない。

（水素供与体）
水素供与体としては、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等が挙げられる。具体的には、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン等が挙げられる。

（カップラー）
カップラーとしては、４−アミノアンチピリン（４ＡＡ）、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等が挙げられる。

（ロイコ体）
ロイコ体としては、トリフェニルメタン誘導体、フェノチアジン誘導体、ジフェニルアミン誘導体等が挙げられる。具体的には、４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）、４，４’−ビス［Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピルアミノ）−２，６−ジメチルフェニル］メタン、１−（エチルアミノチオカルボニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩（ＤＡ６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩（ＤＡ６７）等が挙げられる。

これらの中でも、モル吸光係数、極大吸収波長等の理由から、ロイコ体が好ましく、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩（ＤＡ６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩（ＤＡ６７）がより好ましい。

前記酸化還元系発色試薬の極大吸収波長は、６００〜８００ｎｍであることが好ましく、６５０〜７５０ｎｍがより好ましい。ヘモグロビンＡ１ｃ測定の観点から、極大吸収波長が６００ｎｍより低波長側であると、酸化還元系発色試薬の発色スペクトルとヘモグロビンのスペクトルとが重なるため、感度が低下する恐れがある。一方、極大吸収波長が８００ｎｍより高波長側であると、検出機器が大型化する恐れがある。

前記酸化還元系発色試薬の濃度は、特に限定されないが、０．０００１〜１０ｍｇ／ｃｍ^２であることが好ましく０．００１〜１ｍｇ／ｃｍ^２がより好ましい。酸化還元系発色試薬濃度が０．０００１ｍｇ／ｃｍ^２より少ないと、感度が低下する恐れがある。一方、酸化還元系発色試薬濃度が１０ｍｇ／ｃｍ^２より多いと、バッククラウンドの上昇や、高価格化の恐れがある。

本発明の非測定対象糖化物と糖化アミノ酸オキシダーゼを反応させ、非測定対象糖化物の影響を低減する工程にて発生する過酸化水素は、測定試料中が全血である場合は、全血中のカタラーゼによって酸素と水に分解されるが、必要に応じてカタラーゼを添加してもよい。カタラーゼは試料に添加してもよいし、非測定対象糖化物と糖化アミノ酸オキシダーゼとを反応させる層以下の適当な層に担持させてもよい。

本発明に用いるカタラーゼとしては、非測定対象糖化物を消去する際に生成する過酸化水素を不均化して酸素と水に分解する反応を触媒する酵素であれば、いかなる種類の酵素を用いてもよく、例えば動物由来、微生物由来のカタラーゼが挙げられる。これらの中でも、純度、入手の容易性、価格等の理由から、微生物由来のカタラーゼが好ましい。市販品としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来カタラーゼ Ｃ３５１５（シグマ社製）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来カタラーゼ ０２０７１（シグマ社製）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属由来カタラーゼ ６０６３８（シグマ社製）等が好適に用いられる。

前記カタラーゼの濃度は、特に限定されないが、０．１〜１００００Ｕ／ｃｍ^２であることが好ましく、１〜１０００Ｕ／ｃｍ^２がより好ましい。カタラーゼ濃度が０．１Ｕ／ｃｍ^２より少ないと、非測定対象糖化物を消去する際に生成する過酸化水素を除去できず、見かけ上の測定値が増加してしまう恐れがある。一方、カタラーゼ濃度が１００００Ｕ／ｃｍ^２より多いと、バッククラウンドの上昇や、高価格化の恐れがある。

前記カタラーゼの反応を行う際のｐＨは、無調整でもよいが、使用するカタラーゼの至適ｐＨとなるよう適当なｐＨ調整剤、例えば下記の緩衝剤によって調整するのが好ましい。

前記カタラーゼの反応後、カタラーゼの影響を排除するため、カタラーゼよりも下層にアジ化ナトリウムなどのカタラーゼ阻害剤を担持させてもよい。あるいは、カタラーゼとペルオキシダーゼの基質に対する親和性の違いを利用して、カタラーゼとペルオキシダーゼとの濃度比率を適切に設定することにより、カタラーゼよりも下層にカタラーゼ阻害剤を担持させない構成も可能である。

