JP2013074876A - 糖化ヘモグロビン測定用多層試験片、およびそれを用いた測定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片であって、
少なくとも下記(a)層と(b)層とが、測定試料点着面から(a)層/(b)層の順に積層されており、
(a)層および(b)層に、ペルオキシダーゼおよび酸化還元系発色試薬がそれぞれ異なる層に担持されており、
かつ血液分離層を有さないことを特徴とする多層試験片。
(a)層:少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
(b)層:少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
【選択図】なし
Description
特に糖化ヘモグロビンの一種であるヘモグロビンA1cは、糖尿病の診断に際して最も重要であるとされている。
(1)測定試料中の赤血球を溶血させ、糖化ヘモグロビンを取り出す工程。
(2)前記糖化ヘモグロビンとプロテアーゼを反応させ、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖N末端から糖化アミノ酸および/または糖化ペプチドを切り出す工程。
(3)前記糖化アミノ酸および/または糖化ペプチドと糖化アミノ酸オキシダーゼを反応させ、過酸化水素を生成する工程。
(4)ペルオキシダーゼ存在下で、前記過酸化水素と酸化還元系発色試薬を反応させ、発色させる工程。
(5)前記発色から測定試料中の糖化ヘモグロビン量を比色定量する工程。
しかし、かかる従来技術は、測定試料を希釈し、液体状態の試薬を添加し、反応容器内で反応させ、反応液の吸光度を測定する方法であり、生化学自動分析装置を用いた方法が主流であるが、前記生化学自動分析装置は大型かつ高価である、取扱いには熟練した検査技師が必要である、採血から結果報告までの時間が長い といった問題点があり、POCT:point of care testing(すなわち、臨床現場即時検査)への適用は困難であった。
また、ペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬が同一層に担持されると、保存中にペルオキシダーゼによる酸化還元系発色試薬の自己発色が生じ、保存安定性が著しく低下することを見出した。測定試料中の糖化ヘモグロビン濃度は、グルコース濃度等に比べると一般的に低濃度であるため、糖化ヘモグロビンの測定には、高感度であるロイコ型色素を使用するのが好ましいが、ロイコ色素は特に不安定であり、自己発色を生じやすい。
1. 糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片であって、
少なくとも下記(a)層と(b)層とが、測定試料点着面から(a)層/(b)層の順に積層されており、
(a)層および(b)層に、ペルオキシダーゼおよび酸化還元系発色試薬がそれぞれ異なる層に担持されており、
かつ血液分離層を有さないことを特徴とする多層試験片。
(a)層:少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
(b)層:少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
2. さらに、(a)層と(b)層との少なくとも一層に、界面活性剤が担持されることを特徴とする1.の多層試験片。
3. 糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片であって、
少なくとも下記(a)層と(b)層と(c)層とが、測定試料点着面から(a)層/(b)層/(c)層、(a)層/(c)層/(b)層、または(c)層/(a)層/(b)層の順に積層されており、
(a)層と(b)層と(c)層とのいずれかに、ペルオキシダーゼおよび酸化還元系発色試薬がそれぞれ異なる層に担持されており、
かつ血液分離層を有さないことを特徴とする多層試験片。
(a)層:少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
(b)層:少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
(c)層:少なくともプロテアーゼおよび糖化アミノ酸オキシダーゼ以外の任意の試薬が担持された高分子基材
4. さらに、(a)層と(b)層と(c)層との少なくとも一層に、界面活性剤が担持されることを特徴とする3.の多層試験片。
5. プロテアーゼが、少なくともバチルス(Bacillus)由来プロテアーゼ、アスペルギルス(Aspergillus)由来プロテアーゼ、ストレプトマイセス(Streptomyces)由来プロテアーゼ、およびトリチラチウム(Tritirachium)由来プロテアーゼからなる群より選ばれた1種以上であることを特徴とする1.から4.のいずれかの多層試験片。
6. 酸化還元系発色試薬が、極大吸収波長が600〜800nmのロイコ型色素であることを特徴とする1.から5.のいずれかの多層試験片。
7. 界面活性剤が、親水親油バランス値(Hydrophile Lipophile Balance value:HLB値)が10〜20の非イオン性界面活性剤であることを特徴とする1.から6.いずれかの多層試験片。
8. 1.から7.のいずれかの多層試験片を用い、少なくとも下記工程(i)から(iii)を経て、糖化ヘモグロビン量を比色定量する測定方法。
工程(i):前記多層試験片の上面に測定試料を点着させる工程
工程(ii):前記多層試験片の測定試料点着面とは反対面から、反射光を用いて反射率および/または吸光度を測定する工程
工程(iii):得られた反射率および/または吸光度からヘモグロビン量、糖化ヘモグロビン量、糖化ヘモグロビン量のヘモグロビン量に対する割合からなる群より選ばれた1つ以上を算出する工程
9. 測定試料が全血検体であることを特徴とする8.の測定方法。
(測定対象物)
本発明における測定対象物は、糖化ヘモグロビンであり、糖尿病診断への応用の観点から、ヘモグロビンのβ鎖N末端が糖化されたヘモグロビンA1c(以下、HbA1cともいうことがある。)が好ましい。
本発明における測定試料としては、全血、血球、血漿、血清、髄液、汗、尿、涙液、唾液、皮膚、粘膜、毛髪等の生体試料(すなわち生体から採取された試料)や、飲料水、調味料等の食品類が挙げられる。また、生体試料はヒト由来に限らず、イヌ、ネコ、ウシ等の哺乳類動物由来の生体試料も対象である。これら中でも、糖尿病診断への応用の観点から、全血または血球が好ましく、POCTの観点から、前処理として血球/血漿または血清分離を行わない全血がより好ましい。
