JP3910174B2 - アジ化ナトリウムを用いた測定方法 - Google Patents
アジ化ナトリウムを用いた測定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3910174B2 JP3910174B2 JP2003536453A JP2003536453A JP3910174B2 JP 3910174 B2 JP3910174 B2 JP 3910174B2 JP 2003536453 A JP2003536453 A JP 2003536453A JP 2003536453 A JP2003536453 A JP 2003536453A JP 3910174 B2 JP3910174 B2 JP 3910174B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- measurement
- sample
- oxidation
- sodium azide
- tetrazolium compound
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 108
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 title claims description 26
- -1 tetrazolium compound Chemical class 0.000 claims abstract description 77
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 claims abstract description 35
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 74
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical group OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 44
- 230000032683 aging Effects 0.000 claims description 33
- 108091005996 glycated proteins Proteins 0.000 claims description 28
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 24
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 10
- 108010078123 amadoriase Proteins 0.000 claims description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 claims description 7
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 7
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- 102000017011 Glycated Hemoglobin A Human genes 0.000 claims description 5
- 108091005995 glycated hemoglobin Proteins 0.000 claims description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 5
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims description 4
- 125000006306 4-iodophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C([H])C([H])=C1I 0.000 claims description 3
- 125000001917 2,4-dinitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C(=C1*)[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 19
- 239000012491 analyte Substances 0.000 abstract 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 48
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 46
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 24
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 21
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 19
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 18
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 18
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 18
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 14
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 14
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 14
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 12
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 12
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 11
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 9
- 150000003536 tetrazoles Chemical group 0.000 description 9
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 8
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 8
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000000306 component Substances 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 6
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 6
- RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 4-aminoantipyrine Chemical compound CN1C(C)=C(N)C(=O)N1C1=CC=CC=C1 RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- DBOOMZAMPJBDOE-UHFFFAOYSA-N 4-[2-(2,4-dinitrophenyl)-3-(4-iodophenyl)-1h-tetrazol-5-yl]benzene-1,3-disulfonic acid Chemical class OS(=O)(=O)C1=CC(S(=O)(=O)O)=CC=C1C1=NN(C=2C=CC(I)=CC=2)N(C=2C(=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O)N1 DBOOMZAMPJBDOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 4
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 4
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 4
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 4
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 4
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 4
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 4
- 241001465318 Aspergillus terreus Species 0.000 description 3
- 108010004032 Bromelains Proteins 0.000 description 3
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 3
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 3
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 3
- 108010060059 Sarcosine Oxidase Proteins 0.000 description 3
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 239000004305 biphenyl Substances 0.000 description 3
- 235000019835 bromelain Nutrition 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 3
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 3
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 description 3
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 3
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 2
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 239000008000 CHES buffer Substances 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 2
- 241000221778 Fusarium fujikuroi Species 0.000 description 2
- 241000210525 Fusarium oxysporum f. sp. pini Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N HEPPS Chemical compound OCCN1CCN(CCCS(O)(=O)=O)CC1 OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 2
- 241000228129 Penicillium janthinellum Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008118 Sarcosine oxidase Human genes 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 150000001323 aldoses Chemical class 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 229940107161 cholesterol Drugs 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N diphenyl Chemical group C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 2
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- BEBCJVAWIBVWNZ-UHFFFAOYSA-N glycinamide Chemical compound NCC(N)=O BEBCJVAWIBVWNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000003170 phenylsulfonyl group Chemical group C1(=CC=CC=C1)S(=O)(=O)* 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 229920000259 polyoxyethylene lauryl ether Polymers 0.000 description 2
- 108010043393 protease N Proteins 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000002088 tosyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1C([H])([H])[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 1-naphthol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=CC2=C1 KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RUFPHBVGCFYCNW-UHFFFAOYSA-N 1-naphthylamine Chemical compound C1=CC=C2C(N)=CC=CC2=C1 RUFPHBVGCFYCNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJMPZWOQMLJCRS-UHFFFAOYSA-N 2,3-diphenyl-1h-tetrazole-5-carbonitrile Chemical class N1C(C#N)=NN(C=2C=CC=CC=2)N1C1=CC=CC=C1 FJMPZWOQMLJCRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UBJIPDGISJLPQU-UHFFFAOYSA-N 2,3-diphenyl-5-thiophen-2-yl-1H-tetrazole Chemical class N1N(C=2C=CC=CC=2)N(C=2C=CC=CC=2)N=C1C1=CC=CS1 UBJIPDGISJLPQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CCBICDLNWJRFPO-UHFFFAOYSA-N 2,6-dichloroindophenol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1N=C1C=C(Cl)C(=O)C(Cl)=C1 CCBICDLNWJRFPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXNKNVCYDIVHSA-UHFFFAOYSA-N 2-(4-methylphenyl)-3,5-diphenyl-1h-tetrazole Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1N1N(C=2C=CC=CC=2)N=C(C=2C=CC=CC=2)N1 IXNKNVCYDIVHSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVQFQZZGTZFUNF-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3-[4-(2-hydroxy-3-sulfonatopropyl)piperazine-1,4-diium-1-yl]propane-1-sulfonate Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN1CCN(CC(O)CS(O)(=O)=O)CC1 LVQFQZZGTZFUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CDJXJFDPAXBVDM-UHFFFAOYSA-N 3,5-diphenyl-2-[4-(2-phenylethenyl)phenyl]-1h-tetrazole Chemical class N1N(C=2C=CC(C=CC=3C=CC=CC=3)=CC=2)N(C=2C=CC=CC=2)N=C1C1=CC=CC=C1 CDJXJFDPAXBVDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OJPYZWGULWNRSE-UHFFFAOYSA-O 3,5-diphenyl-2h-tetrazol-3-ium Chemical class C1=CC=CC=C1C1=[NH+]N(C=2C=CC=CC=2)N=N1 OJPYZWGULWNRSE-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- RIZJLOONYNJWKF-UHFFFAOYSA-N 