CN108159223A - 油莎草总黄酮提取物、活性单体荭草苷及其提取方法和应用 - Google Patents

油莎草总黄酮提取物、活性单体荭草苷及其提取方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108159223A
CN108159223A CN201711327107.7A CN201711327107A CN108159223A CN 108159223 A CN108159223 A CN 108159223A CN 201711327107 A CN201711327107 A CN 201711327107A CN 108159223 A CN108159223 A CN 108159223A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bottle
chufa
general flavone
orientoside
extractive
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711327107.7A
Other languages
English (en)
Inventor
敬思群
陈婧萱
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xinjiang University
Original Assignee
Xinjiang University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xinjiang University filed Critical Xinjiang University
Priority to CN201711327107.7A priority Critical patent/CN108159223A/zh
Publication of CN108159223A publication Critical patent/CN108159223A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/88—Liliopsida (monocotyledons)
    • A61K36/89—Cyperaceae (Sedge family)
    • A61K36/8905—Cyperus (flatsedge)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D407/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00
    • C07D407/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings
    • C07D407/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/39—Complex extraction schemes, e.g. fractionation or repeated extraction steps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/51—Concentration or drying of the extract, e.g. Lyophilisation, freeze-drying or spray-drying
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/55—Liquid-liquid separation; Phase separation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及植物总黄酮提取和应用技术领域，是一种油莎草总黄酮提取物、活性单体荭草苷及其提取方法和应用，该油莎草总黄酮提取物，先将油莎草地上茎叶采用乙醇溶液回流提取，合并提取液，减压浓缩至得到浸膏，浸膏采用预处理后的大孔树脂柱层析进行后，在分离过程中，依次采用水和30％的乙醇溶液洗脱后得到30％乙醇洗脱部位，将30％乙醇洗脱部位依序经过减压浓缩和冷冻干燥后得到油莎草总黄酮提取物。本发明首次公开油莎草总黄酮提取物和活性单体荭草苷在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用，药理实验说明，油莎草总黄酮提取物和活性单体荭草苷两者对I/R损伤均具有保护作用。

Description

油莎草总黄酮提取物、活性单体荭草苷及其提取方法和应用
技术领域
本发明涉及植物总黄酮提取和应用技术领域，是一种油莎草总黄酮提取物及其制备方法，所述油莎草总黄酮提取物在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用，以及活性单体荭草苷及其提取方法，所述活性单体荭草苷在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用，所述活性单体荭草苷在制备治疗缺血再灌注24小时引起的缺血性脑中风药物中的应用。
背景技术
脑中风又称为脑血管意外或脑卒中，是一种具有严重危害的脑血管疾病。中风具有发病率高、死亡率高、致残率高、复发率高以及并发症多的特点，同冠心病、癌症并列为威胁人类健康的三大疾病。脑中风主要分为缺血性和出血性脑中风两种类型，而大约80％以上的脑中风是因脑血管栓塞所致的缺血引起的。缺血性脑中风是指脑内血液供应障碍导致的大脑某区域的缺血、缺氧。脑的血流量为750～1000ml/min，耗氧量约占人体总耗氧量的20％，所以脑组织对缺血缺氧非常敏感。众所周知，脑缺血会引发一系列的有害反应，从而导致缺血脑组织细胞内稳态的破坏和结构的损伤，最终导致缺血后急性坏死、程序性坏死、细胞凋亡和自噬等。当缺血的时间比较短暂，很快的将组织再灌注恢复能够降低神经方面的损害，这样会有一定程度的改变。但当时间太长，神经元的损伤就改变不了了，再灌注也不能够使得组织得到缓解，并且会进一步使机体得到损害，然后出现一系列的次生危害。
缺血性脑中风损伤临床症状表现口眼歪斜、语言不利、半身不遂、记忆障碍等。其可能机制包括：能量代谢障碍、梗死周围缺氧去极化、Ca2+超载、兴奋性氨基酸毒性、氧化应激损伤、炎症反应及细胞凋亡等，这些反应又相互交叉，互为因果，最终造成神经细胞的死亡。相关信号通路的激活与抑制对脑缺血损伤的病理过程有着密切的联系，脑缺血损伤的相关分子及信号通路成为脑缺血预防与治疗的新靶向。其中，氧化应激对脑缺血损伤起着重要的作用。
氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内或细胞内的活性氧(reactiveoxygen species，ROS)产生过多，氧化程度超出抗氧化物的清除能力，从而导致活性氧在体内蓄积，并引起一系列生物反应的过程。与抗氧化相关的酶和分子包括：超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氧酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、硫氧还蛋白(Trx)、维生素C、维生素E、谷胱甘肽、类胡萝卜素等。Nrf2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2)是新发现的细胞氧化应激反应中的关键因子，通过与抗氧化反应元件ARE(antioxidantresponse element)结合，激活多种抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表达。Keapl-Nrf2/ARE作为机体内有效的抗氧化信号转导通路，对于防御、减轻氧化应激的损害具有极其重要的作用。
近年来植物活性成分防治缺血性脑中风的研究备受关注，其作用机制往往是多靶点、多效应及多功能，经过在体内干预酶促级联反应的一条或多条通路后，发生复杂的反应而产生放大效应，发挥生理作用。有研究对超过60000种来自中药的化合物(TCM)数据库进行计算分析共获得2355个候选抗中风化合物，在这些化合物中，19种成分已经被鉴定出在结构上与16种目前已经部分用于抗中风治疗的现有药物相同，大多数候选化合物和抗中风植物倾向于与靶标NOS3，PSD-95和PDE5A相互作用。
缺血性脑中风的临床表现呈多样性，若用动物模型或细胞培养模型完全模拟人体脑中风的发病过程是十分困难的。因此，在建立中风模型时，应该根据该模型生理病理表现与中风临床表现的相似度来选择，动物模型与临床的拟合对于研究数据的可靠性具有重要意义。
在研究缺血性脑中风时，除了使用整体动物模型外，用体外培养的神经细胞进行实验也是目前常用的实验方法。脑切片，从皮层培养的原代神经细胞，胶质细胞以及胎儿期或围产期啮齿动物的海马和小脑，这些都广泛的被用作研究脑缺血样损伤的模型。体外模拟缺血性脑中风模型有细胞模型(神经元模型、胶质细胞模型和内皮细胞模型)、共培养模型(神经元与胶质细胞共培养、BBB模型和脑片模型)和缺血模型(直接诱导法、间接诱导法)，其中常用的是直接诱导法中的缺氧缺糖(OGD/R)模型、缺氧/复氧模型、缺血再灌注(I/R)模型等。
P.A.LAPCHAK等人(Lapchak P A,Maher P,Schubert D,et al.Baicalein,anantioxidant 12/15-lipoxygenase inhibitor improves clinical rating scoresfollowing multiple infarct embolic strokes[J].Neuroscience,2007,150(3):585-591)将黄芩苷作用于HT22细胞，发现其能够显著增加细胞存活率，对碘乙酸造成的细胞损伤具有神经保护作用，进一步研究发现在兔子栓塞性中风后1小时内给予黄芩苷也能够显著减少其行为缺陷。
大多数研究集中在白藜芦醇、苦瓜多糖、黄芩苷、黄氏总苷、三七总皂苷及金丝桃苷等植物活性成分对CoCl2诱导的PC12细胞、SHSY-5y细胞等神经细胞氧化损伤的保护作用，但尚未见荭草苷对CoCl2诱导的小