JP2022541839A - 糖化ヘモグロビン測定 - Google Patents

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Abstract

本明細書は、糖化ヘモグロビンを測定するために使用される装置、システム、及び方法を説明する。【選択図】なし

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年６月１７日に出願された米国仮特許出願番号第６３／０４０，１５９号及び２０１９年７月２２日に出願された米国仮特許出願番号第６２／８７７，１８８号の利益を請求し、引用によってその全体の開示を本明細書に取り込む。
（技術分野）
本明細書では、糖化ヘモグロビンを測定するために使用される装置、システム及び方法を説明する。
本明細書では、ヘモグロビン測定、特に糖化ヘモグロビン測定のために使用される装置、システム、及び方法を一般に説明する。一定期間（例えば、３ヶ月）にわたる、個人の平均血糖値を推定することができるため、患者のサンプルにおける糖化ヘモグロビン値を決定することは、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、妊娠糖尿病の診断において重要な要素である。
いくつかの実施形態において、この糖化ヘモグロビンの測定は、全血のものであることができる。全血は、ヒト又は動物の全血であることができる。しかしながら、ヘモグロビン成分が存在する限り、血液の様々な成分についても測定を行うことができる。
一般に、マイクロスライド検査素子、又は単にドライスライド検査素子のようなマイクロスライドを用いて測定を実施することができる。これらのマイクロスライドは、自動分析装置で使用することができる。マイクロスライドはシングルスライドであることができ、それにより、複数のスライドではなく、１滴又は数滴のサンプルとシングルスライドとで全ての分析を完了することができる。いくつかの実施形態において、複数の測定をシングルスライドで行うことができる。
本明細書に記載のマイクロスライドは、架橋ゲルを含む第１のフィルム層であって、架橋ゲルが検出剤、フルクトシルオキシダーゼ、及びペルオキシダーゼを含む第１のフィルム層と、第１のゲルを含む第２のフィルム層と、溶解剤、変性剤及びプロテアーゼを含む第３のフィルム層と、を下から上に向かって含むフィルム層の積層体を含むことができる。いくつかの実施形態において、第１のフィルム層は、ゲル層であり、第２のフィルム層はマスク層であり、第３のフィルム層はスプレッド層である。いくつかの実施形態において、マイクロスライドは、マスク層とスプレッド層との間に接着層又はサブ層を含むことができる。
本明細書に記載のマイクロスライドは、架橋ゲルを含む第１のフィルム層であって、架橋ゲルが、検出剤、フルクトシルオキシダーゼ、干渉防止剤、及びペルオキシダーゼを含む第１のフィルム層と、第１のゲルを含む第２のフィルム層と、溶解剤、変性剤及びプロテアーゼを含む第３のフィルム層と、を下から上に向かって含むフィルム層の積層体を含むことができる。いくつかの実施形態において、第１のフィルム層はゲル層であり、第２のフィルム層はマスキング層であり、第３のフィルム層はスプレッド層である。いくつかの実施形態において、マイクロスライドは、マスキング層とスプレッド層との間に接着層又はサブ層を含むことができる。
本明細書に記載のマイクロスライドは、ゲル層と、マスキング層と、スプレッド層とを下から上に向かって含むフィルム層の積層体を含むことができる。他の実施形態において、本明細書に記載のマイクロスライドは、ゲル層と、マスキング層と、接着層又はサブ層と、スプレッド層とを下から上に向かって含むフィルム層の積層体を含むことができる。いくつかの実施形態において、第１の層、又はゲル層は、ゲルを含む。いくつかの実施形態において、第２のフィルム層、マスキング層は、第２のゲルを含む。いくつかの実施形態において、第３のフィルム層、スプレッド層は、溶解剤、変性剤、及びプロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、接着層又はサブ層が第３の層として含まれ、スプレッド層は第４の層である。
いくつかの実施形態において、ゲルは架橋ゲルであることができる。他の層がマイクロスライドに含まれてもよい。いくつかの実施形態において、架橋ゲルは、検出剤、フルクトシルオキシダーゼ、及びペルオキシダーゼを含む。
第１のフィルム層は、オキシダーゼ補因子と界面活性剤とを更に含むことができる。いくつかの実施形態において、オキシダーゼ補因子は、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）である。フルクトシルオキシダーゼは、Ｆｒｕ－α－ＶａｌＨｉｓペプチド又はＦｒｕ－α－Ｖａｌのような糖化アミノ酸に特異的であり得る。いくつかの実施形態において、干渉防止剤は、アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＡＯ）である。
いくつかの実施形態において、検出剤は、青色ロイコ染料のようなロイコ染料である。検出剤は、Ｎ－カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４’－ビス（ジメチルアミノ）－ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ－６４）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’，Ｎ”Ｎ”－ヘキサ（３－スルホプロピル）－４，４’，４”－トリアミノ－トリフェニルメタン六ナトリウム塩（ＴＰＭ－ＰＳ）、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム（ＤＡ－６７）、及び２－（３，５－ジメトキシ－４－ヒドロキシフェノール）－４，５－ビス（４－ジメチルアミノフェニル）イミダゾールからなる群から選択することができる。
いくつかの実施形態において、ペルオキシダーゼは、ホースラディッシュペルオキシダーゼである。
いくつかの実施形態において、第２のフィルム層は、反射材料部を更に備える。反射材料部は、金属塩を含むことができる。１つの実施形態において、金属は、これに限るものではないが二酸化チタン（ＴｉＯ２）のようなチタンである。
いくつかの実施形態において、第３のフィルム層はカルシウムを更に含む。
いくつかの実施形態において、第３のフィルム層は、ラテックス粒子を含有する多孔質層を含む。いくつかの実施形態において、ラテックス粒子は、ビニルトルエン－ｃｏ－メタクリル酸コポリマー（ＶｔＥ）から形成されることができる。粒子、又は場合によりビーズと呼ばれる粒子は、約２５μｍ未満のメジアン粒径を有することができる。一実施形態において、粒子は、２５μｍのメジアン粒径を有することができる。他の実施形態において、粒子は、約１０μｍ～約４０μｍ、約１５μｍ～約３５μｍ、約２０μｍ～約３０μｍ、約１５μｍ未満、約１０μｍ未満、又は約５μｍ未満のメジアン粒径を有することができる。
いくつかの実施形態では、溶解剤は洗剤である。洗剤は、オクチルフェノールエトキシレート（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００、Union Carbide Corporation、New York）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）（ICI Americas Inc、Delaware）（ＴＷＥＥＮ２０）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ＰＯＥ）、及びＮＯＮＩＤＥＴ（登録商標）（Air Products and Chemicals，Inc，Delaware）Ｐ－４０（ＮＰ－４０）からなる群から選択することができる。一実施形態において、洗剤は、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００である。
いくつかの実施形態では、変性剤は、酸化剤又は界面活性剤である。変性剤は、亜硝酸ナトリウム又はＮ－ラウロイルサルコシン（ＮＬＳ）のうちの１つ以上であることができる。
いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、メタロプロテイナーゼ及び／又は中性プロテアーゼである。プロテアーゼは、エンドプロテアーゼ又はエキソプロテアーゼであることができる。他の実施形態において、プロテアーゼは、プロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ、プロテアーゼXVII、プロテアーゼXXI、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、サーモリシン、バチロリシン、微生物メタロプロテイナーゼ、ペプチダーゼＫ、エンドプロテイナーゼＫ、キモトリプシン、キモトリプシンＣ、グルタミルエンドペプチダーゼ、ペプチジルｌｙｓメタロエンドペプチダーゼ、バチルス（Bacillus）属由来のプロテアーゼ、ロイシルアミノペプチダーゼ、及びサブチリシンからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、第３のフィルム層は、第２のフィルム層の上面に直接接触している。他の実施形態において、第２のフィルム層は、第１のフィルム層の上面に直接接触している。
いくつかの実施形態において、スプレッド層は、マスクキング層の上面に直接接触している。他の実施形態において、スプレッド層は、接着層の上面と直接接触している。
また、本明細書では、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンを検出するためのシングルスライド方法も記載されている。これらの方法は、ａ）本明細書に記載されるスライドを提供するステップ、ｂ）スライドの第３のフィルム層を、赤血球を含む未溶解の血液サンプルと接触させるステップであって、溶解剤が赤血球から糖化ヘモグロビンを放出させ、変性剤が糖化ヘモグロビンと接触して糖化ヘモグロビンを変性させ、プロテアーゼが、変性された糖化ヘモグロビンからフルクトシルペプチドを放出させ、フルクトシルペプチドが第１のフィルム層に到達してフルクトシルオキシダーゼとＦＡＤ補因子と接触して過酸化物を生成し、ペルオキシダーゼ及び過酸化物が検出剤と接触して検出可能なシグナルを放出する、ステップ、ｃ）血液サンプルからヘモグロビンの量を測定するステップであって、ヘモグロビンの量を測定する該ステップは、第１の波長の光におけるスライドからのサンプルの反射率濃度を読み取ることを含む、ステップ、及び、ｄ）血液サンプルからの糖化ヘモグロビンの量を測定するステップであって、糖化ヘモグロビンの量を測定する該ステップは、第２の波長の光における検出剤からの反射率濃度を検出することを含み、第２の波長の光は、第１の波長の光とは異なる、ステップ、を含む。いくつかの実施形態において、検出剤は、酸化染料である。
いくつかの実施形態において、未処理の血液サンプルは、溶解していない血液サンプルであることができる。いくつかの実施形態において、未処理の血液サンプルは、溶解剤ではなく、凝固防止剤に供された血液であることができる。いくつかの実施形態において、凝固防止剤は、抗凝固剤である。いくつかの実施形態において、未処理の血液は、全血であることができる。
いくつかの実施形態において、光の第１の波長は５４０ｎｍであり、光の第２の波長は６７０ｎｍである。
いくつかの実施形態において、本方法は、フルクトシルペプチドを、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）のようなオキシダーゼ補因子に接触させることを更に含む。
また、本明細書では、糖化ヘモグロビンを直接検出するためのシングルスライド方法も説明される。これらの方法は、ａ）第２のフィルム層が反射材料部を含むマイクロスライドを提供するステップ、ｂ）スライドの第３のフィルム層を非処理の赤血球を含む血液サンプルと接触させるステップであって、溶解剤が赤血球から糖化ヘモグロビンを放出させ、変性剤が糖化ヘモグロビンと接触して糖化ヘモグロビンを変性させ、プロテアーゼが変性された糖化ヘモグロビンからフルクトシルペプチドを放出させ、フルクトシルペプチドが第２のフィルム層を横断し、フルクトシルペプチドが前記第１のフィルム層に到達してフルクトシルオキシダーゼとＦＡＤ補因子と接触して過酸化物を生成し、ペルオキシダーゼ及び過酸化物が検出剤と接触して検出可能なシグナルを放出する、ステップ、及び、ｃ）血液サンプルからの糖化ヘモグロビンの量を計測するステップであって、糖化ヘモグロビンの量を計測するステップが、血液サンプル中の酸化染料の記反射率濃度を検出することを含むステップ、を含む。
いくつかの実施形態において、反射性材料部は、金属塩を含む。
全血サンプルは、第３の層のラテックス粒子によって生じる多孔性により、第３のフィルム層を横断することができる。