3-(3-methylphenyl)-2,5-diphenyl-1h-tetrazole Chemical class CC1=CC=CC(N2N(NC(=N2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=C1 RIZJLOONYNJWKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- INEWUCPYEUEQTN-UHFFFAOYSA-N 3-(cyclohexylamino)-2-hydroxy-1-propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CNC1CCCCC1 INEWUCPYEUEQTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NUFBIAUZAMHTSP-UHFFFAOYSA-N 3-(n-morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN1CCOCC1 NUFBIAUZAMHTSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XCBLFURAFHFFJF-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-hydroxyethyl)azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)CS(O)(=O)=O XCBLFURAFHFFJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DVYSLVUKWUHBQL-UHFFFAOYSA-N 4-[2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-1h-tetrazol-5-yl]benzene-1,3-disulfonic acid Chemical class COC1=CC([N+]([O-])=O)=CC=C1N1N(C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)N=C(C=2C(=CC(=CC=2)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)N1 DVYSLVUKWUHBQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAJSIAXXSFQVPJ-UHFFFAOYSA-N 4-[2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-1h-tetrazol-5-yl]benzene-1,3-disulfonic acid Chemical class OS(=O)(=O)C1=CC(S(=O)(=O)O)=CC=C1C1=NN(C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)N(C=2C=CC(I)=CC=2)N1 PAJSIAXXSFQVPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QUOMYOAFIHIRQG-UHFFFAOYSA-N 5-(4-chlorophenyl)-2,3-diphenyl-1h-tetrazole Chemical class C1=CC(Cl)=CC=C1C1=NN(C=2C=CC=CC=2)N(C=2C=CC=CC=2)N1 QUOMYOAFIHIRQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HLQLADJVXUGAKG-UHFFFAOYSA-N 5-ethyl-2,3-diphenyl-1h-tetrazole Chemical class N1C(CC)=NN(C=2C=CC=CC=2)N1C1=CC=CC=C1 HLQLADJVXUGAKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TXCKVRLFZFJSDF-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2,3-diphenyl-1h-tetrazole Chemical class N1C(C)=NN(C=2C=CC=CC=2)N1C1=CC=CC=C1 TXCKVRLFZFJSDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003691 Amadori rearrangement reaction Methods 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000216654 Armillaria Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000008001 CAPS buffer Substances 0.000 description 1
- 108010089254 Cholesterol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000274788 Fusarium oxysporum f. sp. apii Species 0.000 description 1
- 241000879839 Fusarium oxysporum f. sp. batatas Species 0.000 description 1
- 241001443714 Fusarium oxysporum f. sp. fragariae Species 0.000 description 1
- 241000508192 Fusarium oxysporum f. sp. niveum Species 0.000 description 1
- 241000222336 Ganoderma Species 0.000 description 1
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 239000006173 Good's buffer Substances 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 208000007976 Ketosis Diseases 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCNC1CCCCC1 MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 241000228150 Penicillium chrysogenum Species 0.000 description 1
- 241000985533 Penicillium cyaneum Species 0.000 description 1
- 241001136550 Penicillium javanicum Species 0.000 description 1
- 241000985513 Penicillium oxalicum Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010079870 Sarcosine Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000013000 Sarcosine dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710097834 Thiol protease Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 108010092464 Urate Oxidase Proteins 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000005215 alkyl ethers Chemical class 0.000 description 1
- 125000004414 alkyl thio group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004397 aminosulfonyl group Chemical group NS(=O)(=O)* 0.000 description 1
- 150000001448 anilines Chemical class 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 235000010290 biphenyl Nutrition 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 108010023417 cholesterol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001033 ether group Chemical group 0.000 description 1
- SFNALCNOMXIBKG-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol monododecyl ether Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCO SFNALCNOMXIBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N fructose group Chemical group OCC(=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- MNQZXJOMYWMBOU-UHFFFAOYSA-N glyceraldehyde Chemical group OCC(O)C=O MNQZXJOMYWMBOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005150 glycerol Drugs 0.000 description 1
- 108010090622 glycerol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010004903 glycosylated serum albumin Proteins 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000001867 hydroperoxy group Chemical group [*]OO[H] 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N isothiocyanate group Chemical group [N-]=C=S ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002584 ketoses Chemical class 0.000 description 1
- 125000001553 ketosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 125000004092 methylthiomethyl group Chemical group [H]C([H])([H])SC([H])([H])* 0.000 description 1
- 150000004780 naphthols Chemical class 0.000 description 1
- 150000005002 naphthylamines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000018 nitroso group Chemical group N(=O)* 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 description 1
- 238000006864 oxidative decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004043 oxo group Chemical group O=* 0.000 description 1
- 125000001820 oxy group Chemical group [*:1]O[*:2] 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 235000015067 sauces Nutrition 0.000 description 1
- 235000013555 soy sauce Nutrition 0.000 description 1
- 108010085346 steroid delta-isomerase Proteins 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 125000005504 styryl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000213 sulfino group Chemical group [H]OS(*)=O 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 125000001544 thienyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 125000000464 thioxo group Chemical group S=* 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 229930195735 unsaturated hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
- G01N33/721—Haemoglobin
- G01N33/723—Glycosylated haemoglobin
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
Description
【発明の属する技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化還元反応を用いた測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、酸化還元反応を利用して、試料中の測定対象物の量を測定することは、広く実施されており、例えば、生化学分析や臨床検査等における糖化タンパク質の測定にも適用されている。
【０００３】
例えば、血液中の糖化タンパク質、特に赤血球中の糖化ヘモグロビンは、生体血糖値の過去の履歴を反映しているため、糖尿病診断や治療等における重要な指標とされている。このような赤血球中の糖化タンパク質は、前記酸化還元反応を用いて、例えば、以下に示すようにして測定されている。
【０００４】
まず、赤血球を溶血させた試料を調製し、この溶血試料をフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」という）で処理し、糖化タンパク質の糖化部分に作用させて過酸化水素を発生させる。この過酸化水素量は、前記糖化タンパク質量に対応する。そして、この試料に、ペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」という）および還元剤を添加し、前記ＰＯＤを触媒として前記過酸化水素と前記還元剤との間で酸化還元反応させる。この時、前記還元剤として、酸化されることにより発色する還元剤を用いれば、その発色の測定により前記過酸化水素量を測定でき、この結果、赤血球中の糖化タンパク質量を知ることができる。
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、これらの従来の方法では、試料によっては測定感度が十分でないために、測定精度が向上しない場合もある。また、前述のように、血液中の糖化タンパク質は、糖尿病診断や治療等における重要な指標とされているため、これを測定するための酸化還元反応を用いた測定方法においても、更なる測定精度の向上が望まれている。
【０００６】
そこで、本発明の目的は、試料中の測定対象物を、酸化還元反応を用いて測定する方法であって、測定感度に優れる測定方法の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明の測定方法は、試料中の測定対象物を酸化還元反応を用いて測定する方法であって、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの存在下で、前記測定対象物由来の還元物質または酸化物質の量を前記酸化還元反応により測定し、この測定値から前記測定対象物の量を決定し、前記テトラゾリウム化合物と前記アジ化ナトリウムとを含む溶液をエージングした後に、前記試料に添加し、前記エージングの処理温度が、３０℃〜６０℃であり、前記エージングの処理時間が、６〜１２０時間の範囲であり、前記試料が、溶血試料であることを特徴とする。この方法を、以下、第１の測定方法と呼ぶ。
【０００８】
また、本発明の別の測定方法は、試料中の測定対象物を酸化還元反応を用いて測定する方法であって、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの存在下で、前記測定対象物由来の還元物質または酸化物質の量を前記酸化還元反応により測定し、この測定値から前記測定対象物の量を決定し、前記テトラゾリウム化合物と前記アジ化ナトリウムとを含む溶液をエージングした後に、前記試料に添加し、前記エージングの処理温度が、３０℃〜６０℃の範囲であり、前記エージングの処理時間が、６〜１２０時間の範囲であり、前記測定対象物が、糖化タンパク質であり、前記酸化還元反応が、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼにより行われることを特徴とする。この方法を、以下、第２の測定方法と呼ぶ。