本発明の多層試験片には、上記のほか、目的に応じて、緩衝液成分、防腐剤、塩類、酵素安定化剤、色原体安定化剤、界面活性剤などを添加してもよい。その使用量や添加の形態などについては特に限定されない。これらはいずれも、市販品などを入手することができる。
界面活性剤、緩衝液成分については後に詳述する。
防腐剤としては、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。
キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等が挙げられる。
抗生物質としては、ゲンタマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール等が挙げられる。
抗菌剤としては、メチルイソチアゾリノン、イミダゾリジニルウレア等が挙げられる。
塩類としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アルミニウム等が挙げられる。
酵素安定化剤としては、シュークロース、トレハロース、シクロデキストリン、グルコン酸塩、アミノ酸類等が挙げられる。
色原体安定化剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等のキレート剤、シクロデキストリン等が挙げられる。

（界面活性剤）
本発明に用いる界面活性剤としては、溶血剤および／またはプロテアーゼ反応促進剤として作用すれば、いかなる種類の界面活性剤を用いてもよいが、溶血剤およびプロテアーゼ反応促進剤として作用する界面活性剤が好ましい。
前記界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキルグルコシド、ショ糖脂肪酸エステル等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。これらの中でも、溶血剤としての反応性（溶血の速度）、プロテアーゼ反応促進剤としての作用性、価格等の理由からポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）系界面活性剤等）が好ましい。市販品としては、ＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）−１００（ナカライテスク社製）、ＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）−１１４（ナカライテスク社製）、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０（ナカライテスク社製）等が好適に用いられる。また、前記界面活性剤は単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。

前記界面活性剤の濃度は、特に限定されないが、０．０００１〜１０ｍｇ／ｃｍ^２であるとこが好ましく０．００１〜１ｍｇ／ｃｍ^２がより好ましい。界面活性剤濃度が０．０００１ｍｇ／ｃｍ^２より少ないと、十分な溶血効果、およびプロテアーゼ反応促進効果が得られない恐れがある。一方、界面活性剤濃度が１０ｍｇ／ｃｍ^２より多くしても、効果の向上は見られない。

（緩衝剤）
本発明に用いることができる緩衝剤としては、目的とするｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、グッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、ビシン）等が挙げられる。

これらの中でも、本発明に用いるプロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、およびペルオキシダーゼの至適ｐＨ範囲である６．０〜８．５（好ましくは６．０〜７．５）において充分な緩衝能力を有する等の理由から、トリス、リン酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳが好ましく、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳがより好ましい。

前記緩衝剤の濃度は、特に限定されないが、多層試験片作製時の試薬に対して５０〜１００ｍＭ程度が好ましい。

（多層試験片を含むプロダクト）
本発明のプロダクトは、上記の多層試験片を含むものであれば、その構成、組成などは特に限定されない。
なお、本明細書において「プロダクト」とは、使用者が糖化ヘモグロビン量を定量する目的で用いる１セットのうち一部または全部を構成する製品であって、本発明の多層試験片を含むものを意味する。

以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。なお、明細書中の評価法は以下の通りである。

＜１．プロテアーゼの活性測定＞
プロテアーゼの活性は、Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試薬を用いたカゼインフォリン法により算出した。ここで、プロテアーゼの至適ｐＨで、３７℃−１分あたり、カゼインを加水分解し、１．０μｍｏｌのチロシンに相当する呈色を生ずる酵素量を１Ｕと定義した。

＜２．糖化アミノ酸オキシダーゼの活性測定＞
糖化アミノ酸オキシダーゼの活性は、ペルオキシダーゼ存在下で、糖化バリルヒスチジンと糖化アミノ酸オキシダーゼとの反応で生成した過酸化水素と酸化還元系発色試薬を反応させ、その吸光度変化から算出した。ここで、糖化アミノ酸オキシダーゼの至適ｐＨ（ｐＨ＝６．５）で、３７℃−1分あたり、糖化バリルヒスチジンを加水分解し、１．０μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義した。

＜３．ペルオキシダーゼの活性測定＞
ペルオキシダーゼの活性は、ペルオキシダーゼ存在下で、過酸化水素とピロガロール（Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ）とを反応させ、生成したプルプロガリン（Ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌｌｉｎ）に由来する吸光度の変化から算出した。ここで、ペルオキシダーゼの至適ｐＨ（ｐＨ＝６．０）で、２０℃−２０秒あたり、１．０ｍｇのプルプロガリン（Ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌｌｉｎ）に相当する呈色を生ずる酵素量を１Ｕと定義した。

