CN1693881A - 偶联酶促反应测定腺苷脱氨酶的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

Heinz(1980)借助腺苷脱氨酶将腺苷脱氨产生次黄苷，通过次黄苷偶联嘌呤核苷磷酸化酶和黄嘌呤氧化酶酶促反应生成过氧化氢，在过氧化氢酶和醛脱氢酶的作用下，测量334nm处NADPH吸光度上升的速率来测算腺苷脱氨酶活性。该法缺点是试剂成本过高。本发明引入Trinder氏反应，将次黄苷偶联酶促反应生成的过氧化氢在过氧化物酶的作用下使苯胺类供氢体和4－氨基安替比林偶联物凝聚成有色产物。通过连续反应和动态观察有色产物的产量，从而测定腺苷脱氨酶的活性。本发明简化了Heinz氏测定腺苷脱氨酶的次黄苷偶联酶促反应体系，降低了试剂成本。本发明将苯胺类化合物ADOS、ADPS、ALPS、TODB、TOOS和TOPS用作Trinder氏反应的供氢体，增加了反应的灵活性。本发明还涉及用于进行上述方法的试剂盒。

Description

偶联酶促反应测定腺苷脱氨酶的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及一种生物样本中测定腺苷脱氨酶活性的技术方案以及有此方案制造的试剂。特别是涉及一种有腺苷脱氨酶将腺苷脱氨产生次黄苷后偶联多酶促反应体系。

背景技术

Heinz(1980)借助腺苷脱氨酶(Adenosine deaminase，ADA)将腺苷(Adenosine)脱氨产生次黄苷(Inosine)。通过次黄苷偶联嘌呤核苷磷酸化酶(Purine nucleoside phosphorylase，PNP)和黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase，XOD)酶促反应生成过氧化氢(H₂O₂)。过氧化氢酶(Catalase)将过氧化氢还原成水，在乙醇(Ethanol)存在条件下生成乙醛(Acetaldehyde)。乙醛依赖NADP⁺被醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase)氧化，同时NADP⁺被还原成NADPH。通过测量334nm处NADPH吸光度上升的速率来测算ADA活性。该法缺点是反应体系过于繁琐、试剂成本高，阻碍临床推广使用。其反应原理和参考文献如下：

Heinz F，Reckel S，Pilz R，Kalden JR.嘌呤代谢酶的新分光光度计测定法IV。测定腺苷脱氨酶。酶。1980；25(1)：50-5。[Heinz F，Reckel S，Pilz R，Kalden JR.A newspectrophotometric assay for enzymes of purine metabolism.IV.Determination ofadenosine deaminase.Enzyme.1980；25(1)：50-5.]

Trinder(1969)利用供氢体N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-3-甲基苯胺

[N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline，EHSPT或TOOS]和偶联物4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine，4-AA)在过氧化物酶(Peroxidase，POD)的氧化作用下被过氧化氢(H₂O₂)凝聚生成紫红色的有色醌(Quinone dye)。有色醌最大吸收光谱在545-556nm处。通过测量556nm处有色醌吸光度上升的速率来测算POD活性。该法缺点是供氢体的选择过窄，仅选用EHSPT。其反应原理和参考文献如下：

                                      [λmax(最大吸光度波长)556nm]

P.Trinder，用葡萄糖氧化酶和一种新型氧受体来测定血糖。临床生化年刊，卷6，24-26页，1969。[P.Trinder，Determination of glucose in blood using glucose oxidase with analternative oxygen acceptor.Annals in Clinical Biochemistry，v.6，p.24-26，1969]

发明内容

Heinz氏测定腺苷脱氨酶的次黄苷偶联酶促反应体系过于繁琐，尤其是过氧化氢酶、醛脱氢酶和NADP⁺的使用造成试剂成本高，阻碍临床推广使用。

Trinder氏反应仅选用EHSPT作为供氢体，不利于反应的灵活应用。

本发明将次黄苷偶联PNP和XOD酶促反应以及Trinder氏反应联合使用。使XOD氧化下产生的H₂O₂通过Trinder氏反应将苯胺类供氢体和4-氨基安替比林偶联物凝聚成有色产物。通过连续反应和动态观察有色产物的产量，从而测定腺苷脱氨酶的活性。

本发明用Trinder氏反应代替了Heinz氏次黄苷偶联酶促反应法中过氧化氢酶和醛脱氢酶反应步骤。从而简化了Heinz氏法测定腺苷脱氨酶的次黄苷偶联酶促反应体系、省去了昂贵的过氧化氢酶、醛脱氢酶和NADP⁺成分、大大降低了试剂成本，为ADA测试法的产业化和市场化开辟了一条新路。

本发明对Trinder氏反应也进行了改进。将以下任一苯胺类化合物用作Trinder氏反应的供氢体。从而增加了反应的灵活性，使腺苷脱氨酶测定的整套反应体系更有利于临床推广使用。

1)N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-3-甲氧基苯胺

[N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methoxylaniline(ADOS)]

2)N-乙基-N-(3-硫丙基)-3-甲氧基苯胺

[N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline(ADPS)]

3)N-乙基-N-(3-硫丙基)苯胺[N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)aniline(ALPS)]

4)N，N-双(4-硫丁基)-3-甲基苯胺[N，N-Bis(4-sulfobutyl)-3-methylaniline(TODB)]

5)N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-3-甲基苯胺

[N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline(TOOS)]

6)N-乙基-N-(3-硫丙基)-3-甲基苯胺

[N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methylaniline(TOPS)]

以本发明的次黄苷偶联酶促反应配制了测定ADA的试剂盒。

具体实施方式

1.确定Adenosine Michaelis常数Km

1)试剂组成

试剂I   Trizma-base缓冲液pH 7.6    50毫摩尔/升(mmol/L)

        4-AA                       2mmol/L

        ADA                        300单位/升[U/L(牛肠)]

        PNP                        100U/L

        XOD                        200U/L

        POD                        600U/L

试剂II  Tris-HCl缓冲液pH 4.0     50mmol/L

        Adenosine                  0.001-10mmol/L

        TOOS                       2mmol/L

2)试验参数与操作步骤

温度        37℃

波长        550纳米(nm)

比色杯光径  1.0厘米(cm)

测试方法    速率法

反应方向    正

予孵育      1.8毫升(ml)试剂I

予孵育时间  3分钟

启动反应    加0.9ml试剂II

延迟时间    5分钟

测试时间    3分钟

测试仪      Shimadzu UV-160

3)计算

计算出测试时间段每分钟平均吸光度的变化(ΔA/min)。

$\mathrm{\ΔA}/\min =\frac{(\mathrm{\Δ}{A}_1/\min +\mathrm{\Δ}{A}_2/\min +\mathrm{\Δ}{A}_3/\min )}{3}$

4)结果

以ΔA/min作为反应速率V，用1/V作为Y轴，Adenosine浓度S的倒数1/S作为X轴。作Lineweaver-Burke图。求得Adenosine Km 3.53×10^-5mol/L。

2.确定有色产物毫摩尔消光系数ε

1)试剂组成

试剂I    Trizma-base缓冲液pH7.6 50mmol/L

         4-AA                   2mmol/L

         ADA                    300U/L(牛肠)

         PNP                    100U/L

         XOD                    200U/L

         POD                    600U/L

试剂II   Tris-HCl缓冲液pH4.0  50mmol/L

         Adenosine              3mmol/L

         ADOS或ADPS或ALPS       2mmol/L

         或TODB或TOPS或TOOS

2)试验参数与操作步骤

温度        37℃

波长        265nm(Adenosine)

比色杯光径  1.0cm

测试方法    速率法

反应方向    负

予孵育      1.8ml试剂I

予孵育时间  3分钟

启动反应    加0.9ml试剂II

延迟时间    2.5小时

测试仪      Shimadzu UV-160

动态观察1mmol/L Adenosine吸光度下降至2.5小时后完全降解。然后，在以下波长测定有色产物的吸光度：

542nm  (ADOS)

540nm  (ADPS)

561nm  (ALPS)

630nm  (TODB)

630nm  (TOPS)

550nm  (TOOS)

3)结果

ε：毫摩尔消光系数  在本法条件下供氢体ADOS氧化凝聚产物ε＝27.2mM^-1cm^-1

                                      ADPS氧化凝聚产物ε＝27.9mM^-1cm^-1

                                      ALPS氧化凝聚产物ε＝41.3mM^-1cm^-1

                                      TODB氧化凝聚产物ε＝22.5mM^-1cm^-1

                                      TOPS氧化凝聚产物ε＝22.5mM^-1cm^-1

                                      TOOS氧化凝聚产物ε＝32.2mM^-1cm^-1

3.苯胺类供氢体化合物的选择

1)试剂组成

试剂I    Trizma-base缓冲液pH7.6   50mmol/L

         4-AA                     2mmol/L

         PNP                      100U/L

         XOD                      200U/L

         POD                      600U/L

试剂II   Tris-HCl缓冲液pH4.0    50mmol/L

         Adenosine                10mmol/L

ADOS或ADPS或ALPS    2mmol/L

或TODB或TOPS或TOOS

2)生物样本

0-600U/L牛肠ADA。

3)试验参数与操作步骤

温度        37℃

波长        542nm  (ADOS)

            540nm  (ADPS)

            561nm  (ALPS)

            630nm  (TODB)

            630nm  (TOPS)

            550nm  (TOOS)

比色杯光径  1.0cm

测试方法    速率法

反应方向    正

予孵育      0.05ml样本+1.8ml试剂I

予孵育时间  3分钟

启动反应    加0.9ml试剂II

延迟时间    5分钟

测试时间    3分钟

测试仪      Shimadzu UV-160

4)计算

计算出测试时间段每分钟平均吸光度的变化(ΔA/min)。

$\mathrm{\ΔA}/\min =\frac{(\mathrm{\Δ}{A}_1/\min +\mathrm{\Δ}{A}_2/\min +{\mathrm{\ΔA}}_3/\min )}{3}$

$\mathrm{ADA}(U/L)=\frac{\mathrm{\ΔA}/\min \×\mathrm{Tv}\×1000}{\mathrm{\ϵ}\×\mathrm{Sv}\×L}$

一个ADA活性单位(U/L)定义为在本测试特定条件下每分钟将1微摩尔(μmole)腺苷脱氨成为次黄苷。

ε：毫摩尔消光系数  在本法条件下供氢体ADOS氧化凝聚产物ε＝27.2mM^-1cm^-1

                                      ADPS氧化凝聚产物ε＝27.9mM^-1cm^-1

                                      ALPS氧化凝聚产物ε＝41.3mM^-1cm^-1

                                      TODB氧化凝聚产物ε＝22.5mM^-1cm^-1

                                      TOPS氧化凝聚产物ε＝22.5mM^-1cm^-1

                                      TOOS氧化凝聚产物ε＝32.2mM^-1cm^-1

Tv：总反应体积(ml)

Sv：样品体积(ml)

L：比色杯光径(cm)

5)结果

不管选择哪种苯胺类供氢体化合物，ADA线性范围3-600(U/L)

4.ADA测定试剂盒

产品名称：腺苷脱氨酶(ADA)试剂盒

型号：生化试剂

产品代码：DC-ADA

规格：试剂I(R1)50ml，试剂II(R2)25ml，ADA正常血清(冻干)1ml/1瓶，ADA异常血清(冻干)1ml/1瓶，275测试/盒(罗氏Cobas Mira生化分析仪)。

检测介质：血清、血浆、胸腹水或脑脊液

适用于体外诊断

用途

腺苷脱氨酶(ADA)试剂盒适用于体外定量测定人血清、血浆、胸腹水或脑脊液中的腺苷脱氨酶(Adenosine Deaminase，ADA)活性。

概述

腺苷脱氨酶(adenosine deaminase，ADA)将腺苷(Adenosine)脱氨产生次黄苷(Inosine)和氨(NH₃)。ADA广泛存在人体各组织中，尤以小肠、肝、脾最多，血液细胞内酶活性为血清中的40～70倍，故测定时应避免溶血。血清ADA正常参考值3-30U/L。ADA异常增高见于：

1.肝脏病-ADA活性是反映肝损伤的敏感指标，可作为肝功能常规检查项目之一，与ALT或GGT(r-GT)等组成肝酶谱能较全面地反映肝脏病的酶学改变。血清中ADA活性的测定可

1)用于判断急性肝损伤及残留病变：急性黄疸性肝炎，肝细胞出现损伤，在黄疸尚未出现前，可见增高。因ADA分子量较ALT小，当肝细胞轻度受损时ADA比ALT先释入血内。ADA在反映急性肝病的残存病变时优于ALT。

2)协助诊断慢性肝病和有助于肝纤维的诊断：慢性肝炎活动期，慢性迁延性肝炎和肝硬化ADA升高明显。ADA在反映慢性肝损伤时优于ALT.慢性肝病，尤其是肝硬变时ADA阳性率高达90％，其酶活性以肝硬变＞慢性肝炎，并随肝纤维化程度增加而递增，失代偿期肝硬变ADA活性明显高于代偿期肝硬变。

3)有助于黄疸的鉴别：溶血性黄疸，肝细胞性黄疸ADA升高。但阻塞性黄疸时ADA升高不明显，因此在判断黄疸性质时有一定的鉴别价值。

2.结核性胸腹水-结核性胸水中ADA活性明显高于其他原因引起的胸水，因此可测定胸水中的ADA来进行鉴别诊断。

3.伤寒-由伤寒引发高热血清ADA活性显著升高。而高烧有及他原因造成ADA却不增高。

4.脑膜炎-脑脊液ADA检测可作为中枢神经系统疾病诊断和鉴别诊断的重要指标，结核性脑膜炎ADA活性显著增高，病毒性脑炎不增高。

原理

                                    (λmax 556nm)

应用ADA偶联嘌呤核苷磷酸化酶(Purine nucleoside phosphorylase，PNP)，黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase，XOD)和过氧化物酶(Peroxidase，POD)反应连续监测法。ADA酶解腺苷(Adenosine)脱氨产生次黄苷(Inosine)；再通过偶联PNP的作用，生成次黄嘌呤(Hypoxanthine)；后者在XOD氧化下生成尿酸(Uric Acid)和过氧化氢(H₂O₂)；最后在POD的作用下H₂O₂再与N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-3-甲基苯胺[N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline(EHSPT或TOOS)]、4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine，4-AA)反应(Trinder氏反应)，生成紫红色的有色醌(Quinone dye)。通过动态测量有色醌550nm处吸光度上升的速度来测算ADA的活性。

试剂盒组份

每个腺苷脱氨酶(ADA)试剂盒含有：

1.试剂I(R1)             50ml/1瓶

2.试剂II(R2)            25ml/1瓶

3.ADA正常血清(冻干)     1ml/1瓶

4.ADA异常血清(冻干)     1ml/1瓶

5.检验证明

6.1份使用说明。

试剂组成

试剂I       Trizma-base缓冲液pH7.6   50mmol/L

            4-AA                     2mmol/L

            PNP                      100U/L

            XOD                      200U/L

            POD                      600U/L

试剂II      Tris-HCl缓冲液pH4.0    50mmol/L

            Adenosine                10mmol/L

            TOOS                     2mmol/L

ADA质控血清 牛肠ADA和人血清

试剂配制

本试剂盒为液体双试剂，可直接上机使用。ADA质控血清需要溶于1ml蒸馏水中方可使用。

试剂的稳定与贮存期

试剂30℃下可避光保存一周，室温18-19℃下一月，2-8℃一年，严禁冷冻。冻干ADA质控血清2-8℃或冷冻保存一年。溶化后的ADA质控血清30℃下保存至少二周，2-8℃或冷冻保存期更长。

样本收集

血清、胸腹水或脑脊液。用新鲜和非溶血的血清或血浆。如果有需要可以进行抗凝处理。生物样品中ADA在4℃条件下稳定一周。

试验参数与操作步骤

温度        37℃

波长        550nm

比色杯光径  1.0cm

测试方法    速率法

反应方向    正

予孵育      0.05ml样品+1.8ml R1(或依比例混匀)

予孵育时间  3分钟

启动反应    加0.9ml R2(或依比例混匀)

样品/试剂   1∶54

延迟时间    5分钟

测试时间    3分钟

空白参照    水

总反应时间  8分钟

测试仪      Shimadzu UV-160

计算

计算出测试时间段每分钟平均吸光度的变化(ΔA/min)。

$\mathrm{\ΔA}/\min =\frac{({\mathrm{\ΔA}}_1/\min +{\mathrm{\ΔA}}_2/\min +{\mathrm{\ΔA}}_3/\min )}{3}$

$\mathrm{ADA}(U/L)=\frac{\mathrm{\ΔA}/\min \×\mathrm{Tv}\×1000}{\mathrm{\ϵ}\×\mathrm{Sv}\×L}$

一个ADA活性单位(U/L)定义为在本测试特定条件下每分钟将1μmole腺苷脱氨成为次黄苷。

ε：毫摩尔消光系数  在本法条件下有色醌ε＝32.2(1cm光径)

Tv：总反应体积(ml)

Sv：样品体积(ml)

L：比色杯光径(cm)

当比色杯光径1cm时ADA(U/L)＝ΔA/min×1708

当比色杯光径0.5cm时ADA(U/L)＝ΔA/min×3416

注意事项

1.如果受限于分析仪比色杯容积限制，可以依比例(详见试验参数)调整R1、样本及R2使用量。0.18ml R1：0.005ml 样本：0.09ml R2的比例曾应用于罗氏Cobas Mira生化分析仪，其结果和Shimadzu UV-160分光光度仪无显著性差异。

2.如果受限于分析仪只能接受单试剂，则可以在测试前依比例(详见试验参数)混合R1及R2成为一混合剂。

3.若样品ADA＞600U/L，也即用1cm比色杯光径反应吸光值变化大于0.35A/min，须用生理盐水稀释样品，结果乘以稀释倍数。

4.如保存不当，试剂发现有混浊时，应弃用。

试剂性能

线性范围：0-600 ADA(U/L)(γ²＞0.99)

精密度：批内CV 6.4％和批间CV 7.5％

特异性：血清、30mg/dL胆红素、200mg/dL血红蛋白、500mg/dL甘油三酯和4mg/dL抗坏血酸对本法无干扰。

参考值

正常人血清ADA活性参考值4-24U/L，建议各实验室根据自身实验条件自行订定正常人血清ADA活性范围。

仪器

全自动、半自动生化分析仪或可见光分光光度计

产品特征

液体双试剂

特异性测定ADA

测定精密度高

抗干扰能力强

适合自动化快速测定

参考文献

参阅实申参考资料。

Claims (4)

1.一种测定生物样本中腺苷脱氨酶活性的方法，其特征是借助腺苷脱氨酶将腺苷脱氨产生次黄苷，通过次黄苷偶联嘌呤核苷磷酸化酶和黄嘌呤氧化酶酶促反应生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下使苯胺类供氢体和4-氨基安替比林偶联物凝聚成有色产物，通过连续反应和动态观察有色产物的产量，从而测定腺苷脱氨酶的活性。

2.一种按权利要求1制造的测定生物样本中腺苷脱氨酶活性的产品，其特征是借助腺苷脱氨酶将腺苷脱氨产生次黄苷，通过次黄苷偶联嘌呤核苷磷酸化酶和黄嘌呤氧化酶酶促反应生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下使苯胺类供氢体和4-氨基安替比林偶联物凝聚成有色产物，通过连续反应和动态观察有色产物的产量，从而测定腺苷脱氨酶的活性。

3.根据权利要求1所述的测定生物样本中腺苷脱氨酶活性的方法，其特征是苯胺类供氢体可为以下任何一种

N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methoxylaniline(ADOS)

N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline(ADPS)

N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)aniline(ALPS)

N，N-Bis(4-sulfobutyl)-3-methylaniline(TODB)

N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline(TOOS)

N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methylaniline(TOPS)。

4.根据权利要求2所述的制造测定生物样本中腺苷脱氨酶活性的产品，其特征是苯胺类供氢体可为以下任何一种

N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methoxylaniline(ADOS)

N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline(ADPS)

N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)aniline(ALPS)

N，N-Bis(4-sulfobutyl)-3-methylaniline(TODB)

N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline(TOOS)

N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methylaniline(TOPS)。