図１は、本明細書に記載のマイクロスライドに組み込まれる層を示す。 図２は、マスキング層がＴｉＯ２を含むスライドと、マスキング層がＴｉＯ２を含まないスライドとの比較を示す。 図３Ａは、ＴｉＯ２を含まないマスキング層（「コントロール」）及びＴｉＯ２を含むマスキング層についての５４０ｎｍのシグナルを示す。 図３Ｂは、ＴｉＯ２を含まないマスキング層（「コントロール」）及びＴｉＯ２を含むマスキング層についての５４０ｎｍのシグナルを示す。 図４Ａは、ＴｉＯ２を含まないマスキング層（「コントロール」）及びＴｉＯ２を含むマスキング層についての６７０ｎｍのシグナルを示す。 図４Ｂは、ＴｉＯ２を含まないマスキング層（「コントロール」）及びＴｉＯ２を含むマスキング層についての６７０ｎｍのシグナルを示す。 図５は、マスキング層にＴｉＯ２を含まないスライドについて、ヘモグロビン（Ｈｂ）濃度の増加の存在下でのＦｒｕ－ＶＨ基質の用量反応を示す。 図６は、マスキング層にＴｉＯ２を含むスライドについて、ヘモグロビン（Ｈｂ）濃度の増加の存在下でのＦｒｕ－ＶＨ基質の用量反応を示す。 図７Ａは、３７℃の分析器における５分間にわたる６７０ｎｍでの％Ａｌｃモデル液体及び％Ａｌｃ患者サンプルの動態データを示す。プロテアーゼと亜硝酸ナトリウムとは、インクジェットで堆積され、完成されたマイクロスライド上で乾燥される。 図７Ｂは、３７℃の分析器における５分間にわたる６７０ｎｍでの％Ａｌｃモデル液体及び％Ａｌｃ患者サンプルの動態データを示す。プロテアーゼと亜硝酸ナトリウムとは、インクジェットで堆積され、完成されたマイクロスライド上で乾燥される。 図７Ｃは、３７℃の分析器における５分間にわたる６７０ｎｍでの％Ａｌｃモデル液体及び％Ａｌｃ患者サンプルの動態データを示す。プロテアーゼと亜硝酸ナトリウムとは、インクジェットで堆積され、完成されたマイクロスライド上で乾燥される。 図７Ｄは、３７℃の分析器における５分間にわたる６７０ｎｍでの％Ａｌｃモデル液体及び％Ａｌｃ患者サンプルの動態データを示す。プロテアーゼと亜硝酸ナトリウムとは、インクジェットで堆積され、完成されたマイクロスライド上で乾燥される。 図８Ａは、３７℃の分析器における５分間にわたる６７０ｎｍでの％Ａｌｃモデル液体及び％Ａｌｃ患者サンプルの動態データを示す。全ての成分は、ｘ－ホッパーコーティングプロセスによって組み込まれる。 図８Ｂは、３７℃の分析器における５分間にわたる６７０ｎｍでの％Ａｌｃモデル液体及び％Ａｌｃ患者サンプルの動態データを示す。全ての成分は、ｘ－ホッパーコーティングプロセスによって組み込まれる。 図９は、３７℃の分析器における５分間にわたる６７０ｎｍでの％Ａｌｃモデル液体及び％Ａｌｃ患者サンプルの反射率濃度用量反応データを示す。全ての成分は、ｘ－ホッパーコーティングプロセスによって組み込まれる。 図１０は、マイクロスライド％Ａ１ｃとＢｉｏｒａｄ Ｖａｒｉａｎ ＨＰＬＣ％Ａ１ｃとの相関プロットを示す。 図１１は、マイクロスライドヘモグロビン成分患者サンプルの用量反応を示す。 図１２は、マイクロスライドヘモグロビン成分アッセイとマイクロチップリファレンスヘモグロビン成分アッセイとの相関プロットを示す。 図１３は、マイクロスライドＨｂＡ１ｃ成分患者サンプルの用量反応を示す。 図１４は、マイクロスライドＨｂＡ１ｃ成分アッセイとマイクロチップリファレンスＨｂＡ１ｃ成分アッセイとの相関プロットを示す 図１５は、マイクロスライド由来％Ａ１ｃアッセイとＨＰＬＣリファレンス％Ａ１ｃアッセイとの相関プロットを示す。 図１６は、デュアルアッセイマイクロスライド検査素子に対するＨｂＡ１ｃ酵素６７０ｎｍ用量反応プロットを示す。 図１７は、デュアルアッセイマイクロスライド検査素子に対するヘモグロビンスペクトル５４０ｎｍ用量反応プロットを示す。
患者サンプルを用いた直接手段（％Ａ１ｃ測定のみ）による又は導出計算（％Ａ１ｃ結果を得るためのＨｂＡ１ｃ及びヘモグロビン測定）による糖化ヘモグロビン濃度を測定するための酵素カスケードを行う薄膜検査素子、マイクロスライドの使用について説明する。いくつかの実施形態において、患者サンプルは、未処理全血サンプルのような全血サンプルである。いくつかの実施形態では、未処理血液サンプルは、未溶解血液サンプルであることができる。いくつかの実施形態において、未処理血液サンプルは、凝固防止剤に供されたが溶解剤には供されていない血液であることができる。いくつかの実施形態において、凝固防止剤は、抗凝固剤である。いくつかの実施形態において、未処理の血液は、全血であることができる。
血液サンプルは、ヒト又は動物の血液であることができる。いくつかの実施形態において、血液は、哺乳類の血液であることができる。哺乳類は、ヒト、馬、ラクダ、犬、猫、牛、熊、げっ歯類、羊、山羊、豚等を含むことができるが、これらに限定されない。また、爬虫類、魚類、及び鳥類の血液のような他の動物血液も使用することができる。
いくつかの実施形態において、ヘモグロビン成分が存在する限り、患者の血液サンプルの様々な成分又は画分についても測定することができる。
測定は、本明細書に記載の装置、システム、及び方法を用いて達成される。一般に、測定は、ドライマイクロスライドのようなマイクロスライドを用いて実施することができる。マイクロスライドはシングルスライドとすることができ、それによって、複数のスライドではなく、一滴の試料とシングルスライドとを用いて全分析を完了することができる。
本明細書で説明するマイクロスライドは、自動分析システム又は他の種類のメインフレーム分析器で利用することができる。これらの種類の機器は、いくつかの実施形態において、１稼働日あたり数百又は数千のサンプル分析を処理することができる。一実施形態において、マイクロスライドは、現在のＶＩＴＲＯＳメインフレーム分析器（5,1 FS、4600 Chemistry System、5600 Integrated System）及び同様に将来のVITROS分析器でも使用することができる。加えて、本明細書に記載されたマイクロスライドは、Abbott Laboratories、Beckman Coulter、Baxter、Genprobe、Roche Diagnostics、及びSiemensが製造するシステムで使用することが可能である。
しかし、他の実施形態において、マイクロスライドは、非自動化システム又は半自動化システムで利用することができる。いくつかの実施形態において、マイクロスライドは、サンプルごとのシナリオで使用することができ、及び／又は手動でロードすることができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のマイクロスライド検査素子は、酵素カスケードの成分を組み込むことができる。この酵素カスケードは、患者サンプル中の糖化ヘモグロビンの濃度（％Ａ１ｃとして）に直接関連する比色シグナルの生成をもたらすことができる。
ヘモグロビンの糖化度は、業界では一般的にヘモグロビン（Ｈｂ）濃度と糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）濃度との両方を測定し、その比率で表す（導出％Ａ１ｃ）ことで決定される。これは、ＨｂとＨｂＡ１ｃとの測定に別々の検量線を作成するために、２組の標準物質を必要とする。代わりに、未知の患者サンプルの％Ａ１ｃを直接提供するために、既知の％Ａ１ｃ液体を標準物質として使用してアッセイを校正することもできる。
本明細書に記載の装置、システム及び方法は、いずれのアッセイ形式でも利用可能なマイクロスライドを使用することができる。一実施形態において、Ｈｂ濃度及びＨｂＡ１ｃ濃度を決定するために必要な全ての成分を単一の検査素子に組み込み、導出％Ａ１ｃの結果を得ることができる。このような実施形態では、Ｈｂ及びＨｂＡ１ｃはそれぞれ、シングルスライドから異なる検出波長で決定することができ、検査は単一の全血測定イベントから実施することができ、現在のマイクロスライドプロトコルを使用して実施することができる。
別の実施形態において、第２の選択肢は、別々のマイクロスライドを使用して、Ｈｂ濃度及びＨｂＡ１ｃ濃度をそれぞれ個別に測定し、導出された％Ａ１ｃの結果を得ることである。このような実施形態において、Ｈｂ濃度及びＨｂＡ１ｃ濃度はそれぞれ、単一の検査素子内の個々の検査スライドから異なる検出波長で決定することができ、検査は２つの全血測定イベントから実施することができ、現在のマイクロスライドプロトコルを使用して実施することができる。
更に、別の実施形態において、シングルマイクロスライドを使用して％Ａ１ｃを直接測定することができる。そのような実施形態において、％Ａ１ｃは、シングルマイクロスライドから単一の検出波長で決定することができる。測定は、単一の全血測定イベントから行うことができ、現在のマイクロスライドプロトコルを使用して行うことができる。
いくつかの実施形態において、装置、システム及び方法は、ＨｂＡ１ｃを％Ａ１ｃとして決定するために酵素カスケードを使用することができる。本明細書に記載のマイクロスライドで使用される酵素カスケードは、以下の
Figure 2022541839000001
である。
いくつかの実施形態において、カスケードは、（％Ａ１ｃとして）糖化ヘモグロビンの直接測定に使用することができる。しかしながら、このカスケードは、導出された％Ａ１ｃを測定する場合にも使用することができる。
一般に、直接的又は導出された％Ａ１ｃを決定する方法は、未処理の全血サンプルを本明細書に記載のマイクロスライドに適用するステップを含む。いくつかの実施形態において、マイクロスライドは、２つ以上のサンプル位置を含むことができ、２つ以上の血液サンプルを必要とする可能性がある。
溶解性界面活性剤は、血液サンプル中の赤血球を溶解し、それによって糖化ヘモグロビンを遊離させることができる。第２の界面活性剤は、糖化ヘモグロビンを変性させ、それによりタンパク質分解切断部位へのアクセスを提供することができる。次に、プロテアーゼがヘモグロビンのβ鎖のＮ末端部分を切断し、糖化ジペプチド（フルクトシル－α－バリル－ヒスチジン－Ｆｒｕ－α－ＶａｌＨｉｓ）を遊離させる。糖化ジペプチドは、フルクトシルペプチドオキシダーゼ（ＦＰＯＸ）とフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を用いた酸化反応により脱糖し、これにより過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が生成される。Ｈ２Ｏ２とホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）がロイコ染料を酸化し、６７０ｎｍで比色シグナルが得られる。糖化ヘモグロビンの濃度は、形成された染料の反射率濃度に正比例する。いくつかの実施形態において、５４０ｎｍでヘモグロビンのシグナルを読み取り、５４０ｎｍでのヘモグロビン成分の決定と６７０ｎｍでの糖化ヘモグロビンの決定とを利用して、導出％Ａ１ｃ値を決定することができる。
いくつかの実施形態において、マイクロスライドは、少なくとも第１のフィルム層、第２のフィルム層、及び第３のフィルム層を含むことができる。マイクロスライドは、更に多くの層を含むことができる。いくつかの実施形態において、第１のフィルム層は、架橋ゼラチン又はゲルを含むことができ、架橋ゲルは、検出剤、フルクトシルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、及び任意に干渉防止剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、第２のフィルム層は、ゼラチン、ゲル、又は架橋されたゲル若しくは架橋されたゼラチンを含むことができる。いくつかの実施形態において、第３のフィルム層は、溶解剤、変性剤及び／又はプロテアーゼを含むことができる。
マイクロスライド１００は、フィルム層の積層体又は単に層の積層体を含むことができる。フィルム層の積層体は、図１に示されるように、ゲル層１０２、マスキング層１０４、接着層１０６、及びスプレッド層１０８を含むことができる。いくつかの実施形態において、マイクロスライド１００は、上部スライドマウント１１０、下部スライドマウント１１２、又はその両方を含むことができる。いくつかの実施形態において、形成されるとき、層は支持層１１４上に構築することができる。いくつかの実施形態おいて、接着層１０６、マスキング層１０４、及びゲル層１０２は、試薬層として組み合わされることができる。
いくつかの実施形態において、支持層１１４は、ポリエチレンテレフタレート又は他の適切な透明な高分子材料で形成することができる。この透明な高分子材料は、その上に層を適用する又はコーティングすることを可能にする。
いくつかの実施形態において、上部スライドマウント１１０及び下部スライドマウント１１２は、ポリスチレン又は他の適切な高分子材料から形成される。
各層及びマウントを組み合わせて、正方形又は略長方形の上面１１６及び下面１１８であるマイクロスライドを形成することができる。いくつかの実施形態において、上面１１６及び下面１１８は、三角形、五角形、六角形、七角形、八角形、円形、楕円形、又は他の矩形状又は円形状などの他の形状を有することができるが、これらに限定されるものではない。
