CN1568372A

CN1568372A - 使用叠氮化钠的测定方法

Info

Publication number: CN1568372A
Application number: CNA028201949A
Authority: CN
Inventors: 堀井美希; 石丸香
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 2001-10-11
Filing date: 2002-10-09
Publication date: 2005-01-19
Also published as: EP1452606A1; US7226790B2; ATE391793T1; JP3910174B2; US20040209378A1; EP1452606A4; WO2003033730A1; EP1452606B1; DE60226066T2; JPWO2003033730A1; DE60226066D1

Abstract

本发明提供利用氧化还原反应的测定方法，其测定精度优良。在四唑鎓化合物和叠氮化钠的存在下，利用氧化还原反应测定来源于样品中的测定对象的还原物质或氧化物质，并由其测定值确定测定对象的量。四唑鎓化合物和叠氮化钠的添加比例在20∶3－20∶12的范围内。优选将包含四唑鎓化合物和叠氮化钠的溶液预先老化，然后加到测定样品中。

Description

使用叠氮化钠的测定方法

技术领域

本发明涉及利用氧化还原反应的测定方法。

背景技术

以往，利用氧化还原反应测定样品中的测定对象的量已广泛实施，例如，其也适用于生化分析、临床检查等中糖化蛋白质的测定。

例如，血液中的糖化蛋白质，特别是红细胞中的糖化血红蛋白反映机体血糖值的过去的历史，因此是糖尿病诊断、治疗等中的重要指标。例如，如下所示，用前述氧化还原反应，测定这种红细胞中的糖化蛋白质

首先，将红细胞溶血以制备样品，将果糖基氨基酸氧化酶(以下称为“FAOD”)加到此溶血样品中，其作用于糖化蛋白质的糖化部分，生成过氧化氢。此过氧化氢量对应于前述糖化蛋白质量。然后，将过氧化物酶(以下称为“POD”)和还原剂加到此样品中，从而以前述POD为催化剂在前述过氧化氢和前述还原剂之间发生氧化还原反应。此时，如果使用通过氧化而显色的还原剂作为前述还原剂，则可以通过测定该显色来测定前述过氧化氢的量，结果是，可以得知红细胞中的糖化蛋白质量。

发明内容

但是，取决于样品，这些以往的方法可能测定灵敏度不够，因而可能不能提高测定精度。而且，如前所述，由于血液中的糖化蛋白质用作糖尿病诊断、治疗等中的重要指标，因此仍期望进一步提高利用氧化还原反应测定它们的测定方法的测定精度。

因此，本发明的目的是提供一种利用氧化还原反应测定样品中的测定对象的方法，其测定灵敏度优良。

为了实现前述目的，本发明的测定方法是利用氧化还原反应测定样品中的测定对象的方法，其特征在于，在四唑鎓化合物和叠氮化钠的存在下，利用前述氧化还原反应测定来源于前述测定对象的还原物质或氧化物质的量，由该测定值确定前述测定对象的量。如上所述在四唑鎓化合物和叠氮化钠的存在下进行测定，虽然其作用机理不明，但可以提高测定灵敏度。在本发明中，“来源于测定对象的还原物质或氧化物质”指测定对象本身，或者其中的氧化还原物质或使用氧化还原酶等由测定对象形成的氧化还原物质两方面。

在本发明的测定方法中，优选四唑鎓化合物(A)和叠氮化钠(B)的添加比例(摩尔比A∶B)在A∶B＝20∶3-20∶12的范围内。

在本发明的测定方法中，例如，优选前述氧化还原反应的反应溶液中的四唑鎓化合物的终浓度在0.5-2.5mmol/L的范围内，前述反应溶液中的叠氮化钠的终浓度在0.13-1.3mmol/L的范围内。

在本发明的测定方法中，优选将包含四唑鎓化合物和叠氮化钠的溶液老化后到样前述样品中，因为这可以进一步提高灵敏度。

前述老化的处理温度优选在20-60℃的范围内，而且，老化的处理时间优选为6小时获6小时以上，更优选在6-120小时的范围内。

在本发明的测定方法中，优选四唑鎓化合物为2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐。

在本发明的测定方法中，优选前述来源于测定对象的氧化物质为过氧化氢，前述氧化还原反应的测定是前述过氧化氢量的测定。该过氧化氢量的测定，例如，优选使用氧化酶和通过氧化而显色的底物(以下称为显色底物)而测定。

在本发明的测定方法中，对前述样品的种类没有特别的限制，除全血、血浆、血清和血细胞以外，其对，例如，尿、脊髓液等生物样品，果汁等饮料，酱油、沙司等食品等样品。

而且，作为前述测定对象，只要利用前述氧化还原反应，对其没有特别的限制。例如，可以是全血中成分、红细胞中成分、血浆中成分、血清中成分、尿成分、脊髓液成分等，优选为红细胞中成分。例如，当测定前述红细胞成分时，可以使全血本身溶血，将其作为样品，或者可以从全血中分离红细胞，并将前述红细胞溶血，将其作为样品。作为测定对象，例如，可以是糖化血红蛋白、糖化白蛋白等糖化蛋白质，糖化肽，糖化氨基酸，葡萄糖，尿酸，胆固醇，肌酸酐，肌氨酸和甘油等，更优选为糖化蛋白质。

