CN104083571A - 一种有增强微循环作用的油莎草总黄酮的提取方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种有增强微循环作用的油莎草总黄酮的提取方法及应用，选用以油莎草地上茎叶部分为原料，采用动态超高压微射流辅助提取技术从中提取出总黄酮，优化提取工艺，超高压微射流辅助提取工艺参数为，微射流处理压力120MPa，提取温度80℃，乙醇浓度80%，提取时间90min，提取得率为1.46%；并对油莎草总黄酮提取物进行体内外抗氧化性、抑菌性、抗凝血活性和微循环作用的研究，确定了油莎草总黄酮具有良好的体内外抗氧化作用，提取的油莎草总黄酮对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌具有抑菌性，而对黑霉和曲霉无明显的抑菌效果，并具有抗凝血活性和具有增强微循环的显著作用，具有广泛的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及天然植物总黄酮的提取制备的技术领域。具体的说，本发明涉及一种有增强微循环作用的油莎草总黄酮的提取方法及应用的技术领域。
背景技术
油莎草(Cyperus esculentus L Var.Sativus Baeck)是莎草科莎草属多年生草本可作油料和优良牧草用，原产于非洲地中海沿岸。《名医别录》里记载，油莎草的茎叶有主治行气开郁、祛风止痒、宽胞利痰、主胸闷不舒、风疹瘙痒，痈伴随肿毒等功能。有关油莎草块茎方面的研究报道较多,而对其地上茎叶部分的研究未见其报道。地上茎叶中含有蛋白质、糖类、有机酸、黄酮、内酯、香豆素及其甙类、甾体及三萜类、强心苷、挥发油、油脂类等活性成分，而皂苷、蒽醌、生物碱未检出；众多研究表明黄酮类化合物具有广泛的生物活性，包括抗氧化、抗突变、抗衰老、抗肿瘤、抗菌等，是茶以及众多中草药以及食品中重要的功能性成分，对其的研究也越来越广泛与深入。所以提取分理出具有较高生物活性的黄酮类化合物对医药及食品工业是十分重要的。我们对油莎草地上茎叶有效成分进行分析，其中含有黄酮类化合物。黄酮类化合物具有多种药理作用，对人类疾病治疗具有很大的辅助作用。
动态超高压微射流（DHPM）是一种特殊形式的高压均质技术，它利用高压使液体物料高速流过狭窄的缝隙时受到强大的剪切力、撞击力以及空穴爆炸力等综合作用，使细胞破碎、促进细胞内容物溢出，从而提高有效成分的提取率的过程。目前DHPM被应用在灭菌、提取和大分子改性等方面，如对木瓜蛋白酶活性的影响、脂肪酸脂质体的制备、对胰蛋白酶的活性、稳定性和构象的影响等。Xiaoqin Huang等报道了DHPM对马铃薯叶中总黄酮提取有促进作用，且可提高马铃薯叶中总黄酮抗氧化活性,但是在提取率和对于提取黄酮解决技术环节中还存在诸多不足和缺陷。目前国内外未见针对油莎草地上茎叶为原料，采用动态超高压微射流（DHPM）技术手段研究DHPM对油莎草总黄酮提取得率及抗氧化活性的影响，在DHPM在天然产物有效成分油莎草总黄酮提取方面亟需加以解决和克服。
发明内容
针对现有技术中国内外未见针对油莎草地上茎叶为原料采用动态超高压微射流（DHPM）技术手段对油莎草总黄酮提取及抗氧化活性的研究现状，在DHPM在天然产物有效成分油莎草总黄酮提取方面亟需加以解决和克服。本发明旨在提供一种有增强微循环作用的油莎草总黄酮的提取方法及应用，采用动态超高压微射流辅助提取法显著提高了总黄酮的提取率及抗氧化活性，油莎草总黄酮具有良好的体内抗氧化作用，并具有抗凝血活性，具有增强微循环的作用，具有广泛的应用价值。
本发明提供的技术方案：
本发明以油莎草地上茎叶部分为原料，采用动态超高压微射流辅助提取技术从中提取出总黄酮，优化提取工艺，超高压微射流辅助提取工艺参数为，微射流处理压力120MPa，提取温度80℃，乙醇浓度80%，提取时间90min，提取得率为1.46%；并对油莎草总黄酮提取物进行体内外抗氧化性、抑菌性、抗凝血活性和微循环作用的研究，确定了油莎草总黄酮具有良好的体内外抗氧化作用，提取的油莎草总黄酮对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌具有抑菌性，而对黑霉和曲霉无明显的抑菌效果，并具有抗凝血活性和具有增强微循环的显著作用，具有广泛的应用价值。
本发明具体提供一种有增强微循环作用的油莎草总黄酮的提取方法，%按照重量百分比计，具体提取方法步骤如下：
（1）以油莎草地上茎叶部分为原料，将烘干后的油莎草在粉碎机中粉碎后过100目筛。
（2）用石油醚对油莎草粉脱脂，沸程：30-60℃，脱脂温度50℃，时间6-8h后，经50℃烘干2h。
（3）乙醇浸润：料液比按重量比1:40配置的80%乙醇提取液放置于4℃冰箱中静置过夜。
（4）预均质：使用均质压力为30MPa,均质2次。
（5）动态超高压微射流处理：采用120MPa微射流压力处理2次。
（6）乙醇回流：以80%乙醇浓度，提取时间90min，提取温度80℃，回流提取2次，离心4000r/min，15min并合并滤液，经过旋转蒸发工艺，蒸发温度30℃，转速40rpm，得浸膏。
（7）采用真空冷冻干燥，冷凝温度－50℃，真空度<20Pa条件下制备获得油莎草总黄酮浓缩粉。
