CN112129719A - 酱油和醋中组胺的测定方法及其试剂盒 - Google Patents

酱油和醋中组胺的测定方法及其试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN112129719A
CN112129719A CN202010947448.XA CN202010947448A CN112129719A CN 112129719 A CN112129719 A CN 112129719A CN 202010947448 A CN202010947448 A CN 202010947448A CN 112129719 A CN112129719 A CN 112129719A
Authority
CN
China
Prior art keywords
reagent
histamine
buffer
vinegar
adenosine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010947448.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN112129719B (zh
Inventor
冯纬
周利南
黄光荣
刘晔
沈权锋
沈海锋
杨慧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Food Brewing Co ltd
Zhejiang Wuweihe Food Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Food Brewing Co ltd
Zhejiang Wuweihe Food Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Food Brewing Co ltd, Zhejiang Wuweihe Food Co ltd filed Critical Hangzhou Food Brewing Co ltd
Priority to CN202010947448.XA priority Critical patent/CN112129719B/zh
Publication of CN112129719A publication Critical patent/CN112129719A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112129719B publication Critical patent/CN112129719B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种酱油和醋中组胺的测定方法及其试剂盒。该检测方法是样品经过氧化石墨烯脱色后，经过组胺‑N‑甲基转移酶、S‑腺苷同型半胱氨酸水解酶、腺嘌呤核苷酶和核糖‑1‑脱氢酶的酶偶联反应，分光光度法在340nm处检测NADPH的生成量，从而准确定量样品中组胺的含量。基于该方法的试剂盒，检测操作简单、结果重现性好、加标回收率高、不需要大型仪器，可用于中小企业和基层实验室的检测。

Description

酱油和醋中组胺的测定方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及食品加工、生物化学、检测试剂领域，具体涉及的是一种酱油和醋中组胺的酶偶联分析检测技术，及其基于该技术开发的检测试剂盒。
背景技术
组胺是生物胺的一种，是生物体内组氨酸在脱羧酶作用下的产物。组胺普遍存在于酱油、醋、黄酒等发酵食品中。食品中的组胺残留容易引物食品安全问题，如口服8～40mg组胺会产生轻微中毒症状，超过40mg会产生中等中毒症状，超过100mg会产生严重中毒症状。因此，组胺是一类潜在的食品危害因子。食品中组胺的检测方法主要有分光光度法、酶联免疫法、电化学生物传感器法、薄层色谱法、毛细管电泳法和高效液相色谱法等，其中高效液相色谱法是目前应用最多的检测食品中组胺的方法。目前报道的分光光度法检测组胺，存在操作步骤多、测定结果不稳定、平行性差等缺点，而高效液相色谱法等方法需要用到大型仪器，操作也较为复杂，检测时间较长，不适合于中小企业和基层单位使用。
发明内容
本发明针对现有技术的上述不足，提出了一种基于多酶偶联的方法，用于检测酱油和醋等食品中的组胺，该方法操作简单、测定结果平行性好、稳定可靠，定量反应准确。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种酱油和醋中组胺的测定方法，过程为：酱油和醋中的组胺经脱色后，由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基，经组胺-N-甲基转移酶作用生成t-甲基组胺和S-腺苷同型半胱氨酸，后者再经S-腺苷同型半胱氨酸水解酶迅速转化成同型半胱氨酸和腺嘌呤核苷。腺嘌呤核苷再经腺嘌呤核苷酶作用，水解成腺嘌呤和核糖，而核糖迅速被核糖-1-脱氢酶氧化，生成核糖酸和NADPH。利用NADP+和NADPH在340nm吸光度差异，可以定量NADPH的生成量，从而确定组胺的含量。
