CN104359906A

CN104359906A - 一种稳定、抗干扰能力强的血清总胆汁酸检测试剂

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Publication number: CN104359906A
Application number: CN201410696971.4A
Authority: CN
Inventors: 杨君莉; 李志明; 甘宜梧; 谭柏清; 谢清华; 包兴艳; 赵新
Original assignee: Biobase Biodustry Shandong Co Ltd
Current assignee: Biobase Biodustry Shandong Co Ltd
Priority date: 2014-11-28
Filing date: 2014-11-28
Publication date: 2015-02-18
Anticipated expiration: 2034-11-28
Also published as: CN104359906B

Abstract

本发明公开了一种稳定、抗干扰能力强的总胆汁酸的检测试剂，属于临床体外检测技术领域。该试剂中采用新型MES和HEPES生物缓冲体系并添加了新型两性表面活性剂椰油酰胺丙基甜菜碱和非离子表面活性剂烷基糖苷，试剂的抗干扰能力和稳定性得到大幅提升。此外，本试剂R2组分中还添加了γ-Fe₂O₃纳米粒子，其特殊的纳米效应和生物类酶活性特点使其可以有效提高试剂中的NADH和3α-HSD酶的活性并催化反应的进行，提高了分析检测的准确度。因而该试剂可以有效的检测血清总胆汁酸的含量，抗干扰能力强，稳定性好。

Description

一种稳定、抗干扰能力强的血清总胆汁酸检测试剂

技术领域

本发明涉及用于临床测定血清中总胆汁酸含量的试剂，属于临床体外检测技术领域。

背景技术

总胆汁酸(TBA)是在肝脏内合成与甘氨酸或牛磺酸结合成为结合型胆汁酸，然后被肝细胞分泌入胆汁，随胆汁至肠道后，在肠道内细菌作用下被水解成游离型胆汁酸，有97%被肠道重新吸收后回到肝脏，如此循环不息，这样能使总胆汁酸发挥最大生理效应，更可防止总胆汁酸大量进入循环中对其它组织细胞的毒害（总胆汁酸的PH值非常低）。正常人血中胆汁酸浓度很低且相对稳定，一旦当肝细胞发生病变，血清TBA很容易升高，血清TBA升高与肝细胞损伤程度成正比，因而血清TBA水平是反映肝实质损伤的一项重要指标。目前对于总胆汁酸的检测方法主要有酶比色法和循环法两种。临床上常用循环法对总胆汁酸进行检测。循环法检测血清总胆汁酸的原理主要如下：

胆汁酸被3α-羟基类固醇脱氢酶（3α-HSD）及Thio-NAD⁺（二核苷酸氧化型）特异性地氧化，生成3-酮类固醇及Thio-NADH（二核苷酸还原型）。生成的3-酮类固醇在3α-HSD及Thio-NADH存在下，生成胆汁酸和NAD⁺。通过上述循环，血清中微量的胆汁酸得到了放大，Thio-NADH也同比的扩增，于是通过测定Thio-NADH在405nm处特异性的吸光度变化，即可计算得到标本中胆汁酸的含量。市场上循环法检测总胆汁酸的试剂种类也较多，但试剂稳定性及抗干扰能力普遍不好，因而检测效果也不理想。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测血清中总胆汁酸的试剂。该试剂可以有效检测血清总胆汁酸的含量，抗干扰能力强，稳定性好。

本发明采用以下技术方案：

一种稳定、抗干扰能力强的总胆汁酸检测试剂，其特征在于，它包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1的组成为：

2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液（pH4.5） 80-150mmol/L

thioNAD⁺ 0.6-1.2g/L

BSA 0.8-1.2g/L

蔗糖 8-15g/L

甘露醇 8-15g/L

烷基糖苷 0.6-2g/L

椰油酰胺丙基甜菜碱 0.6-2g/L

叠氮钠 0.8-1.5g/L；

试剂R2组成为：

4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液（pH9.2） 150-300mmol/L

3α-羟基类固醇脱氢酶 10-20KU/L

NADH 2-5g/L

BSA 0.6-1.2g/L

纳米粒子 10-30mmol/L

蔗糖 8-15g/L

甘露醇 8-15g/L

烷基糖苷 0.6-2g/L

椰油酰胺丙基甜菜碱 0.6-2g/L

叠氮钠 0.8-1.5g/L。

上述纳米粒子为γ-Fe₂O₃纳米粒子，粒径为5-30nm。

作为本发明的一种优选，所述试剂R1中各组分为：

2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液（pH4.5） 100mmol/L

thioNAD⁺ 0.8g/L

BSA 1.0g/L

蔗糖 10g/L

甘露醇 10g/L

烷基糖苷 1g/L

椰油酰胺丙基甜菜碱 1g/L

叠氮钠 1g/L。

作为本发明的另一种优选，所述试剂R2中各组分为：

4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液（pH9.2） 200mmol/L

3α-羟基类固醇脱氢酶 15KU/L

NADH 3g/L

BSA 1g/L

纳米粒子 20mmol/L

蔗糖 10g/L

甘露醇 10g/L

烷基糖苷 1g/L

椰油酰胺丙基甜菜碱 1g/L

叠氮钠 1g/L。

本发明所述的γ-Fe₂O₃纳米粒子是采用常规微乳-水热法或超声沉淀法合成。

本发明的有益效果是：

1）采用新型2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）和 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）生物缓冲液，该两种缓冲液具有水溶性好、不易螯合盐离子、在可见光和紫外光波段没有明显光吸收、pH不易受温度变化的影响等优点；因此，可以给试剂中NADH和3α-HSD提供极其温和的储存和反应条件，有效提高试剂的稳定性和抗干扰能力。

2）采用新型两性表面活性剂椰油酰胺丙基甜菜碱与非离子表面活性剂烷基糖苷（APG）联用，可显著增强其抗静电和抑菌特性，使

试剂的抗干扰能力和稳定性得到大幅提升。

3）γ-Fe₂O₃纳米粒子特殊的纳米效应和生物类酶活性特点使其可以有效提高试剂中的NADH和3α-HSD酶的活性并催化反应的进行，保证了试剂具有较好的检测灵敏度和准确度。

附图说明

图1是本发明实施例1所得试剂与对照组试剂检测结果线性相关图；

图2是本发明实施例2所得试剂与对照组试剂检测结果线性相关图；

图3是本发明实施例3所得试剂与对照组试剂检测结果线性相关图；

图4是本发明实施例1-3所得试剂与对照组试剂稳定性试验结果图。

具体实施方式

实施例 1

一种稳定、抗干扰能力强的总胆汁酸的检测试剂，包括试剂R1和试剂R2。

其中，试剂R1的组成为：

MES（2-（N-吗啉代）乙磺酸）缓冲液（pH4.5） 80mmol/L

thioNAD⁺ 0.6g/L

BSA 0.8g/L

蔗糖 8g/L

甘露醇 8g/L

烷基糖苷（APG） 0.6g/L

椰油酰胺丙基甜菜碱 0.6g/L

叠氮钠（NaN₃） 0.8g/L；

试剂R2组成为：

HEPES（ 4-羟乙基哌嗪乙磺酸）缓冲液（pH9.2） 150mmol/L

3α-羟基类固醇脱氢酶（3α-HSD） 10KU/L

NADH 2g/L

BSA 0.6g/L

纳米粒子 10mmol/L

蔗糖 8g/L

甘露醇 8g/L

烷基糖苷（APG） 0.6g/L

椰油酰胺丙基甜菜碱 0.6g/L

叠氮钠（NaN₃） 0.8g/L。

上述纳米粒子为粒径为5-20nm的γ-Fe₂O₃纳米粒子。

实施例2

其中，试剂R1的组成为：

MES（2-（N-吗啉代）乙磺酸）缓冲液（pH4.5） 150mmol/L

thioNAD⁺ 1.2g/L

BSA 1.2g/L

蔗糖 15g/L

甘露醇 15g/L

烷基糖苷（APG） 2g/L

椰油酰胺丙基甜菜碱 2g/L

叠氮钠（NaN₃） 1.5g/L；

试剂R2组成为：

HEPES（ 4-羟乙基哌嗪乙磺酸）缓冲液（pH9.2） 300mmol/L

3α-羟基类固醇脱氢酶（3α-HSD） 20KU/L

NADH 5g/L

BSA 1.2g/L

纳米粒子 30mmol/L

蔗糖 15g/L

甘露醇 15g/L

烷基糖苷（APG） 2g/L

椰油酰胺丙基甜菜碱 2g/L

叠氮钠（NaN₃） 1.5g/L。

上述纳米粒子为粒径为20-30nm的γ-Fe₂O₃纳米粒子。

实施例3

其中，试剂R1的组成为：

MES（2-（N-吗啉代）乙磺酸）缓冲液（pH4.5） 100mmol/L

thioNAD⁺ 0.8g/L

BSA 1.0g/L

蔗糖 10g/L

甘露醇 10g/L

烷基糖苷（APG） 1g/L

椰油酰胺丙基甜菜碱 1g/L

叠氮钠（NaN₃） 1g/L。

试剂R2中各组分为：

HEPES（ 4-羟乙基哌嗪乙磺酸）缓冲液（pH9.2） 200mmol/L

3α-羟基类固醇脱氢酶（3α-HSD） 15KU/L

NADH 3g/L

BSA 1g/L

纳米粒子 20mmol/L

蔗糖 10g/L

甘露醇 10g/L

烷基糖苷（APG） 1g/L

椰油酰胺丙基甜菜碱 1g/L

叠氮钠（NaN₃） 1g/L。

上述纳米粒子为粒径为5-15nm的γ-Fe₂O₃纳米粒子。

本发明描述的总胆汁酸检测试剂的使用方法是：在使用时采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，如东芝40全自动分析仪等，利用双试剂速率法进行测定。将R1和R2放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、Randox复合校准品（英国朗道实验诊断有限公司）和样本，操作如表1：

表1本发明总胆汁酸检测试剂检测方法

计算：总胆汁酸含量（μmol/L）＝（∆A测定/min÷∆A标准/min）×C标准。

对本发明实施例1-3制得的试剂分别进行干扰性试验、相关性试验和稳定性对比试验。

干扰性试验：

取新鲜混合血清，分成2等份，然后将每等份再分成5等份，加入不同的干扰物质，使其在血清中的浓度达到表2的要求。然后分别用实施例1-3所得试剂，与市场常见并认可的TBA试剂同时对比测定血清中TBA的含量，对照组测定结果与加入不同干扰物质后各组的测定结果见表2。相对偏差(%)=(干扰样本的测定均值－对照样本的测定均值)/对照样本的测定均值×100%。

表2不同实施例试剂抗干扰性能比较

由表2可以看出，实施例1-3所得试剂在抗坏血酸≤5.6mmol/L、胆红素≤855μmol/L、血红蛋白≤5g/L、甘油三酯≤22.6mmol/L，对测试结果没有明显干扰。而对照组试剂在上述浓度干扰物质存在时，受到明显干扰，这说明本发明的试剂采用新型MES和HEPES生物缓冲液，并且通过油酰胺丙基甜菜碱与APG联用，使试剂的抗干扰能力得到大幅提升，其抗干扰性能远远优于对比试剂。

相关性试验：

按照实施例1-3配方配制试剂，与市场常见的国家食品药品监督管理局认可的某公司的总胆汁酸测定试剂进行对照检测试验，同时检测了20个临床血清样本，检测结果如表3所示。试验还研究了本发明实施例1-3所得的试剂与对照组试剂的相关性曲线（如图1-3所示）。

表3实施例1-3试剂与市场常见并得到认可的总胆汁酸测定试剂对比检测结果

通过图1-3的检测结果显示，本发明试剂与对照组试剂相关性较好，相关系数最高达0.9988，这说明本发明的检测试剂具有较好的灵敏度和准确度，这是由于本发明试剂中添加了具有类酶活性及纳米效应的γ-Fe₂O₃纳米粒子，其可以有效提高试剂中的NADH和3α-HSD酶的活性并催化反应的进行，保证了试剂具有较好的检测灵敏度和准确度，因而检测效果更好，完全符合国家食品药品监督管理局的要求。

试剂的稳定性对比试验：

对实施例1-3所制得的试剂，均匀分装13组作为试验组试剂，每组的试剂量为R1为18mL，R2为6mL；取13组市场常见的国家食品药品监督管理局认可的某公司的总胆汁酸（TBA）测定试剂盒作对照组，对照组与试验组同时放置到2-8℃冰箱中，每月的同一天取出一组试验组和对照组试剂检测TBA质控品（靶值为27.8μmol/L），检测结果如图4所示。

试验结果说明本发明实施例1-3制得的TBA测定试剂在2-8℃储存条件下比市场常见的TBA测定试剂更加稳定。

Claims

1.一种稳定、抗干扰能力强的总胆汁酸检测试剂，其特征在于，它包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1的组成为：

2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液（pH4.5） 80-150mmol/L

thioNAD⁺ 0.6-1.2g/L

BSA 0.8-1.2g/L

蔗糖 8-15g/L

甘露醇 8-15g/L

烷基糖苷 0.6-2g/L

椰油酰胺丙基甜菜碱 0.6-2g/L

叠氮钠 0.8-1.5g/L；

试剂R2组成为：

4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液（pH9.2） 150-300mmol/L

3α-羟基类固醇脱氢酶 10-20KU/L

NADH 2-5g/L

BSA 0.6-1.2g/L

纳米粒子 10-30mmol/L

蔗糖 8-15g/L

甘露醇 8-15g/L

烷基糖苷 0.6-2g/L

椰油酰胺丙基甜菜碱 0.6-2g/L

叠氮钠 0.8-1.5g/L。

2.根据权利要求1所述的总胆汁酸检测试剂，其特征在于，所述纳米粒子为γ-Fe₂O₃纳米粒子，粒径为5-30nm。

3.根据权利要求1所述的总胆汁酸检测试剂，其特征在于，所述试剂R1中各组分为：

2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液（pH4.5） 100mmol/L

thioNAD⁺ 0.8g/L

BSA 1.0g/L

蔗糖 10g/L

甘露醇 10g/L

烷基糖苷 1g/L

椰油酰胺丙基甜菜碱 1g/L

叠氮钠 1g/L。

4.根据权利要求1所述的总胆汁酸检测试剂，其特征在于，所述试剂R2中各组分为：

4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液（pH9.2） 200mmol/L

3α-羟基类固醇脱氢酶 15KU/L

NADH 3g/L

BSA 1g/L

纳米粒子 20mmol/L

蔗糖 10g/L

甘露醇 10g/L

烷基糖苷 1g/L

椰油酰胺丙基甜菜碱 1g/L

叠氮钠 1g/L。