同时，本发明提供按照上述提取方法获得油莎草总黄酮在利用对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌抑菌性中的应用。
本发明提供按照上述提取方法获得油莎草总黄酮在利用抗凝血活性和增强微循环中的应用。
进一步，本发明提供了油莎草总黄酮得率及含量的具体计算方式:
油莎草总黄酮得率的计算
取样液5.0mL于25mL具塞比色管中按照1.3测定吸光度，计算出提取液中总黄酮得率E。计算公式如下:
式中： E:油莎草总黄酮为得率，%；C:为经回归方程计算得出的总黄酮浓度，mg/mL；m:为样品质量，g；V1:为提取液总体积，mL；V2:为测定吸光度时样液定容后的体积，mL;V0:为吸取样液的体积，mL。
油莎草总黄酮光谱分析采用常见分析手段
紫外光谱分析采用：取一定量的油莎草总黄酮配置成0.01mg/mL溶液，在紫外-可见分光光度计中于200-900nm进行扫描。
油莎草总黄酮的红外光谱分析采用：油莎草总黄酮与溴化钾按2:100的比例混合，研磨压片, 采用傅立叶变换红外谱仪分析。红外光谱条件如下：扫描累积次数64次，分辨率4.0cm-1,扫描范围：400～4000cm-1，采集样品的红外光谱图。
通过实施本发明具体的发明内容可以达到以下有益效果：
（1）本发明以油莎草地上茎叶部分为原料，采用动态超高压微射流辅助提取技术从中提取出总黄酮，优化提取工艺，超高压微射流辅助提取工艺参数为，微射流处理压力120MPa，提取温度80℃，乙醇浓度80%，提取时间90min，提取得率为1.46%；并对油莎草总黄酮提取物进行体内外抗氧化性、抑菌性、抗凝血活性和微循环作用的研究，确定了油莎草总黄酮具有良好的体内外抗氧化作用，提取的油莎草总黄酮对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌具有抑菌性，并具有抗凝血活性和具有增强微循环的显著作用，具有广泛的应用价值。
（2）本发明通过体内、外抗氧化实验，证明了采用本发明提供的制备方法与本领域常见采用的回流提取法、超声波法、微波辅助提取法、超声微波双辅助法相比，经采用传统回流提取法、超声波法、微波辅助提取法、超声微波双辅助法和动态超高压微射流辅助提取法样品清除·OH自由基的试验表明，证明了采用本发明提供的制备方法采用动态超高压微射流辅助提取法得到的总黄酮清除·OH自由基、DPPH·自由基的能力和总抗氧化能力均强于本领域常见其它几种提取方法，并具有良好的体内抗氧化作用。
（3）本发明通过抑菌性试验，证明了采用本发明提供的制备方法制备的油莎草总黄酮对枯草芽孢杆菌(MIC=0.5mg/mL，抑菌圈直径=11.9mm)和大肠杆菌(MIC=0.5mg/mL，抑菌圈直径=9.7mm)具有抑菌性。
（4）本发明通过小鼠微循环及抗凝血作用试验，证明了采用本发明提供的制备方法制备的油莎草总黄酮可明显改善小鼠的微循环状况，增大微静脉管径，使毛细血管开放数明显增多，改善机体微循环功能，从而影响机体的外周循环系统。
附图说明
图1 乙醇浓度对得率及DPPH·清除率的影响图。
图2提取温度对得率及DPPH·清除率的影响图。
图3提取时间对得率及DPPH·清除率的影响图。
图4微射流压力对得率及DPPH·清除率的影响图。
图5 油莎草总黄酮紫外光谱图。
图6 油莎草总黄酮红外光谱图。
图7 对·DPPH的清除能力图。
图8对羟自由基的清除能力图。
图9总抗氧化能力的比较图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例,本发明中基本涉及到的%无特别指明都是重量百分比计。
试验：选用油莎草，试验所用原料是油莎草地上茎叶部分。
主要试剂：芦丁标准品，上海源叶生物技术有限公司；无水乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸亚铁、双氧水等均为分析纯，天津市永晟精细化工有限公司； 1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）为分析纯，天津市化学试剂三厂；去离子水（实验室自制）；VC，上海源叶生物科技有限公司； T-AOC 试剂盒、SOD试剂盒、MDA 试剂盒、考马斯亮蓝试剂盒，南京建成生物工程研究所；溶媒：一级大豆油，中粮北海粮油工业（天津）有限公司，凝血酶原时间（PT）测定试剂盒，上海红太阳生物技术有限公司。
实验动物：昆明种小白鼠，6～8周龄，体重20±2 g从新疆医科大学动物饲养中心购买。
饲料、垫料及饮用水：饲料、垫料是北京科澳协力饲料有限公司生产的SPF鼠繁殖饲料，紫外消毒后使用；饮用水来自纯化水，经过高温高压灭菌后使用；
试验仪器：FW-100高速万能粉碎机，北京市永光明医疗仪器厂；AL-104分析天平 ，Mettler-Toledo Group；ＨＨ－２数显恒温水浴锅，金坛市医疗仪器厂；旋转蒸发器RE-52AA ，上海亚荣生化仪器厂；Anke TDL-5-A离心机，上海安亭科学仪器厂；722S型分光光度计，上海安亭科学仪器厂；微射流均质机M-700型，美国Microfluidics公司；GYB60-6S高压均质机，上海华东高压均质机厂；冷冻干燥机，德国SIGMA电仪器有限公司；PARGON 1000型FT-IR傅立叶变换红外光谱仪，上海力晶科技有限公司。