いくつかの実施形態において、マイクロスライドは、少なくとも１つのノッチ又はキーイング面を含むことができる。ノッチ又はキーイング面は、複数のマイクロスライドを積層すること及び／又は１つ又は複数のマイクロスライドを分析機器にロードすることを支援するために使用することができる。一実施形態において、マイクロスライド１００は、ノッチ１２０を含むことができる。ノッチ１２０は、矩形状を有するとして示されているが、他の実施形態において、ノッチ１２０は、積層及び／又はロードを可能にする実質的に任意の形状とすることができる。
更に、マイクロスライド１００は、上面１１６及び／又は下面１１８に窓部１２２を含むことができる。窓部１２２は、フレーム部１２４によって囲まれることができる。しかしながら、いくつかの実施形態において、フレーム部は含まれず、窓部１２２はマイクロスライドの端まで延在することができる。
マイクロスライド１００は、上面１１６上の窓部１２２内にサンプル領域１２６を含むことができる。サンプル領域１２６は、サンプル適用のための場所として機能することができる。下面１１８上では、検出領域１２８が窓部１２２内に存在することができる。検出領域１２８は、分析器を用いて検出するための場所として機能することができる。
ここで、サンプルがマイクロスライド層を通って移動する際の各層について説明する。スプレッド層１０８は、サンプルが干渉する最初の層となることができる。スプレッド層１０８は、ポリマービーズ、バインダ、緩衝剤、少なくとも１つの界面活性剤、二価カチオン塩、亜硝酸ナトリウム、プロテアーゼ、アルコール、及び水を含むことができる。
いくつかの実施形態において、２価の陽イオン塩は、塩化カルシウムである又はＥＤＴＡを結合することができる任意の化合物であることができる。
いくつかの実施形態において、スプレッド層を形成する又は塗布する際、ｔｅｒｔ－ブチルアルコールが存在することができる。しかし、乾燥後は存在しない。
いくつかの実施形態において、高分子ビーズは、ビニルトルエン－ｃｏ－メタクリル酸コポリマービーズ（ＶｔＥビーズ）のようなアクリルビーズを含むことができるが、これらに限定されるものではない。ビーズの機能は、赤血球がコーティングに入ることを可能にする細孔をスプレッド層に形成することであることができる。また、ビーズは、白色反射面を提供し、均一なサンプルの広がりを促進し、ヘム副産物、カタラーゼ、トリグリセリド等の干渉物を捕捉するため機能することもできる。
ビーズは、赤血球がコーティングに浸透するために十分な大きさの平均直径を有することができる。いくつかの実施形態において、直径は、約５μｍより大きく、約１０μｍより大きく、約５０μｍより大きく、約８０μｍより大きく、約２０μｍと約１００μｍとの間、約２０μｍと約３０μｍとの間、約１０μｍと約４０μｍとの間、約１０μｍと約１００μｍとの間、約２０μｍと約２５μｍとの間、約５０μｍと約１００μｍとの間、約２５μｍと約３０μｍとの間、約１００μｍ未満、約８０μｍ未満、約５０μｍ未満、約４０μｍ未満、又は約３０μｍ未満である。
ビーズによって生成される細孔は、約５μｍより大きい、約１０μｍより大きい、約２０μｍより大きい、約２０μｍと約３０μｍとの間、約１０μｍと約４０μｍとの間、約２０μｍと約２５μｍとの間、約２５μｍと約３０μｍとの間、約５０μｍ未満、約４０μｍ未満、又は約３０μｍ未満の孔径を有することができる。一実施形態において、孔径は、約２５μｍである。
層の凝集を促進するために機能することができるバインダは、ラテックスであることができる。一実施形態において、ラテックスは、最終生成物中のモノマーの分子量（ＭＷＭ）ラテックスの固形分のパーセントが約３０％であることができる。いくつかの実施形態において、ラテックスは、これに限るものではないが、ニパサイドのような殺生物剤を含む。他の実施形態において、これに限るものではないが、ポリアクリルアミド（Ｉ１００）のような代替バインダを利用することができる。
緩衝剤は、層を所望のｐＨに維持するために機能する。所望のｐＨは、約６．０～約７．０、約６．２～約７．２、約６．５～約７．５、約６．０～約８．０、約７．０～約８．０、約６．８～約７．２、約７．４、約７．２、約７．０、又は約６．８であることができる。緩衝剤は、必要に応じて、酸又は塩基であることができる。一実施形態において、緩衝液は、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）である。他の緩衝剤は、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸カリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｂｉｓ－ＴＲＩＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＰＳ（ＥＰＰＳ）等、又はそれらの組み合わせを含むことができるが、これらに限定されるものではない。
いくつかの実施形態において、第１の界面活性剤及び第２の界面活性剤を含むことができる。第１の界面活性剤は、溶解剤であることができる。溶解剤は、赤血球を溶解し、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンを放出することができる。溶解剤は、洗浄剤であることができる。
いくつかの実施形態では、洗浄剤は、オクチルフェノールエトキシレート（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００）、ＴＷＥＥＮ（ＴＷＥＥＮ ２０）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ＰＯＥｓ）、ＮＯＮＩＤＥＴ Ｐ－４０（ＮＰ－４０）又はそれらの組み合わせから選択することができる。一実施形態において、洗浄剤は、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００のようなオクチルフェノールエトキシレートである。
いくつかの実施形態において、第２の界面活性剤は、ヘモグロビンを変性させる変性剤であることができる。この変性剤は、タンパク質分解のためにヘモグロビン上のある部位を露出させることができる。変性剤は、単一の酸化状態でのヘム酸化を可能にし、ヘモグロビン形態（オキシ、デオキシ、カルボキシ）の単一スペクトル形態への変換を補助することができる。
一実施形態において、変性剤は、Ｎ－ラウロイルサルコシン（ＮＬＳ）を含むことができる。いくつかの実施形態において、第２の界面活性剤は、亜硝酸ナトリウムのような変性剤助剤又は酸化剤も含むことができる。変性剤助剤は、ヘム中の鉄と配位することによって、ＮＬＳによる変性を促進することを助けることができる。
一実施形態において、コーティング中に存在する１つ又は複数の変性剤は、目的のプロテアーゼ切断部位へアクセスできるようにする糖化ヘモグロビンを変性させることができる。
いくつかの実施形態では、スプレッド層１０８は、酵素カスケードを開始させるために、必要に応じて更なる界面活性剤を含むことができる。
亜硝酸ナトリウムは、モル過剰で存在することができる。いくつかの実施形態において、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）は、全ヘモグロビン濃度の約５～１０倍で存在することができる。いくつかの実施形態において、亜硝酸ナトリウムは、ヘムを鉄状態（＋３）に酸化させるように作用することができる。
更に、変性界面活性剤、亜硝酸ナトリウム、及びヘモグロビンの組み合わせは、５４０ｎｍで読み取ることができるヘモグロビンの単一スペクトル形態を作成することができる。
プロテアーゼは、中性プロテアーゼであることができる。プロテアーゼは、メタロプロテアーゼであることができる。プロテアーゼは、エンドプロテアーゼ又はエキソプロテアーゼであることができる。プロテアーゼは、ヘモグロビンβサブユニット又は鎖のＮ末端から切断することにより、Ｆｒｕ－α－ＶａｌＨｉｓを生成することができる。Ｆｒｕ－α－ＶａｌＨｉｓは、本明細書に記載のゲル層に含まれるフルクトシルオキシダーゼの基質とすることができる。
いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、プロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ、プロテアーゼXVII、プロテアーゼXXI、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、サーモリシン、サブチリシン、又はこれらの組み合わせであることができる。
Ｆｒｕ－α－ＶａｌＨｉｓジペプチドは、接着層及びマスキング層を容易に通過して、本明細書に記載のゲル層に入ることができるように、十分に小さい分子量であることが可能である。
カルシウム成分は、プロテアーゼ活性に必須であり得る。いくつかの実施形態において、マイクロスライド中のカルシウムは、採血管中のＥＤＴＡ抗凝固剤からプロテアーゼを保護することができる。いくつかの実施形態において、カルシウム源は、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）である。他の実施形態において、塩化カルシウムは塩化カルシウム二水和物である。
スプレッド層に存在する塩化カルシウムは、プロテアーゼの活性を保護するために作用することができる。いくつかの実施形態において、ＨｂＡ１ｃ測定のための臨床現場での採血管は、ＥＤＴＡ血漿管である。塩化カルシウムがないと、ＥＤＴＡがプロテアーゼからのカルシウム及び亜鉛と結合し、プロテアーゼのタンパク質分解活性を大きく低下させる可能性がある。
スプレッド層溶媒は、メタノール、エタノール、ｔｅｒｔ－ブチルアルコール等、又はそれらの組み合わせとすることができる。一実施形態においてアルコールは約９７ｗ／ｗのｔｅｒｔ－ブチルアルコールである。
スプレッド層１０８の直下の接着層１０６は、接着物質、界面活性剤、及び／又は溶媒を含むことができる。スプレッド層で生成されたＦｒｕ－α－ＶａｌＨｉｓジペプチドは、接着層１０６を容易に通過することができる。
いくつかの実施形態では、接着物質は、スプレッド層１０８とマスキング層１０４との間の接着を促進するために機能することができる。一実施形態において、接着物質は、ポリイソプロピルアクリルアミド（ｌ１００）である。他の実施形態において、接着物質は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）であることができる。いくつかの実施形態において、ＰＶＰは、ｋ９０鎖長、ｋ３０鎖長、ｋ１５鎖長、又はそれらの組み合わせを有することができる。
接着層界面活性剤は、コーティング助剤として機能することができる。いくつかの実施形態において、接着層界面活性剤は、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００のようなオクチルフェノールエトキシレートである。いくつかの実施形態において、接着物質は、ポリイソプロピルアクリルアミドとオクチルフェノールエトキシレートとの組み合わせであることができる。
接着層１０６の溶媒は、エタノール、イソプロピルアルコール、メタノール、ｔ－ブチルアルコール、アセトン、又はこれらの組み合わせであることができる。一実施形態において、接着層溶媒は、アセトンであることができる。いくつかの実施形態において、エタノールが使用される場合、界面活性剤は必要でないことがある。
マスキング層１０４は、ゲル、少なくとも１つの緩衝剤、顔料物質、分散剤、界面活性剤、硬化剤、及び／又は溶媒／希釈剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、ゲルは、ゼラチン及び／又は硬化ゲルである。
ゲルは、層の凝集を促進し、再湿潤時の毛細管力を促進し、及び／又はサイズ排除機構を提供することができる。いくつかの実施形態において、サイズ排除機構は、（架橋／硬化時に）高分子量の干渉物を排除することができる。
いくつかの実施形態において、ゲルは、硬化ゲルである。一実施形態において、ゲルは、Ｇｅｌ－ＲＣ Ｒｏｕｓｓｅｌｏｔ Ｄｕｂ Ｐｉｇ Ｄｉａ Ｔｙｐｅ ５６又は２７５ Ｂｌｏｏｍ Ｔｙｐｅ Ａ ＮＦ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｓｋｉｎ Ｇｅｌａｔｉｎである。