在一些具体实施方式中，本发明提供的组胺的测定方法具体包括如下步骤：取酱油或醋样品溶液到离心管中，加入氧化石墨烯，振荡混匀，离心收集上清液，为待测溶液；取待测溶液入试管中，加入蒸馏水，混匀；加入试剂1，混匀，再加入试剂2，混匀，于37℃水浴中保温反应10min，于分光光度计中340nm测定吸光度值；根据标准曲线和稀释倍数计算出样品中组胺含量；
其中，所述的试剂1与试剂2的体积比为1:1-2；所述试剂1为：10～100mmol/L缓冲液、10～50mmol/L MgCl2、10～50mmol/L KCl、10～200mmol/L NaCl、1～50mmol/L S-腺苷甲硫氨酸、0.1～10mmol/L NADP+、0.1～200g/L保护剂；
所述的试剂2为：10～100mmol/L缓冲液、1～1000U/L组胺-N-甲基转移酶
1～1000U/L S-腺苷同型半胱氨酸水解酶、1～1000U/L腺嘌呤核苷酶、1～1000U/L核糖-1-脱氢酶、0.1～200g/L保护剂。
在一些具体实施例中，所述试剂1和试剂2的缓冲液各自独立地选自磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种，且所述试剂1和试剂2的pH相同。
在一些具体实施例中，所述的试剂1和试剂2的保护剂各自独立地选自甘油、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸二钠、甘露醇、蔗糖、壳聚糖、灭活的胎牛血清、叠氮钠、吐温、曲拉通X-100中的一种或多种。
在一些具体实施例中，酱油或醋样品中组胺的脱色方法是，取一定量的样品溶液，加入50～200mg氧化石墨烯，振荡混匀1～5min，离心(5000～10000r/min)5～10min，收集上清液，备用检测。
进一步地，本发明针利用四种酶偶联反应，提供一种可以定量检测酱油和醋等食品中组胺的方法与试剂盒，反应原理如图1所示。
在一些实施方式中，一种上述基于酶偶联法的检测酱油和醋等食品中组胺的试剂盒，具体为：该试剂盒由试剂1和试剂2组成，其中：
试剂1为：
10～100mmol/L 缓冲液
10～50mmol/L MgCl2
10～50mmol/L KCl
10～200mmol/L NaCl
1～50mmol/L S-腺苷甲硫氨酸
0.1～10mmol/L NADP+
0.1～200g/L 保护剂；
试剂2为：
10～100mmol/L 缓冲液
1～1000U/L 组胺-N-甲基转移酶
1～1000U/L S-腺苷同型半胱氨酸水解酶
1～1000U/L 腺嘌呤核苷酶
1～1000U/L 核糖-1-脱氢酶
0.1～200g/L 保护剂。
在一些具体实施例中，所述试剂1和试剂2的缓冲液各自独立地选自磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种，且所述试剂1和试剂2的pH相同。
在一些具体实施例中，，所述的试剂1和试剂2的保护剂各自独立地选自甘油、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸二钠、甘露醇、蔗糖、壳聚糖、灭活的胎牛血清、叠氮钠、吐温、曲拉通X-100中的一种或多种。
试剂1和试剂2中的溶剂均为蒸馏水，按常规方法配置。
本发明提供的组胺检测方法操作简单，不需要使用大型仪器，检测结果稳定可靠、重现性好；试剂盒既可在普通分光光度计上使用，也可以应用于高通量检测的全自动生化分析仪，非常适合于中小型生产企业及基层使用。
附图说明
图1为酶偶联法测定组胺原理图；
图2为组胺测定标准曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明，但不是对本发明的限制。
实施例1
试剂1为：
50mmol/L 磷酸缓冲液，pH7.6
20mmol/L MgCl2
20mmol/L KCl
50mmol/L NaCl
5mmol/L S-腺苷甲硫氨酸
1mmol/L NADP+
1g/L 叠氮钠
10g/L 吐温20
试剂2为：
50mmol/L 磷酸缓冲液，pH7.6
200U/L 组胺-N-甲基转移酶
100U/L S-腺苷同型半胱氨酸水解酶
100U/L 腺嘌呤核苷酶
100U/L 核糖-1-脱氢酶
10g/L 甘露醇
10g/L 灭活的胎牛血清
10g/L 曲拉通X-100
1g/L 叠氮钠
上述试剂盒用于酱油和醋中组胺的酶偶联分析检测技术，具体过程为：样品中的组胺经脱色后，由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基，经组胺-N-甲基转移酶催化，生成t-甲基组胺和S-腺苷同型半胱氨酸，后者再经S-腺苷同型半胱氨酸水解酶迅速转化成同型半胱氨酸和腺嘌呤核苷。腺嘌呤核苷再经腺嘌呤核苷酶作用，水解成腺嘌呤和核糖，而核糖迅速被核糖-1-脱氢酶氧化，生成核糖酸和NADPH。利用NADPH在340nm有吸收峰，测定吸光度值，通过组胺标准曲线，可以得到样品中组胺的含量。
