CN104630324A - 改进的同型半胱氨酸检测试剂及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种改进的同型半胱氨酸检测试剂及方法。本发明的方法包含：同型半胱氨酸在同型半胱氨酸甲基转移酶和S-腺苷同型半胱氨酸水解酶作用下，与S-腺苷甲硫氨酸反复循环反应，产生腺苷，通过检测腺苷的生成速率，即可测定样本中同型半胱氨酸的浓度。本发明通过调整试剂盒中的组分位置、pH值、添加稳定剂等措施，获得了特异性和灵敏度高、稳定性强，能够对体液中含量极低的同型半胱氨酸进行自动化检测的方法和试剂盒。

Description

改进的同型半胱氨酸检测试剂及方法
技术领域
本发明涉及改进的同型半胱氨酸检测试剂及方法，尤其涉及利用酶催化反应、酶循环扩增法、酶比色法测定同型半胱氨酸的方法及试剂。
背景技术
同型半胱氨酸(Hcy)为含巯基氨基酸，是体内甲硫氨酸循环过程中的一个代谢中间产物。血液中总Hcy浓度的病理性升高会导致高同型半胱氨酸血症。而高同型半胱氨酸血症与作为人类第一杀手的动脉粥样硬化、高血压、心肌梗死等多种心血管疾病的发生有密切关系，是心血管疾病的一个新的独立和重要的危险因素。同型半胱氨酸的检测已作为临床冠心病的一个独立风险因子，并且其病理性偏高是引起动脉硬化最终导致心脏病和中风的罪魁祸首。
目前国内外已经把同型半胱氨酸作为心血管疾病的一个检测指标。如果能给予病人及时的诊断和预测，进而采取相应措施，仅此一项每年可使数千万人幸免于心肌梗塞或脑血管病，因此对同型半胱氨酸的提前诊断和预测就具有极其重要的意义。
现在国内外有多种同型半胱氨酸(Hcy)检测方法，包括HPLC(高效液相色谱)、荧光偏振法、酶联免疫吸附分析(ELISA)、裂解酶法、循环酶法等。高效液相(HPLC)方法灵敏度高，但仪器昂贵、操作非常复杂，不易于自动化操作；荧光偏振免疫检测(FPIA)方法灵敏度高，检测速度快，但价格昂贵，故短时间内不易普及；酶免疫分析法涉及到人工操作等，容易产生误差；裂解酶法具有稳定性差及使用前需要新鲜配制的缺点，在使用上具有很大不便。当前国内外流行的Hcy检测方法是Hcy循环酶法检测试剂盒。该类试剂盒因为具备高通量、自动化、快速、准确、灵敏、不涉及人为操作、能直接用于生化分析仪等优点，而受到广泛欢迎。现有技术的Hcy循环酶法检测试剂盒有两种：一种为甲基转移酶、水解酶的循环酶法；另一种为胱硫醚循环酶法。胱硫醚循环酶法易受人体内源胱硫醚干扰，而甲基转移酶、水解酶循环酶法因为不受人体内源的胱硫醚干扰，测值准确，而具有最大的市场占有率，并最为流行。但现有的甲基转移酶、水解酶循环酶法依然存在稳定性差的缺点，灵敏度也需要进一步提高。因此，本领域依然存在对稳定性强、灵敏度高的甲基转移酶、水解酶循环酶法及试剂盒的需求。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种检测样品中同型半胱氨酸含量的检测试剂，其由试剂1和试剂2组成，其中试剂1包含下述成分：还原剂，S腺苷甲硫氨酸，pH 8.0～10.0的缓冲液1，EDTA二钠盐，检测氨的试剂一部分，乳酸脱氢酶，试剂2包含下述成分：同型半胱氨酸甲基转移酶，腺苷同型半胱氨酸酶，腺苷脱氨酶(ADA)，稳定剂，pH 7.5～8.5的缓冲液2，硫酸镁，检测氨的试剂的剩余部分。
在一些实施方案中，同型半胱氨酸甲基转移酶的用量为0.5～80KU/L，优选地，1-60KU/L，更优选地，5-40KU/L，更优选地，10-30KU/L，最优选地，20KU/L，和/或腺苷同型半胱氨酸酶的用量为0.5～50KU/L，优选地，1-40KU/L，更优选地，10-30KU/L，最优选地，20KU/L，和/或ADA的用量为0.1～150KU/L，优选地，0.5～100KU/L，更优选地，1～50KU/L，更优选地，2～20KU/L，最优选地，5KU/L，和/或乳酸脱氢酶的用量为0.5～20KU/L，优选地，1～10KU/L，更优选地，1～5KU/L，最优选地，2KU/L，并且其中，腺苷同型半胱氨酸酶的用量大于同型半胱氨酸甲基转移酶的用量，且ADA的用量相对于反应体系是过量的。
在一些实施方案中，S腺苷甲硫氨酸为商业可获得的产品或利用ATP、蛋氨酸、蛋氨酸转腺苷酶的循环酶反应生成，其中ATP和蛋氨酸位于试剂1，蛋氨酸转腺苷酶位于试剂2；优选地，ATP的浓度为0.5mM～80mM，更优选地，1～60mM，更优选地，5-30mM，更优选地，8-15mM，最优选地，10mM；优选地，蛋氨酸的浓度为0.5～80mM，更优选地，1～40mM，更优选地，2-20mM，更优选地，3-10mM，最优选地，5mM；优选地，蛋氨酸转腺苷酶的用量为0.1～100KU/L，更优选地，1～50KU/L，更优选地，2～30KU/L，更优选地，3～10KU/L，最优选地，5KU/L，并且其中，ATP大于蛋氨酸的量，优选地，蛋氨酸转腺苷酶的用量大于同型半胱氨酸甲基转移酶的用量。
在一些实施方案中，还原剂是含硫还原剂或三-(羧乙基)磷化氢盐酸盐(TCEP)，优选地，含硫还原剂为二硫苏糖醇(DTT)或巯基乙醇，优选地，DTT的浓度为1.0～9mM，更优选地，1.2～7mM，更优选地，1.5～3mM，最优选地，1.5mM。
在一些实施方案中，试剂1中检测氨的试剂一部分为还原型辅酶和α-酮戊二酸，优选地，还原型辅酶选自NADH、NADPH、thio-NADH、thio-NADPH，更优选地，还原型辅酶为NADH，试剂2中检测氨的试剂的剩余部分为谷氨酸脱氢酶，优选地，还原型辅酶的浓度为0.3～0.6mM，更优选地，0.4～0.5mM，最优选地，0.4mM；优选地，α-酮戊二酸的浓度为l～20mM，优选地，2～15mM，更优选地，5～10mM，最优选地，8mM；优选地，谷氨酸脱氢酶的用量为l～50KU/L，优选地，5-40KU/L，更优选地，10-30KU/L，最优选地，25KU/L。
