CN1916623A - 肌酸激酶活性测定用试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供含有氨基甲烷磺酸和肌酸激酶(CK)活化剂的肌酸激酶(CK)活性测定用试剂。
Description
技术领域
本发明涉及测定试样中所含肌酸激酶(以下称：CK)活性的试剂。
背景技术
CK是由二个亚组构成的二聚物的磷酸酶。CK的亚组中有B型(脑型)和M型(肌型)两种。CK因两种亚组的不同组合，而存在三种异酶(CK-MM、CK-MB和CK-BB)，CK-MM多含于筋骨，CK-MB多含于心肌，CK-BB多含于脑中。因心肌梗塞和肌肉营养不良等疾病，本存在于发病部位的CK异酶会流失到血液中，因此，在临床检查中存在于血清和血浆等试样中的CK的活性值就成为诊断上述疾病的重要指标。
CK在血液中会钝化，要在生物试样中加入CK活化剂后再进行活性测定。因此，CK活性测定用试剂中含有N-乙酰-L-半胱氨酸(以下称NAC)和硫代丙三醇等含SH基的化合物(以下称SH化合物)，作为CK活化剂。
CK活化剂为不稳定物质，受试剂中所含杂质铜、铁等金属离子的影响，CK活化剂的SH基在试剂保存过程中渐渐被氧化，变成二硫化物基，分子中的SH基变成二硫化物基的CK活化剂(变质的CK活化剂)将失去活化CK的作用。因此，为防止CK活化剂变质，稳定CK活化剂，常常用乙二胺四乙酸(EDTA)来螯合CK活化剂变质之源金属离子。
但是，EDTA稳定CK活化剂的效果并不十分理想，用经长期保存的试剂并不能充分活化测定用试样中的CK，有时无法进行准确的测定。
发明内容
本发明的目的在于提供长期保存后也能正确进行测定的CK活性测定用试剂。
本发明提供含有氨基甲烷磺酸和CK活化剂的肌酸激酶活性测定用试剂。
本发明提供一种长期保存后也能正确测定的CK活性测定用试剂。
附图说明
图1：显示CK活性测定反应原理的模式图。
具体实施方式
本实施方式的CK活性测定用试剂含有氨基甲烷磺酸和CK活化剂。试剂中的氨基甲烷磺酸浓度以能稳定CK活化剂为准，并无特别要求。
本发明中的氨基甲烷磺酸还“含有”氨基甲烷磺酸盐。作为氨基甲烷磺酸盐比如可以是钾盐、钠盐、铵盐(包括与甲胺、二甲胺、甲基乙基胺、三乙胺等合成的盐)等。
作为CK活化剂，没有特定，只要具有活化试样中的CK的作用即可。比如可以使用N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)、N-鸟苷-L-半胱氨酸、半胱胺、二硫苏糖醇(DTT)、半胱氨酸、谷胱甘肽、巯基琥珀酸、硫葡萄糖、二硫赤藓糖醇、巯基醋酸、2-巯基乙醇、溴2-氨乙基异硫糖醛(aminoethyl isothiouronium)2-巯基乙烷磺酸及硫代丙三醇等SH化合物。这些CK活化剂也可以两种以上组合使用，但最好单独使用。混合试样和试剂的反应液中CK活化剂的浓度(最终浓度)为0.1～200mM，优选10～100mM。
关于CK活性测定用试剂在溶液状态下的pH值并无特别限定，最好是5.0～11.0。要维持pH值，最好在试剂中添加缓冲剂。作为缓冲剂比如可以使用树枝状盐酸缓冲剂、咪唑醋酸缓冲剂、磷酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、苹果酸缓冲剂、草酸缓冲剂、酞酸缓冲剂、甘氨酸缓冲剂、醋酸缓冲剂、琥珀酸缓冲剂、硼酸缓冲剂、碳酸缓冲剂等良好缓冲剂。
CK活性测定用试剂中最好含有：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)、二磷酸吡啶核苷酸(NAD)或磷酸烟酰胺腺苷二核苷酸(NADP)、乙糖激酶(HK)或葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖、腺苷二磷酸(ADP)和磷酸肌酸。
CK活性测定用试剂既可以将各种成份冻结干燥为固态也可以将其溶解在溶液里形成液态。
CK活性测定用试剂最好是含有第一试剂和第二试剂的套装试剂，此时，第一试剂和/或第二试剂可以是冻结干燥状态，也可以两个试剂都是液态。
