CN102154442A - 1,5-脱水山梨醇的检测方法和相关诊断试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及1，5-脱水山梨醇的检测方法和相关诊断试剂盒。本发明涉及通过使样本与腺苷二磷酸在腺苷二磷酸依赖的己糖激酶催化下生成脱水葡萄糖-6-磷酸和腺苷一磷酸，然后脱水葡萄糖-6-磷酸与硫代氧化性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶催化下生成硫代还原性辅酶和化合物C6H11O8P，同时生成的C6H11O8P在AG-6-PDH及还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸存在下再次生成AG-6-P和氧化性辅酶，由此循环放大使检测1，5-脱水山梨醇的灵敏度提高。本发明还提供基于上述方法的1，5-脱水山梨醇的检测试剂盒。本发明的试剂盒使用方便、简洁，可以在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上快速检测，不需要特殊或者额外的仪器，其成本也低廉。
Description
技术领域
本发明涉及临床生化诊断领域，涉及一种酶法检测1，5-脱水山梨醇的检测方法和相关诊断试剂盒。进一步而言，本发明涉及循环酶法检测血液中1，5-脱水山梨醇的方法和试剂盒。
背景技术
1，5-脱水山梨醇(1，5-anhydroglucitol，1，5-AG)，又叫做2-脱氧葡萄糖、1，5-脱水葡萄糖醇，是一种具有吡喃环结构的六碳单糖。它是吡喃葡萄糖的还原型(C-1位置上缺少一个羟基)，在吡喃位形成C1椅形氧环，分子式为C6H12O5(分子量164.2，CAS号为154-58-5)，结构与葡萄糖的结构十分相似，两者主要区别在于葡萄糖C-1位置上的羟基被氢所取代，而这种取代恰恰是1，5-脱水山梨醇化学性质稳定的基础。
二十世纪九十年代初日本就把1，5-脱水山梨醇作为糖尿病诊断和疗效检测的常规指标，并为此做了大量的基础与临床研究工作。血清中1，5-脱水山梨醇浓度恒定在12-40mg/L，其代谢稳定。当患有糖尿病时血清1，5-脱水山梨醇浓度会显著降低，其机制是：当患有糖尿病时大量葡萄糖由尿中排出竞争性的抑制了1，5-脱水山梨醇经肾小管的重吸收，使1，5-脱水山梨醇大量经尿排出，导致血中1，5-脱水山梨醇浓度降低，其水平可反映近一周的血糖和尿糖情况。目前大多数国家评价血糖水平需要监测血浆葡萄糖、糖化血红蛋白或果糖胺。糖化血红蛋白水平反映蛋白质半衰期内的平均葡萄糖浓度，即过去2-3个月的血浆葡萄糖浓度变化，而果糖胺反应过去10-14天的血糖水平变化。1，5-脱水山梨醇可以十分敏感的反应葡萄糖的排泌变化，对糖尿病的诊断与治疗是个很好的指标。当葡萄糖浓度水平升高时，即使是暂时性的也会造成循环中1，5-脱水山梨醇浓度下降，例如妊娠造成的1，5-脱水山梨醇浓度的改变可能反应糖代谢的的适度改变，而其他糖尿病的指标都无法反应出来。1，5-脱水山梨醇的特征在对血糖水平接近正常至血糖浓度 中等升高程度的病人的评价很有价值，它对病人自我检测和持续监测血糖水平变化是个有效的补充，对特定的病人进行每天一次或每月一次的监测，如果1，5-脱水山梨醇水平稳定或持续升高，将反应整体血糖水平稳定或有所改善，如果1，5-脱水山梨醇水平下降，就要持续监测血糖水平变化，改变生活方式，还要进行治疗来纠正血糖随后即将发生的恶化。1，5-脱水山梨醇不同于其他指标，在临床实践中有潜在的应用领域。1，5-脱水山梨醇反映餐后高血糖峰值，在非糖尿病人群中血浆1，5-脱水山梨醇水平可能作为一个筛查指标，以监测餐后高血糖相关的心血管危险的发生。1，5-脱水山梨醇与负载后血浆葡萄糖浓度明显呈负相关。在慢性肾功能衰竭的病人中即使血糖正常，血清1，5-脱水山梨醇也会明显下降，1，5-脱水山梨醇的下降是由于1，5-脱水山梨醇重吸收减少造成的，这不依赖于葡萄糖的排泌，血浆或尿1，5-脱水山梨醇浓度可很好的反映肾小管重吸收功能，因为1，5-脱水山梨醇重吸收系统比葡萄糖重吸收系统更容易受损。糖耐量一样的人血浆1，5-脱水山梨醇的浓度可能呈现各种变化，这依赖于他们的肾糖阈，这种内在的特性可能限制1，5-脱水山梨醇的应用。
对1，5-脱水山梨醇水平的检测方法有很多，各有其优缺点。其中高效液相、酶色谱法操作比较复杂，不适合大批量分析。目前适合自动分析仪的方法主要有：ADP-HK-NADPH方法和GK-PROD方法。
1，5-脱水山梨醇在ADP依赖性己糖激酶(ADP-HK)的作用下生成AG-6磷酸(AG-6-P)。AG-6-P再和NADP进行反应，生成NADPH。NADPH具有还原性，和显色剂作用生成显色物质。对显色物质进行比色，即可测定1，5-脱水山梨醇的浓度，该方法分为三个步骤：
另一种方法是使用吡喃糖氧化酶(PROD：EC1.1.3.10)、葡萄糖激 酶(EC2.7.1.2)和三磷酸腺苷(ATP)重生系统可检测血清1，5-脱水山梨醇的浓度变化。葡萄糖激酶和ATP重生系统可有效的将葡萄糖转化为不与吡喃糖氧化酶反应的化合物葡萄糖-6-磷酸，使用这种方法可选择性的针对1，5-脱水山梨醇的变化。吡喃糖氧化酶氧化1，5-脱水山梨醇生成的过氧化氢可通过TRINDER反应进行检测。
但是，现有技术中使用的试剂盒成本较高，稳定性、灵敏度、特异性等方面仍需要进一步改进，因此，需要对1，5-脱水山梨醇的检测方法和相关诊断试剂盒进行改进以满足临床检测和诊断以及化学分析的要求。
发明内容
一方面，本发明提供一种可以简便快捷并可以快速检验血清中1，5-脱水葡萄糖醇的循环酶方法，以及应用该方法配置而成的1，5-脱水葡萄糖醇诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂，能够利用紫外、可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪测定出血清中1，5-AG含量，测定过程中不受葡萄糖，甘露糖，果糖等血清重糖类化合物的干扰。测定速度快。准确度高，为临床及化学分析中推广酶法检测1，5-AG含量提供了有力支撑。
另一方面，本发明还提供了一种液体双试剂检测血清中1，5-AG的试剂盒，以及配制该试剂盒的方法。本发明提供的试剂盒能广泛应用于各种检测仪器中对1，5-AG含量进行检测，通过在反应体系中循环酶系统，放大检测信号，从而确保了试剂的稳定性及临床测值的准确性。另外，本发明提供的试剂操作简便，使用方便，灵敏度高，抗干扰能力强，具有测定速度快，准确度高，试剂稳定等效果。
因此，本发明一方面涉及一种循环酶法检测1，5-AG含量的方法，采用以下步骤进行：
首先需将测定样本(例如，血清)与腺苷二磷酸(ADP)在腺苷二磷酸依赖的己糖激酶(ADP-HK)催化下生成脱水葡萄糖-6-磷酸(AG-6-P)和腺苷一磷酸(AMP)
然后将脱水葡萄糖-6-磷酸(AG-6-P)与硫代氧化性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD)在1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶(AG-6-PDH)催化下生成硫代还原性辅酶(Thio-NADH)和化合物C6H11O8P，同时生成的C6H11O8P在AG-6-PDH及还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)存在下在次生成AG-6-P和氧化性辅酶(NAD)，如上所述循环放大使检测灵敏度提高，同时可以大大的降低测量成本，
本发明的方法与现有技术中ADP-HK-NADPH方法的明显区别在于，发明人开创了循环酶法的检测。通过AG-6-P与Thio-NAD在AG6P-DH存在的条件下，生成Thio-NADH，由于大量的NADH的存在使反应生成物再次循环到产物，这样循环放大。因此，本发明采用了循环酶法，提高了反应的灵敏度，减少了现有技术方法中最后一步反应，可以降低成本。
将以上反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长405nm下吸光度的升高速度，进而测算出样品中1，5-AG的含量。
测定过程中，被测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶100-1∶500，反应温度控制在20℃-40℃，反应时间控制在3-10分钟，检测时设定主波长在405nm，副波长540nm以上。
为了更准确检测样本中的1，5-AG，还应对血清中的糖类物质进行消除，主要采用以下几种方法：
1、葡萄糖(GLU)与(ADP)在己糖激酶(HK)催化作用下生成葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)和一磷酸腺苷(AMP)。G-6-P与磷酸己糖异构酶(PG)催化作用下生成果糖-6磷酸(F-6-P)，F-6-P与三磷酸腺苷(ATP)在6-磷酸果糖异构酶(PFK)催化作用下生成果糖-1，6-二磷酸(F-1，6-P)。通过以上反应完全消除葡萄糖对反应的影响。
2、也可将1中的己糖激酶(HK)改为葡萄糖激酶(GK)，反应特异性更高反应更迅速。
3、葡萄糖在氧气和水的条件下与葡萄糖氧化酶(GLO)的作用，生成葡萄糖醛酸和过氧化氢。过氧化氢通过过氧化氢酶(CAT)进行分解水和氧气。此系统成本较低，清除能力强。
优选地使用上述第3个除葡萄糖系统，其使用葡萄糖氧化酶，价格低廉，反应彻底。
本发明还涉及一种1，5-AG诊断试剂盒，可以包含下述物质：
缓冲液 20-500mmol/L
腺苷二磷酸 1-50mmol/l
腺苷二磷酸依赖型己糖激酶 0.1-100KU/l
硫代氧化性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 0.1-2.0g/l
1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶 0.1-100KU/L
还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 0.1-10g/l
酶保护剂 1％-50％
酶促进剂 1％-50％
螯合剂 0.1-10％
表面活性剂 0.1-10％
防腐剂 0.05％-0.2％。
跟据试剂中各物质稳定性所需，本发明的方法采用的缓冲液有缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、三乙醇氨缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、硼酸-硼酸钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸缓冲液或者磷酸盐，2-吗啉乙磺酸，N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙基磺酸，3-(N-吗啉)丙磺酸。三羟甲基甲胺基乙磺酸，，N′-二(2-羟基乙基)甘氨酸中的一种或几种。浓度优选20-500mmol/l，最优选50-200mmol/l。
腺苷二磷酸，可选用其钾盐，钠盐或为酸形式的腺苷二磷酸。优选浓度为1-50mmol/l，最优选1-10mmol/l。
腺苷二磷酸依赖型己糖激酶，优选浓度0.1-100KU/L，最优选0.5-50KU/L。
硫代氧化性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，优选浓度0.1-2.0g/l，最优选浓度0.5-1.5g/l。
1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶，优选浓度为0.1-100KU/l，最优先浓度为10-50KU/L。
还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸优选浓度为0.1-10g/l，最优选浓度为0.1-5g/l。
为保护酶的稳定性，本发明的方法加入分别为大分子物质，聚乙二醇高分子化合物，蛋白类物质，表面活性剂，醇类。磷化氢，胱氨酸等含有巯基的化合物优选浓度1％-50％，最优选浓度1％-20％。
螯合剂如EDTA，EGTA，HPDH等。优选浓度0.1％-10％，最优选浓度0.1-2％。
为了加快反应速度，本发明的方法加入酶的促进剂，如各种无机盐，如醋酸镁，氯化锰，氯化钾，氯化钠，氯化铵等。无机盐浓度优选1％-50％，最优选浓度1％-10％。
为去除脂类干扰和加速反应，本发明的方法加入聚氧乙烯型表面活性剂，如Triton X系列，Tween系列和十二烷基苯磺酸钠等表面活性 剂。表面活性剂优选浓度0.1％-10％，最优选浓度0.5％-2％。
防腐剂，如如生物防腐剂PC系列，迭氮钠，抗生素系列，苯甲酸，MIT，BND，CAA等。优选浓度0.05％-0.2％。最优浓度为0.05-0.1％。
葡萄糖消除剂可包含：
葡萄糖氧化酶 5-50KU/L
过氧化氢酶 5-100KU/L
己糖激酶 1-100KU/L
果糖异构酶 1-100KU/L
6-磷酸果糖异构酶 1-100KU/L
葡萄糖激酶 1-50KU/L
酶保护剂 0.1-50％
酶促进剂 0.1-50％
三磷酸腺苷 0.1-50mmol/l
二磷酸腺苷 0.1-50mmol/l。
为消除糖类干扰，试剂中应还有以上的酶中的一种或几种。
葡萄糖氧化酶，优选浓度5-50KU/L，最优选浓度1-20KU/L。
过氧化氢酶，优选浓度5-100KU/L，最优选浓度40-100KU/L。
己糖激酶，优选浓度1-100KU/L，最优选浓度1-20KU/L。
果糖异构酶，优选浓度1-100KU/L，最优选浓度1-50KU/L。
6-磷酸果糖异构酶，优选浓度1-100KU/L，最优选浓度1-20KU/L。
葡萄糖激酶，优选浓度1-50KU/L，最优选浓度1-10KU/L。
酶保护剂，主要包括聚乙二醇高分子化合物，蛋白，甘油等。优选浓度0.1-50％，最优选浓度1-10％。
酶促进剂主要包括无机盐，表面活性剂等。优选浓度0.1-50％，最优浓度0.1-10％。
三磷酸腺苷，优选浓度0.1-50mmol/l，最优选浓度1-10mmol/l。
二磷酸腺苷，优选浓度0.1-50mmol/l，最优选浓度1-10mmol/l。
本发明技术方案的突出的特点和显著进步主要表现在：
(1)本发明完全采用循环酶法，酶法反应具有特异性高，通过循环酶法将反应信号扩大，提高了反应灵敏度。同时本发明的方法没有采用色原进行反应，降低了试剂对仪器管道和环境的污染。
(2)本发明采用糖类去除系统和表面活性剂，试剂检测不受糖类和脂类影响。试剂的特异性高。检测准确。
(3)本发明的方法操作简单，可快速得到检测结果。
(4)本发明的方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用。
(5)本发明提供了液体1，5-AG诊断试剂盒，试剂稳定性好。试剂中各酶的活性保存完好，很好的保证了应用该试剂的检测效果。同时配置为液体双试剂可以有效降低干扰的同时，降低试剂各组分之间的交叉影响，使检测结果更加可信，试剂更加稳定。
以下将结合实施例对本发明进行详细说明，其中实施例仅仅是说明而非限定的作用，本领域技术人员完全可以在以下披露的具体实施例的技术上作出改进，但是不超过本发明权利要求的范围或者本发明精神之内所作出的改进都会落入本发明的保护范围。
附图说明
图1：本发明试剂盒与协和试剂对照测定1，5-AG结果的相关性。
图2：本发明试剂盒与协和试剂对照测定1，5-AG结果的线性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例。不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。
实施例一
按一下成分和用量配置1，5-AG诊断试剂盒。本发明中百分比含量除另有明确说明外，均为质量体积比。
试剂1
磷酸缓冲液 100mM
腺苷二磷酸 5mM
氯化镁 5Mm
腺苷二磷酸依赖的己糖激酶 20U/ml
Tio-NAD 1g/L
迭氮钠 0.5g/L
试剂2
Tris缓冲液 10mM
1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶 10U/ml
NADH 6g/L
迭氮钠 0.5g/L
在全自动生化分析仪(奥林巴斯-400)上设定：反应温度37℃、反应时间1.5分钟、测试波长405nm、测试副波长540nm。被测钾离子样品与试剂比为：样品∶试剂1∶试剂2＝5μl∶180μl∶60μl，反应为降反应。
先加入样品和试剂1，两者在全自动生化分析仪内部自动混匀，检测，记录在主副波长下的吸光度值。在3分钟后加入试剂2，两者在全自动生化分析仪内部自动混匀，1分钟后开始记录主副波长的吸光度下降情况。根据速率法或终点法，对照相应的标准曲线计算出样品中1，5-AG的含量。
| 样本 | 吸光度Abs |
| 去离子水 | 0.0120 |
| 1，5-AG纯品溶液(150umol/l) | 0.0430 |
| 葡萄糖溶液(10mmol/l) | 0.0612 |
| 1，5-AG纯品溶液150umol/l+葡萄糖溶液10mmol/l | 0.1321 |
实施例二：
根据实施例一，加入除糖系统，配置成为1，5-AG检测试剂盒。
试剂1
Tris-HCl 100mmol/L
腺苷二磷酸 5mmol/L
腺苷三磷酸 5mmol/L
己糖激酶 5U/ml
葡萄糖-6-磷酸 5U/ml
磷酸己糖异构酶 10U/ml
氯化镁 5mmol/L
腺苷二磷酸依赖的己糖激酶 20U/ml
Tio-NAD 1g/L
迭氮钠 0.5g/L
试剂2
Tris缓冲液 10mM
1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶 10U/ml
NADH 6g/L
迭氮钠 0.5g/L
运用实施例一的实验方法，对除糖系统进行检测。
| 样本 | 吸光度Abs |
| 去离子水 | 0.0096 |
| 1，5-AG纯品溶液(150umol/l) | 0.0441 |
| 葡萄糖溶液(10mmol/l) | 0.0157 |
| 1，5-AG纯品溶液150umol/l+葡萄糖溶液10mmol/l | 0.0510 |
根据以上数据，除糖体系可以去除葡萄糖对检测的干扰，但是葡萄糖对体系还是存在一定的干扰。
实施例三
根据实施例一，加入除糖系统，配置成为1，5-AG检测试剂盒。
试剂1
Tris-HCl 100mmol/L
腺苷二磷酸 5mmol/L
腺苷三磷酸 5mmol/L
葡萄糖激酶 5U/ml
葡萄糖-6-磷酸 5U/ml
磷酸己糖异构酶 10U/ml
氯化镁 5mmol/L
腺苷二磷酸依赖的己糖激酶 20U/ml
Tio-NAD 1g/L
迭氮钠 0.5g/L
试剂2
Tris缓冲液 10mM
1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶 10U/ml
NADH 6g/L
迭氮钠 0.5g/L
运用实施例一的实验方法，对除糖系统进行检测。
| 样本 | 吸光度Abs |
| 去离子水 | 0.0102 |
| 1，5-AG纯品溶液(150umol/l) | 0.0471 |
| 葡萄糖溶液(10mmol/l) | 0.0117 |
| 1，5-AG纯品溶液150umol/l+葡萄糖溶液10mmol/l | 0.0473 |
根据以上数据，除糖体系可以去除葡萄糖对检测的干扰，明显比实施例三的清除干扰的能力强。
实施例四：
根据实施例一，加入除糖系统，配置成为1，5-AG检测试剂盒。
试剂1
Tris-HCl 100mmol/L
腺苷二磷酸 5mmol/L
葡萄氧化酶 5U/ml
过氧化氢酶 5U/ml
氯化镁 5mmol/L
腺苷二磷酸依赖的己糖激酶 20U/ml
Tio-NAD 1g/L
PC-300 0.5g/L
试剂2
Tris缓冲液 10mM
1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶 10U/ml
NADH 6g/L
迭氮钠 0.5g/L
运用实施例一的实验方法，对除糖系统进行检测。
| 样本 | 吸光度Abs |
| 去离子水 | 0.0099 |
| 1，5-AG纯品溶液(150umol/l) | 0.0412 |
| 葡萄糖溶液(10mmol/l) | 0.0102 |
| 1，5-AG纯品溶液150umol/l+葡萄糖溶液10mmol/l | 0.0413 |
根据以上数据，除糖体系可以去除葡萄糖对检测的干扰，计算试剂成本明显低于实施例二和实施例三。
实施例五：
根据实施例四，加入清除酶的促进剂和稳定剂，提高试剂的稳定性。
试剂1
Tris-HCl 100mmol/L
腺苷二磷酸 5mmol/L
葡萄氧化酶 5U/ml
过氧化氢酶 5U/ml
氯化镁 5mmol/L
腺苷二磷酸依赖的己糖激酶 20U/ml
Tio-NAD 1g/L
丙三醇 10g/L
磷化氢 0.5g/L
PC-300 0.5g/L
试剂2
Tris缓冲液 10mM
1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶 10U/ml
NADH 6g/L
MIT 0.5g/L
根据实施例一中的实验条件对试剂进行检测。
| 样本 | 吸光度Abs |
| 去离子水 | 0.0099 |
| 1，5-AG纯品溶液(150umol/l) | 0.0623 |
| 葡萄糖溶液(10mmol/l) | 0.0101 |
| 1，5-AG纯品溶液150umol/l+葡萄糖溶液10mmol/l | 0.0626 |
试剂清除葡萄糖干扰能力良好。
同时对试剂进行37度加速稳定性试验。
| 空白吸光度 | 1，5-AG纯品溶液(150umol/l) | |
| 新配置试剂 | 0.1231 | 0.0634 |
| 37度放置1天 | 0.1212 | 0.0621 |
| 37度放置3天 | 0.1221 | 0.0611 |
| 37度放置5天 | 0.1208 | 0.0608 |
| 37度放置7天 | 0.1211 | 0.0598 |
试剂37度放置7天，相当于2-8度放置一年半，试剂空白吸光度和检测标准吸光度均无明显变化。结果良好。
实施例六：
根据实施例五，加入清除抗坏血酸，胆红素，甘油三酯和血红蛋白干扰的表面活性剂和抗干扰剂。
试剂1
Tris-HCl 100mmol/L
腺苷二磷酸 5mmol/L
葡萄氧化酶 5U/ml
过氧化氢酶 5U/ml
抗坏血酸氧化酶 5U/ml
氯化镁 5mmol/L
腺苷二磷酸依赖的己糖激酶 20U/ml
Tio-NAD 1g/L
PEG8000 20g/L
Triton X 100 1g/L
烷基糖苷650 2g/L
磷化氢 0.5g/L
MIT 0.5g/L
试剂2
Tris缓冲液 10mM
1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶 10U/ml
NADH 6g/L
EDTA 2mmol/L
甘油 50g/L
MIT 0.5g/L
根据以上数据，实施例六抗干扰能力强，抗坏血酸，血红蛋白，胆红素，甘油三酯和葡萄糖对检测不造成明显干扰。
实施例七：
根据实施例六，对试剂配方进行调整。
试剂1
甘氨酸缓冲液 200mmol/L
腺苷二磷酸 3mmol/L
葡萄氧化酶 15U/ml
过氧化氢酶 5U/ml
抗坏血酸氧化酶 5U/ml
氯化镁 5mmol/L
腺苷二磷酸依赖的己糖激酶 50U/ml
Tio-NAD 1g/L
PEG10000 50g/L
Triton X 405 2g/L
烷基糖苷650 3g/L
磷化氢 0.5g/L
MIT 0.5g/L
试剂2
Tris缓冲液 50mmol/L
1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶 50U/ml
NADH 6g/L
EDTA 5mmol/L
PEG-8000 50g/L
丙三醇 50g/L
CAA 1.0g/L
与协和试剂对照(购自日本协和株式会社，批号R001CUB)本实施例在性能与协和试剂一致。但大大节约了试剂成本。
相关性(图1)
| 样本号 | 协和试剂 | 实施例七 | 样本号 | 协和试剂 | 实施例七 |
| 1 | 23.1 | 24.4 | 8 | 67.3 | 66.9 |
| 2 | 172.1 | 171.2 | 9 | 81.2 | 81.7 |
| 3 | 134.7 | 135.2 | 10 | 182.1 | 181.8 |
| 4 | 281.0 | 280.7 | 11 | 311.5 | 313.6 |
| 5 | 45.1 | 46.2 | 12 | 11.7 | 11.5 |
| 6 | 89.5 | 89.7 | 13 | 146.8 | 147.4 |
| 7 | 101.8 | 101.5 | 14 | 111.7 | 111.1 |
线性(图2)
总之，本发明的优势在于，液体双剂盒，操作简单，使用方便，可以应用于全自动和半自动等各种生化分析仪器上；通过加入除糖系统和表面活性去除系统中的干扰对试剂检测的干扰。通过加入酶的保护剂增强试剂的稳定性、准确性、抗干扰性，长时间存放之后仍可以准确测定样本中的钾离子浓度。
本领域技术人员可以理解，本发明公开的方法及由此生产的液体双试剂盒可以广泛应用于Hitachi、Olympus和Synchron各种全自动生化分析仪。、根据现有技术和临床工作人员的经验，在不需要进行创造性劳动的前提下，本领域技术人员可以对各种检测仪器的最佳检测参数进行优化。对各种检测仪器的参数的优化并没有超出本发明要求保护的范围之外。以上实施例是对本发明的说明和进一步解释，而不是对本发明的限制，在本发明的精神和权利保护范围内所做的任何修改，都落入本发明的保护范围。
Claims (16)
1.一种检测血液中1，5-脱水山梨醇的方法，该方法包括下述步骤：
a.样本与腺苷二磷酸在腺苷二磷酸依赖的己糖激酶催化下生成脱水葡萄糖-6-磷酸和腺苷一磷酸
b.脱水葡萄糖-6-磷酸与硫代氧化性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶催化下生成硫代还原性辅酶和化合物C6H11O8P，同时生成的C6H11O8P在AG-6-PDH及还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸存在下再次生成AG-6-P和氧化性辅酶
2.根据权利要求1所述的检测血液中1，5-脱水山梨醇的方法，还包括步骤a前去除葡萄糖干扰的步骤。
3.根据权利要求2所述的检测血液中1，5-脱水山梨醇的方法，所述的去除葡萄糖干扰的步骤选自：
a.葡萄糖与在己糖激酶催化作用下生成葡萄糖-6-磷酸和一磷酸腺苷，葡萄糖-6-磷酸与磷酸己糖异构酶催化作用下生成果糖-6磷酸，果糖-6磷酸F-6-P与三磷酸腺苷在6-磷酸果糖异构酶催化作用下生成果糖-1，6-二磷酸；
b.葡萄糖与在葡萄糖激酶催化作用下生成葡萄糖-6-磷酸和一磷酸腺苷，葡萄糖-6-磷酸与磷酸己糖异构酶催化作用下生成果糖-6磷酸，果糖-6磷酸与三磷酸腺苷在6-磷酸果糖异构酶催化作用下生成果糖-1，6-二磷酸；或
c.葡萄糖在氧气和水的条件下与葡萄糖氧化酶的作用，生成葡萄糖醛酸和过氧化氢，过氧化氢通过过氧化氢酶进行分解水和氧气。
4.一种检测血液中1，5-脱水山梨醇的试剂盒，该试剂盒包含腺苷二磷酸、腺苷二磷酸依赖的己糖激酶、硫代氧化性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶和还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
5.根据权利要求4所述的检测血液中1，5-脱水山梨醇的试剂盒，其中腺苷二磷酸的浓度范围在1-50mmol/L，腺苷二磷酸依赖的己糖激酶的浓度范围在0.1-100KU/L，硫代氧化性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度范围在0.1-2.0g/L，1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶浓度范围在0.1-100KU/L，还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度范围在0.1-10g/L。