在一些实施方案中，试剂2的稳定剂选自非离子型表面活性剂物质、醇类物质、糖类物质、盐类物质、氨基酸和蛋白质类物质，优选地，试剂2的稳定剂选自甘油、海藻糖、甘露醇、BSA，更优选地，试剂2的稳定剂是甘油，优选地，甘油的浓度为25％～45％，更优选地，28％～35％，最优选地，30％。
在一些实施方案中，缓冲液1和缓冲液2独立地选自Tris缓冲液、PBS缓冲液、碳酸盐缓冲液，优选地，缓冲液1和缓冲液2的浓度为5～500mM，优选地，10～200mM，更优选地，20～100mM，更优选地，30～80mM；优选地，缓冲液1和缓冲液2均为50mM的Tris缓冲液且其中缓冲液1的pH为9.0，缓冲液2的pH为8.0。
在一些实施方案中，EDTA二钠盐的浓度为0.05～15mM，优选地，0.1～5mM，更优选地，0.15～1mM，最优选地，0.2mM，和/或硫酸镁的浓度为0.5～80mM，优选地，1～50mM，更优选地，5-30mM，最优选地，10mM。
在一些实施方案中，试剂1和涉及2的比例为10:1～1:10，优选地，5:1～1:1，更优选地，4:1，最优选地，3.75:1。
在一些实施方案中，样品选自体液或生物组织，优选地，所述体液选自尿，血液，血浆，血清，唾液，精液，粪便，痰液，脑脊髓液，泪液，粘液，和羊膜液，更优选地，所述体液是血液，更优选地，所述血液样品被进一步分成血浆或血清级分。
在一个实施方案中，试剂1和试剂2的组成如下：
试剂1：(R1:R2＝3.75:1)
试剂组份 试剂盒每升用量
Tris缓冲液，pH9.0，25℃ 50mM
EDTA.2Na 0.2mM
还原型辅酶NADH 0.4mM
DTT 2.5mM
ATP 10mM
蛋氨酸 5mM
α-酮戊二酸 8mM
乳酸脱氢酶 2KU/L
试剂2：(R1:R2＝3.75:1)
试剂组份 试剂盒每升用量
Tris缓冲液，pH8.0，25℃ 50mM
甘油 30％(v/v)
MgSO4 10mM
AdoHcyase 20KU/L
ADA 5KU/L
蛋氨酸转腺苷酶 30KU/L
谷氨酸脱氢酶 25KU/L
同型半胱氨酸甲基转移酶 20KU/L
。
本发明的第二方面涉及一种检测样品中同型半胱氨酸含量的检测方法，其包括步骤：1)将如上所述的检测试剂的试剂1与样品接触，使样品中的氧化型同型半胱氨酸还原为游离的同型半胱氨酸，2)向步骤1)的混合物中加入如上所述的检测试剂的试剂2，使充分反应，3)测定腺苷的生成速率，从而获得样品中同型半胱氨酸的含量。
在一些实施方案中，样品选自体液或生物组织，优选地，所述体液选自尿，血液，血浆，血清，唾液，精液，粪便，痰液，脑脊髓液，泪液，粘液，和羊膜液，更优选地，所述体液是血液，更优选地，所述血液样品被进一步分成血浆或血清级分。
在一些实施方案中，检测腺苷生成速率的方法为速率法或终点法。
本发明的第三方面涉及一种试剂盒，其包括如上所述所述的检测样品中同型半胱氨酸含量的检测试剂以及使用说明。
换言之，本发明提供了一种改进的采用循环增量技术的同型半胱氨酸(Hcy)酶学测定试剂及其使用方法，用于测定样本如体液中同型半胱氨酸的含量。该循环增量测定系统主要由同型半胱氨酸甲基转移酶(Homocysteine methltransferase，HMT)和S腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase，SAHH，也称为S腺苷同型半胱氨酸酶)组成。样本如体液中的氧化型同型半胱氨酸经还原剂还原后，在同型半胱氨酸甲基转移酶的催化作用下，与S腺苷甲硫氨酸(SAM)反应，生成S-腺苷同型半胱氨酸和甲硫氨酸(在本申请中也称为蛋氨酸)。S腺苷同型半胱氨酸在S腺苷同型半胱氨酸水解酶作用下水解为同型半胱氨酸和腺苷(见图1)。因此，样本中的同型半胱氨酸反复循环反应，不断产生腺苷，腺苷的生成速率与样本中同型半胱氨酸的含量成正比，通过测定腺苷的生成速率，就可以达到测定体液样本中同型半胱氨酸含量的目的。
可以通过本领域已知的任何适当方法如免疫学方法或酶促方法来评估腺苷(Ado)。可以直接或间接评估Ado。例如，可以通过腺苷转化酶评估腺苷转化的共底物或反应产物来间接评估Ado。在一些实施方案中，腺苷转化酶是腺苷激酶，反应产物是腺苷5'-磷酸。在其它实施方案中，腺苷转化酶是腺苷脱氨酶并且反应产物是氨和次黄嘌呤核苷。
腺苷的测定方法很多，在此仅列举两种常见的测定腺苷的辅助酶系统：(l)腺苷在腺苷脱氨酶的作用下生成氨和次黄嘌呤核苷，后者经嘌呤核苷磷酸化酶作用，与磷酸反应生成次黄嘌呤，在黄嘌呤氧化酶的作用下，次黄嘌呤被最终氧化为尿酸，并产生过氧化物氢，经与生色化合物反应，测定生成的色素；或者(2)采用各种测定氨的方法，氨与α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的作用下，产生L-谷氨酸，同时辅酶NADH或NADPH被氧化为NAD+或NADP+，反应系统在340nm处的吸光度值下降。由于样本中的同型半胱氨酸反复循环参与反应，不断产生腺苷，故大大提高了测定的灵敏度。
本发明可以使用任何适当形式的SAM。例如，将SAM直接加入样品。或者，通过另外的反应生产SAM，例如通过SAM合成酶由ATP和Met生产SAM。
本发明的方法可以用于测定任何样品中的同型半胱氨酸，所述样品包括但不限于体液或生物组织。所述体液可以选自由下列各项组成的组：尿、血液、血浆、血清、唾液、精液、粪便、痰液、脑脊髓液、泪液、粘液和羊膜液。在一些实施方案中，所述体液是血液。在一些实施方案中，所述血液样品被进一步分成血浆或血清级分。
在一些实施方案中，在所述样品与SAM和同型半胱氨酸甲基转移酶接触之前或同时，将样品中氧化的或偶联的Hcy转化为还原型Hcy。在一些实施方案中，将样品进行适当量的二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)一膦盐酸盐(TCEP)或其它还原剂的处理，以在样品中生成游离的同型半胱氨酸。
本发明还提供一种测定样品中Hcy的试剂盒，该试剂盒包含如上所述的测定试剂及实施本文所述方法的使用说明。试剂盒可以任选地包括另外的组分如缓冲剂。