本发明中选用的所有原辅材料，所选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一：一种有增强微循环作用的油莎草总黄酮的提取
本发明具体提供一种有增强微循环作用的油莎草总黄酮的提取方法，%按照重量百分比计，具体提取方法步骤如下：
（1）以油莎草地上茎叶部分为原料，将烘干后的油莎草在粉碎机中粉碎后过100目筛。
（2）用石油醚对油莎草粉脱脂，沸程：30～60℃，脱脂温度50℃，时间6～8h后，经50℃烘干2h。
（3）乙醇浸润：料液比按重量比1:40配置的80%乙醇提取液放置于4℃冰箱中静置过夜。
（4）预均质：使用均质压力为30MPa,均质2次。
（5）动态超高压微射流处理：采用120MPa微射流压力处理2次。
（6）乙醇回流：以80%乙醇浓度，提取时间90 min，提取温度80 ℃，回流提取2次，离心4000r/min，15min并合并滤液，经过旋转蒸发工艺，蒸发温度30℃，转速40rpm，得到浸膏。
（7）采用真空冷冻干燥，冷凝温度－50℃，真空度<20Pa条件下制备获得油莎草总黄酮浓缩粉。
实施例二：提取油莎草总黄酮工艺的确定
2.1.1乙醇浓度对得率及DPPH·清除率的影响
称1.000g油沙草粉，石油醚脱脂至无色并烘干，料液比1:40，配置40%，50%，60%，70%，80%，90%乙醇浓度放置于4℃冰箱中静置过夜，经30MPa,均质2次后，在微射流压力100 MPa下处理2次，70℃水浴提取90min，提取2次，离心合并滤液后测吸光度值，计算得率；计算DPPH·清除率。
由附图1可知，油莎草总黄酮得率和DPPH·清除率随着乙醇浓度的上升而增大，并且在60%时达到最大值；随着浓度的继续上升，部分脂溶性杂质溶出影响黄酮类物质的溶出，出现吸光度和DPPH·清除率下降。因此，选择60%的乙醇作为溶剂。
2.1.2提取温度对得率及DPPH·清除率的影响
称1.000g油沙草粉，石油醚脱脂至无色并烘干，料液比1:40，配置70%乙醇浓度放置于4℃冰箱中静置过夜，经30MPa,均质2次后，在微射流压力100 MPa下处理2次，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，90℃水浴提取90min，其他同2.1.1。
由附图2可知，在提取温度40～70℃围内，得率及DPPH·清除率均呈现增长趋势，在70℃时达到最大值，DPPH·的清除率高达93.00%，随着浓度进一步的增加，得率及DPPH·清除率均呈下降趋势，其原因可能是油莎草总黄酮中的某些活性成分被氧化分解。因此，选择70℃提取为最佳。
2.1.3提取时间对得率及DPPH·清除率的影响
称1.000g油沙草粉，石油醚脱脂至无色并烘干，料液比1:40，配置70%乙醇浓度放置于4℃冰箱中静置过夜，经30MPa,均质2次后，在微射流压力100 MPa下处理2次，70℃水浴提取30，60，90，120，150min，其他同2.1.1。
由附图3可知，在提取时间30～90min内，得率及DPPH·清除率均呈现增长趋势，在90min时达到最大，其DPPH·的清除率达到75.13%，随着进一步的增加，得率及·DPPH清除率均呈下降趋势，因此选择90min提取为最佳。
2.1.4微射流压力对得率及DPPH·清除率的影响
称1.000g油沙草粉，石油醚脱脂至无色并烘干，料液比1:40，配置70%乙醇浓度放置于4℃冰箱中静置过夜，经30MPa,均质2次后，在微射流压力分别60MPa，80MPa，100 MPa，120MPa，140Mpa，160 Mpa下处理2次，70℃水浴提取90min，其他同2.1.1。
由附图4可知，随着压力的增大，得率及DPPH·清除率均呈现增长趋势，在100～120MPa内，清除率有明显的上升。随着压力进一步的增大，得率及DPPH·清除率都趋于平缓，其原因可能是微射流压力越大细胞破碎程度越高，从而导致黄酮类物质更完全的溶出。因此，考虑到仪器的承受负荷，选择120MPa为最佳。
实施例三：提取油莎草总黄酮最优工艺的确定
3.1提取条件的正交优化实验
以微射流压力、提取温度、乙醇浓度、提取时间为自变量设计四因素三水平L9（34）正交优化实验油莎草总黄酮提取工艺研究，正交优化实验结果如下。
表1：正交试验结果
表2： 正交试验方差分析
| 因素 | 偏差平方和 | 自由度 | F比 | F临界值 | 显著性 |
| A微射流压力 | 0.035 | 2 | 11.667 | 19.000 | |
| B提取温度 | 0.068 | 2 | 22．667 | 19.000 | * |
| C乙醇浓度 | 0.008 | 2 | 2.667 | 19.000 | |
| D提取时间 | 0.003 | 2 | 1.000 | 19.000 |
注：P<0.05
由正交试验数据表1分析可知，试验因素中对油莎草总黄酮得率影响的顺序为：B(提取温度)＞ A(微射流压力)＞ C(乙醇浓度)＞ D(提取时间)。提取条件的最优组合为A2B3C3D2，即微射流压力为120MPa、乙醇体积分数80%、提取温度80℃、提取时间90min。