いくつかの実施形態において、顔料物質は、マスキング層内に反射部分を生成することができる。顔料物質は、白色の反射面を提供し、ヘム副産物、カタラーゼ、及びトリグリセリドのような干渉物を捕捉する又はマスクするように作用することができる。いくつかの実施形態において、顔料物質は、金属物質又は金属を含むことができる。いくつかの実施形態において、金属は、二酸化チタン（ＴｉＯ２）のようなチタンであるが、これに限定されるものではない。二酸化チタンは、高い白色度及び青色調を有するアナターゼ型二酸化チタン顔料であることができる。いくつかの実施形態において、顔料物質は、Ｈｏｍｂｉｔａｎ ＬＣ－Ｓ、Ｈｕｎｔｓｍａｎ ＴｉＯ２又はＫｅｍｉｅｒａ ３００である。他の実施形態において、二酸化チタンは、ルチル、ブルッカイト、アカオギアイト、及びそれらの組み合わせ、又はアナターゼとの組み合わせのような他の結晶形態であることができるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、二酸化チタンと硬化ゲルとが一緒に作用して、分子量の小さい種（Ｆｒｕ－α－ＶａｌＨｉｓ等）が層を容易に通過できる一方で、より分子量の大きいタンパク質（ヘモグロビン、カタラーゼ、プロテアーゼ）が排除されるふるいを生成することができる。一実施形態において、Ｆｒｕ－α－ＶａｌＨｉｓが通過することができるふるいが生成される。
いくつかの実施形態において、ヘモグロビンが６７０ｎｍでのＨｂＡ１ｃ測定に光学的干渉を起こす、カタラーゼは染料の酸化に必要な過酸化物を消費する、及び／又はプロテアーゼはゲル層に存在する登録酵素（フルクトシルペプチドオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を消化するため、より大きな分子量のタンパク質のこの排除は、マスキング層の本質的な特徴である可能性がある。
いくつかの実施形態では、二酸化チタンは、検光子光源からの光をシグナル定量のための検出器に反射させるために使用される均一な反射面を提供することができる。分析器の光源は、発光ダイオード（ＬＥＤ）である又は本明細書に記載の波長で光を提供できる他の光源であることができる。光がサンプルに接触した後、又は他の方法でサンプルと相互作用した後、１つ又は複数のセンサを使用して、１つ又は複数の波長の光の量を読み取ることができる。センサは、光電子増倍管、接触画像センサ、画像捕捉センサマトリックス、又はそれらの組み合わせであることができる。
マスキング層を緩衝することは、マスキング層を所望のｐＨに維持するために機能する。所望のｐＨは、約６．０～約７．０、約６．２～約７．２、約６．５～約７．５、約６．０～約８．０、約７．０～約８．０、約６．８～約７．２、約７．４、約７．２、約７．０、又は約６．８であることができる。
一実施形態において、少なくとも１つのマスキング層緩衝剤は、第１の緩衝剤及び第2の緩衝剤を含むことができ、これらの各々は、必要に応じて、酸塩又は塩基塩であることができる。一実施形態において、第１の緩衝剤は、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）である。一実施形態において、第２の緩衝剤は、β，β－ジヒドロキシル－１，４－ピペラジンジプロパンスルホン酸二ナトリウム塩（ＰＯＰＳＯ）である。
分散剤は、ポリメタクリル酸ナトリウムであることができる。この薬剤は、顔料の迅速な分散に有効であることができる。一実施形態において、分散剤はＤａｘａｄ ３０Ｓである。
マスキング層界面活性剤は、コーティング助剤として作用することができる。マスキング層界面活性剤は、ポリエーテルスルホネートのようなアニオン性界面活性剤であることができる。一実施形態において、マスキング層界面活性剤は、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ２００Ｅである。
硬化剤は、ゲル層中のゲルを架橋し、及び／又は層の凝集を促進するために機能することができる。いくつかの実施形態において、硬化剤は、ビス（ビニルスルホニルメチル）（ＢＶＳＭ）である。
いくつかの実施形態において、マスキング層の溶媒／希釈剤は、水である。
マスキング層１０４は、スライドの機能領域を分離することができる。例えば、マスキング層１０４は、スプレッド層１０８をゲル層１０２から分離することができる。これにより、スプレッド層で起こる赤血球溶解、ヘモグロビンの変性／消化、Ｆｒｕ－α－ＶａｌＨｉｓジペプチドの遊離を、ゲル層１０２で起こる比色シグナルを生成するためのＦｒｕ－α－ＶａｌＨｉｓジペプチド脱糖及びＨＲＰ／染料反応から分離させることができる。
いくつかの実施形態において、マスキング層は存在しない。例えば、５４０ｎｍでＨｂの測定が要求されるスライドを形成する場合、二酸化チタンは、ヘモグロビンを読み取る能力を阻害するため、存在させない。
しかしながら、５４０ｎｍでのＨｂの測定が要求される他の実施形態において、マスキング層１０４は依然として二酸化チタンを含んでもよい。いくつかの実施形態において、ゲル層に６７０ｎｍのＦｒｕ－α－ＶａｌＨｉｓについての反射シグナルを作成することができ、マスキング層の上にマスキング層を通過していない５４０ｎｍのＨｂについての反射シグナルを作成することができる。このような実施形態において、２つの別々の反射シグナルが測定され、１つは５４０ｎｍでＨｂを測定するために上方から、１つは６７０ｎｍでＦｒｕ－α－ＶａｌＨｉｓを測定するために下方からである。これらの値は、導出された％ＨｂＡ１ｃを決定するために使用することができる。
ゲル層１０２は、ゲル、緩衝剤、少なくとも１つの界面活性剤、カプラー溶媒、還元剤、検出剤、補因子、増幅物質又は触媒、オキシダーゼ、硬化剤、及び溶媒／希釈剤を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ゲル層ゲルは、ゲル又はゼラチンである。ゲルは、層の凝集を促進し、再湿潤時の毛細管力を促進し、及び／又はサイズ排除機構を提供することができる。いくつかの実施形態において、サイズ排除機構は、（架橋／硬化時に）高分子量の干渉物を排除することができる。いくつかの実施形態において、ゲルは、架橋ゲルである。架橋は、層の完全性を改善し、追加の干渉物質を濾過するために細孔サイズを低減することができる。
一実施形態において、ゲルは、Ｇｅｌ－３２ ＴＣＧＩＩＩ ＤＩ Ｇｅｒａｔｉｎである。ゲルは多孔質であることができる。
いくつかの実施形態において、ゲルは、サイズ排除機構として機能することができる。
ゲル層緩衝剤は、層を所望のｐＨに維持するために機能することができる。所望のｐＨは、約６．０～約７．０、約６．２～約７．２、約６．５～約７．５、約６．０～約８．０、約７．０～約８．０、約６．８～約７．２、約７．４、約７．２、約７．０、又は約６．８であることができる。緩衝剤は、必要に応じて、酸又は塩基であることができる。一実施形態において、緩衝液は、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）である。
ゲル層１０２は、１つ以上の界面活性剤を含むことができる。第１の界面活性剤は、コーティング助剤として機能することができる。いくつかの実施形態において、ゲル層の第１の界面活性剤は、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００のようなオクチルフェノールエトキシレートである。
第２の界面活性剤は、染料分散に用いることができる。一実施形態において、第２の界面活性剤は、アルカノールＸＣのようなアルキル化ナフタレンスルホン酸ナトリウムである。
染料層カプラー溶媒は、２，４－ジ－ｎ－ペンチルフェノール（ＫＳ－５２）及び／又は２，４－ジ－ｔｅｒｔ－ペンチルフェノール（ＫＳ－４１）であることができる。
誤った染料の酸化を防ぐために還元剤を添加することができる。一実施形態において、還元剤は、５，５－ジメチル－１，３－シクロヘキサンジオン（Dimedone）であることができる。
検出剤は、染料であってもよい。検出剤は、比色シグナルの生成に使用することができる。検出可能なシグナルを提供する実質的に任意の染料を使用することができる。染料は、Ｎ－カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４’－ビス（ジメチルアミノ）－ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ－６４）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”ヘキサ（３－スルホプロピル）－４，４’，４”－トリアミノ－トリフェニルメタン六ナトリウム塩（ＴＰＭ－ＰＳ）、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－フェノチアジンナトリウム（ＤＡ－６７）、２－（３，５－ジメトキシ－４－ヒドロキシフェノール）－４，５－ビス－（４－ジメチルアミノフェニル）イミダゾール、又はそれらの組み合わせであることができる。一実施形態において、染料は、２－（３，５－ジメトキシ－４－ヒドロキシフェノール）－４，５－ビス－（４－ジメチルアミノフェニル）イミダゾールである。
オキシダーゼは、Ｆｒｕ－α－ＶａｌＨｉｓから過酸化物を生成するオキシダーゼであることができる。オキシダーゼは、Ｆｒｕ－α－ＶａｌＨｉｓを脱糖して、過酸化物を生成することができる。一実施形態において、オキシダーゼは、フルクトシルペプチドオキシダーゼであることができる。
いくつかの実施形態において、ゲル層１０２は、オキシダーゼ反応補因子を含むことができる。補因子は、オキシダーゼ活性を補助する非タンパク質の化学化合物であることができる。他の実施形態において、補因子は、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、及び／又はコエンザイムＡ（ＣｏＡ）であることができる。一実施形態において、補因子は、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）であることができる。
増幅物質又は触媒は、比色染料の反応を増幅する任意の分子であることができる。Ｆｒｕ－α－ＶａｌＨｉｓオキシダーゼ反応から生成される過酸化物は、増幅物質によってシグナルが増幅される染料と相互作用することができる。いくつかの実施形態において、増幅物質は、これに限るものではないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）のようなペルオキシダーゼである。
硬化剤は、ゲル層中のゲルを架橋する及び／又は層の凝集を促進するために機能することができる。いくつかの実施形態において、硬化剤は、ビス（ビニルスルホニルメチル）（ＢＶＳＭ）である。
いくつかの実施形態において、ゲル層の溶媒／希釈剤は水である。
いくつかの実施形態において、ゲル層１０２では、Ｆｒｕ－α－ＶａｌＨｉｓは、フルクトシルペプチドオキシダーゼによって脱糖化される。フルクトシルオキシダーゼは、Ｆｒｕ－α－ＶａｌＨｉｓ及びＦｒｕ－α－Ｖａｌの両方に対して特異的である。しかし、ヘモグロビンのβ鎖のタンパク質分解ではＦｒｕ－α－Ｖａｌは生成されない。また、フルクトシルオキシダーゼの特異性により、アルブミンのような他の糖化タンパク質によるアッセイへの干渉も防ぐことができる。
脱糖反応により、ＦＡＤ補因子が循環して過酸化物が生成される。ホースラディッシュペルオキシダーゼと過酸化物とは、染料を酸化して、６７０ｎｍの光を吸収する着色生成物とする。
いくつかの実施形態において、ゲル層１０２の硬化ゲルは、より大きな分子量のタンパク質（ヘモグロビン、カタラーゼ、プロテアーゼ）を排除するための追加の保護層である。ゲルを架橋することにより、層の孔径が小さくなり、また、コーティング中にゲル層からの染料粒子がマスキング層（例えば、溶融）成分と混合することを防止するために役立つ。
いくつかの実施形態において、ゲル層１０２の硬化は、マイクロスライドについてシグナルを増加させることができる。硬化は、約５％～約１０％、約１％～約１０％、約１％～約５％、約５％～約２０％、又は約１％～約２０％、シグナルを増加させることができる。
いくつかの実施形態において、干渉防止剤は、アスコルビン酸オキシダーゼであることができる。このオキシダーゼは、サンプル中のアスコルビン酸（ビタミンＣ）と反応し、アスコルビン酸が測定に干渉することを防止することができる。いくつかの実施形態において、サンプル中のアスコルビン酸は、ゲル層中の染料と反応して、それらを還元し、その色を減少させる可能性がある。この色の減少は、負の％Ａ１ｃ予測バイアス、又は単に偽性の低い％Ａ１ｃの結果をもたらす可能性がある。アスコルビン酸オキシダーゼを含有させることにより、試料中のアスコルビン酸を除去し、負の予測バイアスを防ぐことができる。
ある実施形態において、サンプルは、特定の症状の緩和又は軽減のためにビタミンを大量に使用している患者からのアスコルビン酸のメガドーズを含む可能性がある。アスコルビン酸オキシダーゼのような干渉防止剤がない場合、結果が不正確になる可能性がある。従って、いくつかの実施形態において、本明細書に記載のスライドは、スライドのゲル層又は任意の他の適切な層に干渉防止剤を含む。
いくつかの実施形態において、マイクロスライドの染料は、検出パラダイムを使用して分析される。検出パラダイムは、１つ以上の反射測定によることができる。一実施形態において、反射光測定は、本明細書に記載の染料による吸光度を検出するために使用される。
一実施形態において、特定の波長の光が検出領域１２８に向けられ、特定の波長で反射光又は反射率濃度が測定される。反射率濃度（ＤＲ）は、反射率から決定される。反射率濃度は、反射率の逆数のＬｏｇに等しい。
いくつかの実施形態において、光は、マイクロスライド内の二酸化チタン層で反射される。いくつかの実施形態において、光の特定の波長は、５４０ｎｍ、６７０ｎｍ、又はその両方とすることができる。いくつかの実施形態において、シグナル強度及び／又は同じスペクトルの光を吸収する可能性のある干渉物に応じて、これらの値の周辺の波長を使用することができ、又はこれらの値を含む範囲の波長を使用することができる。
いくつかの実施形態において、ソーレー帯及びＱ帯領域の波長を使用することができる。波長は、約５４０ｎｍのものを含むことができ、これに限るものではないが、例えば、約５３５ｎｍ、約５３６ｎｍ、約５３７ｎｍ、約５３８ｎｍ、約５３９ｎｍ、約５４１ｎｍ、約５４２ｎｍ、約５４３ｎｍ、約５４４ｎｍ、又は約５４５ｎｍを使用することができる。他の実施形態において、これらに限るものではないが、５３０ｎｍ～５４０ｎｍの範囲、５３９ｎｍ～５４１ｎｍの範囲、５３８ｎｍ～５４２ｎｍの範囲、５３７ｎｍ～５４３ｎｍの範囲、５３６ｎｍ～５４４ｎｍの範囲、５３５ｎｍ～５４５ｎｍの範囲、５４０ｎｍ～５４５ｎｍの範囲、５３５ｎｍ～５４０ｎｍの範囲、５３５ｎｍ～５７５ｎｍの範囲、５３０ｎｍ～５７５ｎｍの範囲、５４０ｎｍ～５７５ｎｍの範囲、５５０ｎｍ～５７５ｎｍの範囲、又は５６０ｎｍ～５７５ｎｍの範囲のような波長の範囲を使用することができる。
同様に、いくつかの実施形態において、約６７０ｎｍの波長、これらに限るものではないが、例えば、約６６５ｎｍ、約６６６ｎｍ、約６６７ｎｍ、約６６８ｎｍ、約６６９ｎｍ、約６７１ｎｍ、約６７２ｎｍ、約６７３ｎｍ、約６７４ｎｍ、又は約６７５ｎｍの波長を使用できる。他の実施形態において、波長の範囲は、これらに限るものではないが、例えば、６６０ｎｍ～６８０ｎｍの範囲、６６９ｎｍ～６７１ｎｍの範囲、６６８ｎｍ～６７２ｎｍの範囲、６６７ｎｍ～６７３ｎｍの範囲、６６６ｎｍ～６７４ｎｍの範囲、６６５ｎｍ～６７５ｎｍの範囲、６７０ｎｍ～６７５ｎｍの範囲、６６５ｎｍ～６７０ｎｍの範囲、を使用することができる。
一実施形態において、反射率濃度は、これに限るものではないが、ＶＩＴＲＯＳ分析器のような自動分析器によって読み取られる。終点反射濃度又は反射率は、この酸化反応によって生成される染料から定量化されてもよい。
アッセイ時間は、使用する分析プロトコル又は分析機器によって異なる場合がある。しかし、一般に、酵素カスケードを介したサンプル適用から反射率濃度の定量までの時間は、約５分～約１０分、約４分～約６分、約３分～約７分、約２分～約８分、約１０分未満、約９分未満、約８分未満、約７分未満、約６分未満、又は約５分未満である。一実施形態において、典型的なアッセイ時間は、ＶＩＴＲＯＳ分析器において、３７℃で約５分である。
アッセイは、ＶＩＴＲＯＳ分析器上で、３７℃で実行することができるが、他の温度とすることもできる。例えば、いくつかの実施形態において、アッセイは、室温、又は３７℃より上の温度若しくは下の温度で実行することができる。
いくつかの実施形態において、プロテアーゼ、フルクトシルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、染料、及び／又はＦＡＤのような酵素カスケードの成分は、５４０ｎｍでのヘモグロビンシグナルの読み取りに必要ないため、ゲル層から除去されてもよい。
いくつかの実施形態において、シングルマイクロスライドを使用して％Ａ１ｃのみを測定することができる。他の実施形態において、別々のマイクロスライドを使用して、ＨｂとＨｂＡ１ｃとをそれぞれ個別に測定し、導出％Ａ１ｃの結果を得ることができる。また、Ｈｂ濃度及びＨｂＡ１ｃ濃度を決定するために必要な全ての成分をシングルマイクロスライドに組み込んで、導出％Ａ１ｃの結果を得ることができる。
本明細書に記載の装置、システム、及び方法は、希釈又は前処理をせずに全血患者サンプルを使用することができる。いくつかの実施形態において、全血は、無溶解である。全血を使用することで、処理された血液を必要とする検査システムと比較して、時間及び資源を節約することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の装置、システム、及び方法は、少量の血液の使用で、ＨｂＡ１ｃ値を測定することができる。臨床及び診断環境において、血液サンプル量は、特に大規模な検査パネルが実施される場合に重要であることがある。
少量の血液は、約１μＬ～約１０μＬ、約２μＬ～約８μＬ、約４μＬ～約６μＬ、約４μＬ～約５μＬ、約４μＬ～約１０μＬ、約２μＬ～約５μＬ、約１０μＬ未満、約８μＬ未満、約６μＬ未満、又は約５μＬ未満であることができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の装置、システム、及び方法は、従来の方法と比較して、短時間でＨｂＡ１ｃ値を測定することができる。これは、迅速アッセイ時間と呼ぶことができる。臨床及び診断環境において、測定時間は、時間及び機器のスループットのコストを考慮する際に重要であることがある。
迅速アッセイ時間は、約１分～約１０分、約２分～約８分、約３分～約７分、約４分～約７分、約４分～約８分、約５分～約７分、約６分～約８分、約５分～約８分、約１０分未満、約８分未満、約７分未満、又は約６分未満であることができる。
迅速アッセイ時間により、本明細書に記載のアッセイを利用する高処理システムは、一定時間当たり、従来のアッセイよりもより多くのアッセイを実行することができ、それにより、一定時間当たりのより多くの利益を生み出すことができる。いくつかの実施形態において、高処理システムは、約３００テスト／時間と約４００テスト／時間との間、約３５０テスト／時間と約４００テスト／時間との間、約３５０テスト／時間と約４５０テスト／時間との間、約３００テスト／時間と約５００テスト／時間との間、約３００テスト／時間と約６００テスト／時間との間、少なくとも約３００テスト／時間、少なくとも約３５０テスト／時間、少なくとも約３７５テスト／時間、又は少なくとも約４００テスト／時間を実行することが可能である。
本明細書に記載の装置、システム、及び方法は、ヘモグロビンのＮ末端β鎖のタンパク質分解による基質（Ｆｒｕ－α－ＶａｌＨｉｓ）の生成と、特定のフルクトシルペプチドオキシダーゼによる脱糖化によってアッセイ特異性を確保することができる。
いくつかの実施形態において、装置、システム、及び方法は、ヘモグロビン構造変異体（ＨｂＳ、ＨｂＣ）干渉に煩わされることはない。いくつかの市販のアッセイは、抗体ベースの方法であるため、ＨｂＳ、ＨｂＣの干渉に煩わされる。
本明細書に記載のマイクロスライドを使用する方法も説明される。
一実施形態において、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンを検出するためのシングルスライド法が記載される。この方法は、本明細書に記載のスライドのようなマイクロスライドのスプレッド層を、赤血球を含む血液サンプルと接触させることを含むことができる。溶解剤は赤血球から糖化ヘモグロビンを放出させ、変性剤は糖化ヘモグロビンに接触して糖化ヘモグロビンを変性させ、プロテアーゼは変性された糖化ヘモグロビンからフルクトシルペプチドを放出させる。そして、フルクトシルペプチドはゲル層に到達し、フルクトシルオキシダーゼに接触して過酸化物を放出させる。ペルオキシダーゼ及び過酸化物は、検出剤と接触し、検出可能なシグナルを放出及び／又は発生させる。
いくつかの実施形態において、干渉防止剤は、血液サンプル中の任意のアスコルビン酸と反応し、サンプルのバイアスを防止する。いくつかの実施形態において、干渉防止剤は、アスコルビン酸オキシダーゼである。
血液サンプルからヘモグロビン量を測定する。測定は、第１の波長の光を用いてサンプルの反射率濃度を読み取ることを含む。また、血液サンプルからの糖化ヘモグロビンの量が測定される。糖化ヘモグロビンの測定は、サンプルからの検出可能なシグナルの反射濃度を第２の波長の光で検出することを含む。いくつかの実施形態において、第２の波長の光は、第１の波長の光と異なる。一実施形態において、光の第１の波長は５４０ｎｍであり、光の第２の波長は６７０ｎｍである。
いくつかの実施形態において、第１の波長の光は分析の比較的早い段階で測定することができ、第２の波長の光はラグタイムの後、分析の遅い段階で測定することができる。ラグタイムは、約３０秒、約４０秒、約５０秒、約６０秒、約２分、約３分、約４分、約３０秒～約１分、約４０秒～約１分、約３０秒～約２分、約３０秒～約３分、又は約３０秒～約４分であることができる。このラグタイムにより、反応カスケードが起こるための十分な時間を可能とする。
別の実施形態において、糖化ヘモグロビンを直接検出するためのシングルスライド法が記載される。この方法は、本明細書に記載のマイクロスライドの第１のフィルム層を、赤血球を含む血液サンプルと接触させることを含むことができる。溶解剤は赤血球から糖化ヘモグロビンを放出させ、変性剤は糖化ヘモグロビンに接触して糖化ヘモグロビンを変性させ、プロテアーゼが変性された糖化ヘモグロビンからフルクトシルペプチドを放出させる。そして、フルクトシルペプチドは第２のフィルム層を横断し、フルクトシルペプチドは第３のフィルム層に到達してフルクトシルオキシダーゼと接触して過酸化物を放出させる。ペルオキシダーゼ及び過酸化物は検出剤と反応し、検出可能なシグナルを生成する。
いくつかの実施形態において、干渉防止剤が血液サンプル中の任意のアスコルビン酸と反応し、サンプルのバイアスを防止する。いくつかの実施形態において、干渉防止剤は、アスコルビン酸オキシダーゼである。
そして、血液サンプルから糖化ヘモグロビンの量を測定する。そのような実施形態において、非糖化ヘモグロビンの測定は行われない。糖化ヘモグロビンの測定は、サンプル中の検出可能なシグナルの反射率濃度を検出することを含む。糖化ヘモグロビン測定は、光の波長でサンプルからの検出可能なシグナルの反射率濃度を検出することを含む。いくつかの実施形態において、光の波長は、６７０ｎｍである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のマイクロスライドは、従来のＨｂＡ１ｃ測定アッセイと比較した場合、低い単位製造コストを有することができる。マイクロスライドは、製造コストを約５％～約１０％、約５％～約２０％、又は約１０％～約２０％削減することができる。
本明細書に記載のマイクロスライドは、透明な支持体上に連続したフィルム層をコーティングすることによって製造することができる。従って、マイクロスライドは、支持体（１１４）上にゲル層コーティングを施し、次にゲル層上にマスキング層、マスキング層上に接着層、及び接着層上にスプレッド層を施すことによって製造することが可能である。
他の実施形態において、連続的な薄膜層堆積によってコーティングが形成されると、コーティングは適切な幅に切り込みを入れる。次に、切り込みを個々のスライドサイズのチップに刻むことによって、切り込まれたコーティングを完成したマイクロスライドに組み立て、これをスペーサーウェブと一緒に上下のスライドマウントに取り付けることができる。この工程は、スライドアセンブリマシン（ＳＡＭ）で行うことができる。
個々のスライドは、メインフレーム分析器で使用するためにカートに梱包することができる。カートは、分析器に適した任意の数のスライドを含むことができる。いくつかの実施形態において、カートは、５０マイクロスライド、１００マイクロスライド、２００マイクロスライド、少なくとも１０マイクロスライド、少なくとも１５マイクロスライド、少なくとも２０マイクロスライド、少なくとも５０マイクロスライド、又は少なくとも１００マイクロスライドを有することができる。他の実施形態において、カートは、１８マイクロスライド、５０マイクロスライド、又は６０マイクロスライドを有することができる。
いくつかの実施形態において、スプレッド層の成分は、インクジェット堆積プロセスを使用して加えることができる。インクジェット堆積プロセスによって加えられるスプレッド層の成分は、プロテアーゼ、亜硝酸ナトリウム、及び／又は塩化カルシウムを含むことができる。
いくつかの実施形態において、マイクロスライドは、支持層１１４と下部スライドマウント１１２との間にスペーサーウェブ(web)１３０を含むことができる。スペーサーは、組立の間、特に上部及び下部スライドマウントの溶接中のマイクロスライドの損傷を防止することができる。
いくつかの実施形態において、マイクロスライドは厚さを有する。スプレッド層、接着層、マスキング層、ゲル層、任意であるスペーサーウェブ及び支持層を含むマイクロスライドの厚さは、約１００μｍ、約２００μｍ、約３００μｍ、約４００μｍ、約５００μｍ、又は約６００μｍである。
（実施例１）
（ヘモグロビン光干渉を低減するためのＴｉＯ２マスキング層の使用）