具体的实施步骤为：取5.0mL酱油或醋样品溶液到10mL离心管中，加入200mg氧化石墨烯，振荡混匀3min，离心(10000r/min)5min，收集上清液，为待测溶液。取2.0mL待测溶液入试管中，加入2.0mL蒸馏水，混匀。加入100uL试剂1，混匀，再加入100uL试剂2，混匀，于37℃水浴中保温反应10min，于分光光度计中340nm测定吸光度值。根据标准曲线和稀释倍数，可以计算出样品中组胺含量。
实施例2
试剂1为：
100mmol/L Tris 缓冲液，pH7.6
20mmol/L MgCl2
20mmol/L KCl
50mmol/L NaCl
5mmol/L S-腺苷甲硫氨酸
1mmol/L NADP+
1g/L 叠氮钠
10g/L 曲拉通X-100
试剂2为：
100mmol/L Tris冲液，pH7.6
200U/L 组胺-N-甲基转移酶
200U/L S-腺苷同型半胱氨酸水解酶
200U/L 腺嘌呤核苷酶
200U/L 核糖-1-脱氢酶
10g/L 甘油
10g/L 灭活的胎牛血清
10g/L 曲拉通X-100
1g/L 叠氮钠
实施例2的测定方法与实施例1相同。
我们对本发明的试剂盒检测酱油和醋中组胺的性能进行了测试，包括线性范围、结果重现性、样品加标回收率。
线性范围测定：用盐酸组胺作为标准品，配制1.0mg/mL组胺的标准溶液母液，将用蒸馏水稀释成0～10μg/mL系列工作溶液。然后按实施例1的方法，测定吸光度值，数据作图如图2所示。根据图2，组胺浓度与吸光度值呈正比，线性方程的相关系数R2＝0.9972，线性相关性好，线性范围为0～10μg/mL。
结果重现性测定：用上述标准曲线测定中的浓度为4.0μg/mL组胺的工作溶液，利用本发明试剂盒连续测定10次，测定结果如表1所示：
表1：连续10次测定4.0μg/mL组胺标准溶液的结果
Figure BDA0002675810610000051
根据表2，连续10次测定4.0μg/mL组胺标准溶液的结果的CV(相对变异系数)为1.93％，变异系数小，结果重现性好、精密度高。
样品加标回收率测定：取某品牌酱油和某品牌醋为待测定样品，按实施例1中方法，测定其组胺浓度。同时在样品中进行两个水平(5mg/L和50mg/L)加标，再次测定样品中组胺浓度。结果如表2所示。
表2：某品牌酱油和某品牌醋中组胺含量及加标回收率测定结果
Figure BDA0002675810610000052
根据表2，利用本发明测定某品牌酱油和某品牌醋中组胺浓度分别为23.6mg/L和5.8mg/L，对其进行的2个水平加标测定的回收率在90％～99.4％，平均回收率为95.7％，回收率较高。
本发明的检测方法对于酱油和醋中组胺的检测操作简单，线性良好，变异系数低，结果重现性好，精密度高，加标回收率满意，显示出该检测方法具有较好的准确性和稳定性。

Claims (8)

1.一种酱油和醋中组胺的酶偶联检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)样品经氧化石墨烯脱色；
(2)由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基，经组胺-N-甲基转移酶催化，生成t-甲基组胺和S-腺苷同型半胱氨酸；
(3)S-腺苷同型半胱氨酸经S-腺苷同型半胱氨酸水解酶迅速转化成同型半胱氨酸和腺嘌呤核苷；
(4)腺嘌呤核苷经腺嘌呤核苷酶作用，水解成腺嘌呤和核糖，而核糖迅速被核糖-1-脱氢酶氧化，生成核糖酸和NADPH；
(5)利用NADPH在340nm有吸收峰，在340nm处测定吸光度值，通过组胺标准曲线，可以确定样品中组胺的含量。
2.根据权利要求1所述的酶偶联检测方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：取酱油或醋样品溶液到离心管中，加入氧化石墨烯，振荡混匀，离心收集上清液，为待测溶液；取待测溶液入试管中，加入蒸馏水，混匀；加入试剂1，混匀，再加入试剂2，混匀，于37℃水浴中保温反应10min，于分光光度计中340nm测定吸光度值；根据标准曲线和稀释倍数计算出样品中组胺含量；
其中，所述的试剂1与试剂2的体积比为1:1-2；所述试剂1为：10～100mmol/L缓冲液、10～50mmol/L MgCl2、10～50mmol/L KCl、10～200mmol/L NaCl、1～50mmol/L S-腺苷甲硫氨酸、0.1～10mmol/L NADP+、0.1～200g/L保护剂；
所述的试剂2为：10～100mmol/L缓冲液、1～1000U/L组胺-N-甲基转移酶1～1000U/LS-腺苷同型半胱氨酸水解酶、1～1000U/L嘌呤核苷酶、1～1000U/L核糖-1-脱氢酶、0.1～200g/L保护剂。
3.根据权利要求2所述的酶偶联检测方法，其特征在于，所述试剂1和试剂2的缓冲液各自独立地选自磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种，且所述试剂1和试剂2的pH相同。