［実施例１］
８ｍｍφの桐山ろ紙 ＮＯ．５Ａ（東京硝子器械社製）に、下記試薬１を１０μＬ滴下し、次いで別の８ｍｍφの桐山ろ紙 ＮＯ．５Ａ（東京硝子器械社製）に、下記試薬２を１０μＬ滴下し、それぞれ遮光デシケーター ３９０９−０４（東京硝子器械社製）にて２５℃−２時間乾燥させ、単層試験片を２種作製した。得られた２種の単層試験片を、縦１００ｍｍ、横２００ｍｍに切断した厚さ１８８μｍのポリエステルフィルム（コスモシャインＡ４１００（東洋紡社製）を介して積層することで、多層試験片を作製した。なお、担持された界面活性剤濃度は０．１ｍｇ／ｃｍ^２、プロテアーゼ濃度は５Ｕ／ｃｍ^２、糖化アミノ酸オキシダーゼ濃度は２．５Ｕ／ｃｍ^２、ペルオキシダーゼ濃度は１０Ｕ／ｃｍ^２、酸化還元系発色試薬濃度は０．１ｍｇ／ｃｍ^２である。
＜試薬１＞
１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ（同仁化学研究所社製） ｐＨ６．５
５．０ｍｇ／ｍＬ Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０（ナカライテスク社製）
１２５Ｕ／ｍＬ 糖化アミノ酸オキシダーゼ ＦＰＯ−３０１（東洋紡績社製）
５００Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ ＰＥＯ−３０２（東洋紡績社製）
＜試薬２＞
１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ（同仁化学研究所社製） ｐＨ６．５
５．０ｍｇ／ｍＬ Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０（ナカライテスク社製）
２５０Ｕ／ｍＬ プロテアーゼ Ｔｙｐｅ−ＸＩＶ（シグマ社製）
５．０ｍｇ／ｍＬ ＤＡ６７（和光純薬工業社製）

得られた多層試験片を、治具（図１参照）で上下から挟んで固定し、ＨｂＡ１ｃ測定性能評価用試料 ＱＲＭ ＨｂＡ１ｃ ２００７−１（一般社団法人 検査医学標準物質機構社製）４０μＬを１層目に点着し、プログラム低温恒温器 ＩＮ６０４（ヤマト科学社製）にて３７℃−５分間、１０分間、１５分間インキュベート後、ポリエステルフィルムのみを抜き取り、２５℃−１分間静置後、測定試料点着面とは反対面の反射率を、下記条件１で測定した。
＜条件１＞
測定試料 ： ＨｂＡ１ｃ測定性能評価用試料 ＱＲＭ
ＬＥＶＥＬ１、２、３、４、５
装置名 ： 分光光度計 ＵＶ−２４５０（島津製作所社製）
付属装置名 ： 積分球 ＩＳＲ−２２００（島津製作所社製）
標準白板 ： 硫酸バリウム標準白板
測定波長 ： ４８０ｎｍ、６６６ｎｍ
入射角 ： ０°
スリット幅 ： ２．０ｎｍ
光束寸法 ： ３ｍｍ×５ｍｍ
温度 ： ２５℃

得られた４８０ｎｍでの反射率、および６６６ｎｍでの反射率から、下式（１）のＫｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋ変換により４８０ｎｍでのＫ／Ｓ値、および６６６ｎｍでのＫ／Ｓ値を得た。次いで、得られた４８０ｎｍでのＫ／Ｓ値と、６６６ｎｍでのＫ／Ｓ値から、下式（２）のＫ／Ｓ比を算出した。なお、Ｋ／Ｓ比とヘモグロビンＡ１ｃ値が比例することは公知である。（非特許文献１参照）また、式（１）中の％Ｒは反射率を意味し、式（２）中のＫ／Ｓ値（４８０ｎｍ）は４８０ｎｍでのＫ／Ｓ値を、Ｋ／Ｓ値（６６６ｎｍ）は６６６ｎｍでのＫ／Ｓ値をそれぞれ意味する。