6.根据权利要求5所述的检测血液中1，5-脱水山梨醇的试剂盒，进一步包括去除葡萄糖干扰组合物。
7.根据权利要求6所述的检测血液中1，5-脱水山梨醇的试剂盒，所述的去除葡萄糖干扰组合物选自：
a.己糖激酶、磷酸己糖异构酶和6-磷酸果糖异构酶的组合物；
b.葡萄糖激酶、磷酸己糖异构酶和6-磷酸果糖异构酶的组合物；或
c.葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的组合物。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的检测血液中1，5-脱水山梨醇的试剂盒，还包含缓冲液、酶保护剂、酶促进剂、螯合剂、表面活性剂和防腐剂。
9.根据权利要求8所述的检测血液中1，5-脱水山梨醇的试剂盒，其包含：
缓冲液 20-500mmol/L
腺苷二磷酸 1-50mmol/l
腺苷二磷酸依赖型己糖激酶 0.1-100KU/l
硫代氧化性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 0.1-2.0g/l
1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶 0.1-100KU/L
还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 0.1-10g/l
酶保护剂 1％-50％质量体积比
酶促进剂 1％-50％
螯合剂 0.1-10％
表面活性剂 0.1-10％
防腐剂 0.05％-0.2％。
10.根据权利要求8或9所述的检测血液中1，5-脱水山梨醇的试剂盒，其中所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、三乙醇氨缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、硼酸-硼酸钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸缓冲液或者磷酸盐、2-吗啉乙磺酸、N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙基磺酸、3-(N-吗啉)丙磺酸、三羟甲基甲胺基乙磺酸、N′-二(2-羟基乙基)甘氨酸中的一种或几种。
11.根据权利要求10所述的检测血液中1，5-脱水山梨醇的试剂盒，其中所述缓冲液的浓度在20-500mmol/L。
12.根据权利要求8或9所述的检测血液中1，5-脱水山梨醇的试剂盒，其中酶保护剂包括大分子物质、聚乙二醇高分子化合物、蛋白类物质、表面活性剂、醇类、磷化氢和胱氨酸，酶保护剂的优选浓度为1％-50％，最优选浓度1％-20％。
13.根据权利要求8或9所述的检测血液中1，5-脱水山梨醇的试剂盒，其中酶促进剂包括无机盐，无机盐包括醋酸镁，氯化锰，氯化钾，氯化钠，氯化铵，酶促进剂的浓度优选为1％-50％，最优选浓度为1％-10％。
14.根据权利要求8或9所述的检测血液中1，5-脱水山梨醇的试剂盒，其中螯合剂包括EDTA、EGTA、HPDH，螯合剂的优选浓度为0.1％-10％，最优选浓度为0.1-2％。
15.根据权利要求8或9所述的检测血液中1，5-脱水山梨醇的试剂盒，其中表面活性剂为聚氧乙烯型表面活性剂，包括Triton X系列，Tween系列和十二烷基苯磺酸钠，表面活性剂的优选浓度为0.1％-10％，最优选浓度为0.5％-2％。
16.根据权利要求8或9所述的检测血液中1，5-脱水山梨醇的试剂盒，其中防腐剂包括生物防腐剂PC系列、迭氮钠、抗生素系列、苯甲酸、MIT、BND、CAA，防腐剂的优选浓度为0.05％-0.2％，最优浓度为0.05-0.1％。
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