本発明における糖化ヘモグロビンの測定原理は、酵素反応を測定試料中の水分によって行う(いわゆる、ドライケミストリー)ことで多層試験片を呈色させ、その呈色の程度を反射光測定によって検知する方法(いわゆる、酵素比色法)によって行なわれる。前記測定原理を用いることで、装置の小型・軽量・低価格化が可能となる。また、正確、簡便かつ迅速な測定が可能となる。
以下に赤血球中の糖化ヘモグロビン量を測定する場合の反応について説明するが、本発明を何ら限定するものではない。
(1)測定試料中の赤血球と界面活性剤を反応させ、溶血させ、糖化ヘモグロビンを取り出す工程。
(2)前記糖化ヘモグロビンとプロテアーゼを反応させ、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖N末端から糖化アミノ酸および/または糖化ペプチドを切り出す工程。
(3)前記糖化アミノ酸および/または糖化ペプチドと糖化アミノ酸オキシダーゼを反応させ、過酸化水素を生成する工程。
(4)ペルオキシダーゼ存在下で、前記過酸化水素と酸化還元系発色試薬を反応させ、発色させる工程。
(5)前記発色から測定試料中の糖化ヘモグロビン量を比色定量する工程。
本発明の多層試験片は、複数の高分子基材(以下、層ともいうことがある。)からなる。前記多層試験片の層数は、実施形態に合わせて変化し得るが、2〜7層が好ましく、2〜6層がより好ましく、2〜5層がさらに好ましい。なお、層数には、本発明に必要な試薬(界面活性剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬等)が担持された高分子基材に加え、血液を展開するための展開層や透明支持層なども含む。層数が1層だと、プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼ、およびペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬等を同一層に担持せざるを得なくなり、プロテアーゼによる糖化アミノ酸オキシダーゼの失活・分解や、酸化還元系発色試薬の自己発色が生じる恐れがある。つまり、多層試験片の保存安定性が著しく低下する恐れがある。一方、層数が7層より多いと、最上層から最下層まで展開するのに必要な測定試料量が多くなるため、好ましくない。
前記多層試験片の層構成は、プロテアーゼが糖化アミノ酸オキシダーゼより測定試料点着面に近い層(以下、上層ともいうことがある。)に担持されることが必要である。プロテアーゼが糖化アミノ酸オキシダーゼより測定試料点着面から遠い層(以下、下層ともいうことがある。)に担持されると、プロテアーゼ反応が不十分となり、感度が低下する恐れがある。
1.『1層目:プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、2層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬』
2.『1層目:プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬、2層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ』
3.『1層目:プロテアーゼ、2層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬』
4.『1層目:プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、2層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ』
1.『1層目:プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、2層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬』
2.『1層目:プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬、2層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、
ペルオキシダーゼ』
1.『1層目:プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、2層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬』
1.『1層目:プロテアーゼ、2層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、3層目:ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬』
2.『1層目:プロテアーゼ、2層目:ペルオキシダーゼ、3層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬』
3.『1層目:プロテアーゼ、2層目:酸化還元系発色試薬、3層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ』
4.『1層目:ペルオキシダーゼ、2層目:プロテアーゼ、3層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬』
5.『1層目:酸化還元系発色試薬、2層目:プロテアーゼ、3層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ』
6.『1層目:プロテアーゼ、2層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、3層目:酸化還元系発色試薬』
7.『1層目:プロテアーゼ、2層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、3層目:ペルオキシダーゼ』
8.『1層目:プロテアーゼ、2層目:ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、3層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ』
9.『1層目:ペルオキシダーゼ、2層目:プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬、3層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ』