由表3方差分析结果表明，提取温度对油莎草总黄酮得率的影响显著。进行实验验证，用此最佳工艺进行验证重复三次,总黄酮得率分别为1.46%，1.46%，1.47%，平均得率为1.46%，RSD为0.395%。而传统回流提取提取率为0.64%。结果表明本实验最佳工艺条件合理，同时也表明此工艺条件具有较好的重复性。
3.2.不同提取方法提取油莎草总黄酮提取率比较
表3 ：不同提取方法提取油莎草总黄酮提取率比较
| 方法 | 传统回流法 | 超声波提取法 | 微波提取法 | 超声微波双辅助提取法 | 动态超高压微射流辅助提取法 |
| 提取率/% | 0.64 | 0.78 | 1.34 | 1.38 | 1.46 |
从表中可以看出，动态超高压微射流辅助提取法提取油莎草总黄酮的提取率高于其他四种提取方法。
3.3 光谱分析
黄酮类化合物具有C6-C3-C6 的基本结构，这一结构特点使大多数黄酮类化合物的紫外光谱有两个主要的吸收峰，其中之一出现在240～280nm 范围内（带Ⅱ），另一个在330～400 nm 范围内（带Ⅰ）。一般说来带Ⅱ吸收可以认为由A-环苯酰系统引起，而带Ⅰ则是由B-环肉桂酰系统引起。由附图5可以看到五种方法提取的油莎草总黄酮都有两个主峰，且峰带（300-400nm）和峰带 （250-300）峰型相似。
由附图6可知，五组光谱图的重叠效果很好，图谱差异较小，说明五种方法提取的总黄酮结构不存在显著差异，所以动态超高压微射流处理对油莎草总黄酮结构无显著影响。
结论：
油莎草总黄酮的最佳提取工艺为：微射流处理压力120MPa，提取温度80℃,乙醇浓度80%，提取时间90min，提取得率为1.46%；动态超高压微射流辅助提取法比其它四种提取法提取得率高，但差别不大。
实施例四：体外抗氧化试验
4.1.体外抗氧化试验
4.1.1清除DPPH·自由基活性的测定 在比色管中加入样品溶液2mL,再加入2mL浓度为2×10-4DPPH·乙醇溶液，混匀后避光反应30min作为样品组；空白组以等体积无水乙醇代替DPPH·溶液，对照组以等体积的蒸馏水代替黄酮溶液；以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液作空白调零，在517m处分别测定A1、A2、A0
清除率：%=[1-(A1-A2)/A0] ×100%，式中A0:样品组吸光度值；A1:空白组吸光值；A2:对照组吸光度值。
4.1.2 不同提取方法提取的油莎草总黄酮清除·DPPH的比较结果
由附图7可知，不同提取方法所得黄酮提取液的清除·DPPH能力均随浓度的增加而提高，且都表现出很好的正向线性关系。5种样品的IC50为：（0.4771±0.04891）、（0.2849±0.04570）、（0.2527±0.01896）、（0.2116±0.05712）和（0.1660±0.02300）mg/mL。其中，动态超高压微射流法提取的油莎草总黄酮对·DPPH的清除能力最强，因此动态超高压微射流处理提高了油莎草总黄酮对·DPPH的清除能力。这与Xiaoqin Huang等研究是一致的。
4.1.3清除羟基自由基（·OH）活性的测定
吸取4mL pH7.4的磷酸纳缓冲溶液，加入1.5mL 5mmol/L的邻二氮菲应用液，充分混匀，再加入1mL 7.5mmol/L硫酸亚铁溶液，立即混匀，分别加入1mL试样溶液，立即混匀，加入1.5mL双蒸水以补充体积，最后加入1mL 0.1%的双氧水溶液，轻轻混匀，于37℃水浴中保温1h，于536 nm处测定吸光度值。对OH自由基清除率的计算公式如下：
清除率（%）=(A0-A1)/(A2-A1)×100，式中：A0：为加入试样和双氧水后测得的吸光值；A1：为加入双氧水而不加试样的吸光值；A2：为不加试样和双氧水时测得的吸光值。
4.1.4不同提取方法提取的油莎草总黄酮清除羟自由基的比较结果
由附图8可知，油莎草总黄酮对·OH的清除能力随浓度的升高而增加。总黄酮浓度为0.05mg/mL时，超声微波双辅助法的样品活性最强（5.85%±0.49%）；浓度为1.0mg/mL时，动态超高压微射流法的样品清除能力最高（55.85%±1.22%）。传统回流提取法、超声波法、微波辅助提取法、超声微波双辅助法和动态超高压微射流辅助提取法样品的IC50分别（1.67±0.02130）、（1.662±0.01976）、（0.8721±0.03501）、（0.6407±0.04660）和（0.5301±0.03589）mg/mL。提取液对·OH的清除能力与提取方法有明显的相关性，这可能是由于动态超高压微射流辅助提取法对黄酮类物质活性破坏小，使其样品的抗氧化活性较强。
4.1.5总抗氧化活性的测定
操作方法按总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒说明书进行。
总抗氧化能力(U/mg样液)=(ODU-ODC)/0.01÷30×N÷Cprot
式中：ODU为测定管吸光度值；ODC为对照管吸光度值；N表示反应体系稀释倍数(也就是说反应液总体积与取样体积之比)；Cprot为待测样液浓度(mg/mL)。
4.1.5不同提取方法提取的油莎草总黄酮总抗氧化能力的比较结果
由附图9可知，不同提取方法所得黄酮提取液的总抗氧化能力均随浓度的增加而提高，且都表现出很好的正向线性关系。其中，动态超高压微射流法提取的油莎草总黄酮总抗氧化能力最强，因此动态超高压微射流处理提高了油莎草总黄酮总抗氧化能力。
结论：采用传统回流提取法、超声波法、微波辅助提取法、超声微波双辅助法和动态超高压微射流辅助提取法样品清除·OH自由基的IC50分别（1.67±0.02130）、（1.662±0.01976）、（0.8721±0.03501）、（0.6407±0.04660）和（0.5301±0.03589）mg/mL；清除DPPH·自由基的IC50为：（0.4771±0.04891）、（0.2849±0.04570）、（0.2527±0.01896）、（0.2116±0.05712）和（0.1660±0.02300）mg/mL；在同一浓度下动态超高压微射流辅助提取法得到的总黄酮总抗氧化能力强于其它四种方法。故动态超高压微射流辅助提取法得到的总黄酮清除·OH自由基、DPPH·自由基的能力和总抗氧化能力均强于其它四种方法，这可能是由于动态超高压微射流辅助提取法对黄酮类物质活性破坏小，使其样品的抗氧化活性较强。
实施例五：体内抗氧化试验
超氧化物歧化酶(SOD)对平衡体内氧化和抗氧化活性起至关重要的作用，它可以保护细胞免受自由基的伤害。丙二醛(MDA)含量的测定常与SOD测定相结合。具体来说，MDA含量可反映局部脂质过氧化的程度，从而间接反映自由基对人体细胞的损害的严重程度。SOD活性间接也反映了体内清除氧自由基的能力。总抗氧化能力(T-AOC)对氧化与抗氧化平衡起着重要作用,可以有效阻断自由基引起的连锁反应,从而起到抗氧化、抗衰老作用。因此，测定MDA、SOD和总抗氧化活性，可用于了解油莎草黄酮的体内抗氧化能力。
5.1.1油莎草黄酮对昆明小白鼠进行灌胃试验
首先将健康的18-22g的雄性昆明种小鼠50只在饲养室适应性喂养3d后。按体重随机分为5组，每组10只，即正常对照组NC、低剂量组LD(100mg/(kg bw·d))、中剂量组MD(200mg/(kg bw·d))、高剂量组HD(400mg/(kg bw·d))，Vc阳性对照组(76mg/(kg bw·d), 正常对照组灌胃给予生理盐水，其余各组按设定剂量给药, 灌胃体积为0.2mL/(10g bw)，连续灌胃28 d。动物在屏障设施下饲养，可自由饮水和进食。
5.1.2小鼠血清及肝组织匀浆的制备
在小鼠最后次给药5小时后摘眼球取血，离心(3000～4000r/min)15min，取血清，并4℃密闭环境保存。小鼠取血处死后，立即在冰台上取肝脏、肾脏，以冰水混合的生理盐水洗去浮血，用滤纸吸干，用玻璃匀浆器制成组织匀浆，离心机离心10min(4℃，3000r/min)，分离上清液测定各指标。同时摘出胸腺及脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重，计算胸腺指数和脾脏指数。
胸腺指数=小鼠胸腺重量（g）/小鼠体重（g）×10g（体重）
脾脏指数=小鼠脾脏重量（g）/小鼠体重（g）×10g（体重）
5.1.3丙二醛（MDA）的测定
过氧化脂质降解产物中的MDA可与硫代巴比酸（TBA）缩合形成的红色产物,在523nm 处有最大吸收峰。操作步骤如说明书，按公式计算MDA值(nmol/mL)
5.1.4超氧化物歧化酶（SOD）活力的测定
测定原理为黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，可用分光光度法测定(550nm)按说明书进行操作。
5.1.5总抗氧化力（T-AOC）的测定
机体中有许多抗氧化物质，能使 Fe3+还原成 Fe2+，后者可与菲啉物质形成稳固的络合物，通过比色可测出其抗氧化能力的高低。血清中以在 37℃下，每分钟每毫升血清使反应体系的吸光度（OD）值每增加 0.01 时，为一个总抗氧化能力单位；组织中以在 37℃下，每分钟每毫升组织蛋白使反应体系的吸光度（OD）值每增加 0.01 时，为一个总抗氧化能力单位。具体操作见试剂盒说明。
5.2 数据处理：用SPSS 17.0统计软件对试验数据进行统计分析，组间差异比较采用t检验法检验差异显著性。如数值间P＜0.05，则在统计上认为有显著性；如数值间如P＜0.01则在统计上认为有极其显著性。
5.3.1油莎草黄酮对小鼠体重、脾指数和胸腺指数的影响
表4： 油莎草黄酮对小鼠体重、脾指数和胸腺指数的影响
| 器官 | 空白对照组 | 低剂量组 | 中剂量组 | 高剂量组 | 阳性对照组 |
| 胸腺指数 | 3.34±0.23 | 3.29±0.47 | 3.13±0.42 | 3.12±0.31 | 3.13±0.25 |
| 脾指数 | 2.93±0.46 | 2.94±0.37 | 2.89±0.28 | 2.83±0.16 | 2.90±0.19 |
注： ** P＜0.01, * P＜0.5
表4显示，经过低、中、高剂量组饲喂4周的小鼠,胸腺、脾等器官和空白对照组的对应器官相比,没有显著变化(p<0.05),在剂量范围不存在明显的量效关系.初步可以证明,饲喂油莎草黄酮对小鼠身体没有损伤.
5.3.2 油莎草黄酮对小鼠体内SOD活性的影响
表5：油莎草黄酮对小鼠体内SOD活性的影响
注：**P＜0.01, *P＜0.5
表5显示，与正常对照组相比，在Vc、中剂量组、高剂量组的油莎草黄酮作用下，小鼠血清、肝脏、肾脏中SOD活性都显著上升(p<0.01或p<0.05)，且存在剂量效应，说明油莎草黄酮可以明显提高小鼠体内的SOD活性。
5.3.3 油莎草黄酮对小鼠小鼠体内丙二醛(MDA)含量的影响
表6：油莎草黄酮对小鼠体内丙二醛(MDA)含量的影响
注：**P＜0.01, *P＜0.5
表6显示，在Vc、低剂量组、中剂量组、高剂量组的油莎草黄酮作用下，血清、肝脏、肾脏中MDA含量明显下降(p<0.01或p<0.05)，且存在剂量效应，说明油莎草黄酮可以明显降低小鼠体内的MDA含量,从而减轻小鼠体内膜脂质过氧化过程。
5.3.4油莎草黄酮对小鼠体内T-AOC的影响
表7：油莎草黄酮对小鼠体内T-AOC的影响
注：**P＜0.01, *P＜0.5
表7显示，在Vc和高剂量组的油莎草黄酮作用下，血清、肝脏、肾脏中T-AOC活性显著提高(p<0.01或p<0.05)，阳性对照（Vc）的作用效果与高剂量油莎草黄酮相当。说明油莎草黄酮可以明显提高小鼠体内的T-AOC活性。
结论：油莎草黄酮提高正常小鼠血清SOD活力和降低MDA含量对浓度具有依赖性，当其在适合的浓度下效果优于抗化血酸。实验结果对比分析发现，油莎草黄酮均可显著增强受试动物SOD活性，并通过抗氧化酶的作用，进一步降低体内MDA水平和提高T-AOC，显示其具有良好的体内抗氧化作用。
实施例六：抑菌试验
6.1.1 供试菌株的活化：在无菌操作台中将菌种接入相应的培养基上。细菌置于36±1℃恒温培养箱内培养18～24h，霉菌在28±1℃，培养48h，培养完成后放置0～4℃，冷藏室备用。
6.1.2 培养基平板制备：将配置好的各种菌种培养基湿热灭菌（121℃，灭菌20min）后，冷却至50～60℃，在无菌操作条件下将培养基倾注于无菌培养皿内，每皿15～25ml，放平只培养基凝固。
6.1.3 菌悬液制备：在无菌操作条件下，取活化好的菌株，用接种环分别挑取少量细菌。霉菌孢子，分别接入9ml无菌水中，摇匀，制成孢子、菌体悬浮液，稀释至菌悬液中细菌、霉菌数为1～8×106个/ml。
6.1.4 滤纸片法测定总黄酮的抑菌作用：用打孔器将定性滤纸打成直径6mm的小圆片，分装于洁净干燥的小培养皿中，灭菌。将灭菌后的滤纸片分别浸入提取液、无菌水1～3h。在无菌操作条件下，分别取0.2ml各种菌悬液加入已制备好的培养基平板中，用涂布棒涂布均匀,。用无菌镊子取浸有提取液的滤纸片贴在含菌平板上，每只含菌平板间隔一定距离贴2片，并用浸有无菌水的滤纸片作对照。贴好滤纸片的平板置于恒温培养箱中培养，细菌置于36±1℃恒温培养箱内培养18～24h，霉菌在28±1℃，培养48h，测抑菌圈直径。同时为保证所测数据的精确性，每一种菌作3个重复。
6.1.5油莎草地上茎叶中总黄酮的最低抑菌浓度（MIC）的测定：在无菌操作条件下把总黄酮提取液分别稀释成50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%的系列溶液，分别放入5支灭过菌的试管中。向各平皿中分别加入不同浓度的总黄酮稀释液各2mL，分别移取各菌悬液0.2mL，倒入高温灭过菌并且相应的温度在60℃左右的固体培养基，充分混匀，待完全冷却凝固后，倒置于恒温培养箱中，在相应条件下培养。观察，以不长菌的最低抑菌浓度为提取液的最小抑菌浓度。每个浓度做三个重复。
6.2.1油莎草总黄酮的抑菌作用
表8：油莎草总黄酮对试验菌的抑制效果
注：—表示无菌生长；+表示有少量菌体生长；++表示有不超过1/3平皿面积的菌落生长；+++表示有不超过1/2的平皿面积的菌落生长；++++表示有超过1/2的平皿面积的菌落生长。
由表8可知，油莎草总黄酮对青霉和曲霉抑菌效果不明显。抑菌性试验结果表明：油莎草总黄酮对枯草芽孢杆菌(MIC=0.5mg/mL，抑菌圈直径=11.9mm)和大肠杆菌(MIC=0.5mg/mL，抑菌圈直径=9.7mm)具有抑菌性，而对黑霉和曲霉无明显的抑菌效果。
结论：油莎草总黄酮对枯草芽孢杆菌(MIC=0.5mg/mL，抑菌圈直径=11.9mm)和大肠杆菌(MIC=0.5mg/mL，抑菌圈直径=9.7mm)具有抑菌性。
实施例七：对小鼠微循环及抗凝血作用试验
7.1.1分组、给药及药物配制：取健康昆明种小鼠50只，依体重随机均分为5组，每组10只，为空白组、阳性药组（0.5g/kg），油莎草总黄酮低剂量组（0.1g/kg）、油莎草总黄酮中剂量组（0.2g/kg）、油莎草总黄酮高剂量组（0.5g/kg）。以0.2ml/10g小鼠灌胃给药，连续给药7d。
7.1.2 对小鼠耳廓微循环的影响：给药前小鼠耳廓血管口径的测量：戊巴比妥纳0.0lmL/g腹腔注射麻醉后，用医用橡皮膏贴在耳廓上去毛，将小鼠腹向下固定在小鼠观察台上，耳廓表面滴加少许液体石蜡，记录耳廓微循环毛细血管口径、交叉节点数。连续给药7d，末次给药30min后再次观察耳廓微循环毛细血管口径、交叉节点数。
7.1.3对出血时间( BT)的影响：按给药7d，末次给药30min后，用利剪将小鼠距尾尖3cm处剪断。待血液自行流出开始计时。每隔30s用滤纸吸去血滴1次，至无血痕为止。记录此段时间为出血时间( BT) 。
7.1.4对凝血时间(CT)的影响：按照给药7d，末次给药30min后摘眼球采血，滴出2滴血于载玻片两端，立即用秒表计时，每隔30s用清洁大头针自血滴边缘向里轻轻挑动1次，并观察有无血丝被挑起。从采血开始至挑起血丝止，即为凝血时间(s)。另一滴血供最后复验。室内温度为15℃。
7.1.5血浆凝血酶原时间测定法（PT）的影响：按照给药7d，末次给药30min后断头取小鼠全血加入枸橼酸钠抗凝管中，静置30min，于3000rpm离心15min，取上清血浆，利用C2000-2高性能血凝仪测定凝血酶原时间PT。
7.2统计学方法：采用SPSS17.0统计软件分析，实验数据以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间差异用t检验。
7.3.1油莎草总黄酮对微循环及抗凝血作用结果：
作为机体新陈代谢、血液循环的形态结构及生理功能的基础，微循环的功能状态是机体体质的重要指标。凝血时间的长短主要与各种凝血因子的含量和功能有关；出血时间的长短与毛细血管功能、组织收缩力、组织因子、血小板的数量和功能、纤溶等因素有关；凝血酶原时间主要反映外源性凝血是否正常，由凝血因子I、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ的水平决定。
7.3.2油莎草总黄酮对小鼠耳廓微循环的影响：
给药后小鼠毛细血管口径增大，交叉节点数明显增加，与空白对照组相比具有统计学意义。提示油莎草总黄酮具有增强小鼠耳廓微循环的作用，并对扩张小鼠耳廓毛细血管的口径有一定作用。结果见表9：
表9 ：油莎草总黄酮对小鼠耳廓微循环的影响
| 组别 | 数量（只） | 剂量（g/kg） | 交叉结点差值 | 血管口径差值（um） |
| 空白对照组 | 10 | _ | 0.7±0.5 | 5.0±5.0 |
| 阳性药组 | 10 | 0.5 | 1.4±0.5** | 10.0±4.5** |
| 低剂量组 | 10 | 0.1 | 1.0±0.7 | 5.0±5.3 |
| 中剂量组 | 10 | 0.2 | 1.1±0.6 | 8.0±6.3 |
| 高剂量组 | 10 | 0.4 | 1.4±0.5** | 10.0±4.6** |
与空白对照组相比*P<0.05．**P <0.01
7.3.3油莎草总黄酮对小鼠出血时间( BT)的影响：
油莎草总黄酮对小鼠出血时间的影响：给药组小鼠的出血时间明显长于空白对照组，提示油莎草总黄酮能抑制小鼠的凝血功能。结果见表10：
表10：油莎草总黄酮对小鼠出血时间的影响
| 组别 | 数量（只） | 剂量（g/kg） | 出血时间（s） |
| 空白对照组 | 10 | _ | 87.6±44.0 |
| 阳性药组 | 10 | 0.5 | 165.8±71.9* |
| 低剂量组 | 10 | 0.1 | 178.1±49.5** |
| 中剂量组 | 10 | 0.2 | 156.7±31.4** |
| 高剂量组 | 10 | 0.4 | 193.5±65.9** |
与空白对照组相比*P<0.05． **P <0.01
7.3.4油莎草总黄酮对小鼠凝血时间(CT)的影响：