当CK活性测定用试剂包括第一试剂和第二试剂时，优选第一试剂中含有G6 PDH、NAD或NADP、乙糖激酶(HK)或葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖、腺苷二磷酸(ADP)及CK活化剂，第二试剂含有磷酸肌酸。
G6PDH、HK和GK其来源无特定，可以来自细菌、酵母、动植物等，也可来源于用基因重组技术生成的物质。G6PDH的最终浓度为0.5～40U/ml之间，优选1～10U/ml。HK或GK的最终浓度为0.5～20U/ml之间，优选1～6U/ml。
CK活性测定用试剂中可以放入乙二胺四醋酸(EDTA)、二亚乙基三胺五醋酸(DTPA)、环己二胺四醋酸(以下称Cy DTA)等螯合剂。当CK活性测定用试剂由第一试剂和第二试剂组成时，优选螯合剂放在第一试剂。CK活化剂变质的原因是试剂中含有金属离子，螯合剂具有通过螯合试剂中的金属离子来抑制CK活化剂变质的效果。
氨基甲烷磺酸可以含在第一试剂和第二试剂的任何一个当中，也可以两者都含。除第一试剂和第二试剂外还可以制备含有氨基甲烷磺酸的第三试剂，在测定前混合进去。氨基甲烷磺酸接触到CK活化剂，可以使变质的CK活化剂的二硫化物基还原为SH基。氨基甲烷磺酸不仅具有这种作用，它还有防止CK活化剂的SH基转化为二硫化物基的作用。
含氨基甲烷磺酸的第一试剂和第二试剂组成的套装试剂可以通过以下方法制备：混合氨基甲烷磺酸、G6 PDH、NAD或NADP、乙糖激酶(HK)或葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖、腺苷二磷酸(ADP)和CK活化剂，配制第一试剂；再配制含有磷酸肌酸的第二试剂。
第一试剂和含氨基甲烷磺酸的第二试剂组成的套装试剂可以通过以下方法制备：混合G6 PDH、NAD或NADP、乙糖激酶(HK)或葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖、腺苷二磷酸(ADP)和CK活化剂，配制第一试剂；再配制含有氨基甲烷磺酸和磷酸肌酸的第二试剂。
在第一试剂中添加氨基甲烷磺酸，可以抑制长期保存造成的SH化合物变质，从而稳定SH化合物。当第二试剂中添加氨基甲烷磺酸时，可以使因长期保存而变质、从而失去CK活化作用的SH化合物还原到变质前的状态(可以活化CK的状态)。因此，通过在第一试剂或第二试剂中添加氨基甲烷磺酸，都可以保证即使使用长期保存后的试剂也能进行准确的CK活性测定。
本实施方式的CK活性测定用试剂的测定对象是试样中含有的全部CK的活性、CK-MM的活性、CK-MB的活性和CK-BB的活性之中的任意一个。在临床检查中一般是测定试样中的全部CK的活性或CK-MB的活性。通过在CK活性测定用试剂中加入与CK的M型亚组特异缔合的抗体(以下称抗CK-M抗体)，即可测定试样中的CK-MB的活性(Wurzburg et al.，1977，J.Clin.Chem.Clin.Biochem.，15：131-135)。作为抗CK-M抗体，只要是能特别识别M型亚组的抗体，它既可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体，还可以将二者混合起来使用。另外，还可以使用抗体的碎片及其衍生物。抗体的碎片及其衍生物具体来说有：Fab，Fab’，F(ab)2以及s Fv碎片等(Blazar et al.，1997，J.Immunol.，159：5821-5833及Bird et al.，1988，Science，242：423-426)。抗体的次类并不限定于IgG，也可以是IgM等。
用于测定的试样，可以是血清，血浆、血液、髓液、尿液和精液等，以血浆或血清为好。
下面，根据图1介绍CK活性测定的反应过程的一例。