Ｋ／Ｓ値＝（１−％Ｒ）^２／（２×％Ｒ） 式（１）

Ｋ／Ｓ比＝Ｋ／Ｓ値（６６６ｎｍ） ／ Ｋ／Ｓ値（４８０ｎｍ） 式（２）

得られたＫ／Ｓ比と、ＨｂＡ１ｃ測定性能評価用試料 ＱＲＭで規定されているＨｂＡ１ｃ値（ＬＥＶＥＬ１＝４．６７％、ＬＥＶＥＬ２＝５．２９％、ＬＥＶＥＬ３＝６．９６％、ＬＥＶＥＬ４＝９．０８％、ＬＥＶＥＬ５＝１０．７９％）とのピアソン相関係数：ｒを算出し、ｒ＞０．９８を◎（Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、０．９８≦ｒ＜０．９５を○（Ｇｏｏｄ）、０．９５≦ｒ＜０．９０を△（Ｎｏｔ Ｂａｄ）、ｒ≦０．９０ を×（Ｂａｄ）として、相関性を評価した。
得られた評価結果を表１に示す。

他方、健常者血液に、合成したフルクトシルバリルヒスチジン（以下、Ｆ−ＶＨとも呼称する）を、０、１００μＭとなるよう溶解させ、２水準の測定試料を調整した。次いで、本発明の多層試験片を、治具（図１参照）で上下から挟んで固定し、前記測定検体 ４０μＬを１層目に点着し、プログラム低温恒温器 ＩＮ６０４（ヤマト科学社製）にて３７℃−５分間、１０分間、１５分間インキュベート後、ポリエステルフィルムのみを抜き取り、２５℃−１分間静置後、測定試料点着面とは反対面の反射率を、下記条件２で測定した。なお、健常者血液は、市販の自動分析機：日立自動分析機 ７１８０（日立ハイテク社製）、市販のヘモグロビンＡ１ｃ測定試薬：ノルディアＮ ＨｂＡ１ｃ（積水メディカル社製）を用いて、通法に従い測定を実施し、ヘモグロビンＡ１ｃ値を算出した。
＜条件２＞
測定試料 ： 健常者血液 １水準 ＨｂＡ１ｃ値＝５．０％
Ｆ−ＶＨ ０、１００μＭ
装置名 ： 分光光度計 ＵＶ−２４５０（島津製作所社製）
付属装置名 ： 積分球 ＩＳＲ−２２００（島津製作所社製）
標準白板 ： 硫酸バリウム標準白板
測定波長 ： ４８０ｎｍ、６６６ｎｍ
入射角 ： ０°
スリット幅 ： ２．０ｎｍ
光束寸法 ： ３ｍｍ×５ｍｍ
温度 ： ２５℃

得られた４８０ｎｍでの反射率、および６６６ｎｍでの反射率から、上式（１）のＫｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋ変換により４８０ｎｍでのＫ／Ｓ値、および６６６ｎｍでのＫ／Ｓ値を得た。次いで、得られた４８０ｎｍでのＫ／Ｓ値と、６６６ｎｍでのＫ／Ｓ値から、上式（２）のＫ／Ｓ比を算出した。得られたＫ／Ｓ比と、前項で得られた検量線から、ヘモグロビンＡ１ｃ値を算出した。得られたＦ−ＶＨ ０μＭを添加した健常者血液のヘモグロビンＡ１ｃ値のｎ＝１０でのＣＶを算出し、０％≦ＣＶ＜３％を◎（Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、３％≦ＣＶ＜５％を○（Ｇｏｏｄ）、５％≦ＣＶ＜８％を△（Ｎｏｔ Ｂａｄ）、８％≦ＣＶを×（Ｂａｄ）として、ばらつきを評価した。
また、得られたＦ−ＶＨ ０μＭを添加した健常者血液のヘモグロビンＡ１ｃ値（ｎ＝１０の平均値）と、Ｆ−ＶＨ １００μＭを添加した健常者血液のヘモグロビンＡ１ｃ値（ｎ＝１０の平均値）から、下式（３）のＨｂＡ１ｃ値差を算出し、ＨｂＡ１ｃ値差≦０．３を◎（Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、０．３＜ＨｂＡ１ｃ値差≦０．５を○（Ｇｏｏｄ）、０．５＜ＨｂＡ１ｃ値差≦０．８を△（Ｎｏｔ Ｂａｄ）、０．８＜ＨｂＡ１ｃ値差を×（Ｂａｄ）として、測定試料中に存在する可能性のある糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響を評価した。なお、式（３）中のＨｂＡ１ｃ値（０μＭ）はＦ−ＶＨ ０μＭを添加した健常者血液のヘモグロビンＡ１ｃ値を、ＨｂＡ１ｃ値（１００μＭ）はＦ−ＶＨ １００μＭを添加した健常者血液のヘモグロビンＡ１ｃ値をそれぞれ意味する。
［数３］
ＨｂＡ１ｃ値差＝ＨｂＡ１ｃ値（１００μＭ） − ＨｂＡ１ｃ値（０μＭ）…（３）
得られた評価結果を表１に示す。
実施例１の測定方法は、生化学自動分析装置を用いた方法と同等の再現性（ＣＶ＜５％）を有し、かつ測定試料中に存在する可能性のある糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響をほとんど受けない。