本文所述的测定可以用于任何适当的目的，例如预后、诊断、药物筛选或治疗监视目的。测定可以容易地自动化。另外，测定可以适用于护理系统点(point of care system)和家庭检测试剂盒。例如，可以调整护理系统的血液检测点以使用本文提供的方法测量高半胱氨酸水平。家庭检测试剂盒还可以适用于与本文提供的方法使用。
本发明的试剂盒在研发的过程中用到了稳定剂来增加试剂盒的稳定性。评价的试剂盒的稳定性包括生化试剂盒领域常用的加速稳定性、开盖稳定性以及长期存放的稳定性等等。所述的稳定剂包括但不限于生化试剂领域常用的稳定剂及这些稳定剂之间的任意组合，例如非离子型表面活性剂物质、醇类物质、糖类物质、盐类物质，甚至是氨基酸和蛋白类物质。在一些实施例中，用海藻糖、甘露醇、BSA等物质作为稳定剂。
本方法通过试剂成分的调换，浓度的改变，甚至缓冲液及相应pH的改变，还有稳定剂的添加，在试剂盒的实际研发中取得了意想不到的效果。例如，通过将还原型辅酶置于首先使用的试剂1中，让使用者在临床检测前期即可根据吸光度判断试剂盒是否已经失效，从而避免错误的诊断结果；本发明的具体研究表明，试剂盒中还原型辅酶的浓度对反应具有重要的影响，介于0.3～0.6mM的还原型辅酶如NADH可以实现本发明的技术目的，而0.4～0.5mM的还原型辅酶如NADH可以更好地实现本发明的技术目的；还原剂的浓度对试剂盒的稳定性起到了重要的作用，低浓度例如低于0.2mM的还原剂由于容易被氧化而失去还原能力，导致检测试剂的反应性很弱而难以检测同型半胱氨酸；本发明的实施例表明，适当浓度的稳定剂的加入可以大大增强试剂盒的稳定性，例如将稳定剂如30％的甘油加入含有主要的反应酶的试剂2中时，试剂盒的稳定性大大增强，而低于20％的甘油将起不到稳定剂的功效；本申请的研究表明，测定试剂中活性成分在试剂1和试剂2中的不同分布会对测定试剂的使用效果如稳定性产生极大的影响，例如将HMT、ADA和MAT都置于试剂1时，这些酶将会很快变性、失活、沉淀，而将其至于试剂2时，稳定性则大大增强，同时，试剂的pH也会影响试剂中酶的稳定性，偏碱性的pH更有利于本申请试剂盒的稳定性。本申请的测定试剂相对于现有技术的测定试剂的改进不限于上述特意列出的方面。实际上，本申请的测定试剂是经过大量的研究后才最终获得的，现有的组成综合体现了所述测定试剂的优良效果。这些效果不能由现有配方简单地推导而来，而只有通过具体的研究，经过大量的尝试才能最终获得。
本领域技术人员知晓，作为具有临床检测和诊断意义的试剂盒，其试剂组分的调换、浓度的改变，甚至缓冲液及相应pH的改变，都会使得试剂盒的性能发生改变，而这些改变并不能由现有配方简单地推导而来，而是要经过大量的尝试才能得到理想的配方。例如，不同NADH浓度对本发明反应的影响是截然不同的，需要通过试验确定一个合适的终浓度才可以使得该试剂具有实际的使用意义，而非在非常宽泛的范围内选任意一个浓度即可完成反应。具体而言，在Hcy检测试剂盒的反应体系中终浓度0.4mM的NADH是一个理想的浓度，偏离该浓度过高过低都会使得该试剂盒的实际应用受到限制，本发明的数据表明，在0.3-0.6mM范围内的NADH都能实现本发明的技术目的，且0.4-0.5mM范围的NADH能更好地实现本发明的技术目的；而且在具有先后顺序的试剂盒中，NADH最好放在首先使用的试剂1中，因为这样医生在临床检测时会在第一时间根据吸光度(行业内要求OD340高于0.8)判断试剂盒是否失效，而放在R2中则不利于及时进行这一判断。再如，还原剂作为启动试剂盒反应的第一步，将样本中的氧化的Hcy还原成为游离型的Hcy后才能启动后续的反应，否则试剂盒的灵敏度将很低，尤其是低浓度的Hcy将有可能难以被检测到。在本发明的试剂盒研发的过程中，发现还原剂的浓度起着至关重要的作用，低浓度的还原剂将不能忍受37℃加速破坏试验而丧失还原能力，导致反应性很弱而难以检测到Hcy的浓度，具体而言就是DTT的浓度在1.5mM及以上是一个比较合适的浓度，DTT浓度太低如低于0.2mM则加速后丧失还原性，浓度太高则在一定程度上造成试剂的浪费。其它如试剂成分的不同位置、不同的pH值、不同的稳定剂都会对检测试剂的检测效果产生预想不到的影响。
本发明的测试试剂特异性和灵敏度高、稳定性强，能够对体液中含量极低的同型半胱氨酸进行自动化检测。
附图说明
图1：显示了本发明试剂盒的测定原理。。
具体实施方式
本发明的方法学原理为，样本中的氧化型同型半胱氨酸(Hcy)经还原剂还原后，在同型半胱氨酸转甲基酶(HcyMetase，HMT)的催化作用下，与S-腺苷-L-蛋氨酸(AdoMet，SAM)反应，生成S-腺苷-L-同型半胱氨酸(AdoHcy)和L-蛋氨酸(Met)。S-腺苷-L-同型半胱氨酸在腺苷同型半胱氨酸酶(AdoHcyase，SAHH)的作用下水解为L-同型半胱氨酸和腺苷(Ado)。反应生成的蛋氨酸与试剂中的三磷酸腺苷(ATP)在蛋氨酸转腺苷酶(MAT)的作用下生成S-腺苷-L-蛋氨酸(AdoMet，SAM)。样本中的L-同型半胱氨酸反复循环反应，不断产生腺苷，腺苷的生成速率与样本中同型半胱氨酸的含量成正比，通过测定腺苷的生成速率，就可以达到测定体液样本中同型半胱氨酸含量的目的。
大部分同型半胱氨酸在血中都以氧化型存在，其中80-90％与蛋白结合，5-10％与同型半胱氨酸自身结合，另外5-10％与半胱氨酸等结合形成混合型同型半胱氨酸二硫化物；还原型仅占约1％。测定血中总同型半胱氨酸含量时，普遍采用还原剂还原其结合的二硫键，使其以游离的还原型同型半胱氨酸形式存在。常用的化学还原剂有二硫苏糖醇(DTT)、三-(羧乙基)磷化氢盐酸盐(TCEP)等。还原剂的用量不宜过大，以免干扰测定反应，如DTT的用量最好小于10mM。
S-腺苷甲硫氨酸作为酶循环反应的起始化合物，可以采用商业成品，但由于普通商业品极不稳定，本发明中采用辅助酶系统生成，即由甲硫氨酸和ATP在SAM合成酶的作用下生成S-腺苷-L-甲硫氨酸，引入这一辅助酶系统的另一个优点是可以在主循环反应中进一步促进理想的反应方向，并可降低甲硫氨酸的试剂用量。这一辅助酶系统在测定方法学中并不是必需的，只要能够提供稳定的S-腺苷-L-甲硫氨酸用于循环测定，任何酶系统或其它方法都是可行的。