【０００９】
このようにテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの存在下で測定を行えば、その作用機作は不明であるが、測定感度を向上させることができる。なお、本発明において、「測定対象物由来の還元物質または酸化物質」とは、測定対象物そのもの、もしくは、その中の酸化還元物質、または測定対象物から酸化還元酵素等を用いて発生した酸化還元物質の双方を意味する。
【発明の実施の形態】
【００１０】
本発明の測定方法において、テトラゾリウム化合物（Ａ）とアジ化ナトリウム（Ｂ）との添加割合（モル比Ａ：Ｂ）が、Ａ：Ｂ＝２０：３〜２０：１２の範囲であることが好ましい。
【００１１】
本発明の測定方法において、例えば、前記酸化還元反応の反応溶液におけるテトラゾリウム化合物の終濃度が、０．５〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、前記反応溶液におけるアジ化ナトリウムの終濃度が０．１３〜１．３ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であることが好ましい。
【００１２】
本発明の測定方法において、より一層感度を向上できることから、テトラゾリウム化合物とアジ化ナトリウムとを含む溶液をエージングした後に、前記試料に添加する。
【００１３】
本発明の測定方法において、前記エージングの処理温度は、４０℃以上であるのが好ましく、４０℃〜６０℃の範囲がよりに好ましい。
【００１４】
本発明の測定方法において、テトラゾリウム化合物が２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフィドフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩であることが好ましい。
【００１５】
本発明の測定方法において、前記測定対象物由来の酸化物質が、過酸化水素であり、前記酸化還元反応の測定が、前記過酸化水素量の測定であることが好ましい。この過酸化水素量の測定は、例えば、酸化酵素と酸化により発色する基質（以下、発色性基質という）とを用いた測定であることが好ましい。前記過酸化水素の測定は、酸化により発色する基質の発色程度の光学的な測定であるのが好ましい。前記光学的測定は、吸光度または反射率の測定であるのが好ましい。
【００１６】
本発明の測定方法において、前記試料の種類は、第１の方法においては溶血試料である。一方、第２の方法においては、前記試料の種類は、特に制限されず、全血、血漿、血清、血球等の他に、例えば、尿、髄液等の生体試料や、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類等の試料に対しても適用できる。第２の方法において、前記試料は、溶血試料であるのが好ましい。
【００１７】
また、前記測定対象物としては、第１の方法においては、前記酸化還元反応を利用するものであれば特に制限されない。例えば、全血中成分、赤血球内成分、血漿中成分、血清中成分、尿成分、髄液成分等があげられるが、好ましくは赤血球内成分である。例えば、前記赤血球成分を測定する場合、全血をそのまま溶血させたものを試料としてもよいし、全血から赤血球を分離して、前記赤血球を溶血させたものを試料として用いてもよい。また、測定対象物としては、例えば、糖化ヘモグロビン、糖化アルブミン等の糖化タンパク質、糖化ペプチド、糖化アミノ酸、グルコース、尿酸、コレステロール、クレアチニン、サルコシン、グリセロール等もあげられ、より好ましくは糖化タンパク質である。
【００１８】
前記第１の方法において、前記測定対象物は、糖化タンパク質、糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸からなる群から選択された少なくとも一つであるのが好ましい。前記第３および第４の方法において、前記測定対象物は、糖化タンパク質である。
【００１９】
また、前記第１の方法において、前記酸化還元反応は、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼにより行われるのが好ましい。前記第３および第４の方法において、前記酸化還元反応は、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼにより行われる。
【００２０】
本発明の測定方法において、前記測定対象物が糖化タンパク質の場合、前記糖化タンパク質の糖化部分をＦＡＯＤで酸化分解することにより過酸化水素を生成させることが好ましい。また、前記糖化ペプチド、糖化アミノ酸も、同様にＦＡＯＤを作用させることが好ましい。なお、前記糖化タンパク質や糖化ペプチドは、必要に応じて、前記ＦＡＯＤ処理前に、プロテアーゼ処理することが好ましい。
【００２１】
発明を実施するための最良の形態
本発明におけるテトラゾリウム化合物としては、例えば、テトラゾール環の少なくとも２箇所に環構造置換基を有する構造であることが好ましく、より好ましくは、３箇所に環構造置換基を有する構造である。
【００２２】
前記テトラゾリウム化合物が、前述のように、前記テトラゾール環の少なくとも２箇所に環構造置換基を有する場合、前記置換基を、前記テトラゾール環の２位および３位に有することが好ましい。また、テトラゾリウム化合物が３箇所に環構造置換基を有する場合は、前記置換基を、前記テトラゾール環の２位、３位および５位に有することが好ましい。
【００２３】
また、テトラゾリウム化合物は、少なくとも２つの環構造置換基の環構造がベンゼン環であることが好ましい。前記ベンゼン環以外の環構造置換基としては、例えば、環骨格にＳまたはＯを含み、かつ共鳴構造である置換基があげられ、例えば、チエニル基、チアゾイル基等である。
【００２４】
また、前記テトラゾリウム化合物は、テトラゾール環の少なくとも３箇所に環構造置換基を有し、前記環構造置換基のうち少なくとも２つの環構造置換基の環構造がベンゼン環であることが好ましい。
【００２５】
また、少なくとも１つの環構造置換基が官能基を有することが好ましく、前記官能基の数が多いことがより好ましい。
【００２６】
前記官能基としては、電子吸引性の官能基が好ましく、例えば、ハロゲン基、エーテル基、エステル基、カルボキシ基、アシル基、ニトロソ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、スルホ基等があげられる。この他にも、例えば、ヒドロペルオキシ基、オキシ基、エポキシ基、エピジオキシ基、オキソ基等の酸素を含む特性基や、メルカプト基、アルキルチオ基、メチルチオメチル基、チオキソ基、スルフィノ基、ベンゼンスルホニル基、フェニルスルホニル基、p-トルエンスルホニル基、p-トリルスルホニル基、トシル基、スルファモイル基、イソチオシアネート基等の硫黄を含む特性基等があげられる。これらの電子吸引性官能基の中でも、好ましくは、ニトロ基、スルホ基、ハロゲン基、カルボキシ基、ヒドロキシ基、メトキシ基、エトキシ基である。また、前記電子吸引性の官能基の他に、例えば、フェニル基（Ｃ6Ｈ5−）、スチリル基（Ｃ6Ｈ5ＣＨ＝ＣＨ−）等の不飽和炭化水素基等もあげられる。なお、前記官能基は、解離によりイオン化していてもよい。
【００２７】
前記テトラゾリウム化合物は、テトラゾール環の２位および３位にベンゼン環を有し、前記ベンゼン環のうち少なくとも一方が、ハロゲン基、カルボキシ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、スルホ基、メトキシ基およびエトキシ基からなる群から選択された少なくとも１つの官能基を有することが好ましい。なお、前記両方のベンゼン環が、前記官能基を有してもよい。前記ベンゼン環において、いずれの箇所（ortho-、meta-、pra-）に前記官能基を有してもよい。また、官能基の数も特に制限されず、同じ官能基を有しても、異なる官能基を有してもよい。
【００２８】
前記テトラゾリウム化合物は、例えば、前記テトラゾール環の２位、３位および５位にベンゼン環構造置換基を有する化合物として、例えば、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−（１，１’−ビフェニル−４，４’−ジル）−ビス（２，５−ジフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩］、２，３−ジフェニル−５−（４−クロロフェニル）テトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（ｐ−ジフェニル）テトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−（ｐ−ジフェニル）テトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（４−スチリルフェニル）テトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（ｍ−トリル）テトラゾリウム塩および２，５−ジフェニル−３−（ｐ−トリル）テトラゾリウム塩等があげられる。
【００２９】
また、前記テトラゾリウム化合物は、前述のような化合物には制限されず、この他に、前記テトラゾール環の２箇所にベンゼン環構造置換基および１箇所にその他の環構造置換基を有する化合物も使用でき、例えば、２，３−ジフェニル−５−（２−チエニル）テトラゾリウム塩、２−ベンゾチアゾイル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−（２−スルホエチル カルバモイル）フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２，２’−ジベンゾチアゾイル−５，５’−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ジテトラゾリウム塩および３−（４，５−ジメチル−２−チアゾイル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩等があげられる。
【００３０】
また、前記テトラゾール環の２箇所にベンゼン環構造置換基および１箇所に環構造でない置換基を有するテトラゾリウム化合物も使用でき、例えば、２，３−ジフェニル−５−シアノテトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−カルボキシテトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−メチルテトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−エチルテトラゾリウム塩等があげられる。
【００３１】
前述のテトラゾリウム化合物の中でも、前述のように、環構造置換基を３つ有する化合物が好ましく、より好ましくは、環構造がベンゼン環である置換基を３つ有し、かつ電子吸引性官能基を多く有するものであり、特に好ましくは、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩である。なお、このようなテトラゾリウム化合物は、例えば、塩でもよいし、イオン化された状態等であってもよい。
【００３２】
前記ＦＡＯＤとしては、下記式（１）に示す反応を触媒するＦＡＯＤであることが好ましい。
【００３３】
【化１】
【００３４】
前記式（１）において、Ｒ1は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を示す。前記糖残基（Ｒ1）は、反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ1）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ1）は、例えば、
−[ＣＨ（ＯＨ）]n−ＣＨ2ＯＨ
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
【００３５】
前記式（１）において、Ｒ2は、特に制限されないが、例えば、糖化アミノ酸、糖化ペプチドまたは糖化タンパク質の場合、α−アミノ基が糖化されている場合と、それ以外のアミノ基が糖化されている場合とで異なる。
【００３６】
前記式（１）において、α−アミノ基が糖化されている場合、Ｒ2は、下記式（２）で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。
−ＣＨＲ3−ＣＯ−Ｒ4 …（２）
【００３７】
前記式（２）において、Ｒ3はアミノ酸側鎖基を示す。また、Ｒ4は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、例えば、下記式（３）で示すことができる。下記式（３）において、ｎは、０以上の整数であり、Ｒ3は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＮＨ−ＣＨＲ3−ＣＯ）n−ＯＨ …（３）
【００３８】
また、前記式（１）において、α−アミノ基以外のアミノ基が糖化されている（アミノ酸側鎖基が糖化されている）場合、Ｒ2は下記式（４）で示すことができる。
−Ｒ5−ＣＨ（ＮＨ− Ｒ6）−ＣＯ−Ｒ7 …（４）
【００３９】
前記式（４）において、Ｒ5は、アミノ酸側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示す。例えば、糖化されたアミノ酸がリジンの場合、Ｒ5は
−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−
であり、
例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、Ｒ5は、
−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ2）−
である。
【００４０】
また、前記式（４）において、Ｒ6は、水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（５）で示すことができる。なお、下記式（５）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ3は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＣＯ−ＣＨＲ3−ＮＨ）n−Ｈ …（５）
【００４１】
また、前記式（４）において、Ｒ7は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（６）で示すことができる。なお、下記式（６）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ3は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＮＨ−ＣＨＲ3−ＣＯ）n−ＯＨ …（６）
【００４２】
前記ＦＡＯＤとしては、例えば、以下の菌から生産されるものも使用できる。そのような菌としては、例えば、フサリウム属(fusarium)、ギベレラ属(Gibberella)、ペニシリウム属(Penicillium)、アルミラリア属(Armillaria)、カルダリオマイセス属(Caldariomyces)、ガノデルマ属(Ganoderma)、アスペルギルス属(Aspergillus)等に属する菌があげられる。具体例には、例えば、フサリウム・オキシスポルムS-1F4(Fusarium oxysporum S-1F4)(FERM BP-5010)、フサリウム・オキシスポルム・f．sp.リニ(Fusarium oxysporum f.sp. lini)(IFO NO.5880)、フサリウム・オキシスポルム・f.sp.バタタス(Fusarium oxysporum f.sp. batatas)(IFO N0.4468)、フサリウム・オキシスポルム・f.sp. ニべウム(Fusarium oxysporum f.sp. niveum)(IFO N0.4471)、フサリウム・オキシスポルム・f.sp.ククメリニウム(Fusarium oxysporum f.sp. cucumerium)(IFO NO.6384)、フサリウム・オキシスポルム・f.SP.メロンゲナエ(Fusarium oxysporum f.sp. melongenae)(IFO N0.7706)、フサリウム・オキシスポルム・f.sp.アピ(Fusarium oxysporum f.sp. apii)(IFO N0.9964)、フサリウム・オキシスポルム・f.sp.ピニ(Fusarium oxysporum f.SP. pini)(IFO N0.9971)、フサリウム・オキシスポルム・f.sp.フラガリエ(Fusarium oxysporum f.sp. fragariae)(IFO NO.31180)、ギベレラ・フジクロイ(Gibberella fujikuroi)(IFO NO.6356,6605)、ペニシリウム・ヤンシネルムS-3413(Penicillium janthinellum S-3413)(FERM BP-5475)、ペニシリウム・ヤンシネルム(Penicillium janthinellum)(IFO N0.4651、6581、7905)、ペニシリウム・オキサリクム(Penicillium oxalicum)(IFO NO.5748)、ペニシリウム・ヤバニクム(Penicillium javanicum)(IFO N0.4639)、ペニシリウム・クリソゲヌム(Penicillium chrysogenum)(IFO N0.4897)、ペニソリウム・シアネウム(Penicillium cyaneum)(IFO N0.5337)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)(IF0 6365)、アスペルギルス・テレウスGP-1(Aspergillus terreus GP-1)(FERM BP-5684)、アスペルギルス・オリザ(Aspergillus oryzae)(IF0 4242)、アスペルギルス・オリザ(Aspergillus oryzae)(IF0 5710)等があげられる。
【００４３】
また、市販のＦＡＯＤとしては、例えば、α−アミノ基が糖化された糖化アミノ酸に特異的に作用する商品名フルクトシル−アミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＸ−Ｅ）（キッコーマン社製）、商品名フルクトシルアミンオキシダーゼ（旭化成社製）等があげられる。
【００４４】
つぎに、本発明の測定方法について、血球中の糖化タンパク質を測定する例をあげて説明する。
【００４５】
まず、全血をそのまま溶血し、または全血から遠心分離等の常法により血球画分を分離してこれを溶血し、溶血試料を調製する。この溶血方法は、特に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音波による方法、浸透圧の差を利用する方法、凍結溶解による方法等が使用できる。この中でも、操作の簡便性等の理由から、前記界面活性剤を用いる方法が好ましい。
【００４６】
前記界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン−p−t−オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系界面活性剤等）、ポリエチレンソルビタンアルキルエステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ系界面活性剤等）等の非イオン性界面活性剤が使用でき、具体的には、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｂｒｉｊ３５等があげられる。前記界面活性剤による処理条件は、通常、処理溶液中の血球濃度が、１〜１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が０．０１〜５重量％になるように前記界面活性剤を添加し、室温で、数秒（約５秒）〜１０分程度攪拌すればよい。
【００４７】
つぎに、前記溶血試料に対し、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加する。
【００４８】
このようにテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加することにより、無添加の場合に比べて、その感度が、約１．２〜３倍の範囲で向上する。
【００４９】
前記テトラゾリウム化合物は、例えば、処理溶液中の血球濃度が、０．２〜２体積％の場合、濃度０．００５〜４００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０２〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、特に好ましくは０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。具体的に、前記テトラゾリウム化合物が２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩の場合は、濃度０．００４〜１６ｍｍｏｌ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０２〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、特に好ましくは０．１〜５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。なお、前記テトラゾリウム化合物は、一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００５０】
また、前記テトラゾリウム化合物（Ａ）とアジ化ナトリウム（Ｂ）の添加割合（モル比Ａ：Ｂ）は、例えば、Ａ：Ｂ＝２０：３〜２０：１２の範囲であり、好ましくは２０：５〜２０：１１の範囲、より好ましくは２０：６〜２０：１０の範囲である。
【００５１】
前記テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムは、そのまま前記溶血試料に添加してもよい。しかし、操作の簡便性等の点から、溶媒に溶解したテトラゾリウム化合物溶液およびアジ化ナトリウム溶液として、または、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの両方を含有する混合液（テトラゾリウム化合物・アジ化ナトリウム混合液）として使用することが好ましい。
【００５２】
前記各種溶液におけるテトラゾリウム化合物（Ｃ）またはアジ化ナトリウム（Ｄ）の濃度は、前記溶血試料に添加する場合の希釈倍率等に応じて適宜決定できるが、テトラゾリウム化合物（Ｃ）の濃度は、例えば、０．６〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは、０．７５〜３ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは１〜２．４ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、前記混合液の場合、テトラゾリウム化合物（Ｃ）とアジ化ナトリウム（Ｄ）との配合割合（モル比Ｃ：Ｄ）は、例えば、Ｃ：Ｄ＝２０：５〜２０：１１の範囲であり、好ましくは２０：６〜２０：８の範囲である。
【００５３】
前記溶液の溶媒としては、例えば、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳＯ，ＤＩＰＳＯ、ＴＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ等のグッドの緩衝液や、リン酸緩衝液等が使用でき、好ましくは、ＭＥＳ、ＭＯＰＳである。前記溶媒のｐＨは、例えば、５．０〜７．０の範囲であり、好ましくは、５．５〜６．５の範囲であり、より好ましくは５．５である。また、前記緩衝液の濃度は、例えば、１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、好ましくは、１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、前記溶血試料に添加した場合の処理溶液における最終濃度は、例えば、０．７〜９ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、好ましくは、０．８〜４．５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
【００５４】
また、より一層の感度向上が可能であることから、調製した前記テトラゾリウム化合物・アジ化ナトリウム混合液を、前記溶血試料に添加する前に、一定時間放置することによってエージングする。このエージング処理によって、感度が、エージングしない場合よりも、例えば、約１．２〜３倍に向上する。
【００５５】
前記エージングにおいて、処理温度は、３０℃〜６０℃であり、４０℃以上であるのが好ましく、４０℃〜６０℃の範囲であるのがより好ましい。処理時間は６〜１２０時間の 範囲、好ましくは６〜７２時間の範囲である。
【００５６】
前記溶血試料に対して、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを直接または前記溶液として添加した後、通常、処理温度４０〜６０℃の範囲で、６〜７２時間インキュベートし、前記試料の前処理を行う。このように試料をテトラゾリウム化合物で前処理することによって、前記試料中に含まれる還元物質等が酸化還元反応に与える影響を除去でき、測定精度が向上できるからである。そして、このようにテトラゾリウム化合物は、測定精度の向上にも寄与するが、本発明の目的である測定感度の向上には、テトラゾリウム化合物だけでなくアジ化ナトリウムの共存が必要であり、それによって本発明に特有の効果が奏される。
【００５７】
続いて、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加した前処理済み溶血試料について、プロテアーゼ処理を行う。これは、後の処理に使用するＦＡＯＤを、測定対象物に作用し易くするためである。
【００５８】
前記プロテアーゼとしては、特に制限されないが、例えば、セリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、メタロプロティナーゼ等が使用でき、具体的には、トリプシン、プロテナーゼＫ、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、ズブチリシン、エラスターゼ、アミノペプチダーゼ等が好ましい。また、分解する糖化タンパク質が糖化ヘモグロビンの場合、前記プロテアーゼは、前記糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテアーゼであり、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、メタロプロティナーゼ、Bacillus subtillis由来のプロテアーゼ等が好ましい。前記Bacillus subtillis由来プロテアーゼとしては、商品名プロテアーゼＮ（例えば、フルカ社製）、商品名プロテアーゼＮ「アマノ」（天野製薬社製）等があげられる。前記メタロプロティナーゼとしては、Bacillus属由来メタロプロティナーゼ（ＥＣ３．４．２４．４）（例えば、東洋紡社製：商品名トヨチーム）等があげられる。これらの中でもより好ましくはメタロプロティナーゼ、ブロメライン、パパインであり、特に好ましくはメタロプロティナーゼである。このように、選択的に分解するプロテアーゼを使用すれば、特定のタンパク質の分解物を選択的に調製できる。前記プロテアーゼ処理は、通常、緩衝液中で行われ、その処理条件は、使用するプロテアーゼの種類、測定対象物である糖化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定される。
【００５９】
前記緩衝液としては、例えば、ＣＨＥＳ緩衝液、ＣＡＰＳＯ緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等が使用できる。そのｐＨは、例えば、６〜１３の範囲であり、好ましくは７〜１１の範囲である。また、プロテアーゼ処理溶液における前記緩衝液の最終濃度は、例えば、１．０〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
【００６０】
具体的には、例えば、前記プロテアーゼとしてメタロプロティナーゼを用いて前記前処理済み溶血試料を処理する場合、通常、反応液中のメタロプロティナーゼ濃度０．１〜４０ＭＵ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０５〜１５体積％、反応温度１５〜３７℃、反応時間１分〜２４時間、ｐＨ６〜１２の範囲である。
【００６１】
また、例えば、前記プロテアーゼとしてプロテアーゼＫを用いて前記前処理済み溶血試料を処理する場合、通常、反応液中のプロテアーゼ濃度１０〜３００ＫＵ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０５〜１５体積％、反応温度１５〜３７℃、反応時間１分〜２４時間、ｐＨ６〜１２の範囲である。また、前記緩衝液の種類も特に制限されず、例えば、トリス塩酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液等が使用できる。
【００６２】
つぎに、前記プロテアーゼ処理により得られた分解物を、前記ＦＡＯＤで処理する。このＦＡＯＤ処理により、前記式（１）に示す反応が触媒される。
【００６３】
このＦＡＯＤ処理は、前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行うことが好ましく、その処理条件は、使用するＦＡＯＤの種類、測定対象物である糖化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定される。
【００６４】
具体的には、例えば、反応液中のＦＡＯＤ濃度５０〜５０，０００Ｕ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０１〜１体積％、反応温度１５〜３７℃、反応時間１〜６０分、ｐＨ６〜９の範囲である。また、前記緩衝液の種類も特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。
【００６５】
つぎに、前記ＦＡＯＤ処理で生成した過酸化水素を、ＰＯＤおよび前記発色性基質を用いて酸化還元反応により測定する。
【００６６】
前記発色性基質としては、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとを組み合せた基質等があげらる。前記トリンダー試薬としては、例えば、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等があげらる。また、前記アミノアンチピリンの他に、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等も使用できる。このような発色性基質の中でも、特に好ましくは、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムである。
【００６７】
前記酸化還元反応は、通常、緩衝液中で行われ、その条件は、前記生成した過酸化水素の濃度等により適宜決定される。通常、反応液中のＰＯＤ濃度１０〜１００，０００ ＩＵ／Ｌ、発色性基質濃度０．００５〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ、反応温度１５〜３７℃、反応時間０．１〜３０分、ｐＨ５〜９である。また、前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、前記プロテアーゼ処理およびＦＡＯＤ処理等と同様の緩衝液等が使用できる。
【００６８】
前記酸化還元反応において、例えば、前記発色性基質を用いた場合、前記反応液の発色程度（吸光度）を分光光度計で測定することにより、過酸化水素の量を測定できる。そして、例えば、この過酸化水素濃度と検量線等とを用いて、試料中の糖化タンパク質量を求めることができる。
【００６９】
前記発色程度は、例えば、吸光度測定以外にも、反射率等の光学的測定によって測定することもできる。また、前記過酸化水素量は、前記ＰＯＤ等を用いた酵素的手法の他に、例えば、電気的手法により測定することもできる。
【００７０】
このように、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加すれば、酸化還元反応を利用する前記糖化タンパク質の測定を感度よく行うことができる。
【００７１】
テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの添加工程の順序は、特に制限されないが、前述のように、前記両者をエージングすることによって、より一層の効果が得られることから、予め両者を混合しておくことが好ましい。
【００７２】
また、前述のように、測定対象物は、酸化還元反応を利用するものであれば、特に制限されず、前記糖化タンパク質の他に、例えば、糖化ペプチド、糖化アミノ酸、グルコース、コレステロール、尿酸、クレアチニン、サルコシン、グリセロール等があげられる。これらを測定する場合は、例えば、前述と同様にして測定試料にテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加した後、以下に示すように測定対象物由来の還元物質または酸化物質を生成して、その量を酸化還元反応により測定すればよい。
【００７３】
過酸化水素を発生させて、前記各測定対象物の量を測定する場合は、例えば、前記グルコースにはグルコースオキシダーゼを、前記コレステロールにはコレステロールオキシダーゼを、前記尿酸にはウリカーゼを、前記クレアチニンにはサルコシンオキシダーゼを、前記サルコシンにはサルコシンオキシダーゼを、前記グリセロールにはグリセロールオキシダーゼを、それぞれ作用させて過酸化水素を発生させればよい。この過酸化水素量の測定方法は、前述と同様にして行なうことができる。また、糖化ペプチド、糖化アミノ酸は、例えば、前記糖化タンパク質の測定と同様にして測定できる。
【００７４】
また、前記測定対象物由来の還元物質を発生させ、この量を酸化還元反応により測定し、この測定値から、前記測定対象物の量を決定する場合は、例えば、以下に示すようにして測定を行なうことができる。
【００７５】
前記測定対象物がグルコースの場合、例えば、ＮＡＤやＮＡＤＰ等の存在下、グルコースデヒドロゲナーゼを用いて、ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨ等の還元物質を発生させる。そして、前記測定対象物由来の還元物質であるＮＡＤＨやＮＡＤＰＨを、例えば、ジアホラーゼと、還元により発色する基質とを用いて、酸化還元反応により測定する。そして、前述のように、例えば、この測定対象物由来の還元物質の濃度と検量線等とを用いて、試料中の測定対象物の量を求めることができる。また、例えば、測定対象物がコレステロールの場合はコレステロールデヒドロゲナーゼを、サルコシンの場合は、サルコシンデヒドロゲナーゼをそれぞれ使用できる。
【００７６】
前記還元により発色する基質としては、特に制限されず、例えば、2,6-ジクロロフェノールインドフェノール等も使用できる。なお、より優れた信頼性の測定値を得るために、例えば、前記測定対象物由来の還元物質を測定する前に、予め吸光度を測定しておくことが好ましい。
【００７７】
【実施例】
（実施例１および比較例１）
まず、Ｈｂ濃度１５０ｇ／Ｌ（ＨｂＡ１ｃ ５．８％）の血液に、下記溶血試薬０．３ｍＬを添加して溶血させ、溶血試料を調製した。この溶血試料２５μＬに精製水２０μＬを混合し、さらに、３ｇ／Ｌ アジ化ナトリウム水溶液を所定濃度（０ｍｍｏｌ／Ｌ、０．３０ｍｍｏｌ／Ｌ、０．６１６ｍｍｏｌ／Ｌ、０．９２４ｍｍｏｌ／Ｌ、１．２３２ｍｍｏｌ／Ｌ、１．５４ｍｍｏｌ／Ｌ）含有する下記第１試薬６５μＬをそれぞれ添加して、３７℃で５分間インキュベートした。なお、前記第１試薬は、前記溶血試料に添加する前に、５０℃で２０時間エージング処理を行った。続いて、下記発色試薬Ａ ４５μＬを添加して３７℃で３分間インキュベートした後、この反応液について、生化学自動分析機（商品名Ｂｉｏ Ｍａｊｅｓｔｙ：日本電子社製）を用いて、主波長７５１ｎｍ、副波長８０５ｎｍの吸収を測定した。これらの結果を下記表１に示す。なお、アジ化ナトリウム無添加（０ｇ／Ｌ）のものが比較例１となる。