在本发明的测定方法中，当前述测定对象为糖化蛋白质时，优选通过用FAOD氧化分解前述糖化蛋白质的糖化部分而形成过氧化氢。而且，前述糖化肽、糖化氨基酸也同样优选经FAOD作用。而且，如果需要，优选在前述FAOD处理前，用蛋白酶处理前述糖化蛋白质和糖化肽。

附图说明

图1显示在本发明的测定方法的一个实施例中，加入的四唑鎓化合物和叠氮化钠的摩尔比、Hb浓度、吸光度之间的相关关系。

图2显示在本发明的测定方法的另一实施例中，包含四唑鎓化合物和叠氮化钠的溶液的老化时间和吸光度之间的关系。

图3显示在本发明的测定方法的进一步的另一实施例中，包含四唑鎓化合物和叠氮化钠的溶液的老化时间和吸光度之间的关系。

具体实施方式

作为本发明中的四唑鎓化合物，例如，优选四唑环的至少两个位置具有环结构取代基，更优选在三个位置具有环结构取代基。

前述四唑鎓混合物，如前所述，在前述四唑环的至少两个位置具有环结构取代基时，优选前述取代基在前述四唑环的2位和3位。而在四唑鎓化合物在三个位置具有环结构取代基时，优选前述取代基在前述四唑环的2位、3位和5位。

而且，优选四唑鎓化合物至少两个环结构取代基的环结构是苯环。作为除前述苯环以外的环结构取代基，例如，可以是环骨架中包含S或O的共振结构的取代基，例如噻吩基、噻唑基等。

而且，优选前述四唑鎓化合物四唑环的至少三个位置具有环结构取代基，并且前述环结构取代基中至少两个的环结构取代基的环结构是苯环。

而且，优选至少一个环结构取代基具有官能团，并且更优选前述官能团的数目多。

作为前述官能团，优选为吸电子官能团，例如，卤素基、醚基、酯基、羧基、酰基、亚硝基、硝基、羟基、磺基等。除此以外，例如，可以是过氧化氢基、氧基、环氧基、环二氧基、氧代基等含氧的特性基，巯基、烷硫基、甲基硫甲基、硫代、亚磺基、苯磺酰基、苯磺酰基、对甲苯磺酰基、对甲苯基磺酰基、甲苯磺酰基、氨磺酰基、异硫氰酸酯基等含硫的特性基。在这些吸电子官能团中，优选硝基、磺基、卤素基、羧基、羟基、甲氧基、乙氧基。而且，除前述吸电子官能团以外，例如，可以是苯基(C₆H₅-)、苯乙烯基(C₆H₅CH＝CH-)等不饱和烃基等。前述官能团可以通过解离而离子化。

优选前述四唑鎓化合物四唑环的2位和3位具有苯环，前述苯环的至少一个具有选自卤素基、羧基、硝基、羟基、磺基、甲氧基和乙氧基的至少一个官能团。也可以前述两个苯环都具有前述官能团。可以在前述官能团中任一位置(邻位、间位、对位)具有前述官能团。而且，对官能团的数目没有特别的限制，可以具有相同的官能团，也可以具有不同的官能团。

前述四唑鎓化合物，例如，在前述四唑环的2位、3位和5位具有苯环结构取代基，例如，可以是2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓盐、3，3′-(1，1′-联苯基-4，4′-二基)-双(2，5-二苯基)-2H-四唑鎓盐、3，3′-[3，3′-二甲氧基-(1，1′-联苯基)-4，4′-二基]-双[2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓盐]、2，3-二苯基-5-(4-氯苯基)四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(对二苯基)四唑鎓盐、2，3-苯基-5-(对二苯基)四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(间甲苯基)四唑鎓盐和2，5-二苯基-3-(对甲苯基)四唑鎓盐。

此外，前述四唑鎓化合物不限于前述的化合物，除此以外，也可以使用前述四唑环的两个位置具有苯环结构取代基和一个位置具有其他环结构取代基的化合物，例如2，3-二苯基-5-(2-噻吩基)四唑鎓盐、2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-磺乙基氨基甲酰基)苯基]-2H-四唑鎓盐、2，2′-二苯并噻唑基-5，5′-双[4-二(2-磺乙基)氨基甲酰基苯基]-3，3′-(3，3′-二甲氧基-4，4′-亚联苯基)二四唑鎓盐和3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓盐等。

而且，还可以使用在前述四唑环的两个位置具有苯环结构取代基和在一个位置具有非环结构取代基的四唑鎓化合物，例如，2，3-二苯基-5-氰基四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-羧基四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-甲基四唑鎓盐和2，3-二苯基-5-乙基四唑鎓盐等。

在前述四唑鎓化合物中，如前所述，优选具有三个环结构取代基的化合物，更优选具有三个环结构是苯环的取代基，并且具有多个吸电子官能团的四唑鎓化合物，特别优选2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐。这种四唑鎓化合物，例如，可以是盐，也可以是离子化状态。

前述FAOD优选是催化下式(1)所示的反应的FAOD。

…(1)

在前式(1)中，R¹表示羟基或来源于糖化反应前的糖的残基(糖残基)。当反应前的糖为醛糖时，前述糖残基(R¹)是醛糖残基，当反应前的糖为酮糖时，前述糖残基(R¹)是酮糖残基。例如，当反应前的糖为葡萄糖时，通过阿马多里(Amadori)重排，反应后的结构为果糖结构，在这种情况下，糖残基(R¹)变成葡萄糖残基(醛糖残基)。例如，这种糖残基(R¹)可以由下式表示：

-[CH(OH)]_n-CH₂OH

其中n为0-6的整数。

在前述式(1)中，对R²没有特别的限制，但是，例如，在糖化氨基酸、糖化肽或糖化蛋白质的情况下，α-氨基被糖化的情况和其以外的氨基被糖化的情况是不同的。

在前述式(1)中，当α-氨基被糖化时，R²是下式(2)所示的氨基酸残基或肽残基。

-CHR³-CO-R⁴ …(2)

在前述式(2)中，R³表示氨基酸侧链基。此外，R⁴表示羟基、氨基酸残基或肽残基，例如，可以由下式(3)表示。在下式(3)中，n为0或0以上的整数，而R³表示与前述相同的氨基酸侧链基。

-(NH-CR³H-CO)_n-OH …(3)

在前述式(1)中，当α-氨基以外的氨基被糖化(氨基酸侧链基被糖化)时，R²可以由下式(4)表示。

-R⁵-CH(NH-R⁶)-CO-R⁷ …(4)

在前述式(4)中，R⁵表示氨基酸侧链基中糖化氨基以外的部分。例如，当糖化氨基酸为赖氨酸时，R⁵为

-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-

例如，当糖化氨基酸为精氨酸时，R⁵为

-CH₂-CH₂-CH₂-NH-CH(NH₂)-

在前述式(4)中，R⁶表示氢、氨基酸残基或肽残基，例如，可以由下式(5)表示。在下式(5)中，n表示0或0以上的整数，R³表示与前述相同的氨基酸侧链基。

-(CO-CHR³-NH)_n-H …(5)

在前述式(4)中，R⁷表示羟基、氨基酸残基或肽残基，例如，可以由下式(6)表示。在下式(6)中，n为0或0以上的整数，R³表示与前述相同的氨基酸侧链基。

-(NH-CHR³-CO)_n-OH …(6)

作为前述FAOD，例如，可以使用由以下菌生产的物质。这种菌，例如，属于镰刀菌属(fusarium)、赤霉属(Gibberella)、青霉属(Penicillium)、蜜环菌属(Armillaria)、卡尔黑霉属(Caldariomyces)、灵芝属(Ganoderma)和曲霉属(Aspergillus)等的菌。具体的实例包括尖孢镰孢(Fusarium oxysporum S-1F4)(FERM BP-5010)、Fusariumoxysporum f.sp.Lini(IFO NO.5880)、甘薯尖孢镰孢(Fusariumoxysporum f.sp.batatas)(IFO NO.4468)、Fusarium oxysporum f.sp.niveum(IFO NO.4471)、苦瓜萎凋病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerium)(IFO NO.6384)、Fusarium oxysporum f.sp.melongenae(IFO NO.7706)、芹菜萎凋病菌(Fusarium oxysporum f.sp.apii)(IFONO.9964)、香石竹萎凋病菌(Fusarium oxysporum f.sp.pini)(IFO NO.9971)、草莓枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.fragariae)(IFO NO.31180)、稻恶苗赤霉(Gibberella fujikuroi)(IFO NO.6356、6605)、微紫青霉(Penicullium janthinellum S-3413)(FERM BP-5475)、微紫青霉(Penicullium janthinellum)(IFO NO.4651、6581、7905)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)(IFO NO.5748)、爪哇青霉(Penicilliumjavanicum)(IFO NO.4639)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)(IFONO.4897)、暗蓝青霉(Penicillium cyaneum)(IFO NO.5337)、土曲霉(Aspergillus terreus)(IFO 6365)、土曲霉GP-1(Aspergillus terreus GP-1)(FERM BP-5684)、米曲霉(Aspergillus oryzae)(IFO 4242)和米曲霉(Aspergillus oryzae)(IFO 5710)等。

而且，作为市售的FAOD，例如，可以是特异性作用于α-氨基被糖化的糖化氨基酸的商品果糖基氨基酸氧化酶(FAOX-E)(キフコ一マン社制)和商品果糖基胺氧化酶(旭化成社制)。

接着，以测定血细胞中的糖化蛋白质为施说明本发明的测定方法。

首先，使全血溶血，或以离心分离等常规方法从全血中分离血细胞部分，并将其溶血，而制备溶血样品。对此溶血方法没有特别的限制，例如，可以使用用表面活性剂的方法、用超声波的方法、利用渗透压差的方法和用冷冻融解的方法。其中，由于操作的简便性等的理由，前述用表面活性剂的方法是优选的。

作为前述表面活性剂，例如，可以使用聚氧乙烯基对叔辛基苯基醚(Triton系表面活性剂等)、聚乙烯失水山梨糖醇烷基酯(Tween系表面活性剂等)、聚氧乙烯烷基醚(Brij系表面活性剂等)等非离子表面活性剂，具体而言，例如，可以为Triton X-100、Tween-20、Brij 35等。用前述表面活性剂处理的条件通常如下：当处理溶液中的血细胞浓度为1-10体积％时，加入前述表面活性剂以使前述处理溶液中的浓度为0.1-5重量％，并在室温下搅拌数秒(约5秒)至10分钟。

接着，将四唑鎓化合物和叠氮化钠加到前述溶血样品中。

通过如此加入四唑鎓化合物和叠氮化钠，其灵敏度比没有加入它们的情况提高1.2-3倍。

例如，当处理溶液中的血细胞浓度为0.2-2体积％时，优选加入前述四唑鎓化合物使浓度在0.005-400mmol/L的范围内，更优选在0.02-100mmol/L的范围内，特别优选在0.1-50mmol/L的范围内。具体而言，当前述四唑鎓化合物为2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐时，优选加入至浓度在0.004-16mmol/L的范围内，更优选在0.02-10mmol/L的范围内，特别优选在0.1-5mmol/L的范围内。而且，前述四唑鎓化合物可以是一种，也可以是两种或两种以上并用。

而且，前述四唑鎓化合物(A)和叠氮化钠(B)的添加比例(摩尔比A∶B)，例如，在A∶B＝20∶3-20∶12的范围内，优选在20∶5-20∶11的范围内，更优选在20∶6-20∶10的范围内。

可以将前述四唑鎓化合物和叠氮化钠原样加到前述溶血样品中。但是，从操作的简便性的角度而言，优选溶于溶剂的四唑鎓化合物溶液和叠氮化钠溶液，或者含有四唑鎓化合物和叠氮化钠二者的混合液(四唑鎓化合物·叠氮化钠混合液)。

前述各种溶液中四唑鎓化合物(C)或叠氮化钠(D)的浓度可以根据加到前述溶血样品中的稀释倍率而适宜地确定，但四唑鎓化合物(C)的浓度，例如，在0.6-10mmol/L的范围内，优选在0.75-3mmol/L的范围内，更优选在1-2.4mmol/L的范围内。此外，当使用前述混合液时，四唑鎓化合物(C)和叠氮化钠(D)的配合比例(摩尔比C∶D)，例如，在C∶D＝20∶5-20∶11的范围内，优选在20∶6-20∶8的范围内。

作为前述溶液的溶剂，例如，可以使用MOPS、MES、MOPSO、DIPSO、TES、POPSO和HEPES等Good缓冲液、磷酸盐缓冲液等，优选为MES和MOPS。前述溶剂的pH，例如，在5.0-7.0的范围内，优选在5.5-6.5的范围内，更优选为5.5。此外，前述缓冲液的浓度，例如，在1-100mmol/L的范围内，优选在1-10mmol/L的范围内，加到前述溶血样品中时的处理溶液中的最终浓度，例如，在0.7-9mmol/L的范围内，优选在0.8-4.5mmol/L的范围内。

而且，因为可能进一步提高灵敏度，优选将所制备的前述四唑鎓化合物·叠氮化钠混合液在加到前述溶血样品中之前通过放置一定时间而老化。通过这种老化处理，灵敏度比没有老化时，例如，提高约1.2-3倍。

在前述老化中，例如，处理温度优选在40-60℃的范围内，更优选在50-60℃的范围内。处理时间，例如，为6小时或6小时以上，优选在6-120小时的范围内，更优选在6-72小时的范围内。

在直接添加或以前述溶液添加四唑鎓化合物和叠氮化钠到前述溶血样品后，通常在40-60℃下培养6-72小时而进行前述样品的预处理。通过如此用四唑鎓化合物预处理样品，可以除去前述样品中包含的还原物质等对氧化还原反应的影响，由此提高测定精度。虽然如上述四唑鎓化合物有助于提高测定精度，但为了本发明的目的，测定灵敏度的提高，叠氮化钠与四唑鎓化合物共存是必需的，通过这样而实现本发明的特有效果。

接着，用蛋白酶处理添加了四唑鎓化合物和叠氮化钠的经预处理的溶血样品。这样，在后来的处理中使用的FAOD可以更为容易地作用于测定对象。

对前述蛋白酶没有特别的限制，例如，可以使用丝氨酸蛋白酶、硫醇蛋白酶、金属蛋白酶等，具体而言，优选胰蛋白酶、蛋白酶K、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠罗蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、弹性蛋白酶、氨基肽酶等。此外，在所分解的糖化蛋白质为糖化血红蛋白时，前述蛋白酶是选择性分解前述糖化血红蛋白的蛋白酶，优选为菠罗蛋白酶、木瓜蛋白酶、来自猪胰腺的胰蛋白酶、金属蛋白酶和来自枯草杆菌(Bacillus subtllis)的蛋白酶等。前述来源于枯草杆菌的蛋白酶可以为商品蛋白酶N(例如Fluka Chemie AG)、商品蛋白酶N“アマノ”(天野制药社制)等。前述金属蛋白酶可以来源于芽孢杆菌属的金属蛋白酶(EC 3.4.24.4)(例如东洋纺社制：商品トヨチ一ム)等。其中更优选金属蛋白酶、菠罗蛋白酶和木瓜蛋白酶，特别优选金属蛋白酶。因此，特定的蛋白质的分解物可以通过使用选择性地分解的蛋白酶而选择性地制备。前述蛋白酶处理通常在缓冲液中进行，其处理条件根据所用的蛋白酶的种类、测定对象糖化蛋白质的种类及其浓度等适宜地确定。

作为前述缓冲液，例如，可以使用CHES缓冲液、CAPSO缓冲液、CAPS缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液、EPPS缓冲液、HEPES缓冲液等。其pH，例如，在6-13的范围内，优选在7-11的范围内。而且，蛋白酶处理溶液中前述缓冲液的最终浓度，例如在1.0-10mmol/L的范围内。

具体而言，例如，当使用金属蛋白酶作为前述蛋白酶处理前述经预处理的溶血样品时，通常反应液中的金属蛋白酶浓度在0.1-40MU/L的范围内，反应液中的血细胞浓度在0.05-15体积％的范围内，反应温度在15-37℃的范围内，反应时间在1分钟至24小时的范围内，pH在6-12的范围内。

而且，例如，当用蛋白酶K作为前述蛋白酶处理前述经预处理的溶血样品时，通常反应液中的蛋白酶浓度在10-300KU/L的范围内，反应液中的血细胞浓度在0.05-15体积％的范围内，反应温度在15-37℃的范围内，反应时间在1分钟至24小时的范围内，pH在6-12的范围内。而且，对前述缓冲液的种类没有特别的限制，例如，可以使用Tris-HCl缓冲液、EPPS缓冲液、PIPES缓冲液等。

接着，用前述FAOD处理前述通过前述蛋白酶处理得到的分解物。通过这种FAOD处理，催化上式(1)所示的反应。

与前述蛋白酶处理相同，这种FAOD处理优选在缓冲液中进行，其处理条件根据所用的FAOD的种类、测定对象糖化蛋白质的种类及其浓度等适宜地确定。

具体而言，例如，反应液中的FAOD浓度在50-50000U/L的范围内，反应液中的血细胞浓度在0.01-1体积％的范围内，反应温度在15-37℃的范围内，反应时间在1-60分钟的范围内，pH在6-9的范围内。而且，对前述缓冲液的种类没有特别的限制，可以使用与前述蛋白酶处理相同的缓冲液。

接着，用POD和前述显色底物通过氧化还原反应测定通过前述FAOD处理形成的过氧化氢。

作为前述显色底物，例如，可以是N-(羧甲基氨基羰基)-4，4′-双(二甲氨基)二苯基胺钠、邻亚苯基二胺(OPD)、Trinder试剂和4-氨基安替比林组合的底物等。作为前述Trinder试剂，例如，可以是苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺和萘胺衍生物等。而且，除前述氨基安替比林以外，也可以使用氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑啉酮腙(SMBTH)等。在这些显色底物中，特别优选N-(羧甲基氨基羰基)-4，4′-双(二甲氨基)二苯基胺钠。

前述氧化还原反应通常在缓冲液中进行。其条件根据前述形成的过氧化氢的浓度等适宜地确定。通常反应液中的POD的浓度在10-100000IU/L的范围内，显色底物浓度在0.005-30mmol/L的范围内，反应温度在15-37℃的范围内，反应时间在0.1-30分钟的范围内，pH在5-9的范围内。而且，对前述缓冲液没有特别的限制，例如，可以使用与前述蛋白酶处理和FAOD处理等相同的缓冲液。

在前述氧化还原反应中，例如，当使用前述显色底物时，可以通过用分光光度计测定前述反应液的显色程度(吸光度)来测定过氧化氢的量。然后，例如，可以用此过氧化氢浓度和校正曲线等求出样品中糖化蛋白质的量。

前述显色程度，例如，除吸光度测定以外，还可以通过反射率等的光学测定而测定。而且，前述过氧化氢量，除前述使用POD等的酶法以外，例如，还可以通过电方法测定。

如此，通过加入四唑鎓化合物和叠氮化钠，可以高灵敏度地进行利用氧化还原反应进行的前述糖化蛋白质的测定。

对四唑鎓化合物和叠氮化钠的添加顺序没有特别的限制，但是，如前所述，由于通过将前述二者老化得到更好的效果，因而优选预先将二者混合。

而且，如上所述，测定对象只要利用氧化还原反应，对其没有特别的限制，除前述糖化蛋白质以外，例如可以是糖化肽、糖化氨基酸、葡萄糖、胆固醇、尿酸、肌酸酐、肌氨酸和甘油等。当测定它们时，例如，可以在与前述相同地将四唑鎓化合物和叠氮化钠加到测定样品中后，如以下所示，生成来源于测定对象的还原物质或氧化物质，利用氧化还原反应测定其量。

当通过形成过氧化氢测定前述各测定对象的量时，例如，可以使葡萄糖氧化酶作用于前述葡萄糖，使胆固醇氧化酶作用于前述胆固醇，使尿酸酶作用于前述尿酸，使肌氨酸氧化酶作用于前述肌酸酐，使肌氨酸氧化酶作用于前述肌氨酸，使甘油氧化酶作用于前述甘油，从而形成过氧化氢。此过氧化氢量的测定方法可以与前述相同地进行。而且，例如，可以与前述糖化蛋白质的测定相同地测定糖化肽和糖化氨基酸。

而且，在生成来源于前述测定对象的还原物质，通过氧化还原反应测定其量，由其测定值确定前述测定对象的量时，例如，可以如下所示进行测定。

当前述测定对象为葡萄糖时，例如，在NAD或NADP等的存在下，使用葡萄糖脱氢酶形成NADH或NADPH等还原物质。然后，例如，使用黄递酶和通过还原而显色的底物，通过氧化还原反应测定来源于前述测定对象的还原物质NADH或NADPH。然后，如前所述，例如，利用该来源于测定对象的还原物质的浓度和校准曲线等求出样品中测定对象的量。而且，例如，当测定对象为胆固醇时，可以使用胆固醇脱氢酶，当为肌氨酸时，可以使用肌氨酸脱氢酶。

作为前述通过还原而显色的底物，虽然对其没有特别的限制，但是，例如，可以使用2，6-二氯酚吲哚酚等。而且，为了获得具有更优良可靠性的测定值，例如，优选在测定前述来源于测定对象的还原物质之前预先测定吸光度。

实施例

(实施例1和比较例1)

首先，将0.3mL下述溶血试剂加入Hb浓度为150g/L(HbA1c5.8％)的血液中进行溶血而制备溶血样品。将25μL该溶血样品和20μL纯化水混合，接着分别加入65μL含有预定浓度(0mmol/L、0.30mmol/L、0.616mmol/L、0.924mmol/L、1.232mmol/L和1.54mmol/L)的3g/L的叠氮化钠水溶液的下述第一试剂，于37℃下培养5分钟。将前述第一试剂加到前述溶血样品中之前，于50℃下进行20小时老化处理。随后加入45μL下述显色试剂A，并于37℃下培养3分钟后，用生物化学自动分析仪(商品Bio Majesty：日本电子社制)测定该反应液在751nm的主波长和805nm的副波长的吸收。其结果如下表1所示。将未添加叠氮化钠(0g/L)的混合物作为比较例1。

(溶血试剂：pH9.0)

CHES缓冲液 380mmol/L

聚氧乙烯月桂基醚 24g/L

(第一试剂)

100mmol/L MOPS(pH6.0) 0.15mL

13MU/L 金属蛋白酶 0.60mL

10mmol/L 四唑鎓化合物 0.60mL

20mmol/L CaCl₂ 0.045mL

3g/L NaN₃ 预定量

蒸馏水剩余部分

总量3.0mL

作为前述金属蛋白酶，使用来源于芽胞杆菌属的金属蛋白酶，作为四唑鎓化合物，使用2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐(商品WST-3，同仁化学社制，下文称为“WST-3”)。

(显色试剂A)

FAOD(商品果糖基氨基酸氧化酶，ア一クレイ社制，26.0KU/L

下同)

POD(东洋纺社制，下同) 77.6KU/L

显色底物(商品DA-64，和光纯药工业社制，下同) 0.052mmol/L

Tris-HCl缓冲液(pH6.9) 200mmol/L

(表1)

第一试剂中叠氮化钠的第一试剂中四唑鎓化合吸光度

终浓度(mmol/L) 物浓度(mmol/L)

比较例1 0 2 0.0124

实施例1 0.300 2 0.0476

0.616 2 0.0518

0.924 2 0.0475

1.232 2 0.0418

1.540 2 0.0275

如上表1所示，在实施例1中，通过在四唑鎓化合物和叠氮化钠的存在下进行测定，由于显色底物DA-64的显色量增加，因此得到比比较例1高的吸光度。因此，可以说本发明的测定方法提高测定灵敏度。

(实施例2和比较例2)

在本实施例中，确认WST-3和叠氮化钠的添加比例变化，并且通过前述二者的老化而进一步提高灵敏度。

(试剂样品)

将WST-3和叠氮化钠以下述添加比例混合而制备试剂样品(A)-(E)。然后，在40℃下将样品(B)-(E)培养20小时。接着，将样品(A)-(E)保持在4℃或4℃以下，并加入金属蛋白酶达2.66MU/L。

(添加比例)

实施例2

(A) (B) (C) (D) (E)

WST-3(mmol/L) 2.0 2.0 2.0 2.7 1.3

NaN₃(mmol/L) 0.7 0.7 1.4 1.4 0.7

WST-3∶NaN₃(摩尔比) 3∶1 3∶1 1.43∶1 1.9∶1 1.9∶1

MOPS pH6.5(mmol/L) 5.5 5.5 5.5 5.5 5.5

CaCl₂(mmol/L) 5.5 5.5 5.5 5.5 5.5

NaCl(mmol/L) 0.33 0.33 0.33 0.33 0.33

老化 ○ ○ ○ ○

(溶血溶液)

将蒸馏水加到血细胞中，将其冷冻后，通过融解而进行血细胞的溶血。在如此得到的溶血溶液中，Hb浓度为100g/L，HbA1c为4.9％。

在所制备的前述溶血样品中加入组成如下的前述处理试剂，进行预处理。

Hb浓度

6.7g/L 13.4g/L 20.1g/L 33.5g/L

溶血溶液 50μL 100μL 150μL 250μL

预处理试剂 434μL 434μL 434μL 434μL

蒸馏水 266μL 216μL 166μL 66μL

总量750

将表面活性剂与缓冲液混合使其达20重量％而制备前述预处理试剂。作为表面活性剂，使用聚氧乙烯月桂基醚(商品Nikkol，日本サ一フアクタント社制)。此外，作为缓冲液，使用将甘氨酰胺缓冲液和甘氨酸溶液混合得到的混合缓冲液(pH9.5)，甘氨酰胺的终浓度为200mM，甘氨酸的终浓度为40mM。

(显色试剂B)

FAOD 25.9KU/L

POD 77.6KU/L

显色底物 0.0518mmol/L

Tris-HCl缓冲液(pH6.9) 200mmol/L

(测定方法)

用蒸馏水将前述溶血溶液稀释2.4倍，并在20μL该稀释液中加入60μL前述各试剂样品、50μL前述显色试剂B，在37℃下反应15分钟，用生物化学自动分析仪(商品JCA-BM 8：日本电子社制)测定在751nm的主波长和805nm的副波长的吸收。结果如下表2和图1所示。前述图1显示添加的四唑鎓化合物和叠氮化钠的摩尔比、Hb浓度、吸光度之间的关系。

(表2)

实施例2

Hb浓度 (A) (B) (C) (D) (E)

0g/L 0.1542 0.1628 0.1469 0.1403 0.1647

6.7g/L 0.0034 0.0101 0.0087 0.0099 0.0097

13.4g/L 0.0063 0.0180 0.0146 0.0173 0.0171

20.1g/L 0.0094 0.0259 0.0202 0.0249 0.0243

33.5g/L 0.0127 0.0384 0.0278 0.0374 0.0349

如前述表2和图1所示，通过加入四唑鎓化合物和叠氮化钠，表现出高吸光度，通过进一步进行培养(老化)，进一步提高吸光度((B)-(E))。而且，由于Hb浓度的增加伴随吸光度的增加，因此可以说吸光度增加不是通过添加的四唑鎓化合物和叠氮化钠自身的吸收而吸光度增加，而是通过它们的添加使显色底物DA-64的吸光度增加。而且，当四唑鎓化合物和叠氮化钠的添加比例为摩尔比3∶1，并进行老化时，观察到高的吸光度增加。这样，通过加入四唑鎓化合物和叠氮化钠，显色底物的显色量增加，通过进一步进行老化，观察到更多的增加，可以说测定灵敏度得到提高。

(实施例3)

在本实施例中，研究通过在溶液中将四唑鎓化合物和叠氮化钠老化而提高测定灵敏度。

首先，准备WST-3浓度为3.33mmol/L，叠氮化钠浓度为0.0833g/L的混合液。然后，通过在60℃下培养而进行老化，在预定时间(0小时、1小时、6小时、14小时、16小时和18小时)取样，将其作为试剂样品。

另一方面，与前述实施例2相同地制备溶血溶液(Hb浓度为100g/L，HbA1c为4.9％)，然后将预定量(2μL、5μL、10μL、20μL和30μL)的前述溶血溶液与300μL下述预处理试剂混合，制备底物Hb溶液(A-E)。

(预处理试剂)

80mmol/L CHES和30mmol/L MOPS的混合液(pH9.4)

9g/L的聚氧乙烯月桂基醚

首先，用蒸馏水将前述底物Hb溶液稀释2倍，在20μL稀释液中添加65μL分别包含前述试剂样品的下述第二试剂和45μL显色试剂C，在37℃下反应15分钟，用前述生物化学自动分析仪测定在751nm的主波长和805nm的副波长的吸收。其结果如下表3和图2所示。前述图2显示老化时间和吸光度之间的关系。

(第二试剂)

试剂样品 4.2mL

1mol/L CaCl₂ 0.035mL

5mol/L NaCl 0.280mL

30mmol/L MES(pH5.5) 1.40mL

100MU/L 金属蛋白酶 0.7mL

蒸馏水 0.385mL

总量7.0mL

(显色试剂C)

FAOD 25.9KU/L

POD 77.6KU/L

显色底物 0.0518mmol/L

Tris-HCl缓冲(pH7.0) 300mmol/L

(表3)

老化时间 Hb终浓度

(A) (B) (C) (D) (E)

(小时) 0.10g/L 0.25g/L 0.50g/L 0.96g/L 1.40g/L

0 0.0003 0.0007 0.0015 0.0037 0.0065

1 0.0003 0.0008 0.0017 0.0042 0.0073

6 0.0008 0.0020 0.0039 0.0084 0.0129

14 0.0009 0.0020 0.0039 0.0084 0.0130

16 0.0008 0.0020 0.0039 0.0083 0.0128

18 0.0008 0.0020 0.0039 0.0083 0.0129

如前述表3和图2所示，通过在老化后使用包含四唑鎓化合物和叠氮化钠的溶液，进一步提高测定灵敏度，而与Hb浓度无关。而且，当老化处理的时间为6小时或6小时以上时，灵敏度达到最大。

(实施例4)

首先，制备包含WST-3和叠氮化钠的下述混合液，然后在预定温度(30℃、40℃、50℃和60℃)下培养预定时间(0小时、6小时、15小时、24小时、48小时和72小时)而老化，以制备试剂样品。

(混合液组成)

WST-3 2.20mmol/L

叠氮化钠 0.05g/L

MOPS(pH6.5) 5.50mmol/L

CaCl₂ 5.50mmol/L

NaCl 330mmol/L

另一方面，与实施例2相同地制备底物Hb溶液(Hb浓度为100g/L)，并用纯化水稀释2倍(体积)，制备稀释溶液。此外，将9mL经老化的前述试剂样品与1mL金属蛋白酶(2.7MU/L)混合，制备金属蛋白酶溶液。然后，在20μL前述稀释溶液中添加65μL前述金属蛋白酶溶液和45μL前述显色试剂A，在37℃下反应15分钟，用前述生物化学自动分析仪测定751nm的主波长和805nm的副波长的吸收。其结果如下表4和图3所示。前述图3显示老化时间和吸光度之间的关系。

(表4)

老化时间老化温度

(小时) 30℃ 40℃ 50℃ 60℃

0 0.0078 0.0078 0.0078 0.0078

6 0.0211 0.0244 0.0253 0.0277

24 0.0259 0.0270 0.0323 0.0320

48 0.0271 0.0286 0.0288 0.0301

72 0.0302 0.0311 0.0311 0.0308

如前述表4和图3所示，当在60℃下进行老化时，吸光度快速增加，因此可以说老化温度较高时，短时间的老化处理提高测定灵敏度。

工业实用性

如以上所述，本发明的利用氧化还原反应的测定方法，由于使用四唑鎓化合物和叠氮化钠，因而测定灵敏度优良。因此，本发明的测定方法，例如适用于红细胞中的HbA1c的测定，可以实现比以往的方法更高的测定精度，其结果是，进一步提高了HbA1c作为糖尿病诊断等的指标物质的重要性。

Claims

1.利用氧化还原反应测定样品中的测定对象的方法，其特征在于，在四唑鎓化合物和叠氮化钠的存在下，利用前述氧化还原反应测定来源于前述测定对象的还原物质或氧化物质的量，由该测定值确定前述测定对象的量。

2.权利要求1的测定方法，其中四唑鎓化合物(A)和叠氮化钠(B)的添加比例(摩尔比A∶B)在A∶B＝20∶3-20∶12的范围内。

3.权利要求1或2的方法，其中前述氧化还原反应的反应液中的四唑鎓化合物的终浓度在0.5-2.5mmol/L的范围内，前述反应溶液中的叠氮化钠的终浓度在0.13-1.3mmol/L的范围内。

4.权利要求1-3之任一项的测定方法，其中将包含四唑鎓化合物和叠氮化钠的溶液老化后加到样品中。

5.权利要求4的测定方法，其中老化的处理温度在20-60℃的范围内。

6.权利要求4或5的测定方法，其中老化的处理时间在6-120小时的范围内。

7.权利要求1-6之任一项的方法，其中四唑鎓化合物为2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐。

8.权利要求1-7之任一项的方法，其中测定对象为选自糖化蛋白质、糖化肽和糖化氨基酸的至少一种。

9.权利要求8的方法，其中糖化蛋白质为糖化血红蛋白。

10.权利要求1-9之任一项的方法，其中来源于测定对象的氧化物质为过氧化氢。

11.权利要求10的方法，其中过氧化氢通过糖化蛋白质的糖化部分和果糖基氨基酸氧化酶之间的反应形成。

12.权利要求10或11的方法，其中氧化物质过氧化氢的量使用氧化酶和通过氧化而显色的底物测定。

13.权利要求12的方法，其中前述过氧化氢的测定是通过氧化而显色的底物的显色程度的光学测定。

14.权利要求13的方法，其中光学测定是吸光度或反射率的测定。