10.『1層目:酸化還元系発色試薬、2層目:プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、3層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ』
11.『1層目:プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、2層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、3層目:酸化還元系発色試薬』
12.『1層目:プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬、2層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、3層目:ペルオキシダーゼ』
13.『1層目:ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、2層目:プロテアーゼ、3層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ』
14.『1層目:プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、2層目:酸化還元系発色試薬、3層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ』
15.『1層目:プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬、2層目:ペルオキシダーゼ、3層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ』
2.『1層目:プロテアーゼ、2層目:ペルオキシダーゼ、3層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬』
3.『1層目:プロテアーゼ、2層目:酸化還元系発色試薬、3層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ』
4.『1層目:ペルオキシダーゼ、2層目:プロテアーゼ、3層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬』
5.『1層目:酸化還元系発色試薬、2層目:プロテアーゼ、3層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ』
6.『1層目:プロテアーゼ、2層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、3層目:酸化還元系発色試薬』
7.『1層目:プロテアーゼ、2層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、3層目:ペルオキシダーゼ』
9.『1層目:ペルオキシダーゼ、2層目:プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬、3層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ』
10.『1層目:酸化還元系発色試薬、2層目:プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、3層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ』
11.『1層目:プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、2層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、3層目:酸化還元系発色試薬』
12.『1層目:プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬、2層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、3層目:ペルオキシダーゼ』
14.『1層目:プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、2層目:酸化還元系発色試薬、3層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ』
15.『1層目:プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬、2層目:ペルオキシダーゼ、3層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ』
2.『1層目:プロテアーゼ、2層目:ペルオキシダーゼ、3層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬』
4.『1層目:ペルオキシダーゼ、2層目:プロテアーゼ、3層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬』
6.『1層目:プロテアーゼ、2層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、3層目:酸化還元系発色試薬』
11.『1層目:プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、2層目:糖化アミノ酸オキシダーゼ、3層目:酸化還元系発色試薬』
本発明の多層試験片を構成する高分子基材としては、前記試薬(界面活性剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬等)を必要量担持でき、かつ測定試料を水平方向および垂直方向に適切に展開できれば、いかなる形態、組成のものを用いてもよい。以下に高分子基材の形態、組成の具体例を示すが、本発明を何ら限定するものではない。
前記高分子基材の形態としては、ろ紙、繊維構造体、多孔質膜(メンブレンフィルター)、フィルム等の自立可能なものや、高分子ゲル等の自立不可能なものが挙げられる。なお、高分子ゲル等の自立不可能なものを用いる際は、ろ紙、繊維構造体、多孔質膜(メンブレンフィルター)、フィルム等の自立可能なものを支持体として設けるのが好ましい。
