CN108318687A - 一种用于检测血清中精氨酰琥珀酸裂解酶的试剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于精氨酰琥珀酸酶检测技术领域，公开了一种用于检测血清中精氨酰琥珀酸裂解酶的试剂及其制备方法，由R1和R2组成；R1由缓冲液、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶、酶保护剂、防腐剂、表面活性剂和乙二胺四乙酸组成；R2由缓冲液、精氨酸代琥珀酸二钠盐、乙二胺四乙酸和硫酸肼组成。加入样本10ul，加入R1，200ul，混匀，37℃孵育2‑3min；加入R2，50ul，混匀，37℃孵育1min后，连续测定3min内的吸光度，计算吸光度变化率。本发明通过检测ASAL催化精氨琥珀酸生成的另一种产品延胡索酸酶，利用NAD+在340nm处有吸收峰的特性，通过全自动生化仪检测ASAL的量。

Description

一种用于检测血清中精氨酰琥珀酸裂解酶的试剂及其制备 方法
技术领域
本发明属于精氨酰琥珀酸酶检测技术领域，尤其涉及一种用于检测血清中精氨酰琥珀酸裂解酶的试剂及其制备方法。
背景技术
精氨酰琥珀酸酶(ASAL)又称精氨酰琥珀酸裂解酶，是肝脏尿素循环的重要酶系之一，催化精氨琥珀酸生成精氨酸和延胡索酸。ASAL主要表达于人的肝脏、肾脏及红细胞中。尽管ASAL在肾脏中有表达，但血清ASAL活性在肾脏患者中不增高，而肝炎患者则明显增高。传统的检测慢性肝病最主要的两个指标为丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)，但是根据俸家富等发表的文献报道，丙氨酸氨基转移酶(ALT)诊断慢性肝病的敏感性为97.6％，特异性为24.7％；天门冬氨酸氨基转移酶(AST)诊断慢性肝病的敏感性为83.8％，特异性仅为28.3％；而ASAL对判断慢性肝病的敏感性为100.0％，特异性为91.1％；因此，ASAL有望成为敏感且特异的肝炎标志物。在检测血清ASAL活性的探索中，主要以测定ASA L催化精氨琥珀酸生成精氨酸为基础。然而，血清中含有较高浓度的精氨酸，加上所用方法操作繁琐，试剂不够稳定，因而没有进入临床使用。
综上所述，现有技术存在的问题是：由于检测标记物本身的缺陷，ALT、 AST对于慢性肝病的检测存在特异性较差的问题，而虽然ASAL的特异性较高，但是由于方法学的问题，ASAL一直没办法准确的检测。本发明提供了一种准确检测血清中ASAL的试剂及其制备方法。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于检测血清中精氨酰琥珀酸裂解酶的试剂及其制备方法。
本发明是这样实现的，一种用于检测血清中精氨酰琥珀酸裂解酶的试剂，所述用于检测血清中精氨酰琥珀酸裂解酶的试剂由R1和R2组成，R1与R2的比值为4:1；
R1：pH7.0，由缓冲液50-200mmol/L、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.2-0.5mmol/L、延胡索酸酶2-10KU/L、苹果酸脱氢酶2-10KU/L、酶保护剂1g/L、防腐剂1g/L、表面活性剂1g/L和乙二胺四乙酸1g/L组成；
R2：pH9.0，由缓冲液50-200mmol/L、精氨酸代琥珀酸二钠盐0.1-2mmol/L、乙二胺四乙酸1g/L和硫酸肼0.05-0.5mol/L组成。
进一步，所述R1中的缓冲液为磷酸盐缓冲液、tris-HCl缓冲液中的一种或几种；酶保护剂为牛血清白蛋白、乙二醇、葡聚糖的一种或者几种；防腐剂为叠氮钠表面活性剂为直链烷基苯磺酸钠、壬基酚聚氧乙烯醚中的一种。
进一步，所述R2中缓冲液为硼砂缓冲液、甘氨酸缓冲液、CHES缓冲液的一种。
进一步，所述用于检测血清中精氨酰琥珀酸裂解酶的试剂的反应原理为：
本发明的另一目的在于提供一种所述用于检测血清中精氨酰琥珀酸裂解酶的试剂的制备方法，所述用于检测血清中精氨酰琥珀酸裂解酶的试剂的制备方法包括以下步骤：
步骤一，加入样本10ul，加入R1，200ul，混匀，37℃孵育2-3min；
步骤二，加入R2，50ul，混匀，37℃孵育1min后，连续测定3min内的吸光度，计算吸光度变化率。
本发明的另一目的在于提供一种使用所述用于检测血清中精氨酰琥珀酸裂解酶的试剂检测的精氨酰琥珀酸裂解酶。
本发明的优点及积极效果为：本发明通过检测ASAL催化精氨琥珀酸生成的另一种产品延胡索酸酶，利用NAD+在340nm处有吸收峰的特性，通过全自动生化仪检测ASAL的量。
精氨酸琥珀酸裂解酶，是尿素合成代谢中的一种酶，肝脏中含量丰富。当肝脏发生病变时，随肝细胞破坏ASAL就进入血液，所以，此酶测定较转氨酶测定对肝脏疾病有较高的特异性。有助于诊断急慢性肝炎，尤其是HBsAg阳性而ALT升高不显著的病人，作出早期诊断有较大价值。
根据俸家富教授在中华肝脏病杂志论文报道，ASAL对判断慢性肝病的敏感性为100.0％,特异性为91.1％；而丙氨酸氨基转移酶(ALT)诊断慢性肝病的敏感性为97.6％,特异性为24.7％；天门冬氨酸氨基转移酶(AS T)诊断慢性肝病的敏感性为83.8％,特异性仅为28.3％。因此,ASAL有望成为敏感且特异的肝炎标志物。
附图说明
图1是本发明实施例提供的用于检测血清中精氨酰琥珀酸裂解酶的试剂的制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的线性检测图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明利用NAD+在340nm处有吸收峰的特性，通过全自动生化仪检测 ASAL的量。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
本发明实施例提供的用于检测血清中精氨酰琥珀酸裂解酶的试剂由R1和 R2组成。R1与R2的比值为4:1。
R1：pH7.0，由缓冲液(50-200mmol/L)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+) (0.2-0.5mmol/L)、延胡索酸酶(2-10KU/L)、苹果酸脱氢酶(2-10KU/L)、酶保护剂(1g/L)、防腐剂(1g/L)、表面活性剂(1g/L)和乙二胺四乙酸(EDTA) (1g/L)组成。
R1中，缓冲液为磷酸盐缓冲液、tris-HCl缓冲液中的一种或几种酶保护剂为牛血清白蛋白、乙二醇、葡聚糖的一种或者几种；防腐剂为叠氮钠表面活性剂为直链烷基苯磺酸钠、壬基酚聚氧乙烯(10)醚中的一种。
R2：pH9.0，由缓冲液(50-200mmol/L)、精氨酸代琥珀酸二钠盐 (0.1-2mmol/L)、乙二胺四乙酸(EDTA)(1g/L)和硫酸肼(0.05-0.5mol/L)组成。
R2中缓冲液为硼砂缓冲液、甘氨酸缓冲液、CHES缓冲液的一种。
本发明实施例提供的用于检测血清中精氨酰琥珀酸裂解酶的试剂的反应原理为：
如图1所示，本发明实施例提供的用于检测血清中精氨酰琥珀酸裂解酶的试剂的制备方法包括以下步骤：
S101：加入样本10ul，加入R1，200ul，混匀，37℃孵育2-3min；
S102：加入R2，50ul，混匀，37℃孵育1min后，连续测定3min内的吸光度，计算吸光度变化率。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
实施例1
本发明实施例的检测血清中精氨酰琥珀酸裂解酶的试剂盒，它包括R1和 R2试剂，R1和R2均以水为溶剂。
R1试剂包含以下组分：
R2试剂包含以下组分：
1、重复性测定：
对同一样本连续测定20次，测得平均值、标准差、变异系数如下：
生化检测要求变异系数不大于10％，本发明的变异系数为1.5％，远低于10％的标准，因此方案的重复性良好。
2、准确度检测
靶值 6.5
测定值1 6.34
测定值2 6.38
测定值3 6.31
测定均值 6.34
相对偏差 2.41％
生化检测要求准备度相对偏差不大于10％，本发明的相对偏差为 2.41％，远低于标准，因此方案的准确度良好。
3、线性检测
将标准品按照比例稀释成5个梯度，每个梯度检测3次，取平均值做回归曲线，计算r值和想对偏差。
稀释倍数 1 2 4 6 8
测定值1 6.37 3.11 1.71 1.03 0.8
测定值2 6.4 3.18 1.79 1.05 0.87
测定值3 6.33 3.17 1.78 0.99 0.84
测定平均值 6.37 3.15 1.76 1.02 0.84
靶值 6.5 3.25 1.625 1.083 0.812
相对偏差 2.05％ 2.97％ -8.31％ 5.51％ -3.04％
相关系数r2＝0.9987，线性方程y＝1.0296x-0.0517，结果表明，本试剂相关性良好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种用于检测血清中精氨酰琥珀酸裂解酶的试剂，其特征在于，所述用于检测血清中精氨酰琥珀酸裂解酶的试剂由R1和R2组成；R1与R2的比值为4:1；
R1：pH7.0，由缓冲液50-200mmol/L、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.2-0.5mmol/L、延胡索酸酶2-10KU/L、苹果酸脱氢酶2-10KU/L、酶保护剂1g/L、防腐剂1g/L、表面活性剂1g/L和乙二胺四乙酸1g/L组成；
R2：pH9.0，由缓冲液50-200mmol/L、精氨酸代琥珀酸二钠盐0.1-2mmol/L、乙二胺四乙酸1g/L和硫酸肼0.05-0.5mol/L组成。
2.如权利要求1所述的用于检测血清中精氨酰琥珀酸裂解酶的试剂，其特征在于，所述R1中的缓冲液为磷酸盐缓冲液、tris-HCl缓冲液中的一种或几种；酶保护剂为牛血清白蛋白、乙二醇、葡聚糖的一种或者几种；防腐剂为叠氮钠表面活性剂为直链烷基苯磺酸钠、壬基酚聚氧乙烯醚中的一种。
3.如权利要求1所述的用于检测血清中精氨酰琥珀酸裂解酶的试剂，其特征在于，所述R2中缓冲液为硼砂缓冲液、甘氨酸缓冲液、CHES缓冲液的一种。
4.如权利要求1所述的用于检测血清中精氨酰琥珀酸裂解酶的试剂，其特征在于，所述用于检测血清中精氨酰琥珀酸裂解酶的试剂的反应原理为：
5.一种如权利要求1所述用于检测血清中精氨酰琥珀酸裂解酶的试剂的制备方法，其特征在于，所述用于检测血清中精氨酰琥珀酸裂解酶的试剂的制备方法包括以下步骤：
步骤一，加入样本10ul，加入R1，200ul，混匀，37℃孵育2-3min；
步骤二，加入R2，50ul，混匀，37℃孵育1min后，连续测定3min内的吸光度，计算吸光度变化率。
6.一种使用权利要求1～4任意一项所述用于检测血清中精氨酰琥珀酸裂解酶的试剂检测的精氨酰琥珀酸裂解酶。
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