4.根据权利要求2所述的酶偶联检测方法，其特征在于，所述的试剂1和试剂2的保护剂各自独立地选自甘油、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸二钠、甘露醇、蔗糖、壳聚糖、灭活的胎牛血清、叠氮钠、吐温、曲拉通X-100中的一种或多种。
5.根据权利要求2所述的酶偶联检测方法，其特征在于，酱油或醋样品中组胺的脱色方法是，取一定量的样品溶液，加入50～200mg氧化石墨烯，振荡混匀1～5min，离心(5000～10000r/min)5～10min，收集上清液，备用检测。
6.根据权利要求1-5任一项所述的酱油和醋中组胺的测定方法所用的测定试剂盒，其特征在于：该试剂盒具体由试剂1和试剂2组成，其中：
试剂1为：
10～100mmol/L缓冲液
10～50mmol/L MgCl2
10～50mmol/L KCl
10～200mmol/L NaCl
1～50mmol/L S-腺苷甲硫氨酸
0.1～10mmol/L NADP+
0.1～200g/L保护剂
试剂2为：
10～100mmol/L缓冲液
1～1000U/L组胺-N-甲基转移酶
1～1000U/L S-腺苷同型半胱氨酸水解酶
1～1000U/L腺嘌呤核苷酶
1～1000U/L核糖-1-脱氢酶
0.1～200g/L保护剂。
7.根据权利要求6所述的测定试剂盒，其特征在于，所述试剂1和试剂2的缓冲液各自独立地选自磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种，且所述试剂1和试剂2的pH相同。
8.根据权利要求6所述的测定试剂盒，其特征在于，所述的试剂1和试剂2的保护剂各自独立地选自甘油、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸二钠、甘露醇、蔗糖、壳聚糖、灭活的胎牛血清、叠氮钠、吐温、曲拉通X-100中的一种或多种。
CN202010947448.XA 2020-09-10 2020-09-10 酱油和醋中组胺的测定方法及其试剂盒 Active CN112129719B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010947448.XA CN112129719B (zh) 2020-09-10 2020-09-10 酱油和醋中组胺的测定方法及其试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010947448.XA CN112129719B (zh) 2020-09-10 2020-09-10 酱油和醋中组胺的测定方法及其试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112129719A true CN112129719A (zh) 2020-12-25
CN112129719B CN112129719B (zh) 2022-12-30

Family

ID=73846306

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010947448.XA Active CN112129719B (zh) 2020-09-10 2020-09-10 酱油和醋中组胺的测定方法及其试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112129719B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4769322A (en) * 1984-04-12 1988-09-06 Eli Lilly And Company Quantification of endogenous histamine
CN101750354A (zh) * 2008-12-10 2010-06-23 苏州艾杰生物科技有限公司 腺苷脱氨酶诊断试剂(盒)及腺苷脱氨酶活性浓度测定方法
CN102703576A (zh) * 2012-05-24 2012-10-03 宁波美康生物科技股份有限公司 S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶的测定方法及其试剂盒
CN104263810A (zh) * 2014-05-09 2015-01-07 山东博科生物产业有限公司 一种同型半胱氨酸检测试剂
CN104630324A (zh) * 2015-02-28 2015-05-20 北京爱必信生物技术有限公司 改进的同型半胱氨酸检测试剂及方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4769322A (en) * 1984-04-12 1988-09-06 Eli Lilly And Company Quantification of endogenous histamine
