CN105424934A - 一种N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶试剂及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明试剂NAG检测技术领域，特别试剂一种NAG检测试剂，试剂R1中含有缓冲液、VRA-NAG、牛血清白蛋白、TritonX-100、乙二醇、抗坏血酸氧化酶、防腐剂；试剂R2中含有缓冲液、防腐剂。本试剂采用新型底物VRA-NAG，此底物与其他底物相比水溶性好，稳定性强，是一种可靠的NAG底物。本试剂使用柠檬酸-磷酸氢二钠做缓冲液，大大提高了试剂的缓冲能力，同时不破坏反应体系。添加TritonX-100以及乙二醇做助溶剂，促进底物溶解，具有明显助溶效果。添加BSA做稳定剂，大大增强了试剂的稳定性以及抗干扰能力。产品配置简单，价格低廉，非常适合大面积临床推广。

Description

一种N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶试剂及检测方法

技术领域

本发明涉及N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶检测技术领域，特别涉及一种N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶检测试剂，还涉及使用此检测试剂的检测方法。

背景技术

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）是存在于细胞溶酶体内的一种水解酶，广泛分布于人体各组织中，但在前列腺和肾脏近端肾小管中含量最高。NAG分子量约为130-140KD，在正常情况下，血清中NAG不能通过肾小球从尿中排泄。尿中NAG主要来自肾近曲小管上皮细胞，但健康人尿中含量甚微。尿NAG活性水平的增高，是早期肾损伤和糖尿病微血管病变的敏感指标。NAG活性可用于肾小管间质性肾炎、尿路感染、糖尿病肾病综合症、高血压肾病、肾移植后的排异反应和肾病综合症的早期诊断。上述疾病时NAG活性的升高均早于其他相应指标，有利于疾病的早期发现和及时治疗。NAG活性还可用于重金属等肾毒性物质环境污染的人群筛查、职业病调查等。

目前，NAG的应用广泛的检测方法有PNP-NAG法、CNP-NAG法，MPT-NAG法等方法。PNP-NAG法是以P-硝基苯酚-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(PNP-NAG)做为底物，在NAG作用下，生成N-乙酰氨基葡萄糖，N-乙酰氨基葡萄糖在N-乙酰氨基葡萄糖氧化酶(NAGOD)的作用下生成H2O2。H2O2在过氧化物酶(POD)的作用下与高灵敏的发色剂双〔3-双(4-氯酚)甲基-4-二甲氨苯基〕胺(BCMA)反应，生成绿色色素。通过测定此色素可求得NAG的活力。此底物价廉，容易获得，但是必须设定样本空白，而且操作时间较长，不适合大批量自动化分析。CNP-NAG法是以2-氯-4-硝基苯乙酰氨基葡萄糖苷为底物，经NAG酶解后的产物不需碱化可直接呈色，，无需设样品空白，可实现大批量自动化操作，但底物较难溶，测定时需严格控制缓冲液pH值，底物溶液以新鲜配制为宜，操作繁琐。MPT-NAG是的测定原理是NAG催化6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（MPT-NAG）水解，生成产物6-甲基-2巯基吡啶（MPT），MPT在340nm处有强烈吸收能力，通过测定340nm处每分钟的吸光度增加速度计算NAG的活力。

在此基础上，本发明使用了新型的VRA-NAG[（4-（3-甲基-苯乙烯）-绕丹宁-3-乙酸氨基-N-乙酰氨基-beta-D-葡萄糖苷]物，它是一种新的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的衍生物，它与其他的底物相比具有水溶性好，稳定性强的优点。此外，采用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系，并添加多种表面活性剂起助溶作用，稳定剂起稳定作用，是一种更加稳定，抗干扰能力更强的NAG试剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测尿液中NAG的试剂及使用该试剂检测NAG含量的方法。该试剂盒采用VRA-NAG作为新型底物，可以更加有效的检测NAG含量，具有稳定性好，抗干扰能力强的特点。

基本原理

底物VRA-NAG在样品中的NAG的催化下，水解释放出有色化合物集团VRA，它在505nm波长处有吸收峰，检测505波长处吸光度的增加值就可以计算出NAG活性。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种NAG检测试剂，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1和试剂R2的组成如下：

1)试剂R1的组分为：

缓冲液...............................................................100mmol/L

VRA-NAG.........................................................3mmol/L

BSA....................................................................1g/L

乙二醇................................................................1ml/L

TritonX-100.........................................................1ml/L

抗坏血酸氧化酶..................................................1ml/L

防腐剂..................................................................2mmol/L

2)试剂R2的组分为：

缓冲液...................................................................1mol/L

防腐剂....................................................................2mmol/L

所述的NAG检测试剂，试剂R1中缓冲液为25℃，PH为5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。

所述的NAG检测试剂，试剂R2中缓冲液为25℃，PH为10.2的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。

所述的NAG检测试剂，所述防腐剂为NaN₃。

所述的NAG检测试剂来检测NAG的方法，使用全自动生化分析仪利用终点法进行测定，检测主波长为505nm。

所述的检测方法，R1试剂和R2试剂的比例为3：1。

本发明的有益效果：

1)采用新型底物VRA-NAG，此底物与其他底物相比水溶性好，稳定性强，是一种可靠的NAG底物。

2)采用表面活性剂TritonX-100以及乙二醇，对于底物的溶解具有很显著的助溶作用，并增强了试剂的抗干扰能力。

3)采用新的缓冲体系柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，大大提高了试剂的分析灵敏度。

附图说明

图1为两种试剂的相关性曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行机一步说明：

实施例1

N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶的检测试剂，包括试剂R1和试剂R2：

1)试剂R1的组分为：

柠檬酸-磷酸氢二钠钠缓冲液（PH=5.0）................................100mmol/L

VRA-NAG...........................................................................3mmol/L

BSA......................................................................................1g/L

乙二醇..................................................................................1ml/L

TritonX-100..........................................................................1ml/L

抗坏血酸氧化酶..................................................................1ml/L

防腐剂NaN_3..........................................................................2mmol/L

2)试剂R2的组分为：

碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（PH=10.2）................................1mol/L

防腐剂NaN_3...........................................................................2mmol/L

3)本实施例试剂的使用方法：

本实施例描述的NAG检测试剂，在使用时采用双试剂功能的全自动生化分析仪，如日立7180全自动生化分析仪等，利用两点终点法进行测定。将R1和R2按照3：1的比例放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本，操作如表1：

表1实施例1试剂检测方法

计算：NAG含量（U/L）＝（?A测定÷?A标准）×C标准。

实施例2

干扰性试验：取新鲜尿液，分为2等份，然后将每等份再分为5等份，加入不同的干扰物质，使其在尿液中浓度达到表2的要求。然后分别用实施例1所得试剂，与市场常见并认可的NAG试剂同时对比测定血清中UA的含量，对照组测定结果与加入不同干扰物质后各组的测定结果见表2。相对偏差(%)=(干扰样本的测定均值－对照样本的测定均值)/对照样本的测定均值×100%。

由表2可以看出，实施例1试剂在乳酸≤0.9g/L、丙酮酸≤20mg/L、酒石酸≤17mg/L、尿酸≤g/L、葡萄糖≤g/L、胆红素≤mg/L对测定结果没有明显干扰。而对照试剂在上述浓度干扰物质存在时，受到明显干扰，这说明实施例1试剂的抗干扰性能远远优于对比试剂。

表2实施例试剂抗干扰性能比较

实施例3

相关性试验：利用实施例1配方配制试剂，与市场常见的国家食品药品监督管理局认可的某公司的NAG试剂盒进行对照检查，同时检测了20个临床样本，检测结果如表3所示。并获得了两种试剂的相关性曲线（如图1所示），通过结果显示，两个试剂盒的相关系数为0.9994，说明两者有极大的相关性。

表3实施例1与市场常见并得到认可的NAG测定试剂盒对比检测结果

实施例4

分析灵敏度实验：用本发明NAG检测试剂盒测试已知浓度为38U/L的样本，记录吸光度差值。同时用市场认可的NAG试剂测试作为对照。检测结果如表4所示。

表4分析灵敏度实验结果

理论浓度（U/L）	实施例1检测结果ΔA	对照试剂检测结果ΔA
			38	0.0987	0.1745

通过检测数据可知，对照试剂的吸光度差值比实施例1的高，说明柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液使试剂的缓冲能力得到提高，并大大提高了试剂的分析灵敏度。

Claims (7)

1.一种N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶检测试剂，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1和试剂R2的组成如下：

试剂R1的组分为：

缓冲液........................................................................................100mmol/L

VRA-NAG..................................................................................3mmol/L

BSA.............................................................................................1g/L

乙二醇........................................................................................1ml/L

TritonX-100................................................................................1ml/L

抗坏血酸氧化酶........................................................................1ml/L

防腐剂........................................................................................2mmol/L

试剂R2的组分为：

缓冲液........................................................................................1mol/L

防腐剂.......................................................................................2mmol/L。

2.根据权利要求1所述的NAG检测试剂，其特征在于使用新型底物VRA-NAG。

3.根据权利要求1所述的NAG检测试剂，其特征在于试剂R1缓冲液为PH5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。

4.根据权利要求1所述的NAG检测试剂，其特征在于试剂R2缓冲液为PH10.2的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。

5.根据权利要求1所述的NAG检测试剂，其特征在于所述防腐剂为NaN₃。

6.一种使用权利要求1-5中任一项所述的NAG检测试剂来检测NAG的检测方法，其特征在于使用全自动生化分析仪利用两点终点法进行测定，检测主波长为505nm。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于R1试剂和R2试剂的比例为3:1。