CN101063654A - 磷测定试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种酶法测定磷试剂，本发明的试剂用蔗糖磷酸化酶(SP)使蔗糖与无机磷作用形成果糖和1－磷酸葡萄糖，后者在磷酸葡萄糖变位酶(PGM)催化下形成6－磷酸葡萄糖。在6－磷酸葡萄糖脱氢酶和6－磷酸葡萄糖酸脱氢酶作用下，6－磷酸葡萄糖氧化为5－磷酸核酮糖。同时导致两分子NAD+被还原，通过在340nm吸光度的增加，可计算样品中无机磷的含量。本发明的试剂具有高度的特异性，同时具有较好准确度和精密度。

Description

磷测定试剂
技术领域：
本发明属于生物试剂技术领域。具体涉及一种酶法测定磷试剂。
背景技术：
人体内含有磷(phosphorus)约17mol(530g)。其中87％存在于骨骼中。其余在软组织细胞内。体内许多重要的物质如某些蛋白质、脂类化合物、核酸、辅酶等都含有磷，在酸碱平衡中，磷酸盐亦具有重要作用。
血液中的磷可分为4部分。即：①无机磷：以H2PO4 -和HPO4 2-的形式存在。②有机磷或磷酸脂：如磷酸核苷酸，磷酸己糖。③含磷脂类：如卵磷脂、脑磷脂、鞘磷脂。④少量其他磷化合物。
血液中的磷与骨骼中的磷维持动态平衡。体内的磷主要以磷酸基形式参与许多对生命活动非常重要的物质代谢。例如：构成磷脂，进而与蛋白质构成细胞的组成成分，参与能量代谢。尤其是氧化磷酸代谢过程，形成ATP等，参与DNA、RNA以及许多辅酶的构成，磷还作为某些酶的激活剂或仰制剂，参与多种酶促反应，糖、脂类蛋白代谢过程中许多生化反应。
目前，由于人体的磷还无法直接测定，所以无机磷的检测实际上是分析磷酸盐阴离子(H2PO4 -，HPO4 2-)。常用的方法有染料结合法，同位素稀释质谱法，原子吸收法，酶法等。磷钼酸非还原法(直接紫外线法)在340nm直接测定磷钼酸聚化合物。方法简单，便于自动化。但该方法在黄疸，溶血，脂血血清在340nm处有光吸收，必须做标本空白，否则会偏离。
丁源圻报告“CV-多元络合体系光度法”是当前已知测磷方法中灵敏度最高的方法(中华医学检验杂志，1991，14(2)：75-78)。无机磷最小定量界限为10-9g。比经典提高2个数量级。其中WHD推荐的中等实验室测定无机磷的常规方法是比色法。决定性方法为同位素稀释质谱法。而酶法测定无机磷是发展方向。其优点是无机磷酸盐化合物在酶作用下的中性范围是稳定的，较早提的酶学方法有了—磷酸甘油醛偶联法，麦芽糖磷酸化酶与磷酸葡萄糖变位酶偶联法等。由于这些方法的敏感度较低，会影响无机磷的诊疗，进而影响他们的常规应用。以嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)和黄嘌呤氧化酶(XOD)偶联并以过氧化物酶(POD)为指标酶的方法是一种较成熟的方法。已有商品试剂盒出售，可用于常规样品的自动分析。但该方法很容易受到胆红素、尿酸及维生素等还原性物质的干扰。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种灵敏度更高的酶法测定磷试剂。
本发明提供了一种酶法测定磷试剂。
本发明的试剂用蔗糖磷酸化酶(SP)使蔗糖与无机磷作用形成果糖和1-磷酸葡萄糖，后者在磷酸葡萄糖变位酶(PGM)催化下形成6-磷酸葡萄糖。在6-磷酸葡萄糖脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶作用下，6-磷酸葡萄糖氧化为5-磷酸核酮糖。同时导致两分子NAD+被还原，通过在340nm吸光度的增加，可计算样品中无机磷的含量。
SP：蔗糖磷酸化酶
PGM：磷酸葡萄糖变位酶
G-6-PDH：6-磷酸葡萄糖脱氢酶
6PGDH：6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶
本发明的酶法测定磷试剂由下列试剂1和试剂2组成：
试剂1：
蔗糖：50-300mmol/L
PGM：200-2500U/L
G-6-PDH：500-3000U/L
缓冲液：10-500mmol/L
NaN3(防腐剂)：0.05％
BSA(牛血清白蛋白)：100mg/L
吐温20：1ml/L
pH7.0
试剂2：
6PGDH：500-5000U/L
NAD(氧化性辅酶I)(或NADP氧化性辅酶II)：0.5-5.0g
SP：1000U/L
Mgcl2：30mm
吐温20：1mol/L
NaN3：0.05％
BSA：100mg/L
缓冲液：10-500mmol/L
pH7.0
上述缓冲液可以为：
Pipes(哌嗪-N，N-双(2-乙璜酸))，ACE(N-(2-乙酰氨基)-2氨基乙磺酸)，MOPSO(3(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸)，BES(N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙璜酸)，HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸)，磷酸盐等。
上述试剂1与试剂2以3∶1比例混合组成单一试剂。
本发明的试剂盒与现有技术试剂相比，有以下优点：
一、精密度：测2.13mmol/L的样本20次计算SD，平均值，CV得SD＝0.023，平均值＝2.15，CV＝2.2％
二、准确度：测1.56mmol/L的定值血清三次，取平均值，计算平均值得1.58mmol/L，则相对偏差为1.013％
三、特异性：
    测值
测含50mg/dl的Vc1.34mmol/L样本 1.33mmol
测含20mg/dl的胆红素1.26mmol/L样本 1.25mmol
测含1.21mmol的尿酸1.12mmol/L样本 1.12mmol
测含500g/dl的血红蛋白1.07mmol/L样本 1.08mmol
具体实施方式：
实例1
试剂1：
蔗糖     100mmol/L
PGM      300U/L
G-6-PDH  600U/L
Pipes    50mM
NaN3    0.05％
BSA      100mg/L
吐温20   1ml/L
pH7.0
试剂2：
6PGDH    2500U/L
NAD      5.0g
SP       500U/L
Mgcl2    30mM
吐温20   1mol/L
NaN3    0.05％
BSA      100mg/L
ACE      10mM
pH7.0
试剂1配制：在1升烧杯中加入800毫升的蒸馏水，称取100毫摩的蔗糖，待溶解完全后加入定量的缓冲液，然后在加入100毫克的BSA，1毫升的吐温20和0.5克NaN3。用NaOH调节pH至7.0，再分别加入G-6-PDH 600U，PGM300U，再定容至1升。
试剂2配制：在1升烧杯中加入800毫升的蒸馏水，称取5克的NAD(P)，待溶解完全后加入规定用量的缓冲液，然后在加入100毫克的BSA，1毫升的吐温20，Mgcl230毫摩和0.5克NaN3。用NaOH调节pH至7.0，再分别加入6PGDH 2500U，SP 500U，再定容至1升。
检测条件：37℃具有340nm波长的分光光度计或全自动生化分析仪。
操作步骤：
    空白管     校准管     样本管
试剂     300     300     300
蒸馏水     6.0
校准管     6.0
样本管     6.0
混匀，37℃孵育5分钟，读取吸光度值A1
试剂2     100     100     100
混匀，37℃孵育5分钟，读取吸光度值A2
计算ΔA＝A1-A2
Figure A20061002607600071
1°与PNP-XOD-POD法临床样本相关性：
    1NP-XOD-POD法     本法
    1     1.77     1.69
    2     3.67     3.74
    3     3.26     3.18
    4     4.27     4.31
    5     3.69     3.74
    6     5.68     5.66
    7     2.15     2.16
    8     3.67     3.79
    9     6.37     6.29
    10     4.29     4.35
    11     2.23     2.37
    12     1.13     1.18
    13     2.82     2.94
    14     6.11     6.16
    15     8.43     8.51
    16     6.46     6.57
    17     2.38     2.41
    18     4.79     4.68
    19     3.26     3.33
    20     2.72     2.74
    21     1.53     1.58
    22     1.38     1.42
    23     5.64     5.68
    24     6.28     6.39
    25     3.17     3.27
    26     2.85     2.90
    27     5.67     5.73
    28     0.39     0.41
    29     9.35     9.46
    30     0.78     0.79
相关方程：Y＝1.013X+0.0125
相关系数：R＝0.999
2°线性范围：
理论值     实际测值
0.90     0.92
1.80     1.82
2.70     2.7
3.60     3.61
4.50     4.51
5.40     5.38
6.30     6.27
7.20     7.20
8.10     8.08
9.00     9.02
相关方程：Y＝0.989X+0.112
相关系数：R＝0.9999
3°精密度：
测2.1mmol/L左右样本20次计算SD平均值CU值：
最大值  2.14
最小值  2.03
平均值  2.09
SD  0.0217
CV  1.04％
实例2
试剂1：
蔗糖       300mmol/L
PGM        2000U/L
G-6-PDH    2000U/L
ACE             500mM
BSA             100mg/L
吐温20          1ml/L
NaN3           0.05％
pH7.0
试剂2：
6PGDH           800U/L
NADP            1.0g
SP              3500U/L
Mgcl2          30mm
吐温20          1mol/L
NaN3           0.05％
BSA             100mg/L
BES             50mM
pH7.0
制法同上。
实例3：
试剂1：
蔗糖            240mmol/L
PGM             1000U/L
G-6-PDH         200U/L
BES             500mM
NaN3           0.05％
BSA             100mg/L
吐温20          1ml/L
pH7.0
试剂2：
6PGDH           2500U/L
NAD             0.8g/L
SP              1000U/L
Mgcl2          30mM
吐温20          1mol/L
NaN3           0.05％
BSA             100mg/L
Pipes            150mM
pH7.0
制法同上。
实例4：
试剂1：
蔗糖             40mmol/L
PGM              300U/L
G-6-PDH          400U/L
MOPSO            250mM
NaN3            0.05％
BSA              100mg/L
吐温20           1ml/L
试剂2：
6PGDH            400U/L
NADP             0.15g/L
SP               2500U/L
Mgcl2           30mM
吐温20           1mol/L
NaN3            0.05％
BSA              100mg/L
Pipes            10mM
pH7.0
制法同上。
实例5
蔗糖             100mmol/L
PGM              800U/L
G-6-PDH          500U/L
HEPES            50mM
NaN3            0.05％
BSA              100mg/L
6PGDH            1500U/L
NAD              0.8g/L
SP               1000U/L
Mgcl2           7.5mM
吐温20           1mol/L
pH7.0
制法同上。
实例6
蔗糖             140mmol/L
PGM              1000U/L
G-6-PDH          200U/L
磷酸盐缓冲液     100mM
NaN3        0.05％
BSA          100mg/L
6PGDH        1000U/L
NADP         0.4g/L
SP           1500U/L
Mgcl2       7.5mM
吐温20       1mol/L
pH7.0
制法同上。

Claims (3)

1、一种酶法测定磷试剂，其特征在于该试剂由下列试剂1和试剂2组成：
试剂1：
蔗糖：50-300mmol/L
PGM：200-2500U/L
G-6-PDH：500-3000U/L
缓冲液：10-500mmol/L
NaN3：0.05％
BSA：100mg/L
吐温20：1ml/L
pH7.0
试剂2：
6PGDH：500-5000U/L
NAD或NAD 0.5-5.0g
SP：1000U/L
Mgcl2：30mm
吐温20：1mol/L
NaN3：0.05％
BSA：100mg/L
缓冲液：10-500mmol/L
pH7.0
2、根据权利要求1所述的一种酶法测定磷试剂，其特征在于其中所述缓冲液为哌嗪-N，N-双(2-乙璜酸)、N-(2-乙酰氨基)-2氨基乙磺酸、3(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸、N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙璜酸、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸或磷酸盐。
3、根据权利要求1所述的一种酶法测定磷试剂，其特征在于该试剂为试剂1与试剂2以3∶1的比例混合组成。
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