CN101750354A (zh) * 2008-12-10 2010-06-23 苏州艾杰生物科技有限公司 腺苷脱氨酶诊断试剂(盒)及腺苷脱氨酶活性浓度测定方法
CN102703576A (zh) * 2012-05-24 2012-10-03 宁波美康生物科技股份有限公司 S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶的测定方法及其试剂盒
CN104263810A (zh) * 2014-05-09 2015-01-07 山东博科生物产业有限公司 一种同型半胱氨酸检测试剂
CN104630324A (zh) * 2015-02-28 2015-05-20 北京爱必信生物技术有限公司 改进的同型半胱氨酸检测试剂及方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112129719B (zh) 2022-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Eisenthal et al. Enzyme assays: a practical approach
CN102703576B (zh) S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶的测定方法及其试剂盒
Fukuuchi et al. A simple HPLC method for determining the purine content of beer and beer-like alcoholic beverages
CN107505273A (zh) 血清总胆汁酸含量测定试剂盒及其使用方法
FI57024C (fi) Foerfarande foer kvantitativ bestaemning av ammoniak i blodet
CN102154442A (zh) 1,5-脱水山梨醇的检测方法和相关诊断试剂盒
Pais et al. Sequential injection system for the enzymatic determination of ethanol in alcoholic beverages with in-line dilution
CN101169411A (zh) 氨诊断/测定试剂盒及氨的浓度测定方法
CN112129719B (zh) 酱油和醋中组胺的测定方法及其试剂盒
CN1896271B (zh) 血清钾离子酶法测定试剂
Scopes A new enzymic method for inorganic phosphate determination
CN111057746B (zh) 一种肌酸激酶同工酶测定试剂盒
AU702943B2 (en) Analysis of analytes in biological fluids
CN101750354A (zh) 腺苷脱氨酶诊断试剂(盒)及腺苷脱氨酶活性浓度测定方法
CN101750355A (zh) 腺苷脱氨酶诊断试剂(盒)及腺苷脱氨酶活性浓度测定方法
CN113466151A (zh) 一种血清钾检测试剂冻干微球及其制备方法
CN116124750A (zh) 一种腺苷脱氨酶含量的检测方法及其应用
Isobe et al. A simple enzymatic differential assay for diamines, spermidine, and spermine in urine and blood
CN101464346A (zh) 氨(离子)诊断/测定试剂盒及氨(离子)的浓度测定方法
Van de Water et al. The serum icteric-index as a tool to correct the influence of bilirubin on the uric acid and magnesium analyses on the Hitachi 747 analyser
Qadar Pasha et al. A rapid method for plasma ammonia estimation using an indigenously purified enzyme
CN101464352A (zh) 氨(离子)诊断/测定试剂盒及氨(离子)的浓度测定方法
Kanaya et al. Application of the “Micro-Stopped-Flow Time Difference Analysis” Technique to a Dehydrogenase-Catalyzed Reaction for Rapid and Sensitive Determination of Pyruvate
CN101464379A (zh) 氨(离子)诊断/测定试剂盒及氨(离子)的浓度测定方法
CN101609016A (zh) 同型半胱氨酸诊断试剂盒及同型半胱氨酸浓度测定方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant