CN101003831A - 肝胆系统疾病诊断试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种血清胆汁酸的测定试剂。目的是提供一种血清胆汁酸测定试剂的改进，该试剂应具有稳定性好、准确性和灵敏度高的特点。技术方案是：肝胆系统疾病诊断试剂盒，该试剂包括两组试剂：试剂1中有硫代氧化型辅酶、缓冲液、防腐剂、抗干扰剂；试剂2中有3αHSD、还原型辅酶、缓冲液、防腐剂、络合剂、高分子加速剂、稳定剂；所述的试剂2中还包括以下几种系统中的一种：甲酸脱氢酶～甲酸～NAD、谷氨酸脱氢酶～谷氨酸～氧化型烟酰胺辅酶、葡萄糖－6－磷酸脱氢酶～葡萄糖～氧化型烟酰胺辅酶、葡萄糖脱氢酶～木糖～氧化型烟酰胺辅酶、乳酸脱氢酶～a－酮戊二酸～氧化型烟酰胺辅酶、甘油脱氢酶～乙二醇－氧化型烟酰胺辅酶。
Description
技术领域
本发明涉及一种血清成分的测定试剂，具体是血清胆汁酸的测定试剂，属于生物制剂技术领域。
背景技术
医学研究表明，胆汁酸的生成和代谢与肝有十分密切的关系，血清中总胆汁酸水平是反映肝实质损伤的重要指标，尤其是急性肝炎、肝硬化、中毒性肝炎等是有较灵敏的变化。但其在血清中浓度很低(微摩尔水平)，不易检测，过去主要因检测手段复杂，要求特殊设备而未能实用化、也难以用于自动分析，限制了日常检验中的应用。
过去，血清胆汁酸的分析主要采用高效液相色谱法(HPLC)、HPLC-紫外光谱法、气相色谱法、放射免疫测定法、酶荧光法、生物发光和酶比色法等，但这些方法都很复杂或需要特殊的设备而不能实现常规化。现有的胆汁酸检测试剂(参见申请号为02119402.5的中国专利申请)，由于采用了3a-HSD建立的循环酶法使胆汁酸的测定得以广泛应用。但是试剂中的NADH随着存放时间的延长，NADH会转化为NAD，使整个反应受其影响，因为血清中胆汁酸含量就很低，NADH的浓度改变，使酶反应失去平衡，达不到最大反应速度，直接影响了结果的准确性，而且低值样品重复性非常差。
发明内容
本发明的目的是克服上述背景技术的不足，提供一种血清胆汁酸测定试剂的改进，所提供的测定试剂应具有稳定性好、准确性和灵敏度高的特点，并且操作方便。
本发明提供的技术方案是：肝胆系统疾病诊断试剂盒，该试剂包括下列两个试剂组份：
试剂1：
硫代氧化型辅酶Thio-NAD 0.81g/L～1.2g/L
缓冲液 5.0g/L～20.0g/L
防腐剂 0.2g/L～1.5g/L
抗干扰剂 1.0g/L～62g/L
试剂2：
3α-羟类固醇脱氢酶(3αHSD) 8ku/L～15ku/L
还原型辅酶NADH 4.0g/L～10.0g/L
缓冲液 5.0g/L～30g/L
防腐剂 0.2g/L～1.5g/L
络合剂 0.5g/L～1.0g/L
高分子加速剂 1.0g/L～5.0g/L
稳定剂 5g/L～10.0g/L
试剂1与试剂2使用时的比例为3∶1；
所述的试剂2中还包括以下几种系统中的一种：甲酸脱氢酶～甲酸～NAD系统、谷氨酸脱氢酶～谷氨酸～氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶～葡萄糖～氧化型烟酰胺辅酶系统、葡萄糖脱氢酶～木糖～氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、乳酸脱氢酶～a-酮戊二酸～氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、甘油脱氢酶～乙二醇-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统。以便将氧化型烟酰胺辅酶或其类似物生成还原型辅酶或其类似物所需的酶和底物系统，在试剂内形成酶-底物-NAD、酶-底物-(thio-NAD)、酶-底物-NADP或酶-底物-(thio-NADP)酶再生反应系统。
所述的试剂2中，甲酸脱氢酶～甲酸～NAD系统中甲酸含量为0.8g/L～10g/L，甲酸脱氢酶含量为2ku/L～10ku/L。
所述的试剂2中，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶～葡萄糖～氧化型烟酰胺辅酶系统中的D-葡萄糖含量3g/L～12g/L，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶含量为3.0ku/L～8.0ku/L。
所述的试剂1和试剂2中还可分别加入表面活性剂1ml/L～5ml/L。
本发明应用将氧化型烟酰胺辅酶或其类似物生成还原型辅酶或其类似物所需的酶和底物系统，在试剂内形成酶-底物-NAD、酶-底物-(thio-NAD)、酶-底物-NADP或酶-底物-(thio-NADP)酶再生反应系统，使还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或类似物自发氧化后生成的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或类似物在上述再生反应系统作用下再生，从而维持还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或类似物在试剂中的浓度，保证了反应的均衡性。与现有试剂盒相比，本发明提供的试剂盒不仅便于推广应用，而且由于应用酶再生系统来维持还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(或类似物)在试剂中的浓度，不但稳定性更好，还显著延长了试剂的保藏时间。此外，试剂中加入抗干扰剂，所以不受内源性物质的干扰。保证了很好的准确性和灵敏度。可用来检测人血清中总胆汁酸(Total bile acide，TBA)的含量，对急性肝炎、肝硬化、中毒性肝炎以及胆汁淤积的诊断、监护提供了方便，具有重要的临床意义。
具体实施方式
现有的胆汁酸检测试剂随着存放时间的延长，试剂中反应所需要的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或其类似物(thio-NADH、NADPH)在试剂中易被氧化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或其类似物(thio-NAD、NADP)，使反应失去平衡，影响检测结果。我们通过大量实验研究，确定应用了将氧化型烟酰胺辅酶或其类似物生成还原型烟酰胺辅酶或其类似物所需的酶和底物系统，在试剂内形成酶-底物-NAD酶再生系统，使试剂中的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或其类似物保持稳定，从而保证测定结果的准确性，以便更好对疾病作出准确的诊断。就此提出的技术方案是：
肝胆系统疾病诊断、监护试剂盒，该试剂包括下列两个试剂组份：
试剂1：
硫代氧化型辅酶(Thio-NAD) 0.81g/L～1.2g/L
缓冲液 5.0g/L～20.0g/L
抗干扰剂 0.5g/L～62g/L
防腐剂 0.2g/L～1.5g/L
试剂2：
3α-羟类固醇脱氢酶(3αHSD) 8ku/L～15ku/L
还原型辅酶NADH 4.0g/L～10.0g/L
缓冲液 5.0g/L～30g/L
防腐剂 0.2g/L～1.5g/L
络合 0.5g/L～1.0g/L
高分子加速剂 1.0g/L～5.0g/L
稳定剂 5g/L～10.0g/L
试剂1与试剂2使用时的比例为3∶1。
所述的试剂2中还包括将氧化型烟酰胺辅酶或其类似物生成还原型辅酶或其类似物所需的酶和底物系统，在试剂内形成酶-底物-NAD、酶-底物-(thio-NAD)、酶-底物-NADP或酶-底物-(thio-NADP)酶再生反应系统。具体如以下几种系统中的一种：甲酸脱氢酶～甲酸～NAD系统、谷氨酸脱氢酶～谷氨酸～氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶～葡萄糖～氧化型烟酰胺辅酶系统、葡萄糖脱氢酶～木糖～氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、乳酸脱氢酶～a-酮戊二酸～氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、甘油脱氢酶～乙二醇～氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统。
所述的试剂2中，甲酸脱氢酶～甲酸～NAD系统中各成分含量可根据需要确定；推荐值：甲酸含量为0.8g/L～10g/L，甲酸脱氢酶含量为2 ku/L～10ku/L。
所述的试剂2中，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶～葡萄糖～氧化型烟酰胺辅酶系统中各成分含量可根据需要确定；推荐值：D-葡萄糖含量3g/L～12g/L，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶含量为3.0ku/L～8.0ku/L。
所述的试剂2中，谷氨酸脱氢酶～谷氨酸～氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶～葡萄糖～氧化型烟酰胺辅酶系统、葡萄糖脱氢酶～木糖～氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、乳酸脱氢酶～a-酮戊二酸～氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、甘油脱氢酶～乙二醇～氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统中，各成分的含量可按需要确定。
所述的试剂1和试剂2中还可分别加入表面活性剂1ml/L～5ml/L。
所述的抗干扰剂是：草氨酸钠、dermaran G50、BPS(bathophenanthrolinedisulfonic acid)中的一种或几种。
所述的表面活性剂可以是非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性离子表面活性剂，这里优选非离子表面活性剂，作为实例有：Theist、Tween系列(如Tween-20)、聚氧乙烯月桂醚系列、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚等，这些表面活性剂可以单独使用，也可以两种或两种以上混合使用，这里不作限制。
所述的络合剂是EDTA.2Na、HEDTA.2Na。
所述的防腐剂是叠氮钠(NaN3)、抗生素、对羟基苯甲酸甲酯、山梨醇中的一种或几种。
所述的高分子加速剂是乙二醇400(PEG-400)、聚乙二醇6000(PEG-6000)、聚乙二醇8000(PEG-8000)，优选聚乙二醇6000。
所述的缓冲液是甘氨酸、GOOd’S缓冲液、乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、硼酸盐缓冲液、3-(环己氨)-2-羟基丙磺酸中的一种或几种，其PH值可在2.0～11.0，缓冲液的浓度在5～200mmol/L范围内，优选10～100mmol/L。
所述的稳定剂是氯化镁、牛(人)血清白蛋白、乙二醇、甘露糖醇、海藻糖中的一种或几种。
以上各种生化原料及试剂均可外购获得。
以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例：
实施例一
试剂1：
缓冲液甘氨酸 7.5g/L
硫代氧化型辅酶Thio-NAD 0.81g/L
防腐剂NaN3 0.2g/L
表面活性剂Tween-20 3ml/L
抗干扰剂草氨酸钠 1.0g/L
抗干扰剂dermaran G50 0.5g/L
抗干扰剂BPS 0.5g/L
试剂2：
缓冲液3-(环己氨)-2-羟基丙磺酸 15.0g/L
表面活性剂Tween-20 1ml/L
甲酸 0.8g/L
甲酸脱氢酶 5ku/L
3αHSD 12ku/L
还原型辅酶NADH 6.1g/L
防腐剂NaN3 0.2g/L
络合剂EDTA.2Na 0.75g/L
高分子加速剂PEG-6000 2.5g/L
稳定剂海藻糖 10g/L
实施例二
试剂1：
缓冲液甘氨酸 0.8g/L
硫代氧化型辅酶Thio-NAD 1.0g/L
防腐剂NaN3 1.0g/L
表面活性剂Tween-20 5.0ml/L
抗干扰剂草氨酸钠 25g/L
抗干扰剂dermaran G50 8.5g/L
抗干扰剂BPS 1.8g/L
试剂2：
缓冲液3-(环己氨)-2-羟基丙磺酸 5.0g/L
表面活性剂Tween-20 5.0ml/L
甲酸 10.0g/L
甲酸脱氢酶 10ku/L
3α-HSD 14ku/L
还原型辅酶NADH 5.0g/L
防腐剂NaN3 1.5g/L
络合剂EDTA.2Na 0.5g/L
高分子加速剂PEG-6000 1.0g/L
稳定剂海藻糖 5.0g/L
实施例三
试剂1：
缓冲液甘氨酸 20.0g/L
硫代氧化型辅酶Thio-NAD 1.2g/L
防腐剂NaN3 1.5g/L
表面活性剂Tween-20 1.0ml/L
抗干扰剂草氨酸钠 50g/L
抗干扰剂dermaran G50 10.0g/L
抗干扰剂BPS 2.0g/L
试剂2：
缓冲液3-(环己氨)-2-羟基丙磺酸 30.0g/L
表面活性剂Tween-20 1.5ml/L
D-葡萄糖 7.0g/L
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 3.0ku/L
3αHSD 13ku/L
还原型辅酶NADH 10.0g/L
防腐剂NaN3 0.5g/L
络合剂EDTA.2Na 1.0g/L
高分子加速剂PEG-6000 5.0g/L
稳定剂海藻糖 6.5g/L
实施例四
试剂1：
缓冲液甘氨酸 10g/L
硫代氧化型辅酶Thio-NAD 1.0g/L
防腐剂NaN3 1.0g/L
表面活性剂Tween-20 3.0ml/L
抗干扰剂草氨酸钠 20g/L
抗干扰剂dermaran G50 8.5g/L
抗干扰剂BPS 1.2g/L
试剂2：
缓冲液3-(环己氨)-2-羟基丙磺酸 9.0g/L
表面活性剂Tween-20 2.0ml/L
D-葡萄糖 12.0g/L
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 8.0ku/L
3α-HSD 12ku/L
还原型辅酶NADH 4.0g/L
防腐剂NaN3 1.5g/L
络合剂EDTA.2Na 0.5g/L
高分子加速剂PEG-6000 5.0g/L
稳定剂海藻糖 80g/L
具体测试步骤如下：
| 加入物 | 空白管(B) | 校准管(S) | 样品管(U) |
| 生理盐水(μl) | 4 | —— | —— |
| 校准液(μl) | —— | 4 | —— |
| 样品(μl) | —— | —— | 4 |
| R1(μl) | 270 | 270 | 270 |
| 混匀，37℃孵育5分钟 | |||
| 试剂2(μl) | 90 | 90 | 90 |
| 混匀，37℃反应10分钟后，在波长405nm处以读取各管的吸光度值A1。 | |||
结果计算
式中：ΔAU以空白管吸光度为对照的样品管吸光度
ΔAS以空白管吸光度为对照的校准管吸光度
CS校准液中胆汁酸的浓度
Claims (4)
1、肝胆系统疾病诊断试剂盒，该试剂包括下列两个试剂组份：
试剂1：
硫代氧化型辅酶Thio-NAD 0.81g/L～1.2g/L
缓冲液 5.0g/L～20.0g/L
防腐剂 0.2g/L～1.5g/L
抗干扰剂 1.0g/L～62g/L
试剂2：
3α-羟类固醇脱氢酶(3αHSD) 8ku/L～15ku/L
还原型辅酶NADH 4.0g/L～10.0g/L
缓冲液 5.0g/L～30g/L
防腐剂 0.2g/L～1.5g/L
络合剂 0.5g/L～1.0g/L
高分子加速剂 1.0g/L～5.0g/L
稳定剂 5g/L～10.0g/L
试剂1与试剂2使用时的比例为3∶1；
其特征在于所述的试剂2中还包括以下几种系统中的一种：甲酸脱氢酶～甲酸～NAD系统、谷氨酸脱氢酶～谷氨酸～氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶～葡萄糖～氧化型烟酰胺辅酶系统、葡萄糖脱氢酶～木糖～氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、乳酸脱氢酶～a-酮戊二酸～氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、甘油脱氢酶～乙二醇～氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统。以便将氧化型烟酰胺辅酶或其类似物生成还原型辅酶或其类似物所需的酶和底物系统，在试剂内形成酶-底物-NAD、酶-底物-(thio-NAD)、酶-底物-NADP或酶-底物-(thio-NADP)酶再生反应系统。
2、根据权利要求1所述的肝胆系统疾病诊断试剂盒，其特征在于所述的试剂2中，甲酸脱氢酶～甲酸～NAD系统中甲酸含量为0.8g/L～10g/L，甲酸脱氢酶含量为2ku/L～10ku/L。
3、根据权利要求1所述的肝胆系统疾病诊断试剂盒，其特征在于所述的试剂2中，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶～葡萄糖～氧化型烟酰胺辅酶系统中的D-葡萄糖含量3g/L～12g/L，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶含量为3.0ku/L～8.0ku/L。
4、根据权利要求2或3所述的肝胆系统疾病诊断试剂盒，其特征在于所述的试剂1和试剂2中还可分别加入表面活性剂1ml/L～5ml/L。
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Open date: 20070725 |