［実施例２］
実施例１で得られた多層試験片を、治具（図１参照）で上下から挟んで固定し、ＨｂＡ１ｃ測定性能評価用試料 ＱＲＭ ＨｂＡ１ｃ ２００７−１（一般社団法人 検査医学標準物質機構社製）２０μＬを１層目に点着し、プログラム低温恒温器 ＩＮ６０４（ヤマト科学社製）にて３７℃−５分間、１０分間、１５分間インキュベート後、ポリエステルフィルムのみを抜き取り、さらに蒸留水 ２０μＬを１層目に点着し、２５℃−１分間静置後、測定試料点着面とは反対面の反射率を、上記条件１で測定した。

得られた４８０ｎｍでの反射率、および６６６ｎｍでの反射率から、上式（１）のＫｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋ変換により４８０ｎｍでのＫ／Ｓ値、および６６６ｎｍでのＫ／Ｓ値を得た。次いで、得られた４８０ｎｍでのＫ／Ｓ値と、６６６ｎｍでのＫ／Ｓ値から、上式（２）のＫ／Ｓ比を算出した。

得られたＫ／Ｓ比と、ＨｂＡ１ｃ測定性能評価用試料 ＱＲＭで規定されているＨｂＡ１ｃ値（ＬＥＶＥＬ１＝４．６７％、ＬＥＶＥＬ２＝５．２９％、ＬＥＶＥＬ３＝６．９６％、ＬＥＶＥＬ４＝９．０８％、ＬＥＶＥＬ５＝１０．７９％）とのピアソン相関係数：ｒを算出し、ｒ＞０．９８を◎（Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、０．９８≦ｒ＜０．９５を○（Ｇｏｏｄ）、０．９５≦ｒ＜０．９０を△（Ｎｏｔ Ｂａｄ）、ｒ≦０．９０ を×（Ｂａｄ）として、相関性を評価した。
得られた評価結果を表１に示す。

他方、実施例１で得られた多層試験片を、治具（図１参照）で上下から挟んで固定し、健常者血液に合成したＦ−ＶＨを、０、１００μＭとなるよう溶解させた測定試料 ２０μＬを１層目に点着し、プログラム低温恒温器 ＩＮ６０４（ヤマト科学社製）にて３７℃−５分間、１０分間、１５分間インキュベート後、ポリエステルフィルムのみを抜き取り、さらに蒸留水 ２０μＬを１層目に点着し、２５℃−１分間静置後、測定試料点着面とは反対面の反射率を、上記条件２で測定した。

得られた４８０ｎｍでの反射率、および６６６ｎｍでの反射率から、上式（１）のＫｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋ変換により４８０ｎｍでのＫ／Ｓ値、および６６６ｎｍでのＫ／Ｓ値を得た。次いで、得られた４８０ｎｍでのＫ／Ｓ値と、６６６ｎｍでのＫ／Ｓ値から、上式（２）のＫ／Ｓ比を算出した。得られたＫ／Ｓ比と、前項で得られた検量線から、ヘモグロビンＡ１ｃ値を算出した。得られたＦ−ＶＨ ０μＭを添加した健常者血液のヘモグロビンＡ１ｃ値のｎ＝１０でのＣＶを算出し、０％≦ＣＶ＜３％を◎（Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、３％≦ＣＶ＜５％を○（Ｇｏｏｄ）、５％≦ＣＶ＜８％を△（Ｎｏｔ Ｂａｄ）、８％≦ＣＶを×（Ｂａｄ）として、ばらつきを評価した。
また、得られたＦ−ＶＨ ０μＭを添加した健常者血液のヘモグロビンＡ１ｃ値（ｎ＝１０の平均値）と、Ｆ−ＶＨ １００μＭを添加した健常者血液のヘモグロビンＡ１ｃ値（ｎ＝１０の平均値）から、上式（３）のＨｂＡ１ｃ値差を算出し、ＨｂＡ１ｃ値差≦０．３を◎（Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、０．３＜ＨｂＡ１ｃ値差≦０．５を○（Ｇｏｏｄ）、０．５＜ＨｂＡ１ｃ値差≦０．８を△（Ｎｏｔ Ｂａｄ）、０．８＜ＨｂＡ１ｃ値差を×（Ｂａｄ）として、測定試料中に存在する可能性のある糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響を評価した。
得られた評価結果を表１に示す。
実施例２の測定方法は、生化学自動分析装置を用いた方法と同等の再現性（ＣＶ＜５％）を有し、かつ測定試料中に存在する可能性のある糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響をほとんど受けない。