前記高分子基材の組成としては、ポリエステル樹脂であるポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリブチレンテレフタレート(PBT)、ポリエチレンナフタレート(PEN)、ポリブチレンナフタレート(PBN)等、オレフィン樹脂であるポリエチレン(PE)、ポリプロピレン(PP)、ポリブテン等、ビニル樹脂であるポリ塩化ビニル(PVC)、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル等、アクリル樹脂、アクリレート樹脂、フッ素樹脂であるポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリビニリデンフルオライド(PVDF)等、ポリカーボネート樹脂、ポリエーテル樹脂であるポリオキシメチレン(POM)、ポリフェニレンオキシド(PPO)、ポリエーテルケトン(PEK)、ポリエーテルエーテルケトン(PEEK)、ポリフェニレンスルフィド(PPS)、ポリスルホン(PSU)、ポリエーテルスルホン(PES)、ポリエーテルイミド(PEI)等、ポリアミド樹脂であるナイロン、アラミド等、セルロース類であるセルロースアセテート、ニトロセルロース、再生セルロース等が挙げられる。
前記高分子基材の面積は、装置の小型・軽量・低価格化の観点から小さければ小さいほどよいが、例えば1〜1000mm2が好ましく、2〜500mm2がより好ましく、5〜200mm2がさらに好ましい。
前記高分子基材の(1層の)厚みは、測定試料の展開性、および酵素(プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ)反応性の観点から、例えば10〜2000μmが好ましく、20〜1000μmがより好ましく、50〜500μmがさらに好ましい。
反応の検出には、発色した多層試験片に対して光(入射光)をあて、その反射光を検出することが最も簡便であるが、これ以外の方法を用いても良い。光源としては、特に限定されないが、例えばUVランプ、キセノンランプ、クリプトンランプ、水銀ランプ、重水素ランプ、タングステンランプ、ハロゲンランプ、発光ダイオード(LED)、レーザー等が挙げられる。これらの中でも、光波長の制御の容易さ、および装置の小型・軽量・低価格化の観点から、発光ダイオード(LED)が好ましい。前記入射光の角度(入射角)は、特に限定されず、任意の角度を用いることができる。一方、反射光の検出は、特に限定されないが、検出面に対して垂直が好ましい。なお、検出には、フォトダイオードや積分球等を用いれば簡便に行う事ができる。
本発明に用いるプロテアーゼとしては、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖N末端に作用して糖化アミノ酸および/または糖化ペプチドを切り出すものであれば、いかなる種類のプロテアーゼを用いてもよく、例えば動物、植物、微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。以下にプロテアーゼの具体例を示すが、本発明を何ら限定するものではない。
動物由来のプロテアーゼとしては、ファクターXa(factorXa)、プラスミン(plasmin)、スロンビン(thrombin)、ペプシン(pepsin)、ロイシンアミノペプチダーゼ(leucinaminopeptidase)、パンクレアチン(pancreatin)、エラスターゼ(elastase)、トリプシン(trypsin)、キモトリプシンA(chymotrypsinA)、アミノペプチダーゼM(aminopeptidaseM)、カルボキシペプチダーゼA(carboxypeptidaseA)、カルボキシペプチダーゼB(carboxypeptidaseB)、カルパイン(calpain)、カテプシンB(cathepsinB)、カテプシンC(cathepsinC)、カテプシンD(cathepsinD)、エンドプロテイナーゼArg−C(endoproteinaseArg−C)等が挙げられる。
植物由来のプロテアーゼとしては、カルボキシペプチダーゼW(carboxypeptidaseW)、カリクレイン(kallikrein)、フィシン(ficin)、パパイン(papain)、キモパパイン(chimopapain)、ブロメライン(bromelain)等が挙げられる。
微生物由来のプロテアーゼとしては、ズブチリシン(subtilisin)、サーモリシン(thermolysin)、ディスパーゼ(dispase)、プロテイナーゼN(proteinaseN)等に代表されるバチルス(Bacillus)由来プロテアーゼ、IP酵素等に代表されるアスペルギルス(Aspergillus)由来プロテアーゼ、プロナーゼ(pronase)等に代表されるストレプトマイセス(Streptomyces)由来プロテアーゼ、プロテイナーゼK(proteinaseK)等に代表されるトリチラチウム(Tritirachium)由来プロテアーゼ、ペプチダーゼR(peptidaseR)等に代表されるリゾバス(Rhizopus)由来プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼP、(carboxypeptidaseP)、PD酵素等に代表されるペニシリウム(Penicillium)由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼGlu−C(endoproteinaseGlu−C)等に代表されるスタフィロコッカス(Staphylococcus)由来プロテアーゼ、クロストリパイン(clostripain)等に代表されるクロストリジウム(Clostridium)由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼLys−C(endoproteinaseLys−C)等に代表されるリソバクター(Lysobacter)由来プロテアーゼ、メタロエンドペプチダーゼ(metalloendopeputidase)等に代表されるグリフォラ(Grifola)由来プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼY(carboxypeptidaseY)、プロテイナーゼA(proteinaseA)等に代表される酵母(Yeast)由来プロテアーゼ、アミノペプチダーゼT(aminopeptidaseT)等に代表されるサーマス(Thermus)由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼAsp−N(endoproteinaseAsp−N)等に代表されるシュードモナス(Pseudomonus)由来プロテアーゼ、リジルエンドペプチダーゼ(lysylendopeputidase)、アクロモペプチダーゼ(achromopeputidase)等に代表されるアクロモバクター(Achromobacter)由来プロテアーゼ等が挙げられる