【００７８】
【００７９】
【００８０】
前記メタロプロティナーゼとしては、Bacillus属由来メタロプロティナーゼを、テトラゾリウム化合物としては、2-(4-ヨードフェニル)-3-(2,4-ジニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩（商品名ＷＳＴ−３、同仁化学社製、以下「ＷＳＴ−３」という）を使用した。
【００８１】
【００８２】
【表１】
【００８３】
前記表１に示すように、実施例１ではテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの存在下で測定を行うことにより、発色基質ＤＡ−６４の発色量が増加したため、比較例１よりも高い吸光度が得られた。このことから、本発明の測定方法によれば、測定感度が向上するといえる。
【００８４】
（実施例２および比較例２）
この実施例は、ＷＳＴ−３とアジ化ナトリウムの添加割合を変化させ、かつ前記両者のエージングによる、さらなる感度の向上を確認した例である。
【００８５】
（試薬サンプル）
ＷＳＴ−３とアジ化ナトリウムとを下記添加割合となるように混合して、試薬サンプル（Ａ）〜（Ｅ）を調製した。そして、サンプル（Ｂ）〜（Ｅ）については、４０℃で２０時間インキュベートを行った。続いて、サンプル（Ａ）〜（Ｅ）を４℃以下に保ち、メタロプロティナーゼを２．６６ＭＵ／Ｌとなるように添加した。
【００８６】
【００８７】
（溶血溶液）
血球に蒸留水を添加し、これを凍結させた後、溶解することによって血球の溶血を行った。これによって得られた溶血溶液は、Ｈｂ濃度が１００ｇ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃが４．９％であった。
【００８８】
調製した前記溶血試料に、下記組成となるように下記前処理試薬を添加し、前処理を行った。
【００８９】
【００９０】
前記前処理試薬は、界面活性剤を２０重量％となるように緩衝液と混合して調製した。前記界面活性剤としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（商品名Ｎｉｋｋｏｌ、日本サーファクタント社製）を使用した。また、緩衝液としては、グリシンアミドの終濃度が２００ｍＭ、グリシンの終濃度が４０ｍＭとなるように、グリシンアミド緩衝液とグリシン溶液とを混合した混合緩衝液を使用した（ｐＨ９．５）。
【００９１】
【００９２】
（測定方法）
前記溶血溶液を蒸留水で２．４倍希釈した希釈液２０μＬに、前記各試薬サンプル６０μＬ、前記発色試薬Ｂ ５０μＬを添加して、３７℃で１５分間反応させ、生化学自動分析機（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８：日本電子社製）により、主波長７５１ｎｍ、副波長８０５ｎｍの吸収を測定した。これらの結果を下記表２および図１のグラフに示す。前記図１は、添加したテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムのモル比と、Ｈｂ濃度と、吸光度との関係を示すグラフである。
【００９３】
【表２】
【００９４】
前記表２および図１に示すように、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加することによって高い吸光度を示し、さらにインキュベート（エージング）を行うことによって、より一層吸光度が向上した((B）〜（E）)。また、Ｈｂ濃度の増加に伴って吸光度が増加していることから、添加したテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウム自身の吸収によって吸光度が増加しているのではなく、これらの添加により発色基質ＤＡ−６４の吸光度が増加しているといえる。また、テトラゾリウム化合物とアジ化ナトリウムの添加割合がモル比３：１であり、かつエージングした場合に、高い吸光度の増加が見られた。このようにテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加することによって、発色基質の発色量が増加し、さらにエージングすることによってより一層増加が見られることから、測定感度が向上したといえる。
【００９５】
（実施例３）
この実施例は、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを溶液中でエージングすることによる測定感度の向上を調べた例である。
【００９６】
まず、ＷＳＴ−３濃度が３．３３ｍｍｏｌ／Ｌであり、アジ化ナトリウム濃度が０．０８３３ｇ／Ｌである混合液を準備した。そして、これを６０℃でインキュベートすることによりエージングを行い、所定の時間（０時間、１時間、６時間、１４時間、１６時間、１８時間）にサンプリングしたものを試薬サンプルとした。
【００９７】
一方、前記実施例２と同様にして溶血溶液（ Hb濃度 100g/L、 HbA1c 4.9% ）を調製し、所定量（ 2μL、 5μL、 10μL、 20μL、 30μL ）の前記溶血溶液と、下記前処理試薬３００μＬと混合して、基質Ｈｂ溶液（Ａ〜Ｅ）調製した。
【００９８】
（前処理試薬）
80 mmol/L CHESと30mmol/L MOPSの混合液(pH9.4)
9 g/L ホ゜リオキシエチレンラウリルエーテル
【００９９】
そして、前記基質Ｈｂ溶液を蒸留水で２倍希釈した希釈液２０μＬに、前記試薬サンプルを含む下記第２試薬６５μＬおよび発色試薬Ｃ ４５μＬを添加して、３７℃で１５分間反応させ、前記生化学自動分析機により、主波長７５１ｎｍ、副波長８０５ｎｍの吸収を測定した。なお、これらの結果を下記表３および図２に示す。前記図２は、エージングの時間と吸光度の関係を示すグラフである。
【０１００】
【０１０１】
【０１０２】
【表３】
【０１０３】
前記表３および図２に示すように、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを含む溶液をエージングした後に使用することによって、Ｈｂ濃度に関わらず、測定感度はさらに向上することがわかった。また、エージング処理の時間が、６時間以上である場合に、測定感度は最大となった。
【０１０４】
（実施例４）
この実施例は、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを溶液中でエージングすることによる測定感度の向上を調べた例である。
【０１０５】
まず、ＷＳＴ−３およびアジ化ナトリウムを含む下記混合液を調製して、これを所定温度（３０℃、４０℃、５０℃、６０℃）で所定時間（０時間、６時間、１５時間、２４時間、４８時間、７２時間）インキュベートしてエージングを行ったものを試薬サンプルとした。
【０１０６】
【０１０７】
一方、実施例２と同様にして調製した基質Ｈｂ溶液（Ｈｂ濃度１００ｇ／Ｌ）を精製水で２倍希釈（体積）し、希釈溶液を調製した。また、エージングした前記試薬サンプル９ｍＬとメタロプロティナーゼ（２．７ＭＵ／Ｌ）１ｍＬとを混合して、メタロプロティナーゼ溶液を調製した。そして、前記希釈溶液２０μＬに、前記メタロプロティナーゼ溶液６５μＬおよび前記発色試薬Ａ ４５μＬを添加して、３７℃で１５分間反応させ、前記生化学自動分析機により、主波長７５１ｎｍ、副波長８０５ｎｍの吸収を測定した。なお、これらの結果を下記表４および図３に示す。前記図３は、エージングの時間と吸光度の関係を示すグラフである。
【０１０８】
【表４】
【０１０９】
前記表４および図３に示すように、６０℃でエージングした場合に速やかに吸光度が増加したことから、エージング温度が高い程、短時間のエージング処理で測定感度を向上できるといえる。
【０１１０】
【産業上の利用の可能性】
以上のように、本発明の酸化還元反応を用いた測定方法は、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを用いるため、かつ、前記テトラゾリウム化合物および前記アジ化ナトリウムを含む溶液をエージングした後に試料に添加するため、測定感度に優れている。このため、本発明の測定方法を、例えば、赤血球中のＨｂＡ１ｃの測定に適用すれば、従来よりも測定精度が高い測定を実現でき、この結果、ＨｂＡ１ｃの糖尿病診断等の指標物質としての重要性がさらに向上する。
【０１１１】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の測定方法の一実施例において、添加したテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムのモル比と、Ｈｂ濃度と、吸光度との相関関係を示したグラフである。
【図２】図２は、本発明の測定方法のその他の実施例において、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを含む溶液のエージング時間と吸光度との関係を示したグラフである。
【図３】図３は、本発明の測定方法のさらにその他の実施例において、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを含む溶液のエージング時間と吸光度との関係を示したグラフである。
【０００１】
本発明は、酸化還元反応を用いた測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、酸化還元反応を利用して、試料中の測定対象物の量を測定することは、広く実施されており、例えば、生化学分析や臨床検査等における糖化タンパク質の測定にも適用されている。
【０００３】
例えば、血液中の糖化タンパク質、特に赤血球中の糖化ヘモグロビンは、生体血糖値の過去の履歴を反映しているため、糖尿病診断や治療等における重要な指標とされている。このような赤血球中の糖化タンパク質は、前記酸化還元反応を用いて、例えば、以下に示すようにして測定されている。
【０００４】
まず、赤血球を溶血させた試料を調製し、この溶血試料をフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」という）で処理し、糖化タンパク質の糖化部分に作用させて過酸化水素を発生させる。この過酸化水素量は、前記糖化タンパク質量に対応する。そして、この試料に、ペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」という）および還元剤を添加し、前記ＰＯＤを触媒として前記過酸化水素と前記還元剤との間で酸化還元反応させる。この時、前記還元剤として、酸化されることにより発色する還元剤を用いれば、その発色の測定により前記過酸化水素量を測定でき、この結果、赤血球中の糖化タンパク質量を知ることができる。
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、これらの従来の方法では、試料によっては測定感度が十分でないために、測定精度が向上しない場合もある。また、前述のように、血液中の糖化タンパク質は、糖尿病診断や治療等における重要な指標とされているため、これを測定するための酸化還元反応を用いた測定方法においても、更なる測定精度の向上が望まれている。
【０００６】
そこで、本発明の目的は、試料中の測定対象物を、酸化還元反応を用いて測定する方法であって、測定感度に優れる測定方法の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明の測定方法は、試料中の測定対象物を酸化還元反応を用いて測定する方法であって、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの存在下で、前記測定対象物由来の還元物質または酸化物質の量を前記酸化還元反応により測定し、この測定値から前記測定対象物の量を決定し、前記テトラゾリウム化合物と前記アジ化ナトリウムとを含む溶液をエージングした後に、前記試料に添加し、前記エージングの処理温度が、３０℃〜６０℃であり、前記エージングの処理時間が、６〜１２０時間の範囲であり、前記試料が、溶血試料であることを特徴とする。この方法を、以下、第１の測定方法と呼ぶ。
【０００８】
また、本発明の別の測定方法は、試料中の測定対象物を酸化還元反応を用いて測定する方法であって、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの存在下で、前記測定対象物由来の還元物質または酸化物質の量を前記酸化還元反応により測定し、この測定値から前記測定対象物の量を決定し、前記テトラゾリウム化合物と前記アジ化ナトリウムとを含む溶液をエージングした後に、前記試料に添加し、前記エージングの処理温度が、３０℃〜６０℃の範囲であり、前記エージングの処理時間が、６〜１２０時間の範囲であり、前記測定対象物が、糖化タンパク質であり、前記酸化還元反応が、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼにより行われることを特徴とする。この方法を、以下、第２の測定方法と呼ぶ。
【０００９】
このようにテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの存在下で測定を行えば、その作用機作は不明であるが、測定感度を向上させることができる。なお、本発明において、「測定対象物由来の還元物質または酸化物質」とは、測定対象物そのもの、もしくは、その中の酸化還元物質、または測定対象物から酸化還元酵素等を用いて発生した酸化還元物質の双方を意味する。
【発明の実施の形態】
【００１０】
本発明の測定方法において、テトラゾリウム化合物（Ａ）とアジ化ナトリウム（Ｂ）との添加割合（モル比Ａ：Ｂ）が、Ａ：Ｂ＝２０：３〜２０：１２の範囲であることが好ましい。
【００１１】
本発明の測定方法において、例えば、前記酸化還元反応の反応溶液におけるテトラゾリウム化合物の終濃度が、０．５〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、前記反応溶液におけるアジ化ナトリウムの終濃度が０．１３〜１．３ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であることが好ましい。
【００１２】
本発明の測定方法において、より一層感度を向上できることから、テトラゾリウム化合物とアジ化ナトリウムとを含む溶液をエージングした後に、前記試料に添加する。
【００１３】
本発明の測定方法において、前記エージングの処理温度は、４０℃以上であるのが好ましく、４０℃〜６０℃の範囲がよりに好ましい。
【００１４】
本発明の測定方法において、テトラゾリウム化合物が２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフィドフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩であることが好ましい。
【００１５】
本発明の測定方法において、前記測定対象物由来の酸化物質が、過酸化水素であり、前記酸化還元反応の測定が、前記過酸化水素量の測定であることが好ましい。この過酸化水素量の測定は、例えば、酸化酵素と酸化により発色する基質（以下、発色性基質という）とを用いた測定であることが好ましい。前記過酸化水素の測定は、酸化により発色する基質の発色程度の光学的な測定であるのが好ましい。前記光学的測定は、吸光度または反射率の測定であるのが好ましい。
【００１６】
本発明の測定方法において、前記試料の種類は、第１の方法においては溶血試料である。一方、第２の方法においては、前記試料の種類は、特に制限されず、全血、血漿、血清、血球等の他に、例えば、尿、髄液等の生体試料や、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類等の試料に対しても適用できる。第２の方法において、前記試料は、溶血試料であるのが好ましい。
【００１７】
また、前記測定対象物としては、第１の方法においては、前記酸化還元反応を利用するものであれば特に制限されない。例えば、全血中成分、赤血球内成分、血漿中成分、血清中成分、尿成分、髄液成分等があげられるが、好ましくは赤血球内成分である。例えば、前記赤血球成分を測定する場合、全血をそのまま溶血させたものを試料としてもよいし、全血から赤血球を分離して、前記赤血球を溶血させたものを試料として用いてもよい。また、測定対象物としては、例えば、糖化ヘモグロビン、糖化アルブミン等の糖化タンパク質、糖化ペプチド、糖化アミノ酸、グルコース、尿酸、コレステロール、クレアチニン、サルコシン、グリセロール等もあげられ、より好ましくは糖化タンパク質である。
【００１８】
前記第１の方法において、前記測定対象物は、糖化タンパク質、糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸からなる群から選択された少なくとも一つであるのが好ましい。前記第３および第４の方法において、前記測定対象物は、糖化タンパク質である。
【００１９】
また、前記第１の方法において、前記酸化還元反応は、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼにより行われるのが好ましい。前記第３および第４の方法において、前記酸化還元反応は、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼにより行われる。
【００２０】
本発明の測定方法において、前記測定対象物が糖化タンパク質の場合、前記糖化タンパク質の糖化部分をＦＡＯＤで酸化分解することにより過酸化水素を生成させることが好ましい。また、前記糖化ペプチド、糖化アミノ酸も、同様にＦＡＯＤを作用させることが好ましい。なお、前記糖化タンパク質や糖化ペプチドは、必要に応じて、前記ＦＡＯＤ処理前に、プロテアーゼ処理することが好ましい。
【００２１】
発明を実施するための最良の形態
本発明におけるテトラゾリウム化合物としては、例えば、テトラゾール環の少なくとも２箇所に環構造置換基を有する構造であることが好ましく、より好ましくは、３箇所に環構造置換基を有する構造である。
【００２２】
前記テトラゾリウム化合物が、前述のように、前記テトラゾール環の少なくとも２箇所に環構造置換基を有する場合、前記置換基を、前記テトラゾール環の２位および３位に有することが好ましい。また、テトラゾリウム化合物が３箇所に環構造置換基を有する場合は、前記置換基を、前記テトラゾール環の２位、３位および５位に有することが好ましい。
【００２３】
また、テトラゾリウム化合物は、少なくとも２つの環構造置換基の環構造がベンゼン環であることが好ましい。前記ベンゼン環以外の環構造置換基としては、例えば、環骨格にＳまたはＯを含み、かつ共鳴構造である置換基があげられ、例えば、チエニル基、チアゾイル基等である。
【００２４】
また、前記テトラゾリウム化合物は、テトラゾール環の少なくとも３箇所に環構造置換基を有し、前記環構造置換基のうち少なくとも２つの環構造置換基の環構造がベンゼン環であることが好ましい。
【００２５】
また、少なくとも１つの環構造置換基が官能基を有することが好ましく、前記官能基の数が多いことがより好ましい。
【００２６】
前記官能基としては、電子吸引性の官能基が好ましく、例えば、ハロゲン基、エーテル基、エステル基、カルボキシ基、アシル基、ニトロソ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、スルホ基等があげられる。この他にも、例えば、ヒドロペルオキシ基、オキシ基、エポキシ基、エピジオキシ基、オキソ基等の酸素を含む特性基や、メルカプト基、アルキルチオ基、メチルチオメチル基、チオキソ基、スルフィノ基、ベンゼンスルホニル基、フェニルスルホニル基、p-トルエンスルホニル基、p-トリルスルホニル基、トシル基、スルファモイル基、イソチオシアネート基等の硫黄を含む特性基等があげられる。これらの電子吸引性官能基の中でも、好ましくは、ニトロ基、スルホ基、ハロゲン基、カルボキシ基、ヒドロキシ基、メトキシ基、エトキシ基である。また、前記電子吸引性の官能基の他に、例えば、フェニル基（Ｃ6Ｈ5−）、スチリル基（Ｃ6Ｈ5ＣＨ＝ＣＨ−）等の不飽和炭化水素基等もあげられる。なお、前記官能基は、解離によりイオン化していてもよい。
【００２７】
前記テトラゾリウム化合物は、テトラゾール環の２位および３位にベンゼン環を有し、前記ベンゼン環のうち少なくとも一方が、ハロゲン基、カルボキシ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、スルホ基、メトキシ基およびエトキシ基からなる群から選択された少なくとも１つの官能基を有することが好ましい。なお、前記両方のベンゼン環が、前記官能基を有してもよい。前記ベンゼン環において、いずれの箇所（ortho-、meta-、pra-）に前記官能基を有してもよい。また、官能基の数も特に制限されず、同じ官能基を有しても、異なる官能基を有してもよい。
【００２８】
前記テトラゾリウム化合物は、例えば、前記テトラゾール環の２位、３位および５位にベンゼン環構造置換基を有する化合物として、例えば、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−（１，１’−ビフェニル−４，４’−ジル）−ビス（２，５−ジフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩］、２，３−ジフェニル−５−（４−クロロフェニル）テトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（ｐ−ジフェニル）テトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−（ｐ−ジフェニル）テトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（４−スチリルフェニル）テトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（ｍ−トリル）テトラゾリウム塩および２，５−ジフェニル−３−（ｐ−トリル）テトラゾリウム塩等があげられる。
【００２９】
また、前記テトラゾリウム化合物は、前述のような化合物には制限されず、この他に、前記テトラゾール環の２箇所にベンゼン環構造置換基および１箇所にその他の環構造置換基を有する化合物も使用でき、例えば、２，３−ジフェニル−５−（２−チエニル）テトラゾリウム塩、２−ベンゾチアゾイル−３−（４−カルボキシ−２−メトキシフェニル）−５−［４−（２−スルホエチル カルバモイル）フェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２，２’−ジベンゾチアゾイル−５，５’−ビス［４−ジ（２−スルホエチル）カルバモイルフェニル］−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）ジテトラゾリウム塩および３−（４，５−ジメチル−２−チアゾイル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩等があげられる。
【００３０】
また、前記テトラゾール環の２箇所にベンゼン環構造置換基および１箇所に環構造でない置換基を有するテトラゾリウム化合物も使用でき、例えば、２，３−ジフェニル−５−シアノテトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−カルボキシテトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−メチルテトラゾリウム塩、２，３−ジフェニル−５−エチルテトラゾリウム塩等があげられる。
【００３１】
前述のテトラゾリウム化合物の中でも、前述のように、環構造置換基を３つ有する化合物が好ましく、より好ましくは、環構造がベンゼン環である置換基を３つ有し、かつ電子吸引性官能基を多く有するものであり、特に好ましくは、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩である。なお、このようなテトラゾリウム化合物は、例えば、塩でもよいし、イオン化された状態等であってもよい。
【００３２】
前記ＦＡＯＤとしては、下記式（１）に示す反応を触媒するＦＡＯＤであることが好ましい。
【００３３】
【化１】
前記式（１）において、Ｒ1は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を示す。前記糖残基（Ｒ1）は、反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ1）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ1）は、例えば、
−[ＣＨ（ＯＨ）]n−ＣＨ2ＯＨ
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
【００３５】
前記式（１）において、Ｒ2は、特に制限されないが、例えば、糖化アミノ酸、糖化ペプチドまたは糖化タンパク質の場合、α−アミノ基が糖化されている場合と、それ以外のアミノ基が糖化されている場合とで異なる。
【００３６】
前記式（１）において、α−アミノ基が糖化されている場合、Ｒ2は、下記式（２）で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。
−ＣＨＲ3−ＣＯ−Ｒ4 …（２）
【００３７】
前記式（２）において、Ｒ3はアミノ酸側鎖基を示す。また、Ｒ4は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、例えば、下記式（３）で示すことができる。下記式（３）において、ｎは、０以上の整数であり、Ｒ3は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＮＨ−ＣＨＲ3−ＣＯ）n−ＯＨ …（３）
【００３８】
また、前記式（１）において、α−アミノ基以外のアミノ基が糖化されている（アミノ酸側鎖基が糖化されている）場合、Ｒ2は下記式（４）で示すことができる。
−Ｒ5−ＣＨ（ＮＨ− Ｒ6）−ＣＯ−Ｒ7 …（４）
【００３９】
前記式（４）において、Ｒ5は、アミノ酸側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示す。例えば、糖化されたアミノ酸がリジンの場合、Ｒ5は
−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−
であり、
例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、Ｒ5は、
−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ2）−
である。
【００４０】
また、前記式（４）において、Ｒ6は、水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（５）で示すことができる。なお、下記式（５）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ3は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＣＯ−ＣＨＲ3−ＮＨ）n−Ｈ …（５）
【００４１】
また、前記式（４）において、Ｒ7は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（６）で示すことができる。なお、下記式（６）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ3は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＮＨ−ＣＨＲ3−ＣＯ）n−ＯＨ …（６）
【００４２】
前記ＦＡＯＤとしては、例えば、以下の菌から生産されるものも使用できる。そのような菌としては、例えば、フサリウム属(fusarium)、ギベレラ属(Gibberella)、ペニシリウム属(Penicillium)、アルミラリア属(Armillaria)、カルダリオマイセス属(Caldariomyces)、ガノデルマ属(Ganoderma)、アスペルギルス属(Aspergillus)等に属する菌があげられる。具体例には、例えば、フサリウム・オキシスポルムS-1F4(Fusarium oxysporum S-1F4)(FERM BP-5010)、フサリウム・オキシスポルム・f．sp.リニ(Fusarium oxysporum f.sp. lini)(IFO NO.5880)、フサリウム・オキシスポルム・f.sp.バタタス(Fusarium oxysporum f.sp. batatas)(IFO N0.4468)、フサリウム・オキシスポルム・f.sp. ニべウム(Fusarium oxysporum f.sp. niveum)(IFO N0.4471)、フサリウム・オキシスポルム・f.sp.ククメリニウム(Fusarium oxysporum f.sp. cucumerium)(IFO NO.6384)、フサリウム・オキシスポルム・f.SP.メロンゲナエ(Fusarium oxysporum f.sp. melongenae)(IFO N0.7706)、フサリウム・オキシスポルム・f.sp.アピ(Fusarium oxysporum f.sp. apii)(IFO N0.9964)、フサリウム・オキシスポルム・f.sp.ピニ(Fusarium oxysporum f.SP. pini)(IFO N0.9971)、フサリウム・オキシスポルム・f.sp.フラガリエ(Fusarium oxysporum f.sp. fragariae)(IFO NO.31180)、ギベレラ・フジクロイ(Gibberella fujikuroi)(IFO NO.6356,6605)、ペニシリウム・ヤンシネルムS-3413(Penicillium janthinellum S-3413)(FERM BP-5475)、ペニシリウム・ヤンシネルム(Penicillium janthinellum)(IFO N0.4651、6581、7905)、ペニシリウム・オキサリクム(Penicillium oxalicum)(IFO NO.5748)、ペニシリウム・ヤバニクム(Penicillium javanicum)(IFO N0.4639)、ペニシリウム・クリソゲヌム(Penicillium chrysogenum)(IFO N0.4897)、ペニソリウム・シアネウム(Penicillium cyaneum)(IFO N0.5337)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)(IF0 6365)、アスペルギルス・テレウスGP-1(Aspergillus terreus GP-1)(FERM BP-5684)、アスペルギルス・オリザ(Aspergillus oryzae)(IF0 4242)、アスペルギルス・オリザ(Aspergillus oryzae)(IF0 5710)等があげられる。
【００４３】
また、市販のＦＡＯＤとしては、例えば、α−アミノ基が糖化された糖化アミノ酸に特異的に作用する商品名フルクトシル−アミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＸ−Ｅ）（キッコーマン社製）、商品名フルクトシルアミンオキシダーゼ（旭化成社製）等があげられる。
【００４４】
つぎに、本発明の測定方法について、血球中の糖化タンパク質を測定する例をあげて説明する。
【００４５】
まず、全血をそのまま溶血し、または全血から遠心分離等の常法により血球画分を分離してこれを溶血し、溶血試料を調製する。この溶血方法は、特に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音波による方法、浸透圧の差を利用する方法、凍結溶解による方法等が使用できる。この中でも、操作の簡便性等の理由から、前記界面活性剤を用いる方法が好ましい。
【００４６】
前記界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン−p−t−オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系界面活性剤等）、ポリエチレンソルビタンアルキルエステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ系界面活性剤等）等の非イオン性界面活性剤が使用でき、具体的には、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｂｒｉｊ３５等があげられる。前記界面活性剤による処理条件は、通常、処理溶液中の血球濃度が、１〜１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が０．０１〜５重量％になるように前記界面活性剤を添加し、室温で、数秒（約５秒）〜１０分程度攪拌すればよい。
【００４７】
つぎに、前記溶血試料に対し、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加する。
【００４８】
このようにテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加することにより、無添加の場合に比べて、その感度が、約１．２〜３倍の範囲で向上する。
【００４９】
前記テトラゾリウム化合物は、例えば、処理溶液中の血球濃度が、０．２〜２体積％の場合、濃度０．００５〜４００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０２〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、特に好ましくは０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。具体的に、前記テトラゾリウム化合物が２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩の場合は、濃度０．００４〜１６ｍｍｏｌ／Ｌの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは０．０２〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、特に好ましくは０．１〜５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。なお、前記テトラゾリウム化合物は、一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００５０】
また、前記テトラゾリウム化合物（Ａ）とアジ化ナトリウム（Ｂ）の添加割合（モル比Ａ：Ｂ）は、例えば、Ａ：Ｂ＝２０：３〜２０：１２の範囲であり、好ましくは２０：５〜２０：１１の範囲、より好ましくは２０：６〜２０：１０の範囲である。
【００５１】
前記テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムは、そのまま前記溶血試料に添加してもよい。しかし、操作の簡便性等の点から、溶媒に溶解したテトラゾリウム化合物溶液およびアジ化ナトリウム溶液として、または、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの両方を含有する混合液（テトラゾリウム化合物・アジ化ナトリウム混合液）として使用することが好ましい。
【００５２】
前記各種溶液におけるテトラゾリウム化合物（Ｃ）またはアジ化ナトリウム（Ｄ）の濃度は、前記溶血試料に添加する場合の希釈倍率等に応じて適宜決定できるが、テトラゾリウム化合物（Ｃ）の濃度は、例えば、０．６〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは、０．７５〜３ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは１〜２．４ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、前記混合液の場合、テトラゾリウム化合物（Ｃ）とアジ化ナトリウム（Ｄ）との配合割合（モル比Ｃ：Ｄ）は、例えば、Ｃ：Ｄ＝２０：５〜２０：１１の範囲であり、好ましくは２０：６〜２０：８の範囲である。
【００５３】