在含有CK的试样中加入含有上述成份的CK活性测定用试剂，将出现如图1所示的反应。在图1中，被CK活化剂活化的CK催化了由磷酸肌酸和ADP生成肌酸和ATP的反应(反应1)。含在试剂中的乙糖激酶(HK)或葡萄糖激酶(GK)通过含在试剂中的葡萄糖和反应1生成的ATP生成葡萄糖-6-磷酸(G6P)和ADP(反应2)。含在试剂中的G6PDH又从反应2中生成的G6P和NAD或NADP生成6-二氧磷-D-葡糖酸和NADH或NADPH(反应3)。NADH或NADPH生成后试样和试剂的混合液中波长340nm附近的吸光度就会升高。监视此吸光度升高过程，就可以测定试样中CK的活性。
最好让CK活性测定用试剂中含有镁离子。在试剂中添加镁盐即可做到这一点。作为镁盐可以使用醋酸镁、硫酸镁、氯化镁等。
也可以在试剂中添加有防腐剂和表面活性作用的化合物。作为防腐剂，比如可以使用叠氮化钠等。有表面活性作用的化合物可使用非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性离子表面活性剂和白朊等，具体地说，可以使用三通类(Union Carbide Chemicals andPlastics Co.的注册商标)、乳液类(花王(株)的注册商标)、牛血清白蛋白(BSA)等等。
试样中有时含有腺嘌呤脱氨酶。腺嘌呤脱氨酶特别是多含在溶血试样中，给CK的活性测定带来负面影响。为了避免这种负面影响，最好在试剂中添加阻止腺嘌呤脱氨酶作用的抑制剂。对抑制剂种类并无特定，只要是抑制腺嘌呤脱氨酶作用的东西即可，比如可以用腺苷一磷酸(AMP)和P1P5二腺苷-5’-五氯乙烷酸(AP5A)等。
用双动法测定活性也可以避免腺嘌呤脱氨酶的负面影响。所谓双动法就是先测定腺嘌呤脱氨酶等酶的活性，然后添加磷酸肌酸，让CK进行酶反应，再测定试样中的激酶的活性(CK活性和腺嘌呤脱氨酶等酶的活性之和)。这些测定结果的差即为CK的活性值。
(实施例1)
以下列出了测定CK活性用第一试剂和第二试剂的基本构成。
<第一试剂>pH 6.6
咪唑125mM
醋酸镁12.5mM
环己二胺四醋酸2.0mM
ADP 2.5mM
AMP 6.25mM
AP5A 12.5M
葡萄糖25mM
NADP 2.5mM
G6PDH 1875U/L
乙糖激酶3750U/L
NAC 30mM
<第二试剂A>pH 9.0
磷酸肌酸150mM
将上述物质按上述浓度溶解在蒸馏水中，配制第一试剂和第二试剂A。然后在第二试剂A中添加氨基甲烷磺酸5mM，配制第二试剂B；在第二试剂A中添加氨基甲烷磺酸10mM，配制第二试剂C；在第二试剂A中添加氨基甲烷磺酸20mM，配制第二试剂D；再配制与第二试剂A同样成份的第二试剂E。
将上述第一试剂和第二试剂A～D在4℃的温度下保存4个月，然后用日立7170S型自动分析仪将第一试剂180μl、第二试剂45μl作为试样和酶校准品(calibrator)(Sysmex公司制)5.6μl混合，测定在340nm处的吸光度变化。第一试剂和第二试剂E不进行4℃环境下的4个月长期保存，配制试剂后马上测定上述试样的CK活性。测定进行二次，测定结果的平均值如下面表1所示。表1中显示的值是将吸光度变化量放大10000倍后的值。
表1
| 氨基甲烷磺酸浓度 | 保存条件 | 吸光度变化量测定值 |
| 0mM (第二试剂A) | 4℃4个月 | 447 |
| 5mM (第二试剂B) | 4℃4个月 | 497.5 |
| 10mM (第二试剂C) | 4℃4个月 | 517.5 |
| 20mM (第二试剂D) | 4℃4个月 | 534.5 |
| 0mM (第二试剂E) | 未长期保存 | 544.5 |
如上所示，使用含有氨基甲烷磺酸并经长期保存的第二试剂B～C时获得的吸光度变化量测定值(以下简称为测定值)比使用经长期保存的第二试剂A时的测定值更接近使用第二试剂E时的测定值。
这说明因长期保存而变质的NAC与氨基甲烷磺酸接触后又回到变质前的状态，得以充分活化CK。从以上可以看出，使用含氨基甲烷磺酸的试剂，即使试剂经过长期保存也能够正确测定试样中的CK活性。
(实施例2)
以下是CK活性测定用第一试剂和第二试剂的基本构成。
<第一试剂A>pH 6.6
咪唑125mM
醋酸镁12.5mM
CyDTA 2.0mM
ADP 2.5mM
AMP 6.25mM
AP5A 12.5μM
葡萄糖30mM
NADP 2.5mM
G6PDH 1875U/L
乙糖激酶3750U/L
NAC 30mM
<第二试剂>pH 9.0
磷酸肌酸150mM
将上述物质按上述浓度溶解在蒸馏水中，配制第一试剂A和第二试剂。然后，在第一试剂A中添加氨基甲烷磺酸1mM，配制第一试剂B；再在第一试剂A中添加氨基甲烷磺酸2mM配制第一试剂C。
将上述第一试剂A～C和第二试剂在4℃的温度下保存1个月，然后用日立7170S型自动分析仪将第一试剂180μl、第二试剂45μl作为试样和酶校准品(calibrator)(Sysmex公司制)5.6μl混合，测定在340nm处的吸光度变化。测定进行二次，测定结果的平均值如下面表2所示。表2所示值是将吸光度变化量放大10000倍后的值。
表2
| 氨基甲烷磺酸浓度 | 吸光度变化量测定值 |
| 0mM (第一试剂A) | 521 |
| 1mM (第一试剂B) | 540 |
| 2mM (第一试剂C) | 541 |
使用含有氨基甲烷磺酸并经长期保存的第一试剂B、C显示出的测定值高于只经过长期保存的第一试剂A。
如上所示，氨基甲烷磺酸与NAC在一起可以抑制NAC经长期保存而变质，从而得以充分活化试样中的CK。以上可以看出，使用添加了氨基甲烷磺酸的试剂，即使长期保存后也能正确地测定CK的活性。
(实施例3)
使用含NAC以外的SH化合物的CK活性测定用试剂来评价氨基甲烷磺酸稳定SH化合物的作用。
将下列物质按下列浓度溶解在蒸馏水中，并将pH维持在6.6。
咪唑125mM
醋酸镁12.5mM
EDTA 2.5mM
ADP 2.5mM
AMP 6.25mM
AP5A 12.5μM
葡萄糖30mM
NADP 2.5mM
G6PDH 1875U/L
乙糖激酶3750U/L
在上述成份中作为CK活化剂添加30mM半胱胺、二硫苏糖醇(DTT)、半胱氨酸、谷胱甘肽和硫代丙三醇中的一个和氨基甲烷磺酸10mM，配制5种第一试剂。同时，也作为CK活化剂添加30mM半胱胺、二硫苏糖醇(DTT)、半胱氨酸、谷胱甘肽和硫代丙三醇中的一个，不添加氨基甲烷磺酸，再配制5种第一试剂。对这十种试剂以37℃施加5天的温度负荷后对试剂中的SH基进行定量。
另外，作为CK活化剂添加30mM半胱胺、二硫苏糖醇(DTT)、半胱氨酸、谷胱甘肽和硫代丙三醇中的一个，不添加氨基甲烷磺酸，配制5种第一试剂，不施加温度负荷对试剂中的SH基进行定量。
SH基的定量是用DTNB 5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(5，5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid))做的。在试剂中添加DTNB，如果有SH化合物，则相当于SH化合物所含SH基的量的二硫化物键断裂，产生5-巯基-2-硝基苯(甲)酸(5-Mercapto-2-nitrobenzoic acid)。5-巯基-2-硝基苯(甲)酸一产生，则波长412nm处的吸光度升高，测定之以定量试剂中的SH基。定量结果如以下表3所示，定量结果是相对于使用未添加氨基甲烷磺酸的第一试剂、在未施加温度负荷的情况下而定量的SH基的量的百分比。
表3
| CK活化剂 | 温度负荷 | 氨基甲烷磺酸浓度(mM) | SH基残留量(％) |
| 半胱胺 | 无 | 0 | 100.0 |
| 37℃5天 | 0 | 34.7 | |
| 37℃5天 | 10 | 55.9 | |
| DTT | 无 | 0 | 100.0 |
| 37℃5天 | 0 | 83.4 | |
| 37℃5天 | 10 | 93.1 | |
| 半胱氨酸 | 无 | 0 | 100.0 |
| 37℃5天 | 0 | 56.3 | |
| 37℃5天 | 10 | 73.1 |
| 谷胱甘肽 | 无 | 0 | 100.0 |
| 37℃5天 | 0 | 75.9 | |
| 37℃5天 | 10 | 85.4 | |