本発明に用いる糖化アミノ酸オキシダーゼ(以下、FAODともいうことがある。)は、公知文献では「フルクトシルアミンオキシダーゼ」「フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ」「フルクトシルペプチドオキシダーゼ」「フルクトシルアミン酸化酵素」「フルクトシルアミノ酸酸化酵素」「フルクトシルペプチド酸化酵素」「糖化アミンオキシダーゼ」「糖化アミノ酸オキシダーゼ」「糖化ペプチドオキシダーゼ」「糖化アミン酸化酵素」「糖化アミノ酸酸化酵素」「糖化ペプチド酸化酵素」「アマドリアーゼ」「ケトアミンオキシダーゼ」「ケトアミン酸化酵素」等、種々の名称で呼ばれている。
本発明に用いるペルオキシダーゼとしては、過酸化水素と酸化還元系発色試薬との反応を触媒する酵素であれば、いかなる種類の酵素を用いてもよく、例えば植物由来、細菌由来、担子菌由来のペルオキシダーゼが挙げられる。これらの中でも、純度、入手の容易性、価格等の理由から、西洋ワサビ、イネ、大豆由来のペルオキシダーゼが好ましく、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼがより好ましい。市販品としては、PEO−131(東洋紡績社製)、PEO−301(東洋紡績社製)、PEO−302(東洋紡績社製)等が好適に用いられる。
本発明に用いる酸化還元系発色試薬としては、過酸化水素と反応して呈色するものであれば、いかなる種類の色素を用いてもよく、例えば水素供与体とカップラー、ロイコ体等が挙げられる。なお、水素供与体とカップラーを用いた代表例は、水素供与体とカップラーとをペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素によって酸化縮合させて色素を形成させるトリンダー(Trinder)法である。
以下に酸化還元系発色試薬の具体例を示すが、本発明を何ら限定するものではない。
水素供与体としては、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等が挙げられる。具体的には、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)アニリン(ALPS)、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3−メチルアニリン(TOPS)、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリン(ADPS)、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3,5−ジメチルアニリン、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)アニリン(ALOS)、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリン(TOOS)、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメチルアニリン(MAOS)、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン(DAOS)、N−エチル−N−(3−メチルフェニル)−N’−アセチルエチレンジアミン、N−エチル−N−(3−メチルフェニル)−N’−サクシニルエチレンジアミン、N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−2,5−ジメチルアニリン、N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン(HDAOS)、N−スルホプロピルアニリン、N−スルホプロピル−3,5−ジメトキシアニリン等が挙げられる。
カップラーとしては、4−アミノアンチピリン(4AA)、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン(MBTH)、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン(SMBTH)等が挙げられる。
ロイコ体としては、トリフェニルメタン誘導体、フェノチアジン誘導体、ジフェニルアミン誘導体等が挙げられる。具体的には、4,4’−ベンジリデンビス(N,N−ジメチルアニリン)、4,4’−ビス[N−エチル−N−(3−スルホプロピルアミノ)−2,6−ジメチルフェニル]メタン、1−(エチルアミノチオカルボニル)−2−(3,5−ジメトキシ−4−ヒドロキシフェニル)−4,5−ビス(4−ジエチルアミノフェニル)イミダゾール、4,4’−ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミン、N−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−4,4’−ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミン塩(DA64)、10−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジン塩(DA67)等が挙げられる。
本発明に用いる界面活性剤としては、溶血剤および/またはプロテアーゼ反応促進剤として作用すれば、いかなる種類の界面活性剤を用いてもよいが、溶血剤およびプロテアーゼ反応促進剤として作用する界面活性剤が好ましい。
前記界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル(Triton(登録商標)系界面活性剤等)、ポリオキシエチレンアルキルエーテル(Brij(登録商標)系界面活性剤等)、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(Tween(登録商標)系界面活性剤等)、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキルグルコシド、ショ糖脂肪酸エステル等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。これらの中でも、溶血剤としての反応性(溶血の速度)、プロテアーゼ反応促進剤としての作用性、価格等の理由からポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル(Triton(登録商標)系界面活性剤等)が好ましい。市販品としては、TritonX(登録商標)−100(ナカライテスク社製)、TritonX(登録商標)−114(ナカライテスク社製)、Nonidet(登録商標)P−40(ナカライテスク社製)等が好適に用いられる。また、前記界面活性剤は単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
本発明に用いることができる緩衝剤としては、目的とするpH範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、グッドバッファー(MES、ADA、PIPES、ACES、コラミン塩酸、BES、TES、HEPES、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、ビシン)等が挙げられる。
本発明では前記試薬(界面活性剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬等)の他、必要に応じてヘモグロビンの酸化剤(フェロシアン化物、アジ化物、亜硝酸塩、硝酸塩等)、酵素反応を妨害するイオンを捕捉するキレート試薬(エチレンジアミン、ビピリジン、エチレンジアミン四酢酸、フェナントロリン、ポルフィリン、クラウンエーテル等)、過酸化水素の定量の妨害物質であるアスコルビン酸を消去するアスコルビン酸オキシダーゼ、塩類(塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化アルミニウム等)、酵素安定化剤(単糖類、オリゴ糖類、多糖類、糖アルコール、グリセロール、グルコン酸塩、アミノ酸類、アルブミン類、グロブリン類、繊維性タンパク質等)、酸化還元系発色試薬安定化剤(シクロデキストリン類、還元性チオアルコール類、還元性硫酸塩類等)を添加してもよい。これらは、単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
[各種評価法]
プロテアーゼの活性は、Folin−Ciocalteu試薬を用いたカゼインフォリン法により算出した。ここで、プロテアーゼの至適pHで、37℃−1分あたり、カゼインを加水分解し、1.0μmolのチロシンに相当する呈色を生ずる酵素量を1Uと定義した。
糖化アミノ酸オキシダーゼの活性は、ペルオキシダーゼ存在下で、糖化バリルヒスチジンと糖化アミノ酸オキシダーゼとの反応で生成した過酸化水素と酸化還元系発色試薬を反応させ、その吸光度変化から算出した。ここで、糖化アミノ酸オキシダーゼの至適pH(pH=6.5)で、37℃−1分あたり、糖化バリルヒスチジンを加水分解し、1.0μmolの過酸化水素を生成する酵素量を1Uと定義した。
ペルオキシダーゼの活性は、ペルオキシダーゼ存在下で、過酸化水素とピロガロール(Pyrogallol)とを反応させ、生成したプルプロガリン(Purpurogallin)に由来する吸光度の変化から算出した。ここで、ペルオキシダーゼの至適pH(pH=6.0)で、20℃−20秒あたり、1.0mgのプルプロガリン(Purpurogallin)に相当する呈色を生ずる酵素量を1Uと定義した。
HLB値は、グリフィン法を用い、HLB値=20×(親水部の式量の総和/分子量)で算出した。なお、界面活性剤の混合物のHLB値は、各成分のHLB値の加重平均で表す。
8mmφの桐山ろ紙 NO.5A(東京硝子器械社製)に、下記試薬1を10μL滴下し、遮光デシケーター 3909−04(東京硝子器械社製)にて25℃−2時間乾燥させ、ブランク試験片を作製した。
<試薬1>
100mM PIPES(同仁化学研究所社製) pH6.5
500U/mL 糖化アミノ酸オキシダーゼ FPO−301(東洋紡績社製)
<試薬2>
100mM PIPES(同仁化学研究所社製) pH6.5
100倍希釈 プロテアーゼ阻害剤カクテル 一般用、100倍濃縮(ナカライテスク社製)
<条件1>
プレキャストゲル : レディーゲルJ 10%T、12well
電気泳動システム : ミニプロティアンTetraセル
パワーサプライ : パワーパックBasic
スタンダード : プレシジョンPlusデュアルスタンダード
泳動バッファー : プレミックスバッファー トリス/グリシン/SDS
スタンダード量 : 10μL
泳動試料量 : 20μL
泳動条件 : 100V定電圧−90分
温度 : 25℃
[数1]
バンド保持率1(%)=(サンプルバンド太さ/ブランクバンド太さ)×100 式(1)
[数2]
バンド保持率2(%)=(サンプルバンド濃さ/ブランクバンド濃さ)×100 式(2)
本発明の多層試験片を、ラミジップ・アルミ AL−9(東京硝子器械社製)に入れ、窒素封入した後、プログラム低温恒温器 IN604(ヤマト科学社製)にて4℃−0、24、48、72、96、120、144、168、336、504時間、または25℃−0、24、48、72、96、120、144、168、336、504時間インキュベートした。次いで、前記多層試験片を治具(図1参照)で上下から挟んで固定し、酸化還元系発色試薬が担持された層側の反射率を、下記条件2で測定した。
<条件2>
装置名 : 分光光度計 UV−2450(島津製作所社製)
付属装置名 : 積分球 ISR−2200(島津製作所社製)
標準白板 : 硫酸バリウム標準白板
測定波長 : 666nm(DA67のλmax)
入射角 : 0°
スリット幅 : 2.0nm
光束寸法 : 3mm×5mm
温度 : 25℃
[数3]
K/S値=(1−%R)2/(2×%R) 式(3)
本発明の多層試験片に、100g/Lのヘモグロビン ヒト H7379(シグマ社製)水溶液 20μLを1層目に点着し、プログラム低温恒温器 IN604(ヤマト科学社製)にて37℃−0、5、10、15、30、60分間インキュベートした。次いで、マイクロチューブ内に前記多層試験片と前記試薬2 1000μLとを添加し、ボルテックスミキサー(エムエス機器社製)で1分間攪拌することで、多層試験片中の界面活性剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬を抽出した。次いで、前記抽出液をマイクロコン−3(ミリポア社製)にて14000Gで遠心濃縮し、分子量3000以下の低分子量成分(界面活性剤、酸化還元系発色試薬等)を除去し、200μLの濃縮液を得た。次いで、前記濃縮液 2.5μLと蒸留水 47.5μLとLaemmliサンプルバッファー(バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製)47.5μLと2−メルカプトエタノール(バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製)2.5μLとを混合し、95℃−5分間ボイルすることで、サンプル溶液1〜6を得た。
[数4]
バンド消失率1(%)
={1−(バンド太さ(0〜60分)/バンド太さ(0分))}×100 式(4)
[数5]
バンド消失率2(%)
={1−(バンド濃さ(0〜60分)/バンド濃さ(0分))}×100 式(5)
100g/Lのヘモグロビン ヒト H7379(シグマ社製)水溶液に、合成したフルクトシルバリルヒスチジン(以下、F−VHともいうことがある。)を、0、50、100、200、500μMとなるよう溶解させ、5水準の測定試料を調整した。
次いで、本発明の多層試験片を、治具(図1参照)で上下から挟んで固定し、前記測定検体 20μLを1層目に点着し、室温−1分間インキュベート後、測定試料点着面とは反対面の反射率を、下記条件3で測定した。
<条件3>
測定試料 : ヘモグロビン ヒト H7379 100g/L
F−VH 0、50、100、200、500μM
装置名 : 分光光度計 UV−2450(島津製作所社製)
付属装置名 : 積分球 ISR−2200(島津製作所社製)
標準白板 : 硫酸バリウム標準白板
測定波長 : 666nm(DA67)、727nm(DA64)、555nm(TOOS)、630nm(MAOS)
入射角 : 0°
スリット幅 : 2.0nm
光束寸法 : 3mm×5mm
温度 : 25℃
[数6]
K/S変動率=K/S値(500μM) / K/S値(0μM) 式(6)
本発明の多層試験片を、治具(図1参照)で上下から挟んで固定し、HbA1c測定性能評価用試料 QRM HbA1c 2007−1(一般社団法人 検査医学標準物質機構社製)20μLを1層目に点着し、プログラム低温恒温器 IN604(ヤマト科学社製)にて37℃−15分間インキュベート後、測定試料点着面とは反対面の反射率を、下記条件4で測定した。
<条件4>
測定試料 : HbA1c測定性能評価用試料 QRM
LEVEL1、2、3、4、5
装置名 : 分光光度計 UV−2450(島津製作所社製)
付属装置名 : 積分球 ISR−2200(島津製作所社製)
標準白板 : 硫酸バリウム標準白板
測定波長 : 480nm、666nm
入射角 : 0°
スリット幅 : 2.0nm
光束寸法 : 3mm×5mm
温度 : 25℃
[数7]
K/S比=K/S値(666nm) / K/S値(480nm) 式(7)
本発明の多層試験片を、治具(図1参照)で上下から挟んで固定し、健常者全血、または糖尿病患者全血 20μLを1層目に点着し、プログラム低温恒温器 IN604(ヤマト科学社製)にて37℃−15分間インキュベート後、測定試料点着面とは反対面の反射率を、下記条件5で測定した。なお、健常者血液、および糖尿病患者血液は、市販の自動分析機:日立自動分析機 7180(日立ハイテク社製)、市販のヘモグロビンA1c測定試薬:ノルディアN HbA1c(積水メディカル社製)を用いて、通法に従い測定を実施し、ヘモグロビンA1c値を算出した。
<条件5>
測定試料 : 健常者血液 5水準、糖尿病患者血液 5水準
装置名 : 分光光度計 UV−2450(島津製作所社製)
付属装置名 : 積分球 ISR−2200(島津製作所社製)
標準白板 : 硫酸バリウム標準白板
測定波長 : 480nm、666nm
入射角 : 0°
スリット幅 : 2.0nm
光束寸法 : 3mm×5mm
温度 : 25℃
[試験片の作成]
[実施例1]
得られた多層試験片の詳細を表1に示す。なお、表中のNP40はNonidet(登録商標)P−40が、XIVはプロテアーゼ Type−XIVが、FPOは糖化アミノ酸オキシダーゼ FPO−301が、PEOはペルオキシダーゼ PEO−302が、DA67はDA67がそれぞれ各層に担持されていること意味する。以下、同様である。
<試薬3>
100mM PIPES(同仁化学研究所社製) pH6.5
5.0mg/mL Nonidet(登録商標)P−40(ナカライテスク社製)
500U/mL プロテアーゼ Type−XIV(シグマ社製)
<試薬4>
100mM PIPES(同仁化学研究所社製) pH6.5
5.0mg/mL Nonidet(登録商標)P−40(ナカライテスク社製)
500U/mL 糖化アミノ酸オキシダーゼ FPO−301(東洋紡績社製)
2000U/mL ペルオキシダーゼ PEO−302(東洋紡績社製)
5.0mg/mL DA67(和光純薬工業社製)
[実施例2〜4]
得られた多層試験片の詳細を表1に示す。
[実施例5]
得られた多層試験片の詳細を表2に示す。
<試薬5>
100mM PIPES(同仁化学研究所社製) pH6.5
5.0mg/mL Nonidet(登録商標)P−40(ナカライテスク社製)
500U/mL プロテアーゼ Type−XIV(シグマ社製)
<試薬6>
100mM PIPES(同仁化学研究所社製) pH6.5
5.0mg/mL Nonidet(登録商標)P−40(ナカライテスク社製)
500U/mL 糖化アミノ酸オキシダーゼ FPO−301(東洋紡績社製)
<試薬7>
100mM PIPES(同仁化学研究所社製) pH6.5
5.0mg/mL Nonidet(登録商標)P−40(ナカライテスク社製)
2000U/mL ペルオキシダーゼ PEO−302(東洋紡績社製)
5.0mg/mL DA67(和光純薬工業社製)
[実施例6〜9]
得られた多層試験片の詳細を表2に示す。
[比較例1]
得られた単層試験片の詳細を表3に示す。
<試薬8>
100mM PIPES(同仁化学研究所社製) pH6.5
5.0mg/mL Nonidet(登録商標)P−40(ナカライテスク社製)
500U/mL プロテアーゼ Type−XIV(シグマ社製)
500U/mL 糖化アミノ酸オキシダーゼ FPO−301(東洋紡績社製)
2000U/mL ペルオキシダーゼ PEO−302(東洋紡績社製)
5.0mg/mL DA67(和光純薬工業社製)
[比較例2〜7]
得られた多層試験片の詳細を表4に示す。
[比較例8,9]
得られた多層試験片の詳細を表5に示す。
実施例1〜9、比較例1〜9の多層試験片を用い、糖化アミノ酸オキシダーゼの保存安定性、酸化還元系発色試薬の保存安定性を評価した。
得られた評価結果を表6、7に示す。
また、酸化還元系発色試薬の安定性の評価結果より、ペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬が同一層に担持されると酸化還元系発色試薬の自己発色が生じ、保存安定性は著しく低下した。なお、酸化還元系発色試薬の自己発色により、感度が低下する恐れがある。
以上の結果より、保存安定性に優れた多層試験片の層構成として、プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼがそれぞれ異なる層に担持されることが必要であり、例えば実施例1〜9の多層試験片が挙げられる。さらに、ペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬がそれぞれ異なる層に担持されることが好ましく、例えば実施例2、3、6〜9の多層試験片が挙げられる。
[実施例10〜13]
得られた多層試験片の詳細を表8に示す。なお、表中のNEPはトヨチームNEPが、XはType−Xが、KはプロテイナーゼKが、XIIIはType−XIIIがそれぞれ各層に担持されていること意味する。
[比較例10]
得られた多層試験片の詳細を表8に示す。なお、表中のIはType−Iが各層に担持されていること意味する。
実施例2、10〜13、比較例10の多層試験片を用い、プロテアーゼの反応性を評価した。
得られた評価結果を表9に示す。
[実施例14]
得られた多層試験片の詳細を表10に示す。なお、表中のDA64はDA64が各層に担持されていること意味する。
[比較例11,12]
得られた多層試験片の詳細を表10に示す。なお、表中の4AAは 4−アミノアンチピリンが、TOOSはTOOSが、MAOSはMAOSがそれぞれ各層に担持されていること意味する。
実施例2、14、比較例11、12の多層試験片を用い、酸化還元系発色試薬の感度、相関性を評価した。
得られた評価結果を表11に示す。
[実施例15〜17]
得られた多層試験片の詳細を表12に示す。なお、表中のTX100はTriton(登録商標)X−100が、Tw20はTween(登録商標)20が、Br35はBrij(登録商標)35がそれぞれ各層に担持されていること意味する。
[比較利13,14]
得られた多層試験片の詳細を表12に示す。なお、表中のF50はDKエステル(登録商標)F50(第一工業製薬社製)が、F70はDKエステル(登録商標)F70がそれぞれ各層に担持されていること意味する。
実施例10、15〜17、比較例13、14の多層試験片を用い、プロテアーゼの反応性を評価した。
得られた評価結果を表13に示す。
実施例1〜4の多層試験片を用い、HbA1c値の検量線を作成し、相関性を評価した。
得られた評価結果を表14に示す。
実施例1〜4の多層試験片を用い、前項で得られたHbA1c値の検量線を用い、HbA1c値を算出した。
得られた評価結果を表15に示す。
Claims (9)
- 糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片であって、
少なくとも下記(a)層と(b)層とが、測定試料点着面から(a)層/(b)層の順に積層されており、
(a)層および(b)層に、ペルオキシダーゼおよび酸化還元系発色試薬がそれぞれ異なる層に担持されており、
かつ血液分離層を有さないことを特徴とする多層試験片。
(a)層:少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
(b)層:少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材 - さらに、(a)層と(b)層との少なくとも一層に、界面活性剤が担持されることを特徴とする請求項1に記載の多層試験片。
- 糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片であって、
少なくとも下記(a)層と(b)層と(c)層とが、測定試料点着面から(a)層/(b)層/(c)層、(a)層/(c)層/(b)層、または(c)層/(a)層/(b)層の順に積層されており、
(a)層と(b)層と(c)層とのいずれかに、ペルオキシダーゼおよび酸化還元系発色試薬がそれぞれ異なる層に担持されており、
かつ血液分離層を有さないことを特徴とする多層試験片。
(a)層:少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
(b)層:少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
(c)層:少なくともプロテアーゼおよび糖化アミノ酸オキシダーゼ以外の任意の試薬が担持された高分子基材 - さらに、(a)層と(b)層と(c)層との少なくとも一層に、界面活性剤が担持されることを特徴とする請求項3に記載の多層試験片。
- プロテアーゼが、少なくともバチルス(Bacillus)由来プロテアーゼ、アスペルギルス(Aspergillus)由来プロテアーゼ、ストレプトマイセス(Streptomyces)由来プロテアーゼ、およびトリチラチウム(Tritirachium)由来プロテアーゼからなる群より選ばれた1種以上であることを特徴とする請求項1から4のいずれかに記載の多層試験片。
- 酸化還元系発色試薬が、極大吸収波長が600〜800nmのロイコ型色素であることを特徴とする請求項1から5のいずれかに記載の多層試験片。
- 界面活性剤が、親水親油バランス値(Hydrophile Lipophile Balance value:HLB値)が10〜20の非イオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項1から6のいずれかに記載の多層試験片。
- 請求項1から7のいずれかに記載の多層試験片を用い、少なくとも下記工程(i)から(iii)を経て、糖化ヘモグロビン量を比色定量する測定方法。
工程(i):前記多層試験片の上面に測定試料を点着させる工程
工程(ii):前記多層試験片の測定試料点着面とは反対面から、反射光を用いて反射率および/または吸光度を測定する工程
工程(iii):得られた反射率および/または吸光度からヘモグロビン量、糖化ヘモグロビン量、糖化ヘモグロビン量のヘモグロビン量に対する割合からなる群より選ばれた1つ以上を算出する工程 - 測定試料が全血検体であることを特徴とする請求項8に記載の測定方法。
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