本发明创建了由同型半胱氨酸甲基转移酶和S腺苷同型半胱氨酸水解酶组成的酶循环反应系统，并应用于同型半胱氨酸的测定。基于酶法循环增量测定的特点，循环反应系统的酶使用量要求不高，最终反应浓度一般在0.2～100KU/L之间，最好在0.5～40KU/L之间。当然，增加酶的用量并不影响本发明方法的应用，但会增加试剂的制造成本。优化酶和底物应用量可以促进循环反应向理想的方向进行，在循环机制中ATP应过量，并大于甲硫氨酸的用量，可用范围一般在0.5～80mM/L之间，最好在1～60mM/L范围之内。腺苷同型半胱氨酸水解酶(又称为腺苷同型半胱氨酸酶)的用量应大于同型半胱氨酸甲基转移酶的用量，SAM合成酶(又名三磷酸腺苷：L-甲硫氨酸S-腺苷转移酶，ATP：L-methionine S-adenosyltranferase，EC2.5.1.6，或简称为蛋氨酸转腺苷酶)的用量最好大于同型半胱氨酸甲基转移酶的用量，此外，腺苷脱氨酶应过量。
利用本发明的酶循环方法，可以按照普通酶学诊断技术制备出各种同型半胱氨酸的诊断试剂。在本发明的一个实施例中，采用测定氨的一种酶学方法。循环系统产生的腺苷在腺苷脱氨酶的作用下产生氨，在谷氨酸脱氢酶辅助测定系统的进一步作用下，还原型辅酶(如：NADH、NADPH、thio-NADH、thio-NADPH等)被氧化为氧化型辅酶，通过监测340nm处光吸收值下降的速率，可以计算出样本中同型半胱氨酸的含量。还原型辅酶的用量一般在0.1～8mM，最好在0.2～6mM。
采用本发明循环机制配制的同型半胱氨酸测定试剂中应当包含缓沖液，如：磷酸盐缓沖液、N(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙基磺酸)(HEPES)缓冲液等，金属离子，如镁离子等反应必需成分，还可含有表面活性剂、络合剂(如：EDTA)和防腐剂等化合物。值得注意的是，镁离子与螯合剂如EDTA二钠盐应分别位于试剂1和试剂2中，以避免二者提前发生化学反应，产生沉淀，影响所述检测试剂的检测效果。
上述试剂的测定方法与本领域中常规的应用方法相同，如：可以采用速率法或终点法，通过参照校准品或绘制标准浓度曲线等，计算出被测物的含量，在此不再赘述。本专业技术人员可以根据本发明的原理和方法配制出各种类似的测定试剂，但并不脱离出本发明的原理和应用范围。
本发明现通过实施例的方式进行说明。这些实施例旨在进行解释，而不旨在限制所附的权利要求。本发明实施例中所使用的试剂如无特殊说明，均可自商业途径获得。
实施例
实施例1：组分调换及浓度变化对试剂盒的影响
作为具有临床检测和诊断意义的试剂盒，其试剂组分的调换、浓度的改变，甚至缓冲液及相应pH的改变，都会使得试剂盒的性能发生改变，而这些改变并不能由现有配方简单地推导而来，而是要经过大量的尝试才能得到理想的配方。下述内容为本发明试剂盒研发过程中涉及的几组实例，其验证了组分调换、浓度变化等因素对试剂盒功效、稳定性等的影响。
首先，现有技术中公开的试剂盒1的配方如下：
试剂1(R1：R2＝3:1)
试剂组分 终浓度
Good's缓冲液 15mM
NAD(P)H 5mM
GLDH 2KU/L
BSA 1.2g/L
TCEP 0.2mM
ATP 10mM
α-酮戊二酸 30mM
甲硫氨酸 5mM
SAM合酶 10KU/L
腺苷脱氨酶 50KU/L
高半胱氨酸甲基转移酶 20KU/L
Zncl2 10mM
试剂2(R1：R2＝3:1)
化学试剂4 浓度
磷酸钠 15mM
BSA 1.2g/L
SAH水解酶 10KU/L
现有技术中公开的试剂盒2的配方如下：
试剂1：(R1:R2＝4:1)
试剂组份 试剂盒每升用量
磷酸盐缓冲液，pH6.5,37℃ 150mM(即，mmol)
EDTA.2Na 0.5mM
MgSO4 15mM
DTT 1.5mM
ATP 80mM
ADA 3KU/L
AdoHcyase 10KU/L
牛血清白蛋白 0.2％
α-酮戊二酸 7.5mM
蛋氨酸转腺苷酶 15KU/L
谷氨酸脱氢酶 5KU/L
同型半胱氨酸甲基转移酶 5KU/L
试剂2：(R1:R2＝4:1)
试剂组份 试剂盒每升用量
HEPES缓冲液,-pH8.3,25℃ 50mM
EDTA.2Na 0.5mM
MgSO4 15mM
蛋氨酸 10mM
甘露糖醇 20mM
还原型辅酶NADH 0.8mM
乳酸脱氢酶 2KU/L
在研发本发明的试剂盒时，本发明人首先测试了上述两种现有技术的试剂盒的检测效果，发现其在实际应用时均存在稳定差、灵敏度不高等缺点，很难用于实际的临床检测目的。为了获得能实际应用于临床检测的试剂盒，本发明人验证了如下因素对试剂盒稳定性及检测效果的影响。
1、NADH浓度以及位置的影响
作为试剂盒检测的色源物质，NADH浓度及位置的选择会对试剂的性能产生非常重要的影响。在临床应用时，检验科医生会首先根据试剂盒的本底吸光度对试剂盒的质量进行判断。以Hcy的检测试剂盒为例，其反应过程是一个吸光度下降的反应，如果试剂盒本身的吸光度低于某个值(行业内以OD340＝0.8作为下限)基本说明该试剂盒接近失效，因此，用其测出的血清样本的Hcy的含量极有可能是不准确的；同时，如果试剂的本底吸光度过高，超出生化仪仪器本身正常的吸光度检测范围，就会导致在现有的机器上难于检测到其变化。具体情况如下表所列：
表1：不同浓度的NADH在R1中时对试剂检测的影响
备注1：吸光度一栏是生化分析仪上自动处理后给出的读值，是常规吸光度值精确到小数点后4位，然后乘以10000来得到的值，例如：48909，即由4.8909×10000而得到(下同)；
备注2：吸光度变化一栏的理解同备注1一样，例如：-215，即由0.0215×10000而得到，负号表示是吸光度减少的反应(下同)。
表2：不同浓度的NADH在R2中对试剂检测的影响
由表1、表2可以得知：不同NADH浓度对反应的影响是截然不同的，需要通过试验确定一个合适的终浓度才可以使得该试剂具有实际的使用意义，而非在非常宽泛的范围内选任意一个浓度即可完成反应。具体而言，在Hcy检测试剂盒的反应体系中终浓度0.4mM的NADH是一个理想的浓度，偏离该浓度过高过低都会使得该试剂盒的实际应用受到限制，本发明的数据表明，在0.3-0.6mM范围内的NADH都能实现本发明的技术目的，且0.4-0.5mM范围的NADH能更好地实现本发明的技术目的；而且在具有先后顺序的试剂盒中，NADH最好放在首先使用的试剂1中，因为这样医生在临床检测时会在第一时间根据吸光度(行业内要求OD340高于0.8)判断试剂盒是否失效，而放在R2中则不利于及时进行这一判断。
2、还原剂浓度对试剂盒的影响
还原剂作为启动试剂盒反应的第一步，将样本中的氧化的Hcy还原成为游离型的Hcy后才能启动后续的反应，否则试剂盒的灵敏度将很低，尤其是低浓度的Hcy将有可能难以被检测到。在本发明的试剂盒研发的过程中，发现还原剂的浓度起着至关重要的作用，低浓度的还原剂将不能忍受37℃加速破坏试验而丧失还原能力，导致反应性很弱而难以检测到Hcy的浓度。具体情况如下：
表3：试剂1中不同浓度的DTT在加速破坏试验中对试剂盒的影响
由表3可以明显看出低浓度的DTT在加速后基本丧失反应，具体而言就是DTT的浓度在1.5mM及以上是一个比较合适的浓度，DTT浓度太低如低于0.2mM则加速后丧失还原性，浓度太高则在一定程度上造成试剂的浪费。
3、不同浓度的稳定剂对试剂盒的影响
作为试剂盒的一个重要性能指标，稳定性对试剂盒的长期存放意义重大，其直接关系到试剂盒货架时间的长短。一个能长期稳定保存的试剂盒无疑会受到医生的青睐，不用因为过期而频繁更换批次，大大减少由此带来的试剂盒批间的差异。通常，在研发试剂盒时都会重点考察这一指标，尤其是在临床生化诊断领域，会去筛选不同的稳定剂，不同的试剂盒由于其成分组成不同，所需要的稳定剂也大不相同，需要大量的验证，而非简单地将现有技术中使用的某类稳定剂应用于本发明的试剂盒就能达到理想的效果。下例是本发明试剂盒研发过程中的一个实例：
表4：试剂2中不同浓度的甘油对本发明试剂盒稳定性的影响
由表4可以看出试剂2中不同浓度的甘油会对试剂盒的稳定性产生了明显不一样的稳定效果。具体而言，在本例中30％的甘油是最合适的浓度，过高或过低稳定效果皆不如30％效果好，经本发明的具体验证，浓度低于20％的甘油将不能很好的实现稳定本发明试剂盒的目的。同时，高于50％的甘油虽然也还能实现稳定剂的功效，但由于粘度的增加，将不利于试剂的制备(给出能实现本发明实验目的的最高可用浓度)。同时，由于测定试剂的主要酶都位于试剂2中，当将稳定剂如甘油加入试剂1时，试剂盒的稳定性并未得到实质性的提高。请注意，该例只是为了说明稳定剂会对试剂盒的稳定性产生明显的稳定效果，并非表明其是该试剂盒的最优稳定剂。本发明在研发过程中得到了多种效果良好的稳定剂，在此不再赘述。
4、pH值以及组分位置对试剂盒的影响
在本发明之前发表的几个专利中，均提到了把HMT、ADA、MAT等酶放在试剂1中，如上述现有技术中公开的试剂盒1和2。然而，本发明试剂盒的研发过程中的尝试表明，这些酶的添加实际上所取得的效果非常有限。下面仅举一例说明事实。
以下为本发明试剂盒研发过程曾尝试的一个具体实例。
试剂1：(R1：R2＝375:1)
试剂2：(R1：R2＝375:1)
试剂组分 试剂盒每升用量
Tris缓冲液,-pH8.0,25℃ 50mM
MgSO4 10mM
AdoHcyase 20KU/L
谷氨酸脱氢酶 25KU/L
下述表5为上述试剂盒的测试结果。
表5：pH值以及组分位置对试剂盒的影响
由表5可以明显地看出，pH6.51和pH7.03下加速后明显的蛋白沉淀，pH8.30和pH9.05下虽没有沉淀产生但加速后的反应极低，说明主要的一种酶或多种酶的活性已经丧失活性，而在本发明的试剂盒(如下所示)中，正常情况下放在R2中的酶的活性稳定性要远远好于放在R1中，由此可见pH值以及组分、位置对试剂盒的影响是非常明显的，需要精心设计并实验验证才可定下而不能随意放置，否则试剂盒的稳定性会大打折扣。
实施例2本发明的试剂盒1的组成及使用方法
经过上述实施例1中的多种尝试，本发明通过将部分活性酶调整到试剂2中，在试剂2中添加不同的稳定剂，调整试剂1和2的pH，调整还原型辅酶的含量和位置，调整还原剂的位置和浓度，获得了本发明的试剂盒。
以下为本发明试剂盒的一个具体实例，称为试剂盒1，该试剂盒同样采用由同型半胱氨酸甲基转移酶和腺苷同型半胱氨酸水解酶组成的酶循环反应，通过利用检测氨的方法，测定固定时间段内还原型辅酶被氧化的速率来定量样品中的Hcy含量。
试剂1：(R1:R2＝3.75:1)
试剂组份 试剂盒每升用量
Tris缓冲液，pH9.0,25℃ 50mM(即，mmol)
EDTA.2Na 0.2mM
还原型辅酶NADH 0.4mM
DTT 2.5mM
ATP 10mM
蛋氨酸 5mM
α-酮戊二酸 8mM
乳酸脱氢酶 2KU/L
试剂2：(R1:R2＝3.75:1)
试剂组份 试剂盒每升用量
Tris缓冲液,-pH8.0,25℃ 50mM
甘油 30％(v/v)
MgSO4 10mM
AdoHcyase 20KU/L
ADA 5KU/L
蛋氨酸转腺苷酶 30KU/L
谷氨酸脱氢酶 25KU/L
同型半胱氨酸甲基转移酶 20KU/L
其中，试剂盒1试剂1配方用于还原氧化型同型半胱氨酸，试剂2与试剂1组合成完整的酶循环测定试剂。测定样本时，采用固定时间法，试剂与样本的比例没有固定要求，但同一测定批次内应一致。如试剂l:样本:试剂2为240:13:65，温度37℃，测定波长340nm，试剂1加样本或校准品后在测定温度孵育300秒，然后加入试剂2，延迟60～120秒，排除样本中氨和丙酮酸的干扰，以及其它S-腺苷-L-蛋氨酸和S-腺苷-L-同型半胱氨酸的副反应，测定时间180秒，读数在测定时间内选择至少2个有效点。
实施例3：本发明试剂盒1的性能测定
目的：评估试剂盒的精密度、准确度、可报告范围、灵敏度、参考可见区间的合适范围，测试其是否可满足临床检验及科研的要求，不对临床引入造成明显偏倚。
方法：采用日立7020全自动生化分析仪，对试剂盒1的下述性能指标进行验证试验。
结论：各项性能指标验证试验结果均满足临床检验及科研的要求。
1试验材料
1.1仪器和试剂
1.1.1仪器：日立7020全自动生化分析仪
1.2试剂：北京爱必信批号：20130831
1.3试剂盒的各项性能指标要求：
1.3.1测定范围：在3～50μmol/L内，r≥0.990。
1.3.2精密性：批内精密性(CV)≤7.0％
批间相对极差≤10.0％
1.3.3试剂空白：光径1cm时，吸光度不小于1.500。
1.3.4长期稳定性：测定质控，观察质控变化趋势，试剂空白应不低于1.500，波动极差应不超过10％。
1.3.5开盖稳定性：开盖稳定性测定30天，试剂空白应不低于1.500，波动极差应不超过10％。
2试验方法
氧化型HCY转化为游离型HCY，游离型HCY与共价底物S-腺苷甲硫氨酸(SAM)在同型半胱氨酸转甲基酶(HMTase)催化下反应生成蛋氨酸(MET)和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)。SAH被SAH水解酶(SAHase)水解成腺苷(Adenosine)和HCY，形成的HCY循环加入反应，从而放大了检测信号，生成的腺苷(Ado)立即水解为次黄嘌呤(Inosine)和氨，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下使NADH转化为NAD+，样本中的HCY的浓度与NADH的变化成正比。
操作基本参数
波长 340nm
反应类型 速率法
反应方向 吸光度下降的反应
比色杯光径 1cm
操作步骤
结果计算：
多点定标拟合曲线，以标本管△A/分计算HCY含量。
2.1试剂空白吸光度
2.1.1试验方法：如用7020全自动生化分析仪测定，参数设置：波长340nm，温37℃。
分别精确吸取13μl纯化水、240μl R1加入比色杯中，温育100～300秒，再加入65μlR2，温育150秒后，测量吸光度值A，测定结果应符合以纯化水为标本时，试剂空白的吸光度值(1cm光径)A≥1.500Abs。
2.1.2试验数据：试剂空白吸光度：2.069Abs
2.2精密度
2.2.1试验方法
同一批试剂对同一标本进行10次平行检测，分别测高、低值两个标本，计算标本测定结果平均值，根据下列公式计算变异系数：
CV ( % ) = Σ ( Xi - X ‾ ) 2 / ( n - 1 ) X ‾ × 100 % - - - ( 1 )
式中：
Xi—试剂测定标本结果的值；
—n次试剂测定结果的平均值；
i—1，2，3，……，n；
n—重复测定次数。
同一批试剂分别同时测定高低值两个标本，变异系数(CV)均不大于7.0％
2.2.2试验数据
批内精密度原始数据见表6
表6批内精密度原始数据
2.3线性范围：
2.3.1试验方法
用高值标本进行系列稀释，配制5个不同浓度的标本(浓度在3umol/L～50umol/L范围内)，对各浓度梯度进行3次平行检测，计算测定结果的平均值，根据下列公式计算相关系数：
r = nΣ X i Y i - Σ X i · Σ Y i [ nΣ X i 2 - ( Σ X i ) 2 ] · [ nΣ Y i 2 - ( Σ Y i ) 2 ] . . . ( 2 )
式中：
Xi——测定管溶液浓度的测定值的平均值；
Yi——与测定管溶液浓度相对应的稀释比例；
i——1，2，3，……，n；
n——测定标本数。
线性回归方程的线性相关系数r应不低于0.9900。
2.3.2试验数据
原始数据见表7
表7线性范围原始数据
线性范围试验结果表明在3～50umol/L范围内；相关系数r＝0.9999，符合要求。2.4长期稳定性试验(见表8)
表8长期稳定性数据
日期 9.45点 48.5点
20131203 9.82/9.62 47.87/48.72
20140106 9.74/9.65 47.60/48.45
20140209 9.47/9.56 47.54/47.98
20140308 9.45/9.55 47.44/47.12
20140408 9.37/9.44 47.36/47.01
20140510 9.34/9.41 47.00/47.10
20140615 9.29/9.30 46.56/46.88
20140720 9.20/9.22 46.89/46.98
20140831 9.16/9.21 45.50/45.48
20140926 9.13/9.11 45.41/45.12
该试剂批号为20130831，长期稳定性观察的13个月来看，试剂稳定，未出现底物明显降解到不可接受的范围的情况(即吸光度＜0.8)，试剂空白在2014年9月26日测定结果为：1.270，长期稳定性数据正常。测定结果波动极差未超过10％。
同时，本申请以市场上常见的Hcy检测试剂作为对照实验(生产日期：20131129)，进行比对，结果如下：
表9对照试剂长期稳定性数据
检测日期 13.97点 32.20点
20131203 13.82/14.01 32.18/31.72
20140106 13.74/13.85 31.40/31.55
20140209 13.57/13.46 31.04/30.98
20140308 13.35/13.21 30.54/30.62
20140408 13.17/13.24 29.86/29.46
20140510 12.85/12.80 29.45/29.20
20140615 12.46/12.55 28.98/28.88
20140720 12.38/12.30 28.49/28.58
20140831 12.26/12.21 28.10/27.98
20140926 12.13/12.11 27.85/27.90
2.5开盖稳定性试验
表10开盖稳定性数据
日期 9.45点 48.5点
20131203 9.22/9.62 50.38/51.17
20131206 8.83/9.2 51.79/48.72
20131209 9.32/9.44 53.35/52.98
20131212 9.67/9.42 53.49/56.66
20131216 9.66/9.49 50.09/50.11
20131219 9.02/9.06 54.02/53.45
20131223 9.8/9.85 54.31/54.42
20131226 9.39/9.82 55.32/53.84
20131229 9.96/9.51 52.51/51.25
20140102 9.67/10.14 53.11/51.91
平均值 9.50 52.74
极差 9.36％ 8.48％
2014.1.2试剂空白：2.126
测定结果显示30天开盖稳定性结果正常。
同时，本申请以市场上常见的Hcy检测试剂作为对照实验(生产日期：20131129)，进行比对，结果如下：
表11：对照试剂开盖稳定性数据
日期 12.36点 31.82点
20131203 12.34/12.38 31.85/31.79
20131206 12.81/12.83 32.41/32.46
20131209 12.94/12.95 33.35/33.48
20131212 13.28/13.30 33.94/33.96
20131216 13.46/13.49 34.67/34.72
20131219 13.61/13.65 34.99/34.95
20131223 13.83/13.84 35.41/35.42
20131226 13.97/13.93 35.82/35.84
20131229 14.26/14.29 36.41/36.25
20140102 14.49/14.46. 36.75/36.77
平均值 13.51 34.56
极差 16％ 14％
2.6加速稳定性破坏试验
表12：加速稳定性数据
表13：对照试剂加速稳定性数据
3试验结果
3.1线性范围：在3～50μmol/L内，r≥0.990。
3.2精密性：批内精密性(CV)≤7.0％
3.3试剂空白：光径1cm时，吸光度不小于1.500。
3.4长期稳定性：试剂空白在可接受的范围之内(＞0.8)，长期稳定性明显优于对照试剂。
3.5开盖稳定性：试剂空白在可接受的范围之内(＞0.8)，开盖测定结果极差未超过10％，对照试剂则明显超过了10％。
3.6加速稳定性：试剂在37℃加速7天后检测，其引起的每分钟吸光度的变化可保留80％左右的反应性，对照试剂则只保留了45％-55％左右的反应性。
4结论
验证试验结果表明同型半胱氨酸测定试剂盒(循环酶法)的试剂空白吸光度、精密度、线性范围等在合理的范围之内。
与现有技术的试剂相比，本申请的试剂盒在主要性能上均可达到甚至超过其效果，同时，本申请的试剂盒在前者的基础上进行了重要改进，更适合实际应用，同时大幅度提高了稳定性和灵敏度。例如，本申请避免了EDTA和Mg2+的直接螯合作用，使两者在各自的组分中发挥应有的作用；调整了作为色源的NADH的保存pH值，赋予了其最切合的保存条件；将大部分起催化作用的酶类放在试剂2中，使之更有利于反应按照原理进行，很大程度上避免了非特异性的本底反应。
另外，通过大量的试验，本申请对试剂中各物质的位置进行了调整，对其浓度进行了改变和优化，同时，通过添加稳定剂等多重调整，使得试剂在开盖稳定性、长期稳定性以及加速稳定性等稳定性性能方面，均获得了实质性的突破，为该试剂盒在临床上的实际应用和产业化过程中的长期保存提供了良好的保证。
实施例4：Hcy检测试剂检测实际血清样本结果
本实施例涉及用上述试剂盒1测试下述样品的Hcy含量，结果如下表所示：
表14：试剂盒1的实际检测应用。
作为心血管疾病的独立危险因子，Hcy的含量越低越好，且成年人同型半胱氨酸量过高则属异常。通过以上数据可以看出，18-60人群100例检测结果平均值是9.87umol/L，按照95％置信限，单侧范围按照均值+1.65SD计算是15.29umol/L，和现有Hcy通用的评判基准基本在一个水平；
60岁以上老人的Hcy含量则普遍偏高，选取的100例血清样本的测值基本呈现正态分布，按照95％置信限，双侧范围按照均值±1.96SD计算，该年龄段人群的Hcy范围是14.75-20.15umo/L，比18-60岁人群的Hcy含量普遍偏高。
从以上数据可以看出，本发明的试剂盒在检测实际血清样本时测值的结果按照统计学角度来讲是符合现有评判基准的，是符合人群分布规律的，是实际可用的。
上述实施例试剂的配制方法仅用于说明本发明的原理及其应用，本发明绝不局限于上述举例的应用范围；此外，在本发明相关领域中的专业技术人员，可以根据本发明的原理和方法配制出与之类似的各种测定试剂，但并不脱离出本发明的原理和应用范围。

Claims (15)

1.一种检测样品中同型半胱氨酸含量的检测试剂，其由试剂1和试剂2组成，其中试剂1包含下述成分：还原剂，S腺苷甲硫氨酸，pH 8.0～10.0的缓冲液1，EDTA二钠盐，检测氨的试剂一部分，乳酸脱氢酶，试剂2包含下述成分：同型半胱氨酸甲基转移酶，腺苷同型半胱氨酸酶，腺苷脱氨酶(ADA)，稳定剂，pH 7.5～8.5的缓冲液2，硫酸镁，检测氨的试剂的剩余部分。
2.根据权利要求1所述的检测样品中同型半胱氨酸含量的检测试剂，其中同型半胱氨酸甲基转移酶的用量为0.5～80KU/L，优选地，1-60KU/L，更优选地，5-40KU/L，更优选地，10-30KU/L，最优选地，20KU/L，和/或腺苷同型半胱氨酸酶的用量为0.5～50KU/L，优选地，1-40KU/L，更优选地，10-30KU/L，最优选地，20KU/L，和/或ADA的用量为0.1～150KU/L，优选地，0.5～100KU/L，更优选地，1～50KU/L，更优选地，2～20KU/L，最优选地，5KU/L，和/或乳酸脱氢酶的用量为0.5～20KU/L，优选地，1～10KU/L，更优选地，1～5KU/L，最优选地，2KU/L，并且其中，腺苷同型半胱氨酸酶的用量大于同型半胱氨酸甲基转移酶的用量，且ADA的用量相对于反应体系是过量的。
3.根据权利要求1或2所述的检测样品中同型半胱氨酸含量的检测试剂，其中S腺苷甲硫氨酸为商业可获得的产品或利用ATP、蛋氨酸、蛋氨酸转腺苷酶的循环酶反应生成，其中ATP和蛋氨酸位于试剂1，蛋氨酸转腺苷酶位于试剂2；优选地，ATP的浓度为0.5mM～80mM，更优选地，1～60mM，更优选地，5-30mM，更优选地，8-15mM，最优选地，10mM；优选地，蛋氨酸的浓度为0.5～80mM，更优选地，1～40mM，更优选地，2-20mM，更优选地，3-10mM，最优选地，5mM；优选地，蛋氨酸转腺苷酶的用量为0.1～100KU/L，更优选地，1～50KU/L，更优选地，2～30KU/L，更优选地，3～10KU/L，最优选地，5KU/L，并且其中，ATP大于蛋氨酸的量，优选地，蛋氨酸转腺苷酶的用量大于同型半胱氨酸甲基转移酶的用量。
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测样品中同型半胱氨酸含量的检测试剂，其中还原剂是含硫还原剂或三-(羧乙基)磷化氢盐酸盐(TCEP)，优选地，含硫还原剂为二硫苏糖醇(DTT)或巯基乙醇，优选地，DTT的浓度为1.0～9mM，更优选地，1.2～7mM，更优选地，1.5～3mM，最优选地，1.5mM。
5.根据权利要求1-4任一项所述的检测样品中同型半胱氨酸含量的检测试剂，其中，试剂1中检测氨的试剂一部分为还原型辅酶和α-酮戊二酸，优选地，还原型辅酶选自NADH、NADPH、thio-NADH、thio-NADPH，更优选地，还原型辅酶为NADH，试剂2中检测氨的试剂的剩余部分为谷氨酸脱氢酶，优选地，还原型辅酶的浓度为0.3～0.6mM，更优选地，0.4～0.5mM，最优选地，0.4mM；优选地，α-酮戊二酸的浓度为l～20mM，优选地，2～15mM，更优选地，5～10mM，最优选地，8mM；优选地，谷氨酸脱氢酶的用量为l～50KU/L，优选地，5-40KU/L，更优选地，10-30KU/L，最优选地，25KU/L。
6.根据权利要求1-5任一项所述的检测样品中同型半胱氨酸含量的检测试剂，其中，试剂2的稳定剂选自非离子型表面活性剂物质、醇类物质、糖类物质、盐类物质、氨基酸和蛋白质类物质，优选地，试剂2的稳定剂选自甘油、海藻糖、甘露醇、BSA，更优选地，试剂2的稳定剂是甘油，优选地，甘油的浓度为25％～45％，更优选地，28％～35％，最优选地，30％。
7.根据权利要求1-6任一项所述的检测样品中同型半胱氨酸含量的检测试剂，其中，缓冲液1和缓冲液2独立地选自Tris缓冲液、PBS缓冲液、碳酸盐缓冲液，优选地，缓冲液1和缓冲液2的浓度为5～500mM，优选地，10～200mM，更优选地，20～100mM，更优选地，30～80mM；优选地，缓冲液1和缓冲液2均为50mM的Tris缓冲液且其中缓冲液1的pH为9.0，缓冲液2的pH为8.0。
8.根据权利要求1-7任一项所述的检测样品中同型半胱氨酸含量的检测试剂，其中EDTA二钠盐的浓度为0.05～15mM，优选地，0.1～5mM，更优选地，0.15～1mM，最优选地，0.2mM，和/或硫酸镁的浓度为0.5～80mM，优选地，1～50mM，更优选地，5-30mM，最优选地，10mM。
9.根据权利要求1-8任一项所述的检测样品中同型半胱氨酸含量的检测试剂，其中试剂1和涉及2的比例为10:1～1:10，优选地，5:1～1:1，更优选地，4:1，最优选地，3.75:1。
10.根据权利要求1-9任一项所述的检测样品中同型半胱氨酸含量的检测试剂，其中样品选自体液或生物组织，优选地，所述体液选自尿，血液，血浆，血清，唾液，精液，粪便，痰液，脑脊髓液，泪液，粘液，和羊膜液，更优选地，所述体液是血液，更优选地，所述血液样品被进一步分成血浆或血清级分。
11.根据权利要求1-10任一项所述的检测样品中同型半胱氨酸含量的检测试剂，其中试剂1和试剂2的组成如下：
试剂1：(R1:R2＝3.75:1)
试剂组份 试剂盒每升用量 Tris缓冲液，pH9.0，25℃ 50mM
EDTA.2Na 0.2mM 还原型辅酶NADH 0.4mM DTT 2.5mM ATP 10mM 蛋氨酸 5mM α-酮戊二酸 8mM 乳酸脱氢酶 2KU/L
试剂2：(R1:R2＝3.75:1)
试剂组份 试剂盒每升用量 Tris缓冲液，pH8.0，25℃ 50mM 甘油 30％(v/v) MgSO4 10mM AdoHcyase 20KU/L ADA 5KU/L 蛋氨酸转腺苷酶 30KU/L 谷氨酸脱氢酶 25KU/L 同型半胱氨酸甲基转移酶 20KU/L
。
12.一种检测样品中同型半胱氨酸含量的检测方法，其包括步骤：1)将权利要求1-11任一项中所述的检测试剂的试剂1与样品接触，使样品中的氧化型同型半胱氨酸还原为游离的同型半胱氨酸，2)向步骤1)的混合物中加入权利要求1-11任一项中所述的检测试剂的试剂2，使充分反应，3)测定腺苷的生成速率，从而获得样品中同型半胱氨酸的含量。
13.根据权利要求12所述的检测样品中同型半胱氨酸含量的检测方法，其中样品选自体液或生物组织，优选地，所述体液选自尿，血液，血浆，血清，唾液，精液，粪便，痰液，脑脊髓液，泪液，粘液，和羊膜液，更优选地，所述体液是血液，更优选地，所述血液样品被进一步分成血浆或血清级分。
14.根据权利要求12或13所述的检测样品中同型半胱氨酸含量的检测方法，其中检测腺苷生成速率的方法为速率法或终点法。
15.一种试剂盒，其包括权利要求1-11所述的检测样品中同型半胱氨酸含量的检测试剂以及使用说明。
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