| 硫代丙三醇 | 无 | 0 | 100.0 |
| 37℃5天 | 0 | 75.6 | |
| 37℃5天 | 10 | 95.2 |
无论使用哪个CK活化剂，添加氨基甲烷磺酸的第一试剂其施加温度负荷后的SH基残留量比不添加氨基甲烷磺酸的第一试剂更多。这说明无论哪种CK活化剂都可以通过添加氨基甲烷磺酸抑制变质的发生。由此可知，氨基甲烷磺酸可以提高各种CK活化剂的保存稳定性。
如上所述，在第一试剂和第二试剂之一添加氨基甲烷磺酸，试剂即使长期保存也能正确地测定CK活性。
Claims (10)
1、一种肌酸激酶活性测定用试剂，其特征在于：含有氨基甲烷磺酸和肌酸激酶活化剂。
2、权利要求1描述的肌酸激酶活性测定用试剂，其特征在于：所述肌酸激酶活化剂是一种含有SH基的化合物。
3、权利要求1描述的肌酸激酶活性测定用试剂，其特征在于：所述肌酸激酶活化剂是选自N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)、N-鸟苷-L-半胱氨酸、半胱胺、二硫苏糖醇(DTT)、半胱氨酸、谷胱甘肽、巯基琥珀酸、硫葡萄糖、二硫赤藓糖醇、巯基醋酸、2-巯基乙醇、溴2-氨乙基异硫糖醛(aminoethyl isothiouronium)、2-巯基乙烷磺酸及硫代丙三醇中的至少一种。
4、权利要求1或2描述的肌酸激酶活性测定用试剂，其特征在于：还至少含有以下一种化合物：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)、二磷酸吡啶核苷酸(NAD)或磷酸烟酰胺腺苷二核苷酸(NADP)、乙糖激酶或葡萄糖激酶、葡萄糖、腺苷二磷酸(ADP)及磷酸肌酸。
5、权利要求1或2描述的肌酸激酶活性测定用试剂，其特征在于：还含有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)、二磷酸吡啶核苷酸(NAD)或磷酸烟酰胺腺苷二核苷酸(NADP)、乙糖激酶或葡萄糖激酶、葡萄糖、腺苷二磷酸(ADP)及磷酸肌酸。
6、权利要求1描述的肌酸激酶活性测定用试剂，其特征在于：还含有与肌酸激酶M型亚组特异缔合的抗体。
7、一种肌酸激酶活性测定用套装试剂，其特征在于：包括二种试剂，其分别是含有肌酸激酶活化剂、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)、二磷酸吡啶核苷酸(NAD)或磷酸烟酰胺腺苷二核苷酸(NADP)、乙糖激酶或葡萄糖激酶、葡萄糖及腺苷二磷酸(ADP)的第一试剂和含有氨基甲烷磺酸及磷酸肌酸的第二试剂。
8、一种肌酸激酶活性测定用套装试剂，其特征在于：包含二种试剂，其分别是含有氨基甲烷磺酸、肌酸激酶活化剂、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)、二磷酸吡啶核苷酸(NAD)或磷酸烟酰胺腺苷二核苷酸(NADP)、乙糖激酶或葡萄糖激酶、葡萄糖及腺苷二磷酸(ADP)的第一种试剂，含有磷酸肌酸的第二种试剂。
9、肌酸激酶活性测定用套装试剂的制造方法，其特征在于：包括以下配制步骤：
a)将肌酸激酶活化剂、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)、二磷酸吡啶核苷酸(NAD)或磷酸烟酰胺腺苷二核苷酸(NADP)、乙糖激酶或葡萄糖激酶、葡萄糖及腺苷二磷酸(ADP)混合，配制第一试剂；及
b)将氨基甲烷磺酸和磷酸肌酸混合配制第二试剂。
10、肌酸激酶活性测定用套装试剂的制造方法，其特征在于：包括以下配制步骤：
a)将氨基甲烷磺酸、肌酸激酶活化剂、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)、二磷酸吡啶核苷酸(NAD)或磷酸烟酰胺腺苷二核苷酸(NADP)、乙糖激酶或葡萄糖激酶、葡萄糖及腺苷二磷酸(ADP)混合，配制第一试剂；及
b)配制含有磷酸肌酸的第二试剂。
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