６枚のマイクロスライドを用意する。そのうちの４枚はマスキング層にＴｉＯ２を含み、２枚は含まない。血液のサンプルは、スプレッド層上の各スライドに滴下される。
図２は、ＴｉＯ２マスキング層の影響を絵で表したものである。スライド１とスライド３とは、ＴｉＯ２マスキング層スライドのスポット側を示す。スライドのスポット側では、ヘモグロビンを確認できる。スライド２とスライド４は、ＴｉＯ２マスキング層のスライドの読み取り側を示す。スライドのゲル層側（読み取り側）からヘモグロビンが排除されている。
これに対し、スライド５とスライド６とは、それぞれ、マスキング層にＴｉＯ２を含まないマイクロスライドのスポット側（スライド５）と読み取り側（スライド６）とを示す。スライド６(読み取り側)ではヘモグロビンを容易に確認できる。
このように、ＴｉＯ２をマスキング層に含むことで、相当量のヘモグロビンがゲル層に浸透することを防ぐことができる。
図３Ａ及び３Ｂ並びに図４Ａ及び４Ｂは、「コントロールコーティング」（非ＴｉＯ２マスキング層）及びＴｉＯ２マスキング層についての、約６ｇ／から約２０ｇ／ｄＬまでのヘモグロビンの濃度範囲の１０レベルの溶血液シリーズについての動態プロットである。
波長５４０ｎｍ及び６７０ｎｍで５分間に渡って動態が記録されている。プロット上のスケールが異なることに注意されたい。コントロールコーティングについて、５４０ｎｍにおけるヘモグロビンシグナルは、典型的な動態プロフィールを示す。 ＴｉＯ２マスキング層スライドの５４０ｎｍでの応答は、コーティングのゲル層からヘモグロビンを排除することによって５４０ｎｍのシグナルがマスクされたことを示す。
同様に、コントロールコーティングの６７０ｎｍのヘモグロビンシグナルは、典型的な動態プロフィールを示す。このデータは、評価するヘモグロビンの濃度により、６７０ｎｍのヘモグロビンシグナルが異なることを示す。このシグナルは、ＨｂＡ１ｃアッセイの６７０ｎｍ染料の読み取りについて、補正アルゴリズムが必要な光学干渉につながる可能性がある。マスキング層に含まれるＴｉＯ２は、６７０ｎｍのヘモグロビンシグナルを大幅に低減し、ＨｂＡ１ｃ比色アッセイ（６７０ｎｍでの読み取り）の光学干渉を防止することができる。
図５及び図６は、ヘモグロビン濃度が増加する液体中の純粋なＦｒｕ－α－ＶａｌＨｉｓジペプチドの用量反応プロットを、ＴｉＯ２を含むマスキング層スライドとＴｉＯ２を含まないマスキング層とで比較して示す図である。図５では、液体はＴｉＯ２を含まないスライド上を流れる。このデータから、ヘモグロビン濃度の上昇に伴い、６７０ｎｍ（０．０ｍＭ Ｆｒｕ－α－ＶａｌＨｉｓ）におけるバックグラウンドシグナルが増加し、テストしたＦｒｕ－α－ＶａｌＨｉｓレベル全体でデルタシグナルの範囲で損失が発生していることがわかる。図６では、液体はＴｉＯ２含有マスキング層スライド上を流れる。このデータは、ヘモグロビン濃度が増加すると、６７０ｎｍ（０．０ｍＭ Ｆｒｕ－α－ＶａｌＨｉｓ）のバックグラウンドシグナルが一定になることを示す。６７０ｎｍにおけるヘモグロビンの光学的干渉は減少及び／又は除去された。
（実施例２）
（ＨｂＡ１ｃマイクロスライド検査）
モデル％Ａ１ｃ液体及び全血患者サンプルのＨｂＡ１ｃマイクロスライドデータを評価する。図７Ａ～Ｄは、モデル％Ａ１ｃ液体のシグナル生成と％Ａ１ｃ患者サンプルのシグナル生成との比較のための６７０ｎｍにおける反射率濃度（ＤＲ）の動態データを示す図である。
Ａ１ｃモデル液体と％Ａ１ｃ患者サンプルとは、同等の％Ａ１ｃである。ＨｂＡ１ｃマイクロスライドは、亜硝酸ナトリウムとプロテアーゼとを除き、全てホッパーコーティングされており、インクジェット堆積プロセスによって塗布されている。
また、変性界面活性剤（Ｎ－ラウロイルサルコシン、ＮＬＳ）を高濃度（被覆率）でコーティングすることにより、％Ａ１ｃモデル液体及び％Ａ１ｃ患者サンプルの動的応答が向上する。図７Ａ～Ｄから分かるように、％Ａ１ｃ患者サンプルは、％Ａ１ｃモデル液体と同様の動態プロフィールを有する。また、図７Ａ～Ｄは、評価され％Ａ１ｃレベル間に良好な識別性があることを示す。
図８Ａ及び８Ｂは、モデル％Ａ１ｃ液体のシグナル生成及び％Ａ１ｃ患者サンプルのシグナル生成の比較のための６７０ｎｍにおけるＤＲ動態データを示す図である。このデータは、本明細書に記載された酵素カスケードを実施するための全ての構成要素を組み込んだｘ－ホッパーコーティングで生成されたものである。
％Ａ１ｃモデル液体と％Ａ１ｃ患者サンプルとは、同等の％Ａ１ｃである。図８Ａ及び８Ｂから分かるように、％Ａ１ｃ患者サンプルは、％Ａ１ｃモデル液体と同様の動態プロファイルを有する。また、図８Ａ及び８Ｂは、評価された％Ａ１ｃレベル間に良好な識別性があることを示す。
図９は、％Ａ１ｃモデル液体及び全血％Ａ１ｃ患者サンプルについて、６７０ｎｍにおけるＤＲ用量応答データを示す。このデータは、図８Ａ及び８Ｂに示されるデータについて同じコーティングを使用して生成される。このデータは、全血患者サンプルが、精製糖化ヘモグロビンから作られた％Ａ１ｃモデル液体と同じ応答曲線を与えることを明確に示す。これは、本明細書に記載のマイクロスライドが、赤血球を溶解し、糖化ヘモグロビンを変性及び消化して、比色シグナルにつながる基質を生成できることを示すものである。
図１０は、ＨｂＡ１ｃマイクロスライドの患者サンプル予測％Ａ１ｃの結果と割り当てられたＨＰＬＳ％Ａ１ｃ値との相関プロットを示す。マイクロチップ％Ａ１ｃ参照と６７０ｎｍでのＨｂＡ１ｃマイクロスライド反射率濃度とに基づいた線形検量線モデルが、各患者サンプルについて６つの複製マイクロスライドのそれぞれを予測するために使用される。マイクロスライド％Ａ１ｃ予測の平均は、ＢｉｏＲａｄ Ｖａｒｉａｎｔ高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）％Ａ１ｃの結果と比較される。図１０で証明されるように、マイクロスライド％Ａ１ｃアッセイは、ＨＰＬＣ％Ａ１ｃアッセイと非常に強い相関を有する。
本実施例で取得し検討したデータに基づくと、本明細書に記載のマイクロスライドを用いて％Ａ１ｃの直接測定を実行可能である。
（実施例３）
（ＨｂＡ１ｃ成分とヘモグロビン成分の測定値とを用いた導出％Ａ１ｃ）
ここで、本明細書に記載されたＨｂＡ１ｃマイクロスライドをヘモグロビンマイクロスライドと組み合わせて使用し、患者サンプルの導出％Ａ１ｃの結果を生成する。
ここで、ＨｂＡ１ｃマイクロスライドは成分の糖化ヘモグロビンを測定し、別のヘモグロビンマイクロスライドは全ヘモグロビン成分を測定する。この２つの結果を用いて導出％Ａ１ｃテスト結果を算出する。
図１１は、前項で使用した％Ａ１ｃ患者サンプルのヘモグロビン成分の用量反応プロットを示す。５４０ｎｍにおける反射率濃度は、Ｖｉｔｒｏｓ Ｍｉｃｒｏｔｉｐヘモグロビン濃度結果（ｇ／ｄＬ）に対してプロットされる。
図１２は、患者サンプルの予測マイクロスライドヘモグロビン成分濃度と、ＭｉｃｒｏＴｉｐ基準ヘモグロビン値との相関プロットを示す。ＭｉｃｒｏＴｉｐヘモグロビン基準値及び５４０ｎｍにおけるヘモグロビンマイクロスライド反射率に基づく線形検量線モデルは、各患者サンプルの６つのヘモグロビンマイクロスライドの複製をそれぞれ予測するために使用される（図１１）。マイクロスライドヘモグロビン成分予測値の平均値は、ＭｉｃｒｏＴｉｐのヘモグロビン基準値と比較される。マイクロスライドヘモグロビン成分アッセイは、ＭｉｃｒｏＴｉｐヘモグロビンアッセイと良好な相関がある。
図１３は、実施例２で使用した％Ａ１ｃ患者サンプルについてＨｂＡ１ｃ成分の用量反応プロットを示す。６７０ｎｍでの反射率濃度は、ＭｉｃｒｏＴｉｐ ＨｂＡ１ｃ成分濃度結果（ｇ／ｄＬ）に対してプロットされている。
図１４は、患者サンプルの予測マイクロスライドＨｂＡ１ｃ成分濃度と、割り当てられたＭｉｃｒｏＴｉｐ基準ＨｂＡ１ｃ成分値との相関プロットを示す。ＭｉｃｒｏＴｉｐ ＨｂＡ１ｃ成分基準値及び６７０ｎｍにおけるＨｂＡ１ｃマイクロスライド反射率に基づく線形較正モデルは、各患者サンプルについて６つのＨｂＡ１ｃ成分の複製マイクロスライドのそれぞれを予測するために使用される（図１３）。マイクロスライドＨｂＡ１ｃ成分の予測値の平均は、ＭｉｃｒｏＴｉｐ ＨｂＡ１ｃ成分の基準値と比較される。マイクロスライドＨｂＡ１ｃ成分アッセイは、ＭｉｃｒｏＴｉｐ ＨｂＡ１ｃ成分アッセイと良好な相関性を有する。
図１５は、患者サンプルについて、予測ＭｉｃｒｏＳｌｉｄｅ誘導％Ａ１ｃとＢｉｏＲａｄ Ｖａｒｉａｎｔ ＨＰＬＣ基準％Ａ１ｃ値との相関プロットを示す。マイクロスライド％Ａ１ｃ値は、ヘモグロビン成分の結果（ｇ／ｄＬ）及びＨｂＡ１ｃ成分の結果（ｇ／ｄＬ）を使用して、国家糖化ヘモグロビン標準化プログラム「マスター式」（VITROS HbA1c MicroTip Assay Instructions for Use, Pub. J55871_EN, Version 2.0)を使用して、誘導％Ａ１ｃｗｐを生成することで得られる。
Figure 2022541839000002
マイクロスライドの％Ａ１ｃ値の平均をＨＰＬＣの％Ａ１ｃ基準値と比較する。マイクロスライドの導出％Ａ１ｃアッセイは、ＨＰＬＳ％Ａ１ｃアッセイと良好な相関がある。
実施例３のデータは、本明細書に記載のヘモグロビンマイクロスライドアッセイをＨｂＡ１ｃマイクロスライドアッセイと組み合わせて使用し、導出％Ａ１ｃの結果を生成することを実行可能であることを実証している。
（実施例４）
（ＨｂＡ１ｃ成分とヘモグロビン成分との決定を用いた導出％Ａ１ｃ）
ここで、シングルマイクロスライド検査素子を用いて、ヘモグロビンスペクトルの結果とＨｂＡ１ｃ酵素との結果を生成し、患者サンプルの導出％Ａ１ｃの結果を生成する。これは「デュアルアッセイ」マイクロスライド検査素子と呼ばれる。使用するマイクロスライドは、マスキング層に二酸化チタンを含まない。これは、二酸化チタンが５４０ｎｍのヘモグロビンシグナルを読み取る能力を阻害するためである。プロテアーゼと亜硝酸ナトリウムは、インクジェット堆積又はｘ－ホッパーコーティング処理によって、マイクロスライドに組み込むことができる。
図１６及び図１７は、デュアルアッセイマイクロスライド検査素子のＨｂＡ１ｃ成分用量反応データ（６７０ｎｍ）及びヘモグロビン成分用量反応（５４０ｎｍ）を示す。反射率濃度（ＤＲ）用量反応データは、デュアルアッセイマイクロスライド検査素子が、酵素カスケードが機能していることを示す６７０ｎｍにおいて用量依存的にＢＢＩ ＨｂＡ１ｃ液体シリーズを登録できることを示す。また、マイクロスライド検査素子は、５４０ｎｍで読み取ったヘモグロビンのスペクトルを用量依存的に測定する。実施例３に記載したように、「デュアルアッセイ」マイクロスライド検査素子を用いて、導出％Ａ１ｃ測定をすることが実現可能である。
（実施例５）
（％Ａ１ｃの直接測定）
全血サンプルは、本明細書で説明するマイクロスライドに適用される。本明細書に記載の酵素カスケードにより、６７０ｎｍの光を吸収する酸化染料が生成され、マイクロスライドはマスキング層を用いて非糖化ヘモグロビンをろ過する。光はマスキング層中の二酸化チタンで反射され、反射濃度を６７０ｎｍで読み取る。％Ａ１ｃ検量線により、反射濃度を％Ａ１ｃとして直接算出する。
（実施例６）
（１つのサンプルを使用した導出％Ａ１ｃ）
全血のサンプルは、マスキング層に二酸化チタンを含まない本明細書に記載のマイクロスライドに適用される。本明細書に記載の酵素カスケードにより、６７０ｎｍで光を吸収する酸化染料が生成され、５４０ｎｍで非糖化ヘモグロビンを測定することができる。５４０ｎｍと６７０ｎｍとの測定値から、導出％Ａ１ｃを算出することができる。
（実施例７）
（シングルマイクロスライド上での２つのサンプルを使用した導出％Ａ１ｃ）
２つの全血サンプルをマイクロスライドの２つの領域に別々に適用する。一方の領域は二酸化チタンをマスキング層中に含み、本明細書に記載した酵素カスケードによって６７０ｎｍの光を吸収する酸化染料が生成される。もう一方の領域は二酸化チタンを含まないため、非糖化ヘモグロビンを５４０ｎｍで直接測定することができる。５４０ｎｍと６７０ｎｍとでの測定値から、導出％Ａ１ｃを算出することができる。
（実施例８）
（シングルスライド上での２回の測定を使用した導出％Ａ１ｃ）
全血のサンプルを本明細書に記載のマイクロスライドに適用する。本明細書に記載された酵素カスケードにより、６７０ｎｍの光を吸収する酸化染料が生成され、マイクロスライドはそのマスキング層により非糖化ヘモグロビンのシグナルを除去する。光はマスキング層の下から酸化チタンを用いて反射され、６７０ｎｍで反射濃度を読み取られる。また、光は、マスキング層の上から、酸化チタンとスプレッド層中のＶｔＥビーズとにより反射され、５４０ｎｍでヘモグロビンの反射率濃度を読み取られる。５４０ｎｍと６７０ｎｍとでの測定値から、導出％Ａ１ｃを算出することができる。
（実施例９）
（アスコルビン酸干渉の低減）
１人の患者から２つのサンプルを採取する。この患者は、抗がん作用を得るために、アスコルビン酸をメガドーズされている。第１のサンプルを、そのゲル層にアスコルビン酸オキシダーゼを含むスライドで、第２のサンプルを、アスコルビン酸オキシダーゼを含まないスライドで測定する。
第１のサンプルからの結果は、第２のサンプルよりも高い％Ａ１ｃ値を示す。
特に他が示されていない限り、本明細書及び請求項で使用される成分の量、分子量のような特性、反応条件等を表す全ての数値は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。従って、反対が示されていない限り、本明細書及び添付の請求項に記載された数値パラメータは、本発明によって得ようとする所望の特性によって変化し得る近似値である。少なくとも、請求項の範囲について均等論の適用を制限しようとするものではなく、各数値パラメータは、少なくとも、報告された有効数字の桁数に照らして、通常の概数を適用することにより解釈されるべきものである。本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータが近似値であるにも関わらず、具体例に示された数値は、可能な限り正確に報告されている。しかし、どの数値も、それぞれの試験測定で見られる標準偏差から必然的に生じる一定の誤差を本質的に含む。
本発明を説明する文脈で（特に以下の請求項の文脈で）使用される用語「a」、「an」、「the」及び類似の指示語は、本明細書に別途示されるか、文脈から明らかに矛盾しない限り、単数と複数との両方を含むように解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の記載は、単に、範囲内に入る各個別の値を個別に参照するための略記法として機能することを意図する。本明細書において他が示されていない限り、各個別の値は、本明細書において個別に言及されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書で特に示されない限り、又は文脈から明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。本明細書で提供される任意の及び全ての例、又は例示的な言語（例えば、「のような」）の使用は、単に本発明をより理解を容易にすることを意図しており、別途請求される本発明の範囲に制限をもたらすものではない。本明細書におけるいかなる文言も、本発明の実施に不可欠な非請求の要素を示すものとして解釈されるべきではない。
本明細書に開示された本発明の代替の要素又は実施形態のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各グループの構成要素は、又はグループの他の構成要素若しくは本明細書に見出される他の要素との任意の組み合わせで、個別に参照及び請求することができる。便宜上及び／又は特許性の理由から、グループの１つ又は複数の構成要素がグループに含まれ、又はグループから削除されることが予想される。そのような包含又は削除が行われる場合、本明細書は、修正されたグループを含むとみなされ、従って、添付の請求項で使用されるすべてのマーカッシュ形式のグループの記述に合致する。
この発明の特定の実施形態は、この発明を実施するために本発明者に知られている最良の態様を含めて、本明細書に記載されている。当然ながら、これらの説明された実施形態に対する変形は、前述の説明を読むことで当業者には明らかになるだろう。本発明者は、当業者がこのような変形を適宜採用することを予期しており、本発明者は、本明細書に具体的に記載された以外の方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、適用される法律によって許可される、本明細書に添付の請求項に記載された主題の全ての変更及び均等物を含む。更に、その全ての可能な変形における上述の要素の任意の組み合わせは、本明細書に別途示されるか、又は文脈に明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。
最後に、本明細書に開示された本発明の実施形態は、本発明の原理を例示するものであることが理解されるべきである。採用され得る他の改変は、本発明の範囲内である。従って、限定ではなく例として、本発明の代替的な構成が、本明細書の教示に従って利用され得る。従って、本発明は、図示及び説明さている通り正確に限定されるものではない。
［付記］
［付記１］
架橋ゲルを含み、前記架橋ゲルが検出剤、フルクトシルオキシダーゼ、干渉防止剤、及びペルオキシダーゼを含む第１のフィルム層と、
第１のゲルを含む第２のフィルム層と、
溶解剤、変性剤、及びプロテアーゼを含む第３のフィルム層と、
を下から上に向かって含むフィルム層の積層体を含む、スライド。
［付記２］
前記溶解剤は、洗浄剤である、
ことを特徴とする付記１に記載のスライド。
［付記３］
前記洗浄剤は、オクチルフェノールエトキシレート（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００）、ＴＷＥＥＮ（ＴＷＥＥＮ ２０）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ＰＯＥ）、及びＮＯＮＩＤＥＴ Ｐ－４０（ＮＰ－４０）からなる群から選択される、
ことを特徴とする付記２に記載のスライド。
［付記４］
前記洗浄剤は、オクチルフェノールエトキシレートである、
ことを特徴とする付記３に記載のスライド。
［付記５］
前記変性剤は、界面活性剤である、
ことを特徴とする付記１に記載のスライド。
［付記６］
前記変性剤は、亜硝酸ナトリウム又はＮ－ラウロイルサルコシン（ＮＬＳ）のうちの１つ以上である、
ことを特徴とする付記５に記載のスライド。
［付記７］
前記プロテアーゼは、メタロプロテアーゼである、
ことを特徴とする付記１に記載のスライド。
［付記８］
前記第３のフィルム層は、カルシウムを更に含む、
ことを特徴とする付記７に記載のスライド。
［付記９］
前記プロテアーゼは、中性プロテアーゼである、
ことを特徴とする付記８に記載のスライド。
［付記１０］
前記プロテアーゼは、エンドプロテアーゼ又はエキソプロテアーゼである、
ことを特徴とする付記１に記載のスライド。
［付記１１］
前記プロテアーゼが、プロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ、プロテアーゼXVII、プロテアーゼXXI、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、サーモリシン及びサブチリシンからなる群から選択される、
ことを特徴とする付記１０に記載のスライド。
［付記１２］
前記ペルオキシダーゼは、ホースラディッシュペルオキシダーゼである、
ことを特徴とする付記１に記載のスライド。
［付記１３］
前記検出剤は、Ｎ－カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４’－ビス（ジメチルアミノ）－ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ－６４）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’，Ｎ” ，Ｎ”－ヘキサ（３－スルホプロピル）－４，４’，４”－トリアミノ－トリフェニルメタン六ナトリウム塩（ＴＰＭ－ＰＳ）、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム（ＤＡ－６７）、及び２－（３，５－ジメトキシ－４－ヒドロキシフェノール）－４，５－ビス（４－ジメチルアミノフェニル）イミダゾールからなる群から選択される、
ことを特徴とする付記１に記載のスライド。
［付記１４］
前記第２のフィルム層は、反射材料部を更に含む、
ことを特徴とする付記１に記載のスライド。
［付記１５］
前記反射材料部は、金属を含む、
ことを特徴とする付記１４に記載のスライド。
［付記１６］
前記金属は、チタンである、
ことを特徴とする付記１５に記載のスライド。
［付記１７］
前記第３のフィルム層は、約２５μｍの直径を有する粒子を備える層を更に含む、
ことを特徴とする付記１に記載のスライド。
［付記１８］
前記第３のフィルム層は、オキシダーゼ補因子及び界面活性剤を更に含む、
ことを特徴とする付記１に記載のスライド。
［付記１９］
前記オキシダーゼ補因子は、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）である、
ことを特徴とする付記１８に記載のスライド。
［付記２０］
前記フルクトシルオキシダーゼは、Ｆｒｕ－α－ＶａｌＨｉｓペプチド又はＦｒｕ－α－Ｖａｌアミノ酸に特異的である、
ことを特徴とする付記１８に記載のスライド。
［付記２１］
前記第１のフィルム層は、前記第２フィルム層の下面に直接接触している、
ことを特徴とする付記１に記載のスライド。
［付記２２］
前記第２のフィルム層は、前記第３のフィルム層の下面に直接接触する、
ことを特徴とする付記２１に記載のスライド。
［付記２３］
前記干渉防止剤は、アスコルビン酸オキシダーゼである、
ことを特徴とする付記１に記載のスライド。
［付記２４］
ａ）付記１に記載のスライドを提供するステップ、
ｂ）前記スライドの前記第３のフィルム層を赤血球を含む未溶解の血液サンプルと接触させるステップであって、前記溶解剤が前記赤血球から糖化ヘモグロビンを放出させ、前記変性剤が前記糖化ヘモグロビンと接触して前記糖化ヘモグロビンを変性させ、前記プロテアーゼが変性された前記糖化ヘモグロビンからフルクトシルペプチドを放出させ、前記フルクトシルペプチドが前記第１のフィルム層に到達し前記フルクトシルオキシダーゼと接触して過酸化物を放出させ、前記ペルオキシダーゼ及び前記過酸化物が前記検出剤と接触して検出可能なシグナルを放出させる、ステップ、
ｃ）前記血液サンプルからヘモグロビンの量を測定するステップであって、ヘモグロビンの量を測定する該ステップは、光の第１の波長における前記スライドからの前記サンプルの反射率濃度を読み取ることを含む、ステップ、及び、
ｄ）前記血液サンプルからの糖化ヘモグロビンの量を測定するステップであって、糖化ヘモグロビンの量を測定する該ステップは、光の第２の波長における前記サンプルからの前記検出可能なシグナルの反射率濃度を検出することを含み、光の前記第２の波長は、光の前記第１の波長とは異なる、ステップ、
を含む、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンを検出するためのシングルスライド方法。
［付記２５］
光の前記第１の波長は５４０ｎｍであり、光の前記第２の波長は６７０ｎｍである、
ことを特徴とする付記２４に記載の方法。
［付記２６］
前記溶解剤は、オクチルフェノールエトキシレート（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００）、ＴＷＥＥＮ（ＴＷＥＥＮ ２０）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ＰＯＥ）、及びＮＯＮＩＤＥＴ Ｐ－４０（ＮＰ－４０）からなる群から選択される洗浄剤である、
ことを特徴とする付記２４に記載の方法。
［付記２７］
前記洗浄剤は、オクチルフェノールエトキシレートである、
ことを特徴とする付記２６に記載の方法。
［付記２８］
前記変性剤は、亜硝酸ナトリウム又はＮ－ラウロイルサルコシン（ＮＬＳ）のうちの１つ以上である、
ことを特徴とする付記２４に記載の方法。
［付記２９］
前記プロテアーゼは、メタロプロテアーゼ、エンドプロテアーゼ又はエキソプロテアーゼである、
ことを特徴とする付記２４に記載の方法。
［付記３０］
前記メタロプロテアーゼは、中性プロテアーゼである、
ことを特徴とする付記２９に記載の方法。
［付記３１］
前記フルクトシルペプチドを、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）であるオキシダーゼ補因子と、接触させることを更に含む、
ことを特徴とする付記２４に記載の方法。
［付記３２］
前記ペルオキシダーゼは、ホースラディッシュペルオキシダーゼである、
ことを特徴とする付記２４に記載の方法。
［付記３３］
前記検出剤は、ロイコ染料である、
ことを特徴とする付記２４に記載の方法。
［付記３４］
ａ）付記１４に記載のスライドを提供するステップ、
ｂ）前記スライドの前記第３のフィルム層を赤血球を含む血液サンプルと接触させるステップであって、前記溶解剤が前記赤血球から糖化ヘモグロビンを放出させ、前記変性剤が前記糖化ヘモグロビンと接触して前記糖化ヘモグロビンを変性させ、前記プロテアーゼが変性された前記糖化ヘモグロビンからフルクトシルペプチドを放出させ、前記フルクトシルペプチドが前記第２のフィルム層を横断し、前記フルクトシルペプチドが前記第１のフィルム層に到達して前記フルクトシルオキシダーゼと接触し過酸化物を放出させ、前記ペルオキシダーゼ及び前記過酸化物が前記検出剤と接触して検出可能なシグナルを放出する、ステップ、及び、
ｃ）前記血液サンプルからの前記糖化ヘモグロビンの量を測定するステップであって、前記糖化ヘモグロビンの量を測定する該ステップは、前記サンプル中の前記検出可能なシグナルの反射率濃度を検出することを含む、ステップ、
を含む、糖化ヘモグロビンを直接検出するためのシングルスライド方法。
［付記３５］
前記反射材料部は、金属を含む、
ことを特徴とする付記３４に記載の方法。
［付記３６］
前記フルクトシルペプチドは、前記架橋ゲルを横断する、
ことを特徴とする付記３４に記載の方法。
［付記３７］
前記プロテアーゼは、メタロプロテアーゼ、エンドプロテアーゼ又はエキソプロテアーゼである、
ことを特徴とする付記３４に記載の方法。
［付記３８］
前記メタロプロテアーゼは、中性プロテアーゼである、
ことを特徴とする付記３７に記載の方法。
［付記３９］
前記フルクトシルペプチドを、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）であるオキシダーゼ補因子と、接触させることを更に含む、
ことを特徴とする付記３４に記載の方法。
［付記４０］
前記ペルオキシダーゼは、ホースラディッシュペルオキシダーゼである、
ことを特徴とする付記３４に記載の方法。
［付記４１］
前記検出剤は、ロイコ染料である、
ことを特徴とする付記３４に記載の方法。

Claims (41)

  1. 架橋ゲルを含み、前記架橋ゲルが検出剤、フルクトシルオキシダーゼ、干渉防止剤、及びペルオキシダーゼを含む第１のフィルム層と、
    第１のゲルを含む第２のフィルム層と、
    溶解剤、変性剤、及びプロテアーゼを含む第３のフィルム層と、
    を下から上に向かって含むフィルム層の積層体を含む、スライド。
  2. 前記溶解剤は、洗浄剤である、
    ことを特徴とする請求項１に記載のスライド。
  3. 前記洗浄剤は、オクチルフェノールエトキシレート（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００）、ＴＷＥＥＮ（ＴＷＥＥＮ ２０）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ＰＯＥ）、及びＮＯＮＩＤＥＴ Ｐ－４０（ＮＰ－４０）からなる群から選択される、
    ことを特徴とする請求項２に記載のスライド。
  4. 前記洗浄剤は、オクチルフェノールエトキシレートである、
    ことを特徴とする請求項３に記載のスライド。
  5. 前記変性剤は、界面活性剤である、
    ことを特徴とする請求項１に記載のスライド。
  6. 前記変性剤は、亜硝酸ナトリウム又はＮ－ラウロイルサルコシン（ＮＬＳ）のうちの１つ以上である、
    ことを特徴とする請求項５に記載のスライド。
  7. 前記プロテアーゼは、メタロプロテアーゼである、
    ことを特徴とする請求項１に記載のスライド。
  8. 前記第３のフィルム層は、カルシウムを更に含む、
    ことを特徴とする請求項７に記載のスライド。
  9. 前記プロテアーゼは、中性プロテアーゼである、
    ことを特徴とする請求項８に記載のスライド。
  10. 前記プロテアーゼは、エンドプロテアーゼ又はエキソプロテアーゼである、
    ことを特徴とする請求項１に記載のスライド。
  11. 前記プロテアーゼが、プロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ、プロテアーゼXVII、プロテアーゼXXI、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、サーモリシン及びサブチリシンからなる群から選択される、
    ことを特徴とする請求項１０に記載のスライド。
  12. 前記ペルオキシダーゼは、ホースラディッシュペルオキシダーゼである、
    ことを特徴とする請求項１に記載のスライド。
  13. 前記検出剤は、Ｎ－カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４’－ビス（ジメチルアミノ）－ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ－６４）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’，Ｎ” ，Ｎ”－ヘキサ（３－スルホプロピル）－４，４’，４”－トリアミノ－トリフェニルメタン六ナトリウム塩（ＴＰＭ－ＰＳ）、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム（ＤＡ－６７）、及び２－（３，５－ジメトキシ－４－ヒドロキシフェノール）－４，５－ビス（４－ジメチルアミノフェニル）イミダゾールからなる群から選択される、
    ことを特徴とする請求項１に記載のスライド。
  14. 前記第２のフィルム層は、反射材料部を更に含む、
    ことを特徴とする請求項１に記載のスライド。
  15. 前記反射材料部は、金属を含む、
    ことを特徴とする請求項１４に記載のスライド。
  16. 前記金属は、チタンである、
    ことを特徴とする請求項１５に記載のスライド。
  17. 前記第３のフィルム層は、約２５μｍの直径を有する粒子を備える層を更に含む、
    ことを特徴とする請求項１に記載のスライド。
  18. 前記第３のフィルム層は、オキシダーゼ補因子及び界面活性剤を更に含む、
    ことを特徴とする請求項１に記載のスライド。
  19. 前記オキシダーゼ補因子は、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）である、
    ことを特徴とする請求項１８に記載のスライド。
  20. 前記フルクトシルオキシダーゼは、Ｆｒｕ－α－ＶａｌＨｉｓペプチド又はＦｒｕ－α－Ｖａｌアミノ酸に特異的である、
    ことを特徴とする請求項１８に記載のスライド。
  21. 前記第１のフィルム層は、前記第２フィルム層の下面に直接接触している、
    ことを特徴とする請求項１に記載のスライド。
  22. 前記第２のフィルム層は、前記第３のフィルム層の下面に直接接触する、
    ことを特徴とする請求項２１に記載のスライド。
  23. 前記干渉防止剤は、アスコルビン酸オキシダーゼである、
    ことを特徴とする請求項１に記載のスライド。
  24. ａ）請求項１に記載のスライドを提供するステップ、
    ｂ）前記スライドの前記第３のフィルム層を赤血球を含む未溶解の血液サンプルと接触させるステップであって、前記溶解剤が前記赤血球から糖化ヘモグロビンを放出させ、前記変性剤が前記糖化ヘモグロビンと接触して前記糖化ヘモグロビンを変性させ、前記プロテアーゼが変性された前記糖化ヘモグロビンからフルクトシルペプチドを放出させ、前記フルクトシルペプチドが前記第１のフィルム層に到達し前記フルクトシルオキシダーゼと接触して過酸化物を放出させ、前記ペルオキシダーゼ及び前記過酸化物が前記検出剤と接触して検出可能なシグナルを放出させる、ステップ、
    ｃ）前記血液サンプルからヘモグロビンの量を測定するステップであって、ヘモグロビンの量を測定する該ステップは、光の第１の波長における前記スライドからの前記サンプルの反射率濃度を読み取ることを含む、ステップ、及び、
    ｄ）前記血液サンプルからの糖化ヘモグロビンの量を測定するステップであって、糖化ヘモグロビンの量を測定する該ステップは、光の第２の波長における前記サンプルからの前記検出可能なシグナルの反射率濃度を検出することを含み、光の前記第２の波長は、光の前記第１の波長とは異なる、ステップ、
    を含む、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンを検出するためのシングルスライド方法。
  25. 光の前記第１の波長は５４０ｎｍであり、光の前記第２の波長は６７０ｎｍである、
    ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
  26. 前記溶解剤は、オクチルフェノールエトキシレート（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００）、ＴＷＥＥＮ（ＴＷＥＥＮ ２０）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ＰＯＥ）、及びＮＯＮＩＤＥＴ Ｐ－４０（ＮＰ－４０）からなる群から選択される洗浄剤である、
    ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
  27. 前記洗浄剤は、オクチルフェノールエトキシレートである、
    ことを特徴とする請求項２６に記載の方法。
  28. 前記変性剤は、亜硝酸ナトリウム又はＮ－ラウロイルサルコシン（ＮＬＳ）のうちの１つ以上である、
    ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
  29. 前記プロテアーゼは、メタロプロテアーゼ、エンドプロテアーゼ又はエキソプロテアーゼである、
    ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
  30. 前記メタロプロテアーゼは、中性プロテアーゼである、
    ことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
  31. 前記フルクトシルペプチドを、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）であるオキシダーゼ補因子と、接触させることを更に含む、
    ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
  32. 前記ペルオキシダーゼは、ホースラディッシュペルオキシダーゼである、
    ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
  33. 前記検出剤は、ロイコ染料である、
    ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
  34. ａ）請求項１４に記載のスライドを提供するステップ、
    ｂ）前記スライドの前記第３のフィルム層を赤血球を含む血液サンプルと接触させるステップであって、前記溶解剤が前記赤血球から糖化ヘモグロビンを放出させ、前記変性剤が前記糖化ヘモグロビンと接触して前記糖化ヘモグロビンを変性させ、前記プロテアーゼが変性された前記糖化ヘモグロビンからフルクトシルペプチドを放出させ、前記フルクトシルペプチドが前記第２のフィルム層を横断し、前記フルクトシルペプチドが前記第１のフィルム層に到達して前記フルクトシルオキシダーゼと接触し過酸化物を放出させ、前記ペルオキシダーゼ及び前記過酸化物が前記検出剤と接触して検出可能なシグナルを放出する、ステップ、及び、
    ｃ）前記血液サンプルからの前記糖化ヘモグロビンの量を測定するステップであって、前記糖化ヘモグロビンの量を測定する該ステップは、前記サンプル中の前記検出可能なシグナルの反射率濃度を検出することを含む、ステップ、
    を含む、糖化ヘモグロビンを直接検出するためのシングルスライド方法。
  35. 前記反射材料部は、金属を含む、
    ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
  36. 前記フルクトシルペプチドは、前記架橋ゲルを横断する、
    ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
  37. 前記プロテアーゼは、メタロプロテアーゼ、エンドプロテアーゼ又はエキソプロテアーゼである、
    ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
  38. 前記メタロプロテアーゼは、中性プロテアーゼである、
    ことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
  39. 前記フルクトシルペプチドを、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）であるオキシダーゼ補因子と、接触させることを更に含む、
    ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
  40. 前記ペルオキシダーゼは、ホースラディッシュペルオキシダーゼである、
    ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
  41. 前記検出剤は、ロイコ染料である、
    ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
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