前記溶液の溶媒としては、例えば、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳＯ，ＤＩＰＳＯ、ＴＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ等のグッドの緩衝液や、リン酸緩衝液等が使用でき、好ましくは、ＭＥＳ、ＭＯＰＳである。前記溶媒のｐＨは、例えば、５．０〜７．０の範囲であり、好ましくは、５．５〜６．５の範囲であり、より好ましくは５．５である。また、前記緩衝液の濃度は、例えば、１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、好ましくは、１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、前記溶血試料に添加した場合の処理溶液における最終濃度は、例えば、０．７〜９ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、好ましくは、０．８〜４．５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
【００５４】
また、より一層の感度向上が可能であることから、調製した前記テトラゾリウム化合物・アジ化ナトリウム混合液を、前記溶血試料に添加する前に、一定時間放置することによってエージングする。このエージング処理によって、感度が、エージングしない場合よりも、例えば、約１．２〜３倍に向上する。
【００５５】
前記エージングにおいて、処理温度は、３０℃〜６０℃であり、４０℃以上であるのが好ましく、４０℃〜６０℃の範囲であるのがより好ましい。処理時間は６〜１２０時間の 範囲、好ましくは６〜７２時間の範囲である。
【００５６】
前記溶血試料に対して、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを直接または前記溶液として添加した後、通常、処理温度４０〜６０℃の範囲で、６〜７２時間インキュベートし、前記試料の前処理を行う。このように試料をテトラゾリウム化合物で前処理することによって、前記試料中に含まれる還元物質等が酸化還元反応に与える影響を除去でき、測定精度が向上できるからである。そして、このようにテトラゾリウム化合物は、測定精度の向上にも寄与するが、本発明の目的である測定感度の向上には、テトラゾリウム化合物だけでなくアジ化ナトリウムの共存が必要であり、それによって本発明に特有の効果が奏される。
【００５７】
続いて、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加した前処理済み溶血試料について、プロテアーゼ処理を行う。これは、後の処理に使用するＦＡＯＤを、測定対象物に作用し易くするためである。
【００５８】
前記プロテアーゼとしては、特に制限されないが、例えば、セリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、メタロプロティナーゼ等が使用でき、具体的には、トリプシン、プロテナーゼＫ、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、ズブチリシン、エラスターゼ、アミノペプチダーゼ等が好ましい。また、分解する糖化タンパク質が糖化ヘモグロビンの場合、前記プロテアーゼは、前記糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテアーゼであり、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、メタロプロティナーゼ、Bacillus subtillis由来のプロテアーゼ等が好ましい。前記Bacillus subtillis由来プロテアーゼとしては、商品名プロテアーゼＮ（例えば、フルカ社製）、商品名プロテアーゼＮ「アマノ」（天野製薬社製）等があげられる。前記メタロプロティナーゼとしては、Bacillus属由来メタロプロティナーゼ（ＥＣ３．４．２４．４）（例えば、東洋紡社製：商品名トヨチーム）等があげられる。これらの中でもより好ましくはメタロプロティナーゼ、ブロメライン、パパインであり、特に好ましくはメタロプロティナーゼである。このように、選択的に分解するプロテアーゼを使用すれば、特定のタンパク質の分解物を選択的に調製できる。前記プロテアーゼ処理は、通常、緩衝液中で行われ、その処理条件は、使用するプロテアーゼの種類、測定対象物である糖化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定される。
【００５９】
前記緩衝液としては、例えば、ＣＨＥＳ緩衝液、ＣＡＰＳＯ緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等が使用できる。そのｐＨは、例えば、６〜１３の範囲であり、好ましくは７〜１１の範囲である。また、プロテアーゼ処理溶液における前記緩衝液の最終濃度は、例えば、１．０〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
【００６０】
具体的には、例えば、前記プロテアーゼとしてメタロプロティナーゼを用いて前記前処理済み溶血試料を処理する場合、通常、反応液中のメタロプロティナーゼ濃度０．１〜４０ＭＵ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０５〜１５体積％、反応温度１５〜３７℃、反応時間１分〜２４時間、ｐＨ６〜１２の範囲である。
【００６１】
また、例えば、前記プロテアーゼとしてプロテアーゼＫを用いて前記前処理済み溶血試料を処理する場合、通常、反応液中のプロテアーゼ濃度１０〜３００ＫＵ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０５〜１５体積％、反応温度１５〜３７℃、反応時間１分〜２４時間、ｐＨ６〜１２の範囲である。また、前記緩衝液の種類も特に制限されず、例えば、トリス塩酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液等が使用できる。
【００６２】
つぎに、前記プロテアーゼ処理により得られた分解物を、前記ＦＡＯＤで処理する。このＦＡＯＤ処理により、前記式（１）に示す反応が触媒される。
【００６３】
このＦＡＯＤ処理は、前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行うことが好ましく、その処理条件は、使用するＦＡＯＤの種類、測定対象物である糖化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定される。
【００６４】
具体的には、例えば、反応液中のＦＡＯＤ濃度５０〜５０，０００Ｕ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０１〜１体積％、反応温度１５〜３７℃、反応時間１〜６０分、ｐＨ６〜９の範囲である。また、前記緩衝液の種類も特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。
【００６５】
つぎに、前記ＦＡＯＤ処理で生成した過酸化水素を、ＰＯＤおよび前記発色性基質を用いて酸化還元反応により測定する。
【００６６】
前記発色性基質としては、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとを組み合せた基質等があげらる。前記トリンダー試薬としては、例えば、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等があげらる。また、前記アミノアンチピリンの他に、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等も使用できる。このような発色性基質の中でも、特に好ましくは、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムである。
【００６７】
前記酸化還元反応は、通常、緩衝液中で行われ、その条件は、前記生成した過酸化水素の濃度等により適宜決定される。通常、反応液中のＰＯＤ濃度１０〜１００，０００ ＩＵ／Ｌ、発色性基質濃度０．００５〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ、反応温度１５〜３７℃、反応時間０．１〜３０分、ｐＨ５〜９である。また、前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、前記プロテアーゼ処理およびＦＡＯＤ処理等と同様の緩衝液等が使用できる。
【００６８】
前記酸化還元反応において、例えば、前記発色性基質を用いた場合、前記反応液の発色程度（吸光度）を分光光度計で測定することにより、過酸化水素の量を測定できる。そして、例えば、この過酸化水素濃度と検量線等とを用いて、試料中の糖化タンパク質量を求めることができる。
【００６９】
前記発色程度は、例えば、吸光度測定以外にも、反射率等の光学的測定によって測定することもできる。また、前記過酸化水素量は、前記ＰＯＤ等を用いた酵素的手法の他に、例えば、電気的手法により測定することもできる。
【００７０】
このように、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加すれば、酸化還元反応を利用する前記糖化タンパク質の測定を感度よく行うことができる。
【００７１】
テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの添加工程の順序は、特に制限されないが、前述のように、前記両者をエージングすることによって、より一層の効果が得られることから、予め両者を混合しておくことが好ましい。
【００７２】
また、前述のように、測定対象物は、酸化還元反応を利用するものであれば、特に制限されず、前記糖化タンパク質の他に、例えば、糖化ペプチド、糖化アミノ酸、グルコース、コレステロール、尿酸、クレアチニン、サルコシン、グリセロール等があげられる。これらを測定する場合は、例えば、前述と同様にして測定試料にテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加した後、以下に示すように測定対象物由来の還元物質または酸化物質を生成して、その量を酸化還元反応により測定すればよい。
【００７３】
過酸化水素を発生させて、前記各測定対象物の量を測定する場合は、例えば、前記グルコースにはグルコースオキシダーゼを、前記コレステロールにはコレステロールオキシダーゼを、前記尿酸にはウリカーゼを、前記クレアチニンにはサルコシンオキシダーゼを、前記サルコシンにはサルコシンオキシダーゼを、前記グリセロールにはグリセロールオキシダーゼを、それぞれ作用させて過酸化水素を発生させればよい。この過酸化水素量の測定方法は、前述と同様にして行なうことができる。また、糖化ペプチド、糖化アミノ酸は、例えば、前記糖化タンパク質の測定と同様にして測定できる。
【００７４】
また、前記測定対象物由来の還元物質を発生させ、この量を酸化還元反応により測定し、この測定値から、前記測定対象物の量を決定する場合は、例えば、以下に示すようにして測定を行なうことができる。
【００７５】
前記測定対象物がグルコースの場合、例えば、ＮＡＤやＮＡＤＰ等の存在下、グルコースデヒドロゲナーゼを用いて、ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨ等の還元物質を発生させる。そして、前記測定対象物由来の還元物質であるＮＡＤＨやＮＡＤＰＨを、例えば、ジアホラーゼと、還元により発色する基質とを用いて、酸化還元反応により測定する。そして、前述のように、例えば、この測定対象物由来の還元物質の濃度と検量線等とを用いて、試料中の測定対象物の量を求めることができる。また、例えば、測定対象物がコレステロールの場合はコレステロールデヒドロゲナーゼを、サルコシンの場合は、サルコシンデヒドロゲナーゼをそれぞれ使用できる。
【００７６】
前記還元により発色する基質としては、特に制限されず、例えば、2,6-ジクロロフェノールインドフェノール等も使用できる。なお、より優れた信頼性の測定値を得るために、例えば、前記測定対象物由来の還元物質を測定する前に、予め吸光度を測定しておくことが好ましい。
【００７７】
【実施例】
（実施例１および比較例１）
まず、Ｈｂ濃度１５０ｇ／Ｌ（ＨｂＡ１ｃ ５．８％）の血液に、下記溶血試薬０．３ｍＬを添加して溶血させ、溶血試料を調製した。この溶血試料２５μＬに精製水２０μＬを混合し、さらに、３ｇ／Ｌ アジ化ナトリウム水溶液を所定濃度（０ｍｍｏｌ／Ｌ、０．３０ｍｍｏｌ／Ｌ、０．６１６ｍｍｏｌ／Ｌ、０．９２４ｍｍｏｌ／Ｌ、１．２３２ｍｍｏｌ／Ｌ、１．５４ｍｍｏｌ／Ｌ）含有する下記第１試薬６５μＬをそれぞれ添加して、３７℃で５分間インキュベートした。なお、前記第１試薬は、前記溶血試料に添加する前に、５０℃で２０時間エージング処理を行った。続いて、下記発色試薬Ａ ４５μＬを添加して３７℃で３分間インキュベートした後、この反応液について、生化学自動分析機（商品名Ｂｉｏ Ｍａｊｅｓｔｙ：日本電子社製）を用いて、主波長７５１ｎｍ、副波長８０５ｎｍの吸収を測定した。これらの結果を下記表１に示す。なお、アジ化ナトリウム無添加（０ｇ／Ｌ）のものが比較例１となる。
【００７８】
前記メタロプロティナーゼとしては、Bacillus属由来メタロプロティナーゼを、テトラゾリウム化合物としては、2-(4-ヨードフェニル)-3-(2,4-ジニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム塩（商品名ＷＳＴ−３、同仁化学社製、以下「ＷＳＴ−３」という）を使用した。
【００８１】
【表１】
前記表１に示すように、実施例１ではテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの存在下で測定を行うことにより、発色基質ＤＡ−６４の発色量が増加したため、比較例１よりも高い吸光度が得られた。このことから、本発明の測定方法によれば、測定感度が向上するといえる。
【００８４】
（実施例２および比較例２）
この実施例は、ＷＳＴ−３とアジ化ナトリウムの添加割合を変化させ、かつ前記両者のエージングによる、さらなる感度の向上を確認した例である。
【００８５】
（試薬サンプル）
ＷＳＴ−３とアジ化ナトリウムとを下記添加割合となるように混合して、試薬サンプル（Ａ）〜（Ｅ）を調製した。そして、サンプル（Ｂ）〜（Ｅ）については、４０℃で２０時間インキュベートを行った。続いて、サンプル（Ａ）〜（Ｅ）を４℃以下に保ち、メタロプロティナーゼを２．６６ＭＵ／Ｌとなるように添加した。
【００８６】
（溶血溶液）
血球に蒸留水を添加し、これを凍結させた後、溶解することによって血球の溶血を行った。これによって得られた溶血溶液は、Ｈｂ濃度が１００ｇ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃが４．９％であった。
【００８８】
調製した前記溶血試料に、下記組成となるように下記前処理試薬を添加し、前処理を行った。
【００８９】
前記前処理試薬は、界面活性剤を２０重量％となるように緩衝液と混合して調製した。前記界面活性剤としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（商品名Ｎｉｋｋｏｌ、日本サーファクタント社製）を使用した。また、緩衝液としては、グリシンアミドの終濃度が２００ｍＭ、グリシンの終濃度が４０ｍＭとなるように、グリシンアミド緩衝液とグリシン溶液とを混合した混合緩衝液を使用した（ｐＨ９．５）。
【００９１】
（測定方法）
前記溶血溶液を蒸留水で２．４倍希釈した希釈液２０μＬに、前記各試薬サンプル６０μＬ、前記発色試薬Ｂ ５０μＬを添加して、３７℃で１５分間反応させ、生化学自動分析機（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８：日本電子社製）により、主波長７５１ｎｍ、副波長８０５ｎｍの吸収を測定した。これらの結果を下記表２および図１のグラフに示す。前記図１は、添加したテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムのモル比と、Ｈｂ濃度と、吸光度との関係を示すグラフである。
【００９３】
【表２】
前記表２および図１に示すように、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加することによって高い吸光度を示し、さらにインキュベート（エージング）を行うことによって、より一層吸光度が向上した((B）〜（E）)。また、Ｈｂ濃度の増加に伴って吸光度が増加していることから、添加したテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウム自身の吸収によって吸光度が増加しているのではなく、これらの添加により発色基質ＤＡ−６４の吸光度が増加しているといえる。また、テトラゾリウム化合物とアジ化ナトリウムの添加割合がモル比３：１であり、かつエージングした場合に、高い吸光度の増加が見られた。このようにテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを添加することによって、発色基質の発色量が増加し、さらにエージングすることによってより一層増加が見られることから、測定感度が向上したといえる。
【００９５】
（実施例３）
この実施例は、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを溶液中でエージングすることによる測定感度の向上を調べた例である。
【００９６】
まず、ＷＳＴ−３濃度が３．３３ｍｍｏｌ／Ｌであり、アジ化ナトリウム濃度が０．０８３３ｇ／Ｌである混合液を準備した。そして、これを６０℃でインキュベートすることによりエージングを行い、所定の時間（０時間、１時間、６時間、１４時間、１６時間、１８時間）にサンプリングしたものを試薬サンプルとした。
【００９７】
一方、前記実施例２と同様にして溶血溶液（ Hb濃度 100g/L、 HbA1c 4.9% ）を調製し、所定量（ 2μL、 5μL、 10μL、 20μL、 30μL ）の前記溶血溶液と、下記前処理試薬３００μＬと混合して、基質Ｈｂ溶液（Ａ〜Ｅ）調製した。
【００９８】
（前処理試薬）
80 mmol/L CHESと30mmol/L MOPSの混合液(pH9.4)
9 g/L ホ゜リオキシエチレンラウリルエーテル
【００９９】
そして、前記基質Ｈｂ溶液を蒸留水で２倍希釈した希釈液２０μＬに、前記試薬サンプルを含む下記第２試薬６５μＬおよび発色試薬Ｃ ４５μＬを添加して、３７℃で１５分間反応させ、前記生化学自動分析機により、主波長７５１ｎｍ、副波長８０５ｎｍの吸収を測定した。なお、これらの結果を下記表３および図２に示す。前記図２は、エージングの時間と吸光度の関係を示すグラフである。
【０１００】
【表３】
前記表３および図２に示すように、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを含む溶液をエージングした後に使用することによって、Ｈｂ濃度に関わらず、測定感度はさらに向上することがわかった。また、エージング処理の時間が、６時間以上である場合に、測定感度は最大となった。
【０１０４】
（実施例４）
この実施例は、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを溶液中でエージングすることによる測定感度の向上を調べた例である。
【０１０５】
まず、ＷＳＴ−３およびアジ化ナトリウムを含む下記混合液を調製して、これを所定温度（３０℃、４０℃、５０℃、６０℃）で所定時間（０時間、６時間、１５時間、２４時間、４８時間、７２時間）インキュベートしてエージングを行ったものを試薬サンプルとした。
【０１０６】
一方、実施例２と同様にして調製した基質Ｈｂ溶液（Ｈｂ濃度１００ｇ／Ｌ）を精製水で２倍希釈（体積）し、希釈溶液を調製した。また、エージングした前記試薬サンプル９ｍＬとメタロプロティナーゼ（２．７ＭＵ／Ｌ）１ｍＬとを混合して、メタロプロティナーゼ溶液を調製した。そして、前記希釈溶液２０μＬに、前記メタロプロティナーゼ溶液６５μＬおよび前記発色試薬Ａ ４５μＬを添加して、３７℃で１５分間反応させ、前記生化学自動分析機により、主波長７５１ｎｍ、副波長８０５ｎｍの吸収を測定した。なお、これらの結果を下記表４および図３に示す。前記図３は、エージングの時間と吸光度の関係を示すグラフである。
【０１０８】
【表４】
前記表４および図３に示すように、６０℃でエージングした場合に速やかに吸光度が増加したことから、エージング温度が高い程、短時間のエージング処理で測定感度を向上できるといえる。
【０１１０】
【産業上の利用の可能性】
以上のように、本発明の酸化還元反応を用いた測定方法は、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを用いるため、かつ、前記テトラゾリウム化合物および前記アジ化ナトリウムを含む溶液をエージングした後に試料に添加するため、測定感度に優れている。このため、本発明の測定方法を、例えば、赤血球中のＨｂＡ１ｃの測定に適用すれば、従来よりも測定精度が高い測定を実現でき、この結果、ＨｂＡ１ｃの糖尿病診断等の指標物質としての重要性がさらに向上する。
【０１１１】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の測定方法の一実施例において、添加したテトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムのモル比と、Ｈｂ濃度と、吸光度との相関関係を示したグラフである。
【図２】図２は、本発明の測定方法のその他の実施例において、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを含む溶液のエージング時間と吸光度との関係を示したグラフである。
【図３】図３は、本発明の測定方法のさらにその他の実施例において、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムを含む溶液のエージング時間と吸光度との関係を示したグラフである。
Claims (16)
- 試料中の測定対象物を酸化還元反応を用いて測定する方法であって、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの存在下で、前記測定対象物由来の還元物質または酸化物質の量を前記酸化還元反応により測定し、この測定値から前記測定対象物の量を決定し、
前記テトラゾリウム化合物と前記アジ化ナトリウムとを含む溶液をエージングした後に、前記試料に添加し、
前記エージングの処理温度が、３０℃〜６０℃であり、
前記エージングの処理時間が、６〜１２０時間の範囲であり、
前記試料が、溶血試料であることを特徴とする測定方法。 - 前記測定対象物が、糖化タンパク質、糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸からなる群から選択された少なくとも一つである請求項１に記載の方法。
- 前記酸化還元反応が、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼにより行われる請求項１または２に記載の方法。
- 試料中の測定対象物を酸化還元反応を用いて測定する方法であって、テトラゾリウム化合物およびアジ化ナトリウムの存在下で、前記測定対象物由来の還元物質または酸化物質の量を前記酸化還元反応により測定し、この測定値から前記測定対象物の量を決定し、
前記テトラゾリウム化合物と前記アジ化ナトリウムとを含む溶液をエージングした後に、前記試料に添加し、
前記エージングの処理温度が、３０℃〜６０℃の範囲であり、
前記エージングの処理時間が、６〜１２０時間の範囲であり、
前記測定対象物が、糖化タンパク質であり、前記酸化還元反応が、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼにより行われることを特徴とする測定方法。 - 前記試料が、溶血試料である請求項４に記載の方法。
- 前記エージングの処理温度が、４０℃以上である請求項１〜５のいずれかに記載の測定方法。
- 前記エージングの処理温度が、４０℃〜６０℃の範囲である請求項１〜６のいずれか一項に記載の測定方法。
- テトラゾリウム化合物（Ａ）とアジ化ナトリウム（Ｂ）との添加割合（モル比Ａ：Ｂ）が、Ａ：Ｂ＝２０：３〜２０：１２の範囲である請求項１〜７のいずれか一項に記載の測定方法。
- 前記酸化還元反応の反応液におけるテトラゾリウム化合物の終濃度が、０．５〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、前記反応溶液におけるアジ化ナトリウムの終濃度が０．１３〜１．３ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である請求項１〜８のいずれか一項に記載の測定方法。
- 前記テトラゾリウム化合物が２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフィドフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩である請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記糖化タンパク質が、糖化ヘモグロビンである請求項２〜１０のいずれか一項に記載の方法。
- 測定対象物由来の酸化物質が、過酸化水素である請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
- 過酸化水素が、糖化タンパク質の糖化部分とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとの反応により生成する過酸化水素である請求項１２に記載の方法。
- 酸化物質である過酸化水素の量の測定が、酸化酵素と酸化により発色する基質とを用いた測定である請求項１２または１３に記載の方法。
- 前記過酸化水素の測定が、酸化により発色する基質の発色程度の光学的な測定である請求項１４に記載の方法。
- 光学的測定が、吸光度または反射率の測定である請求項１５に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001314217 | 2001-10-11 | ||
| JP2001314217 | 2001-10-11 | ||
| PCT/JP2002/010464 WO2003033730A1 (fr) | 2001-10-11 | 2002-10-09 | Procede de mesure au moyen d'azoture de sodium |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2003033730A1 JPWO2003033730A1 (ja) | 2005-02-03 |
| JP3910174B2 true JP3910174B2 (ja) | 2007-04-25 |
Family
ID=19132568
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003536453A Expired - Fee Related JP3910174B2 (ja) | 2001-10-11 | 2002-10-09 | アジ化ナトリウムを用いた測定方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7226790B2 (ja) |
| EP (1) | EP1452606B1 (ja) |
| JP (1) | JP3910174B2 (ja) |
| CN (1) | CN1568372A (ja) |
| AT (1) | ATE391793T1 (ja) |
| DE (1) | DE60226066T2 (ja) |
| WO (1) | WO2003033730A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1330773C (zh) | 2002-05-21 | 2007-08-08 | 爱科来株式会社 | 防止n－(羧甲基氨羰基)－4,4′－双(二甲氨基)二苯胺钠盐错误显色的方法、试剂溶液及使用该方法的测量方法 |
| KR101134607B1 (ko) * | 2003-11-19 | 2012-04-09 | 세키스이 메디칼 가부시키가이샤 | 당화 단백질의 측정 방법 |
| JPWO2005056823A1 (ja) * | 2003-12-12 | 2007-07-05 | アークレイ株式会社 | 糖化アミンの測定方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4478115A (en) * | 1984-01-18 | 1984-10-23 | Southco, Inc. | Tamper-resistant fastener key |
| JPS60214900A (ja) * | 1984-04-10 | 1985-10-28 | Fujimoto Daiagunosuteitsukusu:Kk | 血清中総胆汁酸濃度の自動分析測定方法および測定試薬 |
| AU577577B2 (en) * | 1984-06-25 | 1988-09-29 | Warner-Lambert Company | Isolation and quantitation of alkaline phosphatase |
| US4748115A (en) * | 1986-01-08 | 1988-05-31 | Abbott Laboratories | Substrate formulation in 2-amino-2-methyl-1-propanol buffer for alkaline phosphatase assays |
| JPH06253899A (ja) | 1993-03-02 | 1994-09-13 | Toyobo Co Ltd | 尿素窒素測定用試薬組成物 |
| JP3987900B2 (ja) * | 1997-11-26 | 2007-10-10 | アークレイ株式会社 | 糖化タンパク質の測定方法 |
| US6352835B1 (en) * | 1998-11-17 | 2002-03-05 | Kyoto Daiichi Kagaku Co. Ltd. | Method of measuring substance in sample using a redox reaction |
| US6790665B2 (en) * | 2000-09-28 | 2004-09-14 | Arkray, Inc. | Method of quantifying hemoglobin and method of measuring glycation ratio of hemoglobin |
| JP4336886B2 (ja) * | 2001-09-28 | 2009-09-30 | アークレイ株式会社 | テトラゾリウム化合物の保存方法、それに用いる安定化剤、および前記方法を用いたテトラゾリウム化合物試薬溶液 |
-
2002
- 2002-10-09 US US10/490,900 patent/US7226790B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-10-09 AT AT02801511T patent/ATE391793T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-10-09 EP EP02801511A patent/EP1452606B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-09 DE DE60226066T patent/DE60226066T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-09 CN CNA028201949A patent/CN1568372A/zh active Pending
- 2002-10-09 WO PCT/JP2002/010464 patent/WO2003033730A1/ja active IP Right Grant
- 2002-10-09 JP JP2003536453A patent/JP3910174B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPWO2003033730A1 (ja) | 2005-02-03 |
| DE60226066D1 (de) | 2008-05-21 |
| EP1452606A1 (en) | 2004-09-01 |
| US20040209378A1 (en) | 2004-10-21 |
| ATE391793T1 (de) | 2008-04-15 |
| CN1568372A (zh) | 2005-01-19 |
| EP1452606A4 (en) | 2005-06-29 |
| WO2003033730A1 (fr) | 2003-04-24 |
| US7226790B2 (en) | 2007-06-05 |
| EP1452606B1 (en) | 2008-04-09 |
| DE60226066T2 (de) | 2009-05-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5097758B2 (ja) | 酸化還元反応を用いた糖化タンパク質の測定方法および測定キット | |
| US6514720B2 (en) | Method of measuring substance in sample using a redox reaction | |
| EP1329722A1 (en) | Assay method with the use of redox reaction | |
| US6790665B2 (en) | Method of quantifying hemoglobin and method of measuring glycation ratio of hemoglobin | |
| JP4045322B2 (ja) | 酸化還元反応を用いた測定方法 | |
| US20030186346A1 (en) | Process for producing protein decomposition product | |
| JP4143698B2 (ja) | Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムの誤発色防止方法および前記方法を用いた試薬溶液ならびに測定方法 | |
| JP3910174B2 (ja) | アジ化ナトリウムを用いた測定方法 | |
| JP4214277B2 (ja) | ホルマザンを用いた酸化還元反応による測定方法 | |
| JP4250693B2 (ja) | 酸化還元反応を用いた測定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060515 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060707 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060817 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060913 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20061128 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061206 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070109 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070123 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100202 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110202 Year of fee payment: 4 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |