CN102128795A - 一种蜂胶新鲜度的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种蜂胶新鲜度的测定方法，是从蜂胶中提取出β-葡萄糖苷酶；对提取出的β-葡萄糖苷酶进行活力测定；根据活力高低来确定蜂胶的新鲜度，当吸光度低于0.1absU时，认为蜂胶中已没有β-葡萄糖苷酶活力，确认蜂胶为不新鲜。本发明提供的方法根据蜂胶中β-葡萄糖苷酶活力随蜂胶储存温度、储存时间呈现明显的规律性，可以反应蜂胶在不同储存条件下的新鲜程度；该方法灵敏度高，不同产地的蜂胶呈现相似的变化规律；方法简单，仪器常见，具备实用性，检测费用低。
Description
技术领域
本发明属蜂胶检测方法，主要涉及一种蜂胶新鲜度的测定方法，通过测定蜂胶中β-葡萄糖苷酶活力高低来判定蜂胶的新鲜程度。
技术背景
蜂胶是西方蜜蜂从植物上采集加工而成的树脂状的复杂产品。现代药理研究表明，蜂胶具有抗病毒、抗菌消炎、抗肿瘤、抗氧化、降血脂、调节机体免疫功能等多种生物活性作用，在药品、保健品及化妆品等方面具有广阔的应用前景。
蜂胶化学成分复杂，目前已从蜂胶中分离鉴定出的化学成分有黄酮类、萜烯类、醌类、酯类、醇类、醛类、酚类、有机酸类，还有大量的氨基酸、酶类、维生素类、多糖及多种微量元素等。尤其是含有大量的类黄酮、酚酸和萜烯类化合物是蜂胶的重要特征。
尽管类黄酮类化合物和多酚类相对比较稳定，但在空气中与氧接触会被氧化分解。有研究表明，随储存时间的延长，蜂胶的主要活性成分(多酚和类黄酮)及生物学活性明显降低(Bonvehi & Coll，2000)。除了主要活性成分类黄酮外，蜂胶中还含有约10％的芳香挥发油，蜂胶中挥发油含量虽然不高，但成分相当复杂，发挥着许多药理活性，如抑菌(Trusheva et al.，2010；Popovaet al.，2009)，抗真菌(Ota et al.，2001)等。然而，这些挥发性成分随储存时间延长会慢慢挥发掉，从而使蜂胶药理活性降低。
蜂胶的化学成分复杂，药理活性的发挥是多种成分协同作用的结果，而目前我国的蜂胶国标仍以总黄酮的高低来确定蜂胶的质量，从而忽视了酚酸及挥发性成分的作用。蜂胶国家标准中也没有与新鲜度相关的理化指标，而蜂胶从蜂箱中采集后基本在室温下自然储存，不同储存时间的蜂胶其活性成分组成可能差异很大，这对蜂胶化学成分的稳定性及产品稳定性不利。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种蜂胶新鲜度的测定方法，是一种适用于蜂胶原材料，可以测定蜂胶新鲜的方法。
为了实现上述的发明目的，本发明的蜂胶新鲜度的测定方法包括：从蜂胶中提取出β-葡萄糖苷酶；对提取出的β-葡萄糖苷酶进行活力测定；根据活力高低来确定蜂胶的新鲜与否。
本发明具体通过以下步骤实现：
(1)蜂胶中β-葡萄糖苷酶的提取：蜂胶捣碎，过30目筛。取蜂胶粉末3.0g加入25mL pH6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，然后加入0.6g PVPP及少许石英砂。在冰浴上研磨成糊状。低温高速离心15min，上清液转移到另一只离心管中，低温高速离心30min取上清液定容至25mL，为粗酶液；
(2)取0.5mL粗酶液，加入0.5mL 30mM对-硝基β-D-葡萄糖苷(pNPG)混合，混合液在57℃的水浴锅中温育1.5h，加入2.5mL 1M Na2CO3终止反应，冷却至室温后，用分光光度计在400nm处测定吸光度。空白对照为混合液立即在100℃水浴中加热5min使酶灭活，然后加入2.5mL 1M Na2CO3终止反应。
(3)根据所测得的β-葡萄糖苷酶活力高低判定蜂胶新鲜度。由于吸光度准确范围为0.100～0.900absU，当吸光度低于0.1absU时，认为蜂胶中已没有β-葡萄糖苷酶活力，这样的蜂胶被认为是不新鲜的。β-葡萄糖苷酶活力以反应所测得的吸光度为单位(absU)。
新鲜度判定标准
蜂胶的新鲜度与所测得的吸光度成正比，吸光度越高，蜂胶越新鲜；吸光度越低，蜂胶越不新鲜。由于吸光度准确范围为0.100～0.900absU，当吸光度低于0.1absU时，认为蜂胶中已没有β-葡萄糖苷酶活力，这样的蜂胶被认为是不新鲜的。
本发明提供的方法具有以下优点：
1、蜂胶中β-葡萄糖苷酶活力随蜂胶储存温度、储存时间呈现明显的规律性，可以反应蜂胶在不同储存条件下的新鲜程度。
2、该方法灵敏度高，不同产地的蜂胶呈现相似的变化规律。
3、方法简单，仪器常见，检测费用低。
具体实施方式
本发明结合实施例作进一步的说明。
实施例1
分别取-20℃、4℃和室温下储存60天的三个蜂胶样本(分别产自山东、浙江、福建)，捣碎，过30目筛。分别取蜂胶粉末3.0g，加入25mL pH6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，然后加入0.6g PVPP及少许石英砂。在冰浴上研磨成糊状。低温高速离心15min，上清液转移到另一只离心管中，低温高速离心30min取上清液定容至25mL。
分别取0.5mL粗酶液，加入0.5mL 30mM的pNPG。反应混合57℃的水浴锅中温育1.5h，加入2.5mL 1M Na2CO3终止反应。冷却至室温后在400nm处测定吸光度。空白对照为反应混合液立即在100℃水浴中加热5min使酶灭活，然后加入2.5mL 1M Na2CO3终止反应。测得蜂胶中β-葡萄糖苷酶反应的吸光度，结果见表1。
表1不同储存温度下贮存60天蜂胶中的β-葡萄糖苷酶活力(absU)
| -20℃ | 4℃ | 室温 | |
| 蜂胶样本1 | 0.578 | 0.525 | 0.119 |
| 蜂胶样本2 | 0.445 | 0.389 | 0.086 |
| 蜂胶样本3 | 0.367 | 0.339 | 0.081 |
从表1可见，随着储存时间的升高，蜂胶中β-葡萄糖苷酶活力逐渐降低。三个不同的蜂胶样本表现出相同的降低趋势。室温下储存60天的三个蜂胶样本基本没有酶活力。而-20℃和4℃储存60天的蜂胶样本，酶活力仍较高，因此，蜂胶不宜在室温下长时间保存。
实施例2
分别取室温下储存0、10、20、30、45、60、90天的三个蜂胶样本(分别产自山东、浙江、福建)，捣碎，过30目筛。分别取蜂胶粉末3.0g，加入25mLpH6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，然后加入0.6gPVPP及少许石英砂。在冰浴上研磨成糊状。低温高速离心15min，上清液转移到另一只离心管中，低温高速离心30min取上清液定容至25mL。
分别取0.5mL粗酶液，加入0.5mL 30mM的pNPG。反应混合57℃的水浴锅中温育1.5h，加入2.5mL 1M Na2CO3终止反应。冷却至室温后在400nm处测定吸光度。空白对照为反应混合液立即在100℃水浴中加热5min使酶灭活，然后加入2.5mL 1M Na2CO3终止反应。测得蜂胶中β-葡萄糖苷酶反应的吸光度，结果见表2。
表2室温下储存不同时间的蜂胶中的β-葡萄糖苷酶活力(absU)
| 3天 | 10天 | 20天 | 30天 | 45天 | 60天 | 90天 | 120天 | |
| 蜂胶样本1 | 0.498 | 0.390 | 0.310 | 0.249 | 0.175 | 0.119 | 0.062 | 0.054 |
| 蜂胶样本2 | 0.406 | 0.349 | 0.264 | 0.227 | 0.125 | 0.086 | 0.053 | 0.049 |
| 蜂胶样本3 | 0.359 | 0.279 | 0.203 | 0.171 | 0.112 | 0.081 | 0.045 | 0.037 |
室温下储存的蜂胶，随储存时间的延长β-葡萄糖苷酶活力显著下降，除了蜂胶样本1，室温下储存60天的蜂胶中几乎检测不到β-葡萄糖苷酶活力(吸光度＜0.1absU)。室温储存90天的蜂胶检测不到酶活力。三个不同蜂胶样本表现出相同的下降趋势。因此，蜂胶从蜂箱取出后，不宜在室温下储存两个月以上。通过本专利方法，如果所测吸光度小于0.1absU，我们可以认定该蜂胶在室温下已储存两个月以上，为不新鲜的蜂胶。
实施例3
分别取4℃下储存1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月的三个蜂胶样本(分别产自山东、浙江、福建)，捣碎，过30目筛。分别取蜂胶粉末3.0g，加入25mL pH6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，然后加入0.6gPVPP及少许石英砂。在冰浴上研磨成糊状。低温高速离心15min，上清液转移到另一只离心管中，低温高速离心30min取上清液定容至25mL。
分别取0.5mL粗酶液，加入0.5mL 30mM的pNPG。反应混合57℃的水浴锅中温育1.5h，加入2.5mL 1M Na2CO3终止反应。冷却至室温后在400nm处测定吸光度。空白对照为反应混合液立即在100℃水浴中加热5min使酶灭活，然后加入2.5mL 1M Na2CO3终止反应。测得蜂胶中β-葡萄糖苷酶反应的吸光度，结果见表3。
表3 4℃下储存不同时间的蜂胶中的β-葡萄糖苷酶活力(absU)
| 1个月 | 2个月 | 3个月 | 6个月 | 9个月 | 12个月 | |
| 蜂胶样本1 | 0.578 | 0.525 | 0.489 | 0.422 | 0.359 | 0.285 |
| 蜂胶样本2 | 0.445 | 0.389 | 0.356 | 0.282 | 0.236 | 0.169 |
| 蜂胶样本3 | 0.367 | 0.339 | 0.329 | 0.256 | 0.196 | 0.136 |
4℃下储存的蜂胶，随储存时间的延长β-葡萄糖苷酶活力缓慢下降，储存一年的蜂胶中仍能检测到β-葡萄糖苷酶活力。三个不同蜂胶样本表现出相同的下降趋势。
Claims (3)
1.一种蜂胶新鲜度的测定方法，其特征在于，采用β-葡萄糖苷酶活力为指标，通过以下步骤实现：
(1)从蜂胶中提取β-葡萄糖苷酶：取蜂胶粉末，加入pH6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，然后加入PVPP及少许石英砂，在冰浴上研磨成糊状，低温高速离心15分钟，上清液转移到另一只离心管中，低温高速离心30分钟取上清液定容至25mL，为粗酶液；
(2)β-葡萄糖苷酶活力的测定：取粗酶液，加入30mM对-硝基β-D-葡萄糖苷混合，混合液在57℃的水浴锅中温育，加入1M Na2CO3终止反应，冷却至室温后，用分光光度计在400nm处测定吸光度；
(3)根据β-葡萄糖苷酶活力的大小判定蜂胶的新鲜度：当吸光度低于0.1absU时，认为蜂胶中已没有β-葡萄糖苷酶活力，确认蜂胶为不新鲜。
2.根据权利要求书1所述的一种蜂胶新鲜度的测定方法，其特征在于，步骤(2)中空白对照是将混合液立即在100℃水浴中加热5分钟使酶灭活，然后加入1M Na2CO3终止反应。
3.根据权利要求1或2所述的一种蜂胶新鲜度的测定方法在测定蜂胶新鲜度中的应用。
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