CN1650025A - 检测轻症葡萄糖耐量异常或胰岛素分泌缺陷的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明旨在提供使用酶方便地检测轻症葡萄糖耐量异常和/或早期胰岛素分泌不良的非侵入性方法。即，通过使用试剂在明确的时间内对葡萄糖负荷前和葡萄糖负荷后分泌到尿中的肌醇定量并将所测量的肌醇的增加量(或增加比率)与在正常受试者中事先确定的特征水平相比较来检测轻症葡萄糖耐量异常和/或早期胰岛素分泌不良。

Description

检测轻症葡萄糖耐量异常或 胰岛素分泌缺陷的方法
发明领域
本发明涉及使用样品如尿来检测轻症葡萄糖耐量异常或胰岛素分泌缺陷的方法。此外，本发明可应用于预测或诊断源自轻症葡萄糖耐量异常或胰岛素分泌缺陷引起的疾病如糖尿病、动脉硬化症或高血压的方法；还可应用于判定对所述疾病发挥预防、治疗或医疗建议的效果的方法；和评估用于治疗所述疾病的治疗剂的方法。
发明背景
糖尿病治疗的一个最终目标是防止糖尿病并发症的发作和抑制其发展。如为实现该目标的临床试验所阐明的，重要的是在尽可能早的阶段发现异常并开始对该异常的治疗[如Diabetes Research and Clinical Practice，28，103(1995)]。
此外，认为发现患有前驱糖尿病或者处于糖尿病前期的个体，或者具有轻症葡萄糖耐量异常或胰岛素分泌缺陷的个体(这些个体现在没有前驱糖尿病但是很可能在不久的将来患糖尿病或者前驱糖尿病)并给予他们治疗或者关于锻炼和饮食的建议是更先进的预防方法。已经进行了临床试验以科学地阐明该观点[例如，Diabetes Care，21，1720(1998)]。因此，检测前驱糖尿病个体对于糖尿病及其并发症的预防是重要的。此外，认为诊断具有轻症葡萄糖耐量异常或胰岛素分泌缺陷的个体(这些个体现在没有前驱糖尿病但是很可能在不久的将来患糖尿病或者前驱糖尿病)对于较早期地防止糖尿病是最重要的。
糖尿病的诊断方法的一个实例是经口的葡萄糖耐量试验。口服75g葡萄糖负荷后，空腹时血糖水平小于110mg/dl并且负荷后2小时血糖水平小于140mg/dl的一组个体被定义为正常葡萄糖耐量(NGT)。此外，空腹血糖水平不小于110mg/dl但是小于126mg/dl并且负荷后2小时血糖水平小于140mg/dl的一组个体被定义为空腹时血糖异常上升(IFG)；空腹时血糖水平小于126mg/dl并且负荷后2小时血糖水平不小于140mg/dl但是小于200mg/dl的一组个体被定义为葡萄糖耐量异常(IGT)；并且IFG+IGT组都被定义为边界型(borderline type)。空腹时血糖水平不小于126mg/dl或者负荷后2小时血糖水平不小于200mg/dl的一组个体被定义为糖尿病。
日本糖尿病协会(Japan Diabetes Society)的指南教导在仅仅基于空腹时血糖水平和负荷后2小时血糖水平定义为NGT的个体中，负荷后1小时血糖水平为180mg/dl或更高的个体具有患糖尿病的较高危险，因此他们应该被作为边界型处理。
术语“葡萄糖耐量异常”或“葡萄糖耐量不足”指葡萄糖通过进餐导入血液中后血糖被摄入外周组织如骨骼肌、肝脏和脂肪细胞的不足导致的血糖水平增加的状况。此外，术语“轻症葡萄糖耐量异常”是指血糖的增加较健康个体稍高的情况。
胰岛素是胰腺β细胞分泌的一种激素并且作用于骨骼肌、肝脏和脂肪组织以降低血糖水平。术语“胰岛素分泌缺陷”指葡萄糖通过进餐等被导入血液中后用以摄取足够量的血糖到外周组织如骨骼肌、肝脏和脂肪细胞的胰岛素分泌不足的状况。在胰岛素分泌缺陷中，仅仅在葡萄糖被导入血液后用以摄取血糖进入外周组织的胰岛素分泌不足的状况被称为“早期胰岛素分泌不良”。根据日本糖尿病协会的指南，术语“早期胰岛素分泌不良”指胰岛素产生指数I.I小于0.4的状况。胰岛素产生指数I.I被定义为ΔIRI(30-0)/ΔPG(30-0)，其中ΔIRI(30-0)指葡萄糖负荷后30分钟和葡萄糖负荷前30分钟之间的血胰岛素水平的差值；ΔPG(30-0)指葡萄糖负荷后30分钟和葡萄糖负荷前30分钟血糖水平的差值。
关于这些诊断的血液葡萄糖水平和胰岛素水平的分析是侵入性方法，需要在短的时间内进行多于1次的抽血，对受试者造成很大痛苦。因此，需要可以解决这些不利之处的具有较低侵入性的简单测定法，优选地，非侵入性测定法。
另一方面，生物样品中肌醇的定量确定被认为可用于诊断糖尿病并且已经提供了下面的报道。
(a)在糖尿病中，尿肌醇水平上升[Larner J.等，New Eng.J.Med.，323，373-378(1990)]。
(b)没有发现NGT和边界型之间关于尿肌醇水平的差异[SusumuSuzuki，Diabetes Care，Vol.17，No.12(1994)1465-1468]。
(c)边界型(IFG，IGT)和糖尿病显示出比NGT更高的尿肌醇水平(JP2001-190299A)。
上面的报道(a)和(b)显示了用GC/MS确定尿肌醇水平得到的结果。然而，这些数据在重复性和可靠性上存在问题，因为它们随不同的检查者而变化。另一方面，在报道(c)中，这些结果比通过GC/MS得到的更精确和可靠，因为它们通过用高敏感的肌醇测定试剂，使用一种酶确定尿肌醇水平得到。在这种方法中，对患有前驱糖尿病组的检测已经成为可能。
然而，报道(c)中使用的肌醇测定试剂也有问题，包括：(i)由于窄的测量范围和需要稀释样品以测定多种尿肌醇水平造成不够低的检测限；(ii)不能充分避免尿中共存物质特别是葡萄糖的影响。因此，对落在NGT范围内的轻症葡萄糖耐量异常和胰岛素分泌缺陷的检测目前是不可能的。
此外，如果仅仅根据75g经口的葡萄糖负荷前和葡萄糖负荷2小时后的血糖水平判断受试者是NGT，那么这种判断没有反映从0到2小时内血糖水平的变化。例如，仅仅在刚进行葡萄糖负荷后保持较高血糖水平，从而很可能在不久的将来患糖尿病或前驱糖尿病的个体(具有轻症葡萄糖耐量异常和胰岛素分泌缺陷)在实践中也被归为NGT。如此处所用的，术语“轻症葡萄糖耐量异常”被归为NGT，但是指葡萄糖耐量稍微下降，其特征是当进行负荷试验并在空腹时、负荷后30分钟、1小时和2小时四次收集血样时，存在三种情况：(i)陡急高血糖，即负荷后30分钟和1小时非常高的血糖水平(180mg/dL或更高)，(ii)负荷后2小时时尽管血糖水平小于140mg/dL但仍然比健康个体高(例如不低于120mg/dL)，(iii)高∑PG(例如530mg/dL或更高)，即在75g经口葡萄糖负荷前和葡萄糖负荷后30、60和120分钟时的血糖水平的总和。因此，从公开的(a)-(c)通过确定肌醇水平不可能预测在不久的将来很可能患糖尿病或前驱糖尿病的个体，例如具有轻症葡萄糖耐量异常的个体。
这样，常规技术没有教导检测轻症葡萄糖耐量异常和胰岛素分泌缺陷的方法，轻症葡萄糖耐量异常和胰岛素分泌缺陷在刚刚葡萄糖负荷之后保持较高的血糖水平，从而在不久的将来很可能患糖尿病或前驱糖尿病。
发明概述
本发明旨在提供具有良好重复性的简单确定轻症葡萄糖耐量异常和/或胰岛素分泌缺陷的检测方法。
为了实现该目标，本发明人考虑到寻找有效确定轻症葡萄糖耐量异常和/或胰岛素分泌缺陷的标记物是有利的。作为集中努力的结果，尽管肌醇通常被认为可用于检测胰岛素抗性和前驱糖尿病(边界型和糖尿病)，但是本发明人出乎意料地发现肌醇也可用作有效检测轻症葡萄糖耐量异常或胰岛素分泌缺陷的标记物。
从人体收集的血清、血浆或尿，或者活组织的匀浆提取物被用作样品。优选尿，因为其可以非侵入性地得到。