［比較例１］
８ｍｍφの桐山ろ紙 ＮＯ．５Ａ（東京硝子器械社製）に、上記試薬１を１０μＬ滴下し、次いで別の８ｍｍφの桐山ろ紙 ＮＯ．５Ａ（東京硝子器械社製）に、上記試薬２を１０μＬ滴下し、それぞれ遮光デシケーター ３９０９−０４（東京硝子器械社製）にて２５℃−２時間乾燥させ、単層試験片を２種作製した。得られた２種の単層試験片を積層することで、多層試験片を作製した。

得られた多層試験片を、治具（図１参照）で上下から挟んで固定し、ＨｂＡ１ｃ測定性能評価用試料 ＱＲＭ ＨｂＡ１ｃ ２００７−１（一般社団法人 検査医学標準物質機構社製）２０μＬを１層目に点着し、プログラム低温恒温器 ＩＮ６０４（ヤマト科学社製）にて３７℃−５分間、１０分間、１５分間インキュベート後、測定試料点着面とは反対面の反射率を、上記条件１で測定した。

得られた４８０ｎｍでの反射率、および６６６ｎｍでの反射率から、上式（１）のＫｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋ変換により４８０ｎｍでのＫ／Ｓ値、および６６６ｎｍでのＫ／Ｓ値を得た。次いで、得られた４８０ｎｍでのＫ／Ｓ値と、６６６ｎｍでのＫ／Ｓ値から、上式（２）のＫ／Ｓ比を算出した。

得られたＫ／Ｓ比と、ＨｂＡ１ｃ測定性能評価用試料 ＱＲＭで規定されているＨｂＡ１ｃ値（ＬＥＶＥＬ１＝４．６７％、ＬＥＶＥＬ２＝５．２９％、ＬＥＶＥＬ３＝６．９６％、ＬＥＶＥＬ４＝９．０８％、ＬＥＶＥＬ５＝１０．７９％）とのピアソン相関係数：ｒを算出し、ｒ＞０．９８を◎（Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、０．９８≦ｒ＜０．９５を○（Ｇｏｏｄ）、０．９５≦ｒ＜０．９０を△（Ｎｏｔ Ｂａｄ）、ｒ≦０．９０ を×（Ｂａｄ）として、相関性を評価した。
得られた評価結果を表１に示す。

他方、得られた多層試験片を、治具（図１参照）で上下から挟んで固定し、健常者血液に合成したＦ−ＶＨを、０、１００μＭとなるよう溶解させた測定試料 ２０μＬを１層目に点着し、プログラム低温恒温器 ＩＮ６０４（ヤマト科学社製）にて３７℃−５分間、１０分間、１５分間インキュベート後、測定試料点着面とは反対面の反射率を、上記条件２で測定した。

得られた４８０ｎｍでの反射率、および６６６ｎｍでの反射率から、上式（１）のＫｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋ変換により４８０ｎｍでのＫ／Ｓ値、および６６６ｎｍでのＫ／Ｓ値を得た。次いで、得られた４８０ｎｍでのＫ／Ｓ値と、６６６ｎｍでのＫ／Ｓ値から、上式（２）のＫ／Ｓ比を算出した。得られたＫ／Ｓ比と、前項で得られた検量線から、ヘモグロビンＡ１ｃ値を算出した。得られたＦ−ＶＨ ０μＭを添加した健常者血液のヘモグロビンＡ１ｃ値のｎ＝１０でのＣＶを算出し、０％≦ＣＶ＜３％を◎（Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、３％≦ＣＶ＜５％を○（Ｇｏｏｄ）、５％≦ＣＶ＜８％を△（Ｎｏｔ Ｂａｄ）、８％≦ＣＶを×（Ｂａｄ）として、ばらつきを評価した。
また、得られたＦ−ＶＨ ０μＭを添加した健常者血液のヘモグロビンＡ１ｃ値（ｎ＝１０の平均値）と、Ｆ−ＶＨ １００μＭを添加した健常者血液のヘモグロビンＡ１ｃ値（ｎ＝１０の平均値）から、上式（３）のＨｂＡ１ｃ値差を算出し、ＨｂＡ１ｃ値差≦０．３を◎（Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、０．３＜ＨｂＡ１ｃ値差≦０．５を○（Ｇｏｏｄ）、０．５＜ＨｂＡ１ｃ値差≦０．８を△（Ｎｏｔ Ｂａｄ）、０．８＜ＨｂＡ１ｃ値差を×（Ｂａｄ）として、測定試料中に存在する可能性のある糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響を評価した。
得られた評価結果を表１に示す。
比較例１の測定方法は、生化学自動分析装置を用いた方法と比べ再現性に劣り、かつ測定試料中に存在する可能性のある糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響を受け擬高値を示す。特に、反応時間が短くなるとその傾向が顕著になる。

以上の結果より、本発明の測定方法、および多層試験片を用いて測定したヘモグロビンＡ１ｃ値の再現性は良好であった。さらに、本発明の測定方法、および多層試験片は測定試料中に存在する可能性のある糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響を受けにくく、かつ保存安定性に優れていることから本発明を用いることで、正確、簡便かつ迅速に測定試料中の糖化ヘモグロビン量を比色定量することができる。

本発明により、診断の現場で正確、簡便かつ迅速に測定試料中の糖化ヘモグロビン量を比色定量することができ、さらには測定試料中に存在する可能性のある糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響を受けにくく、かつ保存安定性にも優れることから、予防医学に基づく臨床検査分野、診断医療分野、製薬分野および保健医学分野をはじめ、生命科学分野の産業界に大きく寄与することが期待される。

Claims (9)

1. 少なくとも下記（ａ）層と（ｂ）層と（ｃ）層とが、測定試料点着面から（ａ）層／（ｂ）層／（ｃ）層の順に積層されてなる多層試験片を用い、
   少なくとも下記工程（１）から工程（４）を経て、糖化ヘモグロビン量を比色定量することを特徴とする測定方法。
   （ａ）層：少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
   （ｂ）層：水不透過性高分子基材
   （ｃ）層：少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
   工程（１）：前記多層試験片の上面に測定試料を点着させる工程
   工程（２）：（ｂ）層を取り除く工程
   工程（３）：前記多層試験片の測定試料点着面とは反対面から、反射光を用いて反射率および／または吸光度を測定する工程
   工程（４）：得られた反射率および／または吸光度からヘモグロビン量、糖化ヘモグロビン量、糖化ヘモグロビン量のヘモグロビン量に対する割合からなる群より選ばれた１つ以上を算出する工程
2. さらに、工程（２）と工程（３）との間に下記工程（５）を経ることを特徴とする請求項１に記載の測定方法。
   工程（５）：測定試料点着面に水溶液を滴下する工程
3. さらに、（ａ）層と（ｃ）層との少なくとも一層に、ペルオキシダーゼおよび酸化還元系発色試薬がそれぞれ異なる層に担持された多層試験片を用いることを特徴とする請求項１または２に記載の測定方法。
4. さらに、（ａ）層と（ｃ）層との少なくとも一層に、界面活性剤が担持された多層試験片を用いることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の測定方法。
5. 測定試料が全血検体であることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の測定方法。
6. 少なくとも下記（ａ）層と（ｂ）層と（ｃ）層とが、測定試料点着面から（ａ）層／（ｂ）層／（ｃ）層の順に積層されてなる多層試験片であって、「ヘモグロビン量」、「糖化ヘモグロビン量」および「糖化ヘモグロビン量のヘモグロビン量に対する割合」からなる群より選ばれた１つ以上を算出するための多層試験片。
   （ａ）層：少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
   （ｂ）層：水不透過性高分子基材
   （ｃ）層：少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
7. さらに、（ａ）層と（ｃ）層との少なくとも一層にペルオキシダーゼが担持され、かつ、（ａ）層と（ｃ）層との少なくとも一層に酸化還元系発色試薬が担持された請求項６に記載の多層試験片。
8. さらに、（ａ）層と（ｃ）層との少なくとも一層に、界面活性剤が担持された、請求項６または７に記載の多層試験片。
9. 請求項６から８のいずれかに記載の多層試験片を含むプロダクト。