油莎草总黄酮对小鼠凝血时间的影响：给药物组小鼠的凝血时间明显长于空白对照组，提示油莎草总黄酮能抑制小鼠的凝血功能。结果见表11：
表11：油莎草总黄酮对小鼠凝血时间的影响
| 组别 | 数量（只） | 剂量（g/kg） | 凝血时间（s） |
| 空白对照组 | 10 | _ | 38.6±14.5 |
| 阳性药组 | 10 | 0.5 | 74.1±19.9** |
| 低剂量组 | 10 | 0.1 | 51.1±12.9 |
| 中剂量组 | 10 | 0.2 | 59.1±19.1* |
| 高剂量组 | 10 | 0.4 | 73.5±18.7** |
与空白对照组相比*P<0.05． **P <0.01
7.3.5油莎草总黄酮对小鼠凝血酶原时间(PT)的影响：
油莎草总黄酮对小鼠凝血酶原时间的影响：给药组小鼠的凝血酶原时间明显长于空白对照组，提示油莎草总黄酮能抑制小鼠的凝血功能。结果见表12：
表12： 油莎草总黄酮对小鼠凝血酶原时间(PT)的影响
| 组别 | 数量（只） | 剂量（g/kg） | 出血时间（s） |
| 空白对照组 | 10 | _ | 8.98±1.20 |
| 阳性药组 | 10 | 0.5 | 9.94±1.64 |
| 低剂量组 | 10 | 0.1 | 10.24±1.20* |
| 中剂量组 | 10 | 0.2 | 11.70±2.23** |
| 高剂量组 | 10 | 0.4 | 9.86±1.39 |
与空白对照组相比*P<0.05． **P <0.01
结论：通过上述对小鼠微循环及抗凝血作用试验，油莎草总黄酮的中、高剂量组可使小鼠出血时间、凝血时间长于对照组，说明具有抗凝血功能，其机制与抑制凝血因子、血小板和毛细血管功能有关。说明油莎草总黄酮可明显改善小鼠的微循环状况，增大微静脉管径，使毛细血管开放数明显增多，改善机体微循环功能，从而影响机体的外周循环系统。其抗凝作用与化学成份的关系以及临床实用价值等方面，尚待进一步研究。
通过上述各实施例提供采用动态超高压微射流辅助提取油莎草总黄酮，通过对油莎草总黄酮提取物进行体内外抗氧化性、抑菌性、抗凝血活性和微循环作用的研究，并通过与本领域常见采用的回流提取法、超声波法、微波辅助提取法、超声微波双辅助法相比，经采用传统回流提取法、超声波法、微波辅助提取法、超声微波双辅助法和动态超高压微射流辅助提取法样品清除·OH自由基的试验表明，证明了采用本发明提供的制备方法采用动态超高压微射流辅助提取法得到的总黄酮清除·OH自由基、DPPH·自由基的能力和总抗氧化能力均强于本领域常见其它几种提取方法，并具有良好的体内抗氧化作用，提取的油莎草总黄酮对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌具有抑菌性，并具有抗凝血活性和具有增强微循环的显著作用，具有广泛的应用价值。
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (3)
1.一种有增强微循环作用的油莎草总黄酮的提取方法，其特征在于，%按照重量百分比计，具体提取方法步骤如下：
（1）以油莎草地上茎叶部分为原料，将烘干后的油莎草在粉碎机中粉碎后过100目筛；
（2）用石油醚对油莎草粉脱脂，沸程：30-60℃，脱脂温度50℃，时间6-8h后，经50℃烘干2h；
（3）乙醇浸润：料液比按重量比1:40配置的80%乙醇提取液放置于4℃冰箱中静置过夜；
（4）预均质：使用均质压力为30MPa,均质2次；
（5）动态超高压微射流处理：采用一定微射流压力处理2次；提取压力120MPa；
（6）乙醇回流：以80%乙醇浓度，提取时间90min，提取温度80℃，回流提取2次，离心4000r/min，15min并合并滤液，经过旋转蒸发工艺，蒸发温度30℃，转速40rpm，得浸膏;
（7）采用真空冷冻干燥，冷凝温度－50℃，真空度<20Pa条件下制备获得油莎草总黄酮浓缩粉。
2.一种如权利要求1所述的提取方法获得油莎草总黄酮在利用对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌抑菌性中的应用。
3.一种如权利要求1所述的提取方法获得油莎草总黄酮在利用抗凝血活性和增强微循环中的应用。
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