本发明人继续研发肌醇的高敏感性定量确定测定法和用于测定法的组合物以提供对肌醇具有高度准确性的简单且节约成本的定量确定测定法(JP 06-61278B)。该酶测定法(其不需要任何预处理)第一次提供了得到肌醇的可靠数据的方法。高敏感性定量确定测定法和用于定量确定的组合物的开发使得可以第一次成功地提供检测轻症葡萄糖耐量异常和/或胰岛素分泌缺陷的本发明方法。
此外，将给定量的葡萄糖施与受试者后，在给定时间内从受试者非侵入地得到尿样并使用上述肌醇测定试剂确定尿中肌醇水平。测定结果揭示不仅患有前驱糖尿病的个体(边界型，IFG，IGT)和患有糖尿病的个体，而且尽管为NGT但实际上显示轻症葡萄糖耐量异常的个体和尽管为NGT但实际上显示早期胰岛素分泌下降的个体都具有比从健康个体事先确定的特征值更高的水平。因此，已经发现本发明的分析试剂使得不仅可以区别NGT和具有进行性葡萄糖耐量异常的非NGT(边界型，IFG，IGT，糖尿病)，而且可以简单地、高度重复地和有效地将尽管为NGT但实际上显示轻症葡萄糖耐量异常的个体或者尽管为NGT但实际上显示早期胰岛素分泌下降的个体与健康个体区别开来。
此外，样品中肌醇的浓度可能非常低并且所使用的一些肌醇脱氢酶与葡萄糖微弱地反应。从而，需要事先除去葡萄糖。除去葡萄糖的方法包括一种利用肌醇具有极端化学稳定性的方法和另一种通过使用酶作为催化剂修饰葡萄糖的方法。利用肌醇化学稳定性的方法包括，例如，在6N HCl存在下加热样品以允许除了肌醇之外的糖进行酸分解并从分解的产物中回收肌醇；另一种方法通过用还原剂如氢硼化钠处理样品以还原具有羰基或甲酰基的糖如葡萄糖(肌醇除外)并将这些糖修饰以使得化合物成为肌醇脱氢酶(即用于定量肌醇测定法的一种酶)化学惰性的。使用一种酶作为催化剂修饰葡萄糖的方法包括一种通过将样品中的葡萄糖用葡萄糖氧化酶(EC 1，1，3，4)转变成葡萄糖酸的方法，另一种通过使用己糖激酶(EC 2，7，1，1)将样品中的葡萄糖转变成6-磷酸葡萄糖的方法。
在这些转变方法中公知多种改进方法。对于用葡萄糖氧化酶将葡萄糖转变成葡萄糖酸的方法中，例如，公知的一种方法是与葡萄糖氧化酶反应后通过催化剂除去过氧化氢产物(JP 63-185397A)。
此外，对于用己糖激酶将葡萄糖转变成6-磷酸-葡萄糖的方法，公知的方法为使用磷酸己糖异构酶和6-磷酸果糖激酶将葡萄糖转变成1，6-二磷酸果糖以防止6-磷酸葡萄糖通过平衡反应被再次转变成葡萄糖(JP05-76397A)；用6-磷酸葡萄糖脱氢酶在氧化型辅酶存在下进行反应(JP01-320998A，JP 03-27299A)；和用丙酮酸激酶在二磷酸腺苷存在下进行反应以防止由于葡萄糖被清除而导致三磷酸腺苷水平改变，从而保持三磷酸腺苷水平恒定(JP 02-104298A)。
然而，当使用己糖激酶除去葡萄糖时，在反应液中酶促反应产生大量ADP，从而不能忽视其对酶促反应的影响。从而，优选将所得的ADP转变成不影响反应的化合物。
从而，本发明人已经考虑到了使用一种ADP消除剂，将在反应液中产生的ADP通过酶促反应转变成一种不影响反应的化合物。
能够将ADP转变成一种不影响反应的化合物的任一物质可用作ADP消除剂。在这些物质中，优选酶并且更优选催化ADP向AMP转变的激酶。激酶也称为磷酸激酶或磷酸转移酶。催化ADP向AMP转变的激酶的实例包括焦磷酸-甘油转移酶、6-磷酸果糖激酶、乙酸激酶和ADP-己糖激酶。
作为热心研究的结果，本发明人已经发现6-磷酸果糖激酶和ADP-己糖激酶优选用作本发明中的ADP消除剂。
当6-磷酸果糖激酶被用作消除样品中葡萄糖所进行的反应中的ADP消除剂时，ADP随着用ATP-己糖激酶在ATP存在下将葡萄糖向6-磷酸葡萄糖转变而产生并同时与6-磷酸果糖激酶反应以允许ADP向AMP转变并伴随着将事先加入的6-磷酸果糖转变成1，6-二磷酸果糖。
当ADP-己糖激酶被用作消除样品中葡萄糖所进行的反应中的ADP消除剂时，ADP随着用ATP-己糖激酶在ATP存在下将葡萄糖向6-磷酸葡萄糖转变而产生并且可被转变成AMP。
此外，优选在盐的存在下进行这种反应。盐的实例包括：镁盐如氯化镁和乙酸镁；钾盐如氯化钾和硫酸钾。使用的盐的浓度为(但不限于)优选约1到100mM。
通过酶促修饰产生的这些化合物中的任何一种都不与肌醇脱氢酶—用于定量肌醇测定的一种酶—反应。本发明人已经发现更优选通过这些方法事先除去葡萄糖。
此外，本发明人发现当同时使用两种激酶-ATP己糖激酶和ADP-己糖激酶—时可以更准确地测定肌醇，因为样品中糖的影响减小了。此外，本发明人还发现通过将硫代-NAD水平调节到终浓度0.1mM或更高，优选2到10mM可以将肌醇测定范围扩大约10倍。从而，本发明人完成了更敏感的测定系统。
术语“特征值”指基于从NGT受试者选出的健康受试者尿样中的肌醇水平平均值、标准差和ROC(应答操作特征)曲线确定的值。当使用尿样时，葡萄糖负荷前和葡萄糖负荷后预定的时间点之间尿肌醇排泄的增加范围在0到20μg/mg肌酸酐；或者5到15μg/mg肌酸酐；或者更优选地8到12μg/mg肌酸酐。此外，如果在将来进行大规模检查并且为临床选择的健康个体进行测定，那么特征值可能改变。此外，特征值也可以根据所选的人群的种族、性别和年龄而变。
附图简述
图1显示了根据参考实施例1对硫代-NAD水平的研究结果。
图2显示了根据参考实施例2对肌醇分析试剂的稳定性试验结果。
图3显示了根据参考实施例3ADP-己糖激酶的作用。
图4显示了根据参考实施例4肌醇水平的校准曲线。
图5显示了根据实施例1肌醇水平和∑PG之间的关系。
图6显示了根据实施例2肌醇水平和胰岛素产生指数间的关系。
图7显示了根据实施例3每组和∑PG间的关系。
图8显示了根据实施例4每组和胰岛素产生指数间的关系。
图9显示了根据实施例5每组和肌醇水平间的关系。
图10显示了根据实施例6每组和肌醇水平间的关系。
图11显示了根据实施例7葡萄糖耐量试验和进餐耐量试验中尿肌醇水平间的相关性。
图12显示了根据实施例8葡萄糖耐量试验中Δ肌醇和进餐耐量试验中Δ肌醇之间在每组中的关系。
图13显示了根据实施例9尿葡萄糖阴性个体在进餐耐量试验中尿肌醇水平和轻症葡萄糖耐量异常的关系。
实施本发明的最佳模式
本发明及其优选的实施方案将如下更详细地描述。
根据本发明，轻症葡萄糖耐量异常和胰岛素分泌缺陷的检测通过使用本发明的试剂确定葡萄糖负荷前和葡萄糖负荷后预定的时间点受试者尿中排泄的肌醇的量，并将葡萄糖负荷之前和之后肌醇的增加量或增加率与对健康个体事先定义的特征值进行比较来进行。
增加量被计算为葡萄糖负荷后预定的时间点的肌醇含量和葡萄糖负荷前的肌醇含量之间的差值，增加率被计算为葡萄糖负荷后预定的时间点的肌醇含量和葡萄糖负荷前的肌醇含量的比率。
对于肌醇的浓度，可以使用实测值，或者可以使用关于合适的标准指数的相对值以补偿用饮用水对尿的稀释。优选地，该指数为尿肌酸酐水平。受试者包括所有个体以及被怀疑有生活方式相关疾病如糖尿病的那些个体。
可以使用任何量的负荷葡萄糖和任何类型的葡萄糖负荷方法。然而，优选为如在典型的葡萄糖负荷试验或膳食摄取中使用的口服施用75g葡萄糖水溶液。
可以在葡萄糖负荷前和直到葡萄糖负荷后6小时，优选葡萄糖负荷后30分钟到3小时后的任何时间收集尿样。尿收集时间适宜地选自30分钟到3小时。
当使用尿作为样品时，其通过非侵入性方法收集，从而不需要选择取样方法、时间和地点。例如，这种样品可以容易地由受试者在家里、办公室、学校等处准备，收集的尿样可以直接地或者以尿浸泡的滤纸的形式或其他适宜的形式运输，这些形式消除了对医学研究所等的依赖。从而，本发明提供了一种卓越的方法，其中当滤纸等用尿浸泡时，送达的样品通过适宜的方法提取并通过本发明的简单而快速的测定法然后将结果立即送给受试者。
尤其是，可以根据需要监控尿肌醇水平而受试者和通常没有葡萄糖负荷一样生活。例如，可能使用一天中最大肌醇水平或最大肌醇水平和最小肌醇水平间的差异了解葡萄糖耐量异常的程度或胰岛素分泌缺陷的程度。此外，根据需要监测尿肌醇水平允许受试者重新考虑食物成分并调节锻炼的量以防止糖尿病或其发展而进行有规律生活。
监测尿肌醇水平的方法包括能够检测肌醇的任何类型的方法，例如，使用试纸，其中与肌醇反应的酶被固定在试纸上的方法和使用电极作为传感器(其中与肌醇作用的酶被固定在电极上)检测肌醇的电化学方法。
在试纸方法中，例如，过氧化氢通过氧化酶产生并与过氧化物酶起反应产生活性氧，活性氧导致发色团氧化显色，其强度可被观察到。发色团包括，但不限于，碘化钾、四甲基联苯胺、N-(3-硫代丙基)-3，3’5，5’-四甲基联苯胺钠、4-氨基安替比林和O-联甲苯胺。
对于通过传感器检测，例如，当使用氧化酶时，可以使用电极直接测量过氧化氢；或者可以测量通过电子载体如二茂铁衍生物或醌衍生物得到的氧化还原电流或电流的量。同样，当使用脱氢酶时，可以使用电极直接测量还原的辅酶；或者可以测量通过电子载体得到的氧化还原电流或电流的量。实例显示于“Biosensor and Quantitative Assay of Substrate Usingthe Same(申请号JP 09-263492)”等。
此外，例如，通过将上面的传感器直接整合到厕所的马桶或类似物或者连接到马桶的设备中可以更容易地进行尿肌醇水平的日常监控。这些设备还可以具有记忆测量值和连接到信息处理器终端的功能。这样，甚至当受试者住在有一定距离的地方，医学专业人员或者医学研究所也可以通过电子媒介与受试者接触以处理生活数据；给予医学建议；以及检查葡萄糖耐量异常的程度和胰岛素分泌缺陷的程度，从而建议食物成分，调整锻炼量，改善生活方式和进行医学治疗。
对于对样品中的葡萄糖以及肌醇定量测定以检测轻症葡萄糖耐量异常和/或胰岛素分泌缺陷，优选通过本发明方法定量地测定肌醇，而葡萄糖可使用任何常规方法定量地测定。
此外，可通过综合测定结果和医生的观察进行更精确的处理。此外，因为可能通过发现糖尿病的发病前状况，即前驱糖尿病，和轻度葡萄糖耐量异常和胰岛素分泌缺陷(它们在目前不是前驱糖尿病但是很可能在不久的将来转变成糖尿病或前驱糖尿病)来确定患糖尿病的危险性，尽管这种发现通过常规标记物是不可能的，例如该危险性可用作生命保险等等检查中的一项进行。
对于样品中肌醇的定量确定，将1到500μL样品加到用于肌醇定量测定的组合物中以允许在37℃反应，然后，可以直接或间接测定反应开始后两个时间点之间的几分钟或几十分钟，例如反应启动后3分钟和4分钟之间的1分钟或3分钟和8分钟之间的5分钟内辅酶改变的量。这样，通过将已知浓度的肌醇所测得的吸光度的改变进行比较确定样品中肌醇含量。
用于定量测定的组合物(试剂)需要含有至少一种作用于肌醇的酶，并且优选地其还含有辅酶。
此外，如合适，表面活性剂如聚氧乙烯辛基苯基醚(OP-10)可以加入到本试剂中。
此外，本试剂以液体产品、冷冻干燥的产品或冷冻产品的形式使用。
对于定量测定样品中肌醇，可以使用酶定量测定肌醇的任何类型的方法。本发明中将要使用的酶(其能够定量测定肌醇)包括至少作用于肌醇的任何酶。然而，在这些酶中，优选肌醇脱氢酶，最优选来自黄杆菌(Flavobacterium)671株(FERM BP-7323，此后缩写为F.sp.671)的肌醇脱氢酶。此外，优选地，试剂中将要使用的肌醇脱氢酶具有尽可能低的或者没有对辅酶如硫代-NAD和NADH有不利影响的污染物，所述污染物例如具有分解辅酶的活性的物质，如NADH氧化酶。
菌株F.sp.671基于国际条约保藏在日本茨城県つくば，东1-1-3的通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现在为：日本茨城県つくば，东1-1-1，中央第6，独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心)，保藏日期为2000年10月12日，保藏号为FERM BP-7323。
为了检测肌醇，可以使用能够检测肌醇的任何方法。这些方法包括：使用可见光着色试剂，例如，典型地使用硫代-NAD进行黄色着色，使用硝基蓝四唑(NBT)进行蓝色着色；或者使用氯化2-(4-碘代苯基)-3-(4-硝基苯基)--5-苯基-2H-四唑(INT)进行红色着色；发光方法；荧光方法；涉及检测电变化的方法；以及这些方法与放大技术的组合。
此外，使用可以利用上面方法中任一种方法的小型设备可以非侵入性地进行尿肌醇的测定而没有时间和地点的限制。
确定肌醇脱氢酶的活性的测定法如下：
(1)活性测定法
<反应溶液组分>
100mM Tris缓冲液(pH8.5)
20mM肌醇(Sigma Co.，Ltd.)
2mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)(Oriental Yeast Co.，Ltd.)
5U/ml硫辛酰胺脱氢酶(Asahi Kasei Corporation)
0.025％硝基蓝四唑(NBT；Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)
1.5％ Triton-X100(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)
将1ml上面的反应液加到小试管中。将反应液在37℃孵育5分钟后，将稀释B倍的20μl酶溶液加到其中并混合以开始反应。反应刚好5分钟后，加入2ml 0.1N HCl并混合以中止反应。在550nm测量吸光度得到A1。此外，用除了肌醇之外的相同的反应液进行类似的测量以得到吸光度A0。可从下面的等式计算酶活性。
U/ml＝[(A1-A0)/18.3×[1/5]×[3.02/0.02]×B
等式中的数字代表下面的意思：
18.3：NTB的摩尔吸光系数
5：反应时间
3.02：反应液的总体积
0.02：酶溶液的体积
B：酶溶液的稀释因子
来自F.sp.671株的肌醇脱氢酶的性质如下：
(2)酶作用
在至少肌醇和辅酶的存在下该酶产生肌醇单酮和还原的辅酶。辅酶包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸类(此后缩写为NADs)如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(乙酰基-NAD)、烟酰胺次黄嘌呤二核苷酸(脱氨基-NAD)、吡啶醛腺嘌呤二核苷酸(醛-NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(硫代-NAD)，和硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(硫代-NADP)。
表1显示了使用每种辅酶的相对活性的比率(当NAD用作辅酶时为100％)。根据下面的方法确定随着辅酶改变的相对活性。
相对活性分析
<反应液组分>
缓冲液：100mM甘氨酸缓冲液(pH10.0)
底物：20mM肌醇(Sigma，Co.，Ltd.)
辅酶：2mM
(NAD，硫代-NAD，NADP，硫代NADP；Oriental Yeast Co.，Ltd.)
将1ml上面的反应液加到石英小室中。然后，将石英小室放在调节到37℃的分光光度计中。将小室孵育5分钟或以上然后向其中加入20μl约1.0U/ml的酶溶液并混合。从每种还原的辅酶特有的波长下每分钟吸光度的改变得到初速度。将用每种辅酶得到的初速度与用NAD作为辅酶得到的初速度(100％)相比较以提供相对活性。
表1
关于所用的每种辅酶的相对活性比
    细菌菌株名称     F.sp.671
    辅酶     肌醇
    NADNADP硫代-NAD硫代-NADP     100％8％29％0％
(3)底物特异性
根据上述相对活性分析，使用相同浓度的D-手性-肌醇、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、甘露醇、表-肌醇或鲨肌醇代替反应液中的底物进行测量。表2显示了将肌醇反应的初速度作为100％的每种底物的酶活性。其揭文了来自株系F.sp.671的酶为对肌醇具有高特异性的脱氢酶。
所用的底物包括D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、甘露醇、D-手性-肌醇(同上：Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)、肌醇、表-肌醇和鲨肌醇(同上：Sigma，Co.，Ltd.)。
表2
底物特异性
    细菌菌株名称     F.sp.671
    辅酶     NAD
    肌醇手性-肌醇鲨肌醇表肌醇半乳糖果糖甘露糖甘露醇     100％18％小于1％2％小于1％小于1％小于1％0％
(4)最适pH
按照上述相对活性测定法，在反应液中使用100mM tris缓冲液(pH7.0-9.0)或100mM甘氨酸缓冲液(pH9.0-11.0)中的每一种代替100mM pH10.0的甘氨酸缓冲液进行测量。测量表明最适pH约为11.0(底物：肌醇)。
(5)分子量
使用TSK凝胶G300SW(0.75Φ×600mm)，洗脱液：50mM磷酸缓冲液(pH7.5)+0.2M Na2SO4+0.05％ NaN3，和Oriental Yeast Co.，Ltd.(日本)的分子量标准，Shimadzu Corporation(日本)生产的色谱仪。对于检测，测量UV 280nm处的吸光度和每个级分的活性。肌醇被用作活性测量中的底物，测得分子量为40,000±10,000。
(6)热稳定性
酶在40℃下处理15分钟后显示出几乎100％的残存活性。约5U/ml的酶溶液受到热处理15分钟。使用上述酶活性测定法测量残存活性。在活性测量中，肌醇被用作底物。
(7)Km值
使用上述相对活性测定法，改变肌醇和NAD与硫代-NAD的浓度以分别测定Km值。使用上述活性测定法，改变底物浓度以计算Km值。
对底物肌醇的Km值：1.7±0.2mM
对辅酶NAD的Km值：0.04±0.01mM
对辅酶硫代NAD的Km值：4.5±1mM
对于更高敏感性的肌醇定量测定，可以使用酶促循环方法。酶促循环方法的一个实例在下面的化学方程式中图示：
在方程式中，A1代表NAD(P)或硫代-NAD(P)；A2代表A1的还原形式；当A1是硫代-NAD(P)时B1代表NAD(P)，当A1是NAD(P)时B1代表还原的硫代-NAD(P)；B2代表B1的氧化产物。如此处所用的，NAD(P)代表烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。
对于使用酶促循环的肌醇定量反应中的溶液组成，根据肌醇脱氢酶各种辅酶的Km值等适宜地选择两种或多种辅酶，随后将pH条件调节到正向反应/逆反应的最适pH值之间以在酶促循环中得到有效前进。A1和B1的量应该超过样品中肌醇含量并且也超过对A1和B1的肌醇脱氢酶的Km值。
当使用例如来自F.sp.671的肌醇脱氢酶时，对于NAD和硫代-NAD的Km值分别为0.04mM和4.5mM。对于循环反应，硫代-NAD和NAD可选作辅酶。A1和B1的浓度优选为0.02mM到2M，尤其优选0.05到100mM。肌醇脱氢酶的量优选为1到1000U/mL，尤其优选1到100U/mL。可适宜地根据试验样品的类型和量、待分析样品中肌醇含量等等选择上述量，但是也允许其他量。
当己糖激酶被用作消除样品中存在的糖的酶时，可以使用能够催化葡萄糖向6-磷酸葡萄糖反应的任何己糖激酶，包括来自芽孢杆菌属中某些种的己糖激酶。优选的己糖激酶是具有优良热稳定性的己糖激酶。优良热稳定性的己糖激酶可以通过在”Stable Hexokinase and Production MethodThereof”(JP 2000-078982A)中描述的方法得到。
因为与6-磷酸葡萄糖一起产生的ADP对酶促循环方法中的反应具有一些抑制作用，所以本发明者已经成功地将依赖ADP的己糖激酶和己糖激酶同时使用以充分提高葡萄糖的消除而对肌醇脱氢酶的反应没有任何影响。
ATP：5’-三磷酸腺苷
ADP：5’-二磷酸腺苷
AMP：5’-一磷酸腺苷
如下进行己糖激酶活性的测定。
<反应溶液组成>
50mM Tris缓冲液(pH8.5)(Sigma，Co.，Ltd.)
20mM葡萄糖(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)
4mM ATP(Oriental Yeast Co.，Ltd.)
5U/mL 6-磷酸葡萄糖脱氢酶(Toyobo Co.，Ltd.)
1mM NADP(Oriental Yeast Co.，Ltd.)
10mM氯化镁(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)
溶解和稀释酶的溶液：50mM Tris缓冲液(pH8.5)
将1ml上面的反应液加到1cm光程长度的石英小室中，并在37℃孵育5分钟。然后，将稀释B倍的20μl酶溶液加到小室中并混合以开始反应。从反应开始测量340nm处吸光度以得到每分钟的吸光度变化A1，其显示为线性反应。也在类似反应中进行不知情试验以得到每分钟的吸光度变化A0，只是加入50μl用于溶解和稀释酶的溶液代替酶溶液。从下面的等式计算酶活性。
U/ml＝[(A1-A0)/6.22×[1.02/0.02]×B
等式中的数字代表下面的意思：
6.22：340nm处NADPH的摩尔消光系数
1.02：反应液的总体积(mL)
0.02：反应中所用酶溶液的体积(mL)
B：酶溶液的稀释因子
如下进行依赖ADP的己糖激酶活性的测定。
<反应液的组成>
50mM Tris缓冲液(pH7.5)
20mM葡萄糖溶液(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)
2mM ADP溶液(pH7.0)(Oriental Yeast Co.，Ltd.)
5U/mL 6-磷酸葡萄糖脱氢酶(Asahi Kasei Corporation)
1mM NADP溶液(Oriental Yeast Co.，Ltd.)
2mM氯化镁溶液(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)
溶解和稀释酶的溶液：10mM Tris缓冲液(pH7.5)
将3ml上面的反应液加到小试管中，并在37℃孵育5分钟。然后，将稀释B倍的50μl酶溶液加到小试管中并混合以开始反应。从反应开始时测量340nm处的吸光度以得到每分钟的吸光度变化A1，其显示为线性反应。也在类似反应物中进行不知情试验以得到每分钟的吸光度变化A0，只是加入50μl用于溶解和稀释酶的溶液代替酶溶液。从下面的等式计算酶活性。
U/ml＝[(A1-A0)/6.22×[3.05/0.05]×B
等式中的数字代表下面的意思：
6.22：340nm处NADPH的摩尔消光系数
3.05：反应液的总体积(mL)
0.05：反应中所用酶溶液的体积(mL)
B：酶溶液的稀释因子
己糖激酶的量优选为1到1,000u/ml，尤其优选1到100u/ml。依赖ADP的己糖激酶的量优选为1到1,000u/ml，尤其优选1到100u/ml。可以根据受试样品的类型和量适当选择用量，也可以使用其他量。
此外，为了测定宽范围浓度的尿肌醇并且测定具有良好重复性，应该有效进行酶促循环反应。作为对硫代-NAD和NADH(在酶促循环反应中使用的两种辅酶)的浓度和比率进行深入研究的结果，本发明人还发现硫代-NAD水平优选0.01mM或更高，尤其优选终浓度为2到10mM并且NADH/硫代-NAD的比率优选0.01到0.5，尤其优选0.01到0.1。然而，可以根据受试样品的类型和量适当选择用量，并且可以应用其他量。
实施例
下面将详细描述本发明的实施例和参考实施例，但是本发明不被它们所限制。
参考实施例1(对硫代-NAD水平的研究)
1)试剂
<R-1>
5mM MES(2-吗啉代乙基磺酸)(pH6.0)
0到40mM硫代-NAD(Oriental Yeast Co.，Ltd.)
<R-2；用于肌醇定量测定的试剂)
200mM N-二(羟乙基)甘氨酸(pH9.0)
0.3mM NADH(Oriental Yeast Co.，Ltd.)
25U/mL肌醇脱氢酶(Asahi Kasei Corporation)
2)方法
使用的测量设备为Autoanalyzer 7170S(Hitachi Chemical Co.，Ltd.)。向3μL浓度为0到3000μM的肌醇溶液加入180μL R-1试剂并在37℃孵育4.8分钟，然后加入180μL R-2试剂以开始反应。在反应启动后5.4和7.8分钟测量405nm处的吸光度，然后得到两处吸光度的差值。计算每分钟吸光度的增加速度(ΔmABS/分钟)然后关于标准溶液研究敏感性。
3)结果
结果如图1所示。如图1所示的，使用终浓度为0.1到10mM的硫代-NAD，在肌醇浓度为0到3,000μM观察到校准曲线为线性的。此外，发现硫代-NAD的终浓度优选2到10mM以增强肌醇检测的敏感性。
参考实施例2
(对肌醇定量测定试剂中缓冲液的研究)
1)试剂
<R-1>
5mM MES(pH6.0)
5mM硫代-NAD(Oriental Yeast Co.，Ltd.)
<R-2；肌醇定量测定试剂>
100mM缓冲液(pH8.8)
0.5mM NADH(Oriental Yeast Co.，Ltd.)
10u/ml肌醇脱氢酶(Asahi Kasei Corporation)
2)方法
按照上面所示组成制备用于肌醇定量测定的R-2试剂，缓冲液选自：
Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)，
Tricine(N-三(羟甲基)-甲基甘氨酸)，
Bicine(N，N-二(羟乙基)甘氨酸)，
TAPS(N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙基磺酸)，
TEA(三乙醇胺)，
CHES(2-(环己基氨基)乙基磺酸)，和
AMPSO(3-((1，1-二甲基-2-羟基-乙基)氨基)-2-羟基丙基磺酸)。
使用的测量设备为Autoanalyzer 7170S(Hitachi Chemical Co.，Ltd.)。向15μL事先制备的标准100μM肌醇溶液加入180μL R-1试剂并在37℃孵育4.8分钟，然后加入60μL R-2试剂以开始反应。在反应启动后5.4和7.8分钟测量405nm处的吸光度，然后得到两处吸光度的差值。计算每分钟吸光度的增加速度(ΔmABS/分钟)然后关于标准溶液研究敏感性。通过加速试验研究每种R-2试剂的稳定性，其中仅仅R-2试剂保存在30℃培养箱中20天，然后在第7、12和20天进行如上述相同的试验。
3)结果
结果如图2所示。与标准溶液相比显示出稳定敏感性的缓冲液是Tris、Tricine、Bicine和TEA；具有最稳定敏感性的缓冲液是Bicine。
参考实施例3(对ADP-己糖激酶的研究)
1)试剂
<R-1>
5mM MES(pH6.0)
5mM MgCl2(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)
8mM ATP(Oriental Yeast Co.，Ltd.)
10mM硫代-NAD(Oriental Yeast Co.，Ltd.)
10u/mL ATP-己糖激酶(Asahi Kasei Corporation)
0到0.4u/mL ADP-己糖激酶(Asahi Kasei Corporation)
<R-2；肌醇定量测定试剂>
200mM Bicine(pH9.0)
0.3mM NADH(Oriental Yeast Co.，Ltd.)
25u/ml肌醇脱氢酶(Asahi Kasei Corporation)
2)方法
使用的测量设备为Autoanalyzer 7170S(Hitachi Chemical Co.，Ltd.)。通过混合100μL2,000μM肌醇溶液和1mL 0到10g/dL葡萄糖溶液制备样品。向3μL每一样品中加入180μL R-1试剂并在37℃孵育4.8分钟，然后加入180μL R-2试剂以开始反应。在反应启动后5.4和7.8分钟测量405nm处的吸光度，然后得到两处吸光度的差值。计算每分钟吸光度的增加速度(ΔmABS/分钟)然后关于标准溶液研究敏感性。
3)结果
结果如图3所示。从图3明显看出，当仅使用ATP-己糖激酶时，增加葡萄糖水平(例如10g/dL)导致对敏感性产生影响。相反，当将ATP-己糖激酶和ADP-己糖激酶一起使用时，增加葡萄糖水平对敏感性没有影响。这表明样品中的葡萄糖可以通过同时与ATP-己糖激酶和ADP-己糖激酶反应除去；从而可以更准确地测定肌醇水平。
参考实施例4
(使用酶的具有高敏感性的肌醇定量测定)
1)试剂
肌醇测定法的试剂
<R-1；葡萄糖消除试剂>
5mM MES(pH6.0)
0.05％NaN3(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)
0.05％OP-10(Nippon Chemicals)
5mM MgCl2(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)
8mM ATP(Oriental Yeast Co.，Ltd.)
10mM硫代-NAD(Oriental Yeast Co.，Ltd.)
10u/mL ATP-己糖激酶(Asahi Kasei Corporation)
4u/mL ADP-己糖激酶(Asahi Kasei Corporation)
<R-2；肌醇定量测定试剂>
200mM Bicine(pH9.0)
0.05％ NaN3(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)
40mM KHCO3(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)
0.3mM NADH(Oriental Yeast Co.，Ltd.)
25u/ml肌醇脱氢酶(Asahi Kasei Corporation)
2)方法
使用的测量设备为Autoanalyzer 7170S(Hitachi Chemical Co.，Ltd.)。向3μL事先制备的肌醇溶液加入180μL葡萄糖消除试剂并在37℃孵育4.8分钟进行葡萄糖消除反应，然后向其中加入180μL肌醇定量测定试剂以开始反应。在反应启动后5.4和7.8分钟测量405nm处的吸光度，然后得到两处吸光度的差值。计算每分钟吸光度的增加速度(ΔmABS/分钟)。
3)结果
结果如图4所示。如图4所示，本测定试剂允许以简单的方式定量测定肌醇。肌醇的测量范围是0到2,000μM，当检出下限被定义为最小浓度时，检出下限是10μM，该最小浓度不与通过对0mM肌醇多次测量得到的“ΔmABS/分钟的+2x标准差”重叠。
实施例1
(通过测定尿肌醇检测轻症葡萄糖耐量异常)
1)受试者
通过标准75g经口葡萄糖负荷试验检查112名受试者。刚好在葡萄糖负荷前、葡萄糖负荷后30、60、120和180分钟收集血样以确定血糖和胰岛素水平。同时，刚好在葡萄糖负荷前、葡萄糖负荷后60、120和180分钟收集尿样以确定肌醇、尿糖和肌酸酐水平。
2)试剂和测定法：
血糖：电极方法(Kyoto Daiichi Kagaku Corporation：GA-1160)
胰岛素：RIA2抗体法
肌醇测试试剂：和实施例4的相同
尿糖：电极方法(Kyoto Daiichi Kagaku Corporation：GA-1160)
肌酸酐：肌酸酐-HA试验Wako(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)
3)方法：
∑PG——刚好在75g经口葡萄糖负荷前、葡萄糖负荷后30、60和120分钟葡萄糖水平的总和——被用作葡萄糖耐量指数。确定刚好在75g经口葡萄糖负荷前、葡萄糖负荷后30、60和120分钟各自尿样中肌醇水平和肌酸酐水平以计算排泄的肌醇与尿肌酸酐的量的比(肌醇/肌酸酐)。此外，将Δ肌醇含量[(60分钟时的肌醇含量—负荷前肌醇含量)/2]+[(120分钟时的肌醇含量—负荷前肌醇含量)/2]用作葡萄糖负荷后与负荷前之间的肌醇水平的指数。研究了∑PG和Δ肌醇含量的关系。
4)结果：
结果在表3和图5中显示。如图5所示，∑PG和Δ肌醇含量显示出良好的相关性。较高的∑PG表明血糖水平在葡萄糖负荷后保持较高，从而存在葡萄糖耐量异常。此外，例如，如果Δ肌醇的特征值被设为10μg/mgCre(肌酸酐)，那么可有效检测∑PG水平约为530mg/dL的轻症葡萄糖耐量异常的病例。
表3
             血糖(mg/dL)0分钟  30     60     120    180   ∑PG              胰岛素(μU/mL)0分钟 30   60    120   180   1.1          尿肌醇(μg/mg Cre)0分钟 60    120   180   Δmyo        尿糖(g/dL)0分钟 60    120   180    Δ肌醇 ∑PG ΔIRI/ΔPG
  1正常型2正常型3正常型4正常型5正常型6正常型7正常型8正常型9正常型10正常型11正常型12正常型13正常型14正常型15正常型16正常型17正常型18正常型19正常型20正常型21正常型22正常型23正常型24正常型25正常型26正常型27正常型28正常型29正常型30正常型31正常型32正常型33正常型34正常型35正常型36正常型37正常型38正常型39正常型   89     150    161    135    94    535105    180    153    65     107   483102    119    158    121    78    50085     170    143    98     85    496106    164    162    115    83    54796     125    139    134    125   49492     130    139    90     78    451101    144    135    108    107   48887     161    172    109    60    529106    175    167    133    60    581106    158    129    128    72    521101    137    101    83     82    42298     129    81     101    97    40992     127    123    85     70    42795     132    103    102    69    432106    157    107    102    85    48288     121    138    100    79    44797     130    88     103    102   41899     151    114    105    106   469102    148    176    127    89    55389     108    120    92     102   40991     144    153    105    72    493101    154    148    91     73    49498     148    177    124    52    54595     168    98     84     76    44589     147    93     84     55    41390     129    93     101    81    41375     96     75     84     60    33092     127    87     83     69    38983     109    107    101    78    400100    123    71     89     79    38396     110    75     89     82    37091     108    82     80     82    36191     140    152    99     59    48279     119    120    89     60    407100    151    148    139    100   53896     119    110    85     63    41099     145    149    109    63    50285     98     101    82     50    366   5    23    23    22    13    0.308    59    40    24    22    0.962    26    47    20    11    1.415    41    76    21    14    0.425    17    19    20    8     0.215    10    24    25    16    0.175    16    13    19    11    0.297    37    27    38    34    0.703    25    21    17    4     0.3013   83    124   107   14    1.0112   63    50    73    11    0.9611   87    86    25    10    2.117    49    10    18    11    1.359    39    25    18    8     0.868    39    30    28    12    0.8410   75    32    21    9     1.076    18    32    15    5     0.365    28    18    14    8     0.707    7     8     24    16    0.008    62    59    38    20    1.1710   51    65    21    37    2.169    75    67    38    7     1.255    26    36    14    5     0.4010   29    59    67    10    0.376    78    20    16    4     0.995    26    23    21    4     0.367    36    14    17    6     0.743    37    17    13    4     1.625    37    25    11    5     0.919    32    27    28    12    0.887    32    33    13    3     1.096    46    20    18    7     2.867    16    17    19    8     0.533    2     5     7     3     -0.024    9     5     7     2     0.1310   41    45    49    27    0.815    38    34    18    5     1.439    21    31    17    7     0.264    14                4     0.77   13    24    33    26    1523    24    40    26    911    12    13    13    146    60    51    43    913    13    19    15    326    38    59    68    2321    24    32    29    724    17    23    22    -425    35    46    44    1617    26    35    25    149     16    14    14    69     12    20    13    713    23    18    20    811    12    11    12    09     12    11    11    39     11    12    12    29     10    15    17    414    13    11    11    -28     10    12    18    341    70    92    47    4035    34    40    31    228    26    25    17    -27     8     8     9     111    11    11    11    024    34    30    31    87     9     14    8     525    22    20    19    -411    13    13    14    225    21    20    18    -416    15    17    14    05     8     13    10    515    18    17    12    210    13    16    15    47     8     8     7     110    12    15    14    418    26    38    36    1420    22    28    29    523    36    40    32    158     8     8     9     0  0.03  0.02  0.02  0.010.02  0.01  0.01  0.010.01  0.02  0.02  0.020     0.07  0.01  0.010.02  0.03  0.03  0.020.01  0.01  0.01  0.010.01  0.02  0.02  0.010.02  0.03  0.03  0.030.01  0.03  0.01  0.010.02  0.01  0     00.01  0     0.01  00.01  0.01  0     00.01  0     0     0.010.02  0.01  0.01  00.01  0.01  0.01  0.010.03  0.03  0.02  0.020.01  0.01  0.01  0.010.01  0.01  0.01  0.010.02  0.02  0.02  00.01  0.24  0.4   0.030.01  0.01  0.01  0.010.01  0.03  0.02  0.010.02  0.02  0.02  0.010.02  0.03  0.02  00.01  0.02  0.01  00.02  0.01  0     0.010     0.01  0.01  00.03  0.03  0.02  0.020.03  0.01  0     0.010     0.01  0     00.03  0     0     00.01  0.01  0     0.020.02  0.01  0     00.01  0.01  0.01  00.02  0.01  0.01  0.010.02  0.03  0.03  00.01  0.01  0     00.01  0.02  0.01  00.01  0.01  0.02  0     159193237-416146780324-23402-21085-42-4052414145150   535483500496547494451488529581521422409427432482447418469553409493494545445413413330389400383370361482407538410502366     0.300.961.410.420.210.170.290.700.301.010.982.111.350.860.841.070.360.700.001.172.161.250.400.370.990.360.741.620.910.881.092.860.53-0.020.130.611.430.260.77
表3(接上页)
40正常型41正常型42正常型43正常型44正常型45正常型46正常型47正常型48正常型49正常型50正常型51正常型52正常型53正常型54正常型55正常型56正常型57正常型58正常型59正常型60   IFG61   IFG62   IFG63   IFG64   IFG65   IFG66   IFG67   IFG68   IFG69   IGT70   IGT71   IGT72   IGT73   IGT74   IGT75   IGT76   IGT77   IGT78   IGT79   IGT80   IGT  89    114    87    91    63    38195    169    175   109   59    54876    78     86    90    84    310100   124    92    87    65    40395    138    117   91    67    44189    106    85    82    79    362103   192    153   96    80    54487    131    123   109   69    45099    126    104   83    66    41286    106    86    85    89    36384    131    89    89    80    39385    116    99    110   83    41087    122    89    96    88    39490    147    112   116   52    46592    187    186   133   49    59899    146    181   133   137   55999    160    206   138   68    603107   151    189   115   44    562105   194    234   110   81    64389    167    187   130   108   573117   165    154   90    80    526115   174    206   136   65    631117   204    220   103   152   644110   185    240   127   120   662111   183    200   83    75    577110   153    60    88    82    411117   236    192   101   71    646111   166    167   124   70    568113   204    229   115   58    661111   192    237   161   63    701104   153    130   141   141   528113   195    224   170   147   70298    158    213   143   48    61295    119    147   142   73    503103   187    217   164   111   671123   196    232   150   158   701108   150    192   168   124   618114   178    204   172   138   668108   211    214   167   69    70097    211    256   196   117   760123   218    244   160   83    745  7    9     10    15    3    0.0811   35    46    29    7    0.322    7     4     10    5    2.508    51    29    18    5    1.797    26    44    27    6    0.446    79    32    16    4    4.299    33    44    20    5    0.276    42    36    24    4    0.8210   47    9     15    5    1.373    22    18    17    8    0.956    40    24    12    10   0.726    17    17    18    9    0.356    27    30    35    13   0.606    72    53    50    8    1.163    17    25    27    4    0.155    19    16    15    13   0.3011   30    49    72    18   0.316    16    44    38    7    0.235    17    40    23    11   0.1322   133   142   104   79   1.428    37    108   27    11   0.604    8     19    20    4    0.077    31    37    33    16   0.286    15    26    15    14   0.124    16    22    12    4    0.175    44    22    18    15   0.9124   196   100   48    17   1.4512   53    55    40    8    0.755    20    47    44    12   0.1610   18    26    48    9    0.107    28    24    17    16   0.437    19    44    48    31   0.155    14    22    33    5    0.155    20    21    29    6    0.636    18    30    35    11   0.143    30    60    67    56   0.373    17    22    32    26   0.334    10    13    17    12   0.096    36    50    41    10   0.296    20    28    34    16   0.122    11    13    21    7    0.09   27    35    44    44    129     10    9     9     08     8     8     8     -18     7     9     12    110    17    23    26    107     8     9     12    218    56    38    28    287     10    10    9     327    18    21    18    -714    20    19    14    510    15    17    16    513    13    12    11    -111    16    20    24    717    16    22    28    2368   487   623   395   1864     4     4     3     17     7     14    10    413    20    42    30    1824    32    72    29    2826    34    41    27    1224    46    72    45    3512    33    84    25    4637    113   140   56    9017    26    59    29    2616    26    48    28    2213    15    19    19    412    19    19    13    79     22    21    14    1349    111   96    42    5422    67    146   94    8515    22    29    28    1063    114   185   176   8859    72    149   75    5240    31    36    40    -621    55    74    27    4431    88    119   88    7215    14    15    13    029    47    89    49    3915    66    116   28    7615    29    29    26    1517    73    150   27    95  0.01   0.02   0.01   00      0.02   0.01   0.010.01   0.01   0.02   0.010.01   0.03   0.01   00.02   0      0      00.02   0.01   0.01   00.02   0.77   0.06   00.01   0.01   0.01   0.010      0.02   0      0.010      0      0      00.03   0      0      00.03   0.02   0.02   00.02   0.02   0.01   00      0      0      00      0.23   0.15   0.030      0      0.01   00.03   0.04   0      00.02   0.03   0.05   0.020      0.04   0.13   00.02   0.02   0.01   00.01   0.06   0.06   00.01   0.23   0.55   00.01   0.61   1.04   0.120.02   0.05   0.12   0.030      0.1    0.17   00.01   0.01   0.02   0.010.02   0.03   0.02   0.010.01   0.02   0.03   00.01   0.89   0.53   0.030.01   0.37   1.31   0.410.02   0.02   0      0.010.01   0.67   0.38   0.140.03   0.19   1.16   0.170.01   0.01   0.03   0.010.01   0.02   0.01   0.010.01   0.95   0.53   0.660.02   0.02   0.02   0.020.02   0.04   0.13   0.030.01   0.22   0.43   0.030.03   0.06   0.05   0.010.02   1.41   1.54   0.02     120-11102283-755-17218614182812354690262247135485108652-64472039761595  381548310403441362544450412363393410394465598559603562643573526631644662577411646568661701528702612503671701618668700760745     0.080.322.501.790.444.290.270.821.370.950.720.350.601.160.150.300.310.230.131.420.600.070.280.120.170.911.450.750.160.100.430.150.150.630.140.370.330.090.290.120.09
表3(接上页)
81     IGT82     IGT83糖尿病型84糖尿病型85糖尿病型86糖尿病型87糖尿病型88糖尿病型89糖尿病型90糖尿病型91糖尿病型92糖尿病型93糖尿病型94糖尿病型95糖尿病型96糖尿病型97糖尿病型98糖尿病型99糖尿病型100糖尿病型101糖尿病型102糖尿病型103糖尿病型104糖尿病型105糖尿病型106糖尿病型107糖尿病型108糖尿病型109糖尿病型110糖尿病型111糖尿病型112糖尿病型  100   161   204   173   101  638110   219   240   186   100  755127   206   250   178   125  761128   249   279   214   89   870151   228   263   256   166  898170   278   326   322   197  1096204   281   337   363   286  1185112   209   262   237   91   820129   232   288   225   122  874106   171   253   243   115  773110   203   232   201   105  746139   225   286   326   245  976116   232   285   232   114  865132   220   329   318   223  999102   178   250   250   122  780173   239   352   311   201  1075152   236   224   264   263  876166   252   306   274   205  998101   249   373   444   342  1167152   239   314   299   162  1004141   208   261   189   138  799136   236   262   225   209  859101   128   193   206   138  628110   198   241   257   151  806152   253   346   291   158  1042129   239   202   130   86   700112   200   250   283   246  845111   198   251   254   171  814137   198   258   232   141  825134   201   276   233   151  844111   169   240   201   101  721136   201   200   137   141  674  7    9     12    14    12   0.036    15    21    31    13   0.088    21    25    37    21   0.166    22    25    31    15   0.135    12    13    16    7    0.095    7     8     11    9    0.0212   15    19    26    28   0.044    10    18    15    7    0.064    11    15    10    7    0.074    9     20    32    14   0.086    41    43    46    14   0.384    5     8     10    8    0.017    15    20    31    15   0.0730   49    80    105   74   0.222    9     13    36    16   0.099    7     23    36    20   -0.036    17    14    12    11   0.133    11    17    20    10   0.093    5     7     6     5    0.017    11    33    31    12   0.053    4     7     11    8    0.017    14    18    20    10   0.076    15    25    58    46   0.335    24    32    55    31   0.2210   19    44    16    23   0.095    39    65    24    6    0.316    11    15    29    27   0.065    17    20    32    21   0.145    11    30    21    8    0.105    13    19    20    11   0.124    12    28    28    10   0.147    8     10    20    13   0.02   15    15    21    18    332    117   210   178   13115    14    36    27    1150    119   221   144   12050    152   262   208   15764    146   232   225   12521    63    145   151   8333    106   195   112   11714    71    170   80    10627    44    135   79    6316    83    112   90    8236    86    191   202   10316    50    155   62    8738    40    244   167   10418    26    148   91    6949    108   236   227   12340    62    146   167   6415    71    161   114   10037    154   290   301   18533    56    174   127   8328    66    154   67    8273    160   268   181   14113    19    46    28    2045    55    99    118   3299    183   371   280   17824    69    67    40    4433    66    157   178   7817    43    180   167   9427    105   177   138   11422    43    138   85    6827    83    132   90    7026    35    38    31    11  0.02  0.02   0.03   0.020.03  3.12   4.13   1.440.02  0.03   0.14   0.080.02  1.6    1.33   0.310.03  0.85   2.33   1.020.01  1.33   3.46   2.750.05  3.42   7.25   7.250.01  1.17   0.98   0.160.03  2.82   5.89   1.160.02  0.99   5.11   1.960.02  1.57   1.92   1.250.05  2.71   6.43   6.730.02  1.09   0.73   0.110.03  0.12   0.4    0.610     0.08   3.31   1.160.04  2.21   6.46   4.650.01  0.15   0.18   0.110.01  1.38   4.5    1.680.02  3.44   2.45   2.10.03  0.36   3.29   2.230.02  0.12   0.66   0.020.01  0.92   1.76   0.530.02  0      0.02   0.020.01  0.15   1.3    1.610.11  3.02   3.32   3.20.03  1.76   0.59   0.120.01  0.42   1.62   2.50.02  0.48   0.99   0.840.06  3.88   6.04   3.780.02  0.65   4.88   2.690.01  0.43   1.44   0.10.01  0.01   0      0   31311112015712583117106638210387104691236410018583821412032178447894114687011  638755761870898109611858208747737469768659997801075876998116710047998596288061042700845814825844721674     0.030.080.160.130.090.020.040.060.070.080.380.010.070.220.09-0.030.130.090.010.050.010.070.330.220.090.310.060.140.100.120.140.02
实施例2
(通过测定尿肌醇检测早期胰岛素分泌不良)
1)受试者：
和实施例1的受试者相同。
2)试剂和测定法：
和实施例1的相同。
3)方法：
对每一尿样测定刚好在75g经口葡萄糖负荷前、葡萄糖负荷后60和120分钟的肌醇水平和肌酸酐水平，然后得到排泄的肌醇量和肌酸酐量的比(肌醇/肌酸酐)。此外，将Δ肌醇含量[(60分钟时的肌醇含量—负荷前肌醇含量)/2]+[(120分钟时的肌醇含量—负荷前肌醇含量)/2]用作葡萄糖负荷前与负荷后肌醇水平的指标。研究胰岛素产生指数(I.I)和Δ肌醇含量之间的关系。
4)结果：
结果如图6所示。如图6所示，发现了胰岛素产生指数(I.I)和Δ肌醇含量之间的关系。在其中Δ肌醇含量为15μg/mg Cre或更高的大部分病例中，胰岛素产生指数小于0.4。根据日本糖尿病协会的指南，可根据小于0.4的胰岛素产生指数判断存在早期胰岛素分泌不良。从图6可明显发现，如果Δ肌醇的特征值为15μg/mg Cre，那么可对显示出小于0.4的胰岛素产生指数或这具有早期胰岛素分泌不良的病例进行有效检测。
实施例3
(通过测定尿肌醇和尿糖检测轻症葡萄糖耐量异常)
1)受试者：
和实施例1的相同。
2)试剂和测定法：
和实施例1的相同。
3)方法：
对每一尿样测定刚好在75g口服葡萄糖负荷前、葡萄糖负荷后60和120分钟的肌醇水平和肌酸酐水平。然后得到排泄的肌醇量和肌酸酐量的比(肌醇/肌酸酐)。同时，还得到尿糖水平。将Δ肌醇含量[(60分钟时的肌醇含量—负荷前肌醇含量)/2]+[(120分钟时的肌醇含量—负荷前肌醇含量)/2]用作葡萄糖负荷前与负荷后肌醇水平的指标。
4)结果
将显示出Δ肌醇含量为10μg/mg Cre或更高的病例记作加(+)，而其他病例记作减(-)。同样对于尿糖，葡萄糖负荷后2小时显示出尿糖水平为50mg/dL或更高的病例记作“+”，而其他病例记作“-”。使用在实施例5中计算的∑PG。
在112名试验的受试者中，52例在组Δ肌醇(-)和尿糖(-)中，12例在组Δ肌醇(+)和尿糖(-)中，48例在组Δ肌醇(+)和尿糖(+)中。没有人相应于组Δ肌醇(-)和尿糖(+)。将组Δ肌醇(-)和尿糖(-)、组Δ肌醇(+)和尿糖(-)，和组Δ肌醇(+)和尿糖(+)的各自∑PG值相互比较。
结果在图7中显示。如图7所示，组Δ肌醇(-)和尿糖(-)的∑PG值的平均值和标准差分别为453mg/dL和76.6mg/dL。组Δ肌醇(+)和尿糖(-)的∑PG值的平均值和标准差分别为556mg/dL和81.1mg/dL。组Δ肌醇(+)和尿糖(+)的∑PG值的平均值和标准差分别为791mg/dL和164.8mg/dL。此外，如与组Δ肌醇(-)和尿糖(-)的∑PG进行比较，组Δ肌醇(+)和尿糖(-)的∑PG明显较高，组Δ肌醇(+)和尿糖(+)的∑PG也明显更高。这些表明葡萄糖耐量异常的程度可以通过尿肌醇和尿糖组合来非侵入性地确定。
实施例4
(通过测定尿肌醇和尿糖检测早期胰岛素分泌不良)
1)受试者：
和实施例1的相同。
2)试剂和测定法：
和实施例1的相同。
3)方法：
和实施例3的相同。
4)结果：
将显示出Δ肌醇含量为10μg/mg Cre或更高的病例记作加(+)，而其他病例记作减(-)。同样对于尿糖，葡萄糖负荷后2小时显示出尿糖水平为50mg/dL或更高的病例记作“+”，而其他病例记做“-。使用在实施例2中计算的胰岛素产生指数值。
将组Δ肌醇(-)和尿糖(-)、组Δ肌醇(+)和尿糖(-)，和组Δ肌醇(+)和尿糖(+)的各自胰岛素产生指数(ΔIRI 30-0/ΔPG 30-0)值相互比较。
结果在图8中显示。如图8所示，组Δ肌醇(-)和尿糖(-)的ΔIRI 30-0/ΔPG 30-0的平均值和标准差分别为1.32和0.79。组Δ肌醇(+)和尿糖(-)的ΔIRI 30-0/ΔPG 30-0的平均值和标准差分别为0.45和0.42。组Δ肌醇(+)和尿糖(+)的ΔIRI 30-0/ΔPG 30-0的平均值和标准差分别为0.16和0.19。此外，如与组Δ肌醇(-)和尿糖(-)的ΔIRI 30-0/ΔPG 30-0进行比较，组Δ肌醇(+)和尿糖(-)的ΔIRI 30-0/ΔPG 30-0明显较低，组Δ肌醇(+)和尿糖(+)的ΔIRI 30-0/ΔPG 30-0也明显更低。这些表明早期胰岛素分泌不良的程度可以通过尿肌醇和尿糖组合来非侵入性地确定。
实施例5
(通过测定尿肌醇检测轻症葡萄糖耐量异常)
1)受试者：
实施例1中所示受试者中的59名被判断为NGT，为显示出空腹血糖水平小于110mg/dl和葡萄糖负荷后2小时的水平小于140mg/dl的受试者。
2)试剂和测定法：
和实施例1中的相同。
3)方法：
在被判断为NGT的受试者中，那些具有葡萄糖负荷后1小时水平为180mg/dL或更高或者葡萄糖负荷后2小时水平为120mg/dL或更高的受试者被称为B组或者显示出轻微下降的葡萄糖耐量(轻症葡萄糖耐量异常)的受试者和其他受试者被称为A组。NGT的59名受试者包括45名A组受试者和14名B组受试者。通过确定刚好在75g口服葡萄糖负荷前、葡萄糖负荷后60和120分钟每个尿样中肌醇水平和肌酸酐水平得到A或B组中肌醇含量和排泄的尿肌酸酐量的比(肌醇/肌酸酐)。
此外，将Δ肌醇含量[(60分钟时的肌醇含量—负荷前肌醇含量)/2]+[(120分钟时的肌醇含量—负荷前肌醇含量)/2]用作葡萄糖负荷前与负荷后肌醇水平的指标。
4)结果：
结果在图9中显示。如图9所示，A组的Δ肌醇含量的平均值为3.9μg/mg Cre，B组的Δ肌醇含量的平均值为25.8μg/mg Cre。如与A组相比较的，具有轻微下降的葡萄糖耐量的B组(轻症葡萄糖耐量异常)导致更高的Δ肌醇含量。
实施例6
(通过确定尿肌醇检测胰岛素分泌缺陷)
1)受试者：
和实施例1的相同。
2)试剂和测定法：
和实施例1的相同。
3)方法：
在被判断为NGT的受试者中，那些具有胰岛素产生指数小于0.4的被归为B组，其他受试者被归为A组。NGT的59名受试者包括37名A组受试者和22名B组受试者。通过确定刚好在75g口服葡萄糖负荷前、葡萄糖负荷后60和120分钟每个尿样中肌醇水平和肌酸酐水平得到A或B组中肌醇含量和排泄的尿肌酸酐量的比(肌醇/肌酸酐)。
此外，将Δ肌醇含量[(60分钟时的肌醇含量—负荷前肌醇含量)/2]+[(120分钟时的肌醇含量—负荷前肌醇含量)/2]用作葡萄糖负荷前与负荷后肌醇水平的指标。
4)结果：
结果在图10中显示。如图10所示，A组的Δ肌醇含量的平均值为4.4μg/mg Cre，B组的Δ肌醇含量的平均值为16.9μg/mg Cre。如与A组相比较的，具有早期胰岛素分泌不良导致更高的Δ肌醇含量。
实施例7
(葡萄糖负荷试验中尿肌醇和进餐负荷试验中尿肌醇之间的关系)
1)受试者：
在如实施例1所示的那些受试者中，52名受试者同意接受进餐负荷试验，其中包括22名NGT受试者(C组)、14名边界型受试者(B组)，和16名糖尿病型受试者(D组)。进餐前和进餐后120分钟收集血样，然后确定血糖水平和胰岛素水平。此外，收集进餐前和进餐后120分钟的尿样，然后确定肌醇水平、尿糖水平和肌酸酐水平。
2)试剂和测定法：
和实施例1中的相同。
3)方法：
在空腹条件下收集血样和尿样后，受试者进食。食物包括罐装灭菌熟食(Wellness Menus Nichirei Corporation)和包装的煮饭(Sato FoodsIndustries，Co.，Ltd.))，含有96.1g碳水化合物、31.0g蛋白质、13.9g脂肪和1.1g钠，662kcal能量。进餐后120分钟时收集血样和尿样。通过确定每个尿样中肌醇水平和肌酸酐水平得到肌醇含量与排泄的尿肌酸酐量的比(肌醇/肌酸酐)。此外，将Δ肌醇含量[(120分钟时的肌醇含量—负荷前肌醇含量)]用作进餐前与进餐后肌醇含量的指标。
4)结果：
图11显示了葡萄糖负荷试验中Δ肌醇(X轴)和进餐负荷试验中Δ肌醇(Y轴)间的关系。如图11所示，葡萄糖负荷试验中Δ肌醇(X轴)和进餐负荷试验中Δ肌醇(Y轴)显示出良好相关性(Y＝1.044X-2.0，r＝0.83，P＜0.0001)并且显示几乎相同的值。这些结果揭示即使不进行葡萄糖负荷试验，轻症葡萄糖耐量异常或胰岛素分泌缺陷也可以通过确定进餐之前和之后尿肌醇水平来检测。
实施例8
(葡萄糖负荷试验中尿肌醇和进餐负荷试验中尿肌醇之间的关系)
1)受试者：
和实施例7的相同。
2)试剂和测定法：
和实施例1的相同。
3)方法：
和实施例7的相同。
4)结果：
图12显示了每组葡萄糖负荷试验中尿肌醇和进餐负荷试验中尿肌醇之间的关系。如图12中所示，每组葡萄糖负荷试验中Δ肌醇和进餐负荷试验中Δ肌醇相互非常一致。这些结果揭示即使不进行葡萄糖负荷试验，轻症葡萄糖耐量异常或胰岛素分泌缺陷可以通过确定进餐之前和之后尿肌醇水平来检测。
实施例9
(进餐负荷试验中尿肌醇和尿糖阴性个体中轻症葡萄糖耐量异常之间的关系)
1)受试者：
在实施例7中的那些受试者中，32个个体在进餐后2小时尿糖为阴性(小于50mg/dL)。
2)试剂和测定法：
和实施例1的相同。
3)方法：
和实施例7的相同，只是在进餐负荷试验中Δ肌醇为7μg/mg Cre或更多的个体归为(+)组，其他的归为(-)组。
4)结果：
结果在图13中显示。如图13所示，与Δ肌醇(-)组相比，即使在进餐后2小时为尿糖阴性的个体中，Δ肌醇(+)组的那些个体中的许多也在葡萄糖负荷试验中显示出较高的∑PG。这些结果揭示，即使在进餐后2小时为尿糖阴性的个体中，也可以通过确定进餐之前和之后尿肌醇水平来非侵入性地确定葡萄糖耐量异常的程度。
工业应用性
如上所述，本发明提供了具有良好重复性的以非侵入性的方式检测轻症葡萄糖耐量异常和/或早期胰岛素分泌不良的方法。
保藏的生物材料的参考
(1)(a)本发明的生物材料保藏的保藏机构的名称和地址：
名称：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心
地址：日本茨城果つくば，东1-1-1，中央第6；
(b)向(a)的保藏机构保藏的日期：
2000年10月12日(原保藏日期)；
(c)(a)的机构给予的保藏号：
FERM BP-7323。

Claims (26)

1.检测轻症葡萄糖耐量异常的方法，其特征在于所述方法包括：
定量测定样品中肌醇水平；和
将显示为特征值或特征值以上判定为轻症葡萄糖耐量异常或胰岛素分泌缺陷。
2.根据权利要求1的方法，其中使用酶进行样品中肌醇水平的定量测定。
3.根据权利要求2的方法，其中酶为肌醇脱氢酶。
4.根据权利要求2或3的方法，其中通过酶促循环方法进行利用酶对肌醇水平的定量测定。
5.根据权利要求1到4中任意一项所述的方法，其特征在于除去样品中的除了肌醇之外的糖而定量测定肌醇水平。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于除去样品中的除了肌醇之外的糖的反应同时使用了两种激酶。
7.根据权利要求6的定量方法，其特征在于所述两种激酶是ATP-己糖激酶和ADP-己糖激酶。
8.根据权利要求4到7中任意一项所述的定量方法，其特征在于硫代-NAD以终浓度0.1mM或更高浓度用作定量测定肌醇反应中的辅酶。
9.根据权利要求4到7中任意一项所述的定量方法，其特征在于硫代-NAD以终浓度2到10mM用作定量测定肌醇反应中的辅酶。
10.根据权利要求1到9中任意一项所述的方法，其中在葡萄糖负荷之前和之后，或者进餐之前和之后得到样品。
11.根据权利要求10的方法，其中样品为尿。
12.根据权利要求1到11中任意一项所述的方法，其特征在于样品是尿，且特征值为以0到20μg/mg肌酸酐作为75g葡萄糖负荷后尿中所排泄肌醇的增加量。
13.根据权利要求1到11中任意一项所述的方法，其特征在于样品是尿且特征值为以8到12μg/mg肌酸酐作为75g葡萄糖负荷后尿中所排泄肌醇的增加量。
14.根据权利要求1到13中任意一项所述的方法，其特征在于定量测定样品中的葡萄糖水平以及样品中的肌醇水平。
15.消除样品中葡萄糖的方法，其特征在于在样品的葡萄糖消除反应中同时使用了两种激酶。
16.根据权利要求15的消除葡萄糖的方法，其特征在于所述两种激酶是ATP-己糖激酶和ADP消除剂。
17.根据权利要求16的消除葡萄糖的方法，其中ADP消除剂是ADP-己糖激酶。
18.使用肌醇脱氢酶在硫代-NAD或NADH存在下酶促定量测定样品中肌醇水平的方法，其特征在于组合使用两种激酶。
19.根据权利要求18的方法，其特征在于所述两种激酶是ATP-己糖激酶和ADP消除剂。
20.根据权利要求19的消除葡萄糖的方法，其中ADP消除剂是ADP-己糖激酶。
21.用于定量测定肌醇的组合物，其特征在于组合物至少包含：
1)硫代-NAD；
2)NADH；
3)肌醇脱氢酶；和
4)两种激酶。
22.根据权利要求21的定量测定肌醇的组合物，其特征在于所述两种激酶是ATP-己糖激酶和ADP消除剂。
23.根据权利要求22的定量测定肌醇的组合物，其中ADP消除剂是ADP-己糖激酶。
24.根据权利要求21到23中任意一项所述的定量测定肌醇的组合物，其特征在于组合物还包含选自Bicine(N，N-二(羟乙基)甘氨酸)、Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)、TEA(三乙醇胺)和Tricine(N-三(羟甲基)-甲基甘氨酸)的缓冲液。
25.根据权利要求21到24中任意一项所述的定量测定肌醇的组合物，其特征在于硫代-NAD的终浓度是0.1mM或更高。
26.根据权利要求21到24中任意一项所述的定量测定肌醇的组合物，其特征在于硫代-NAD的终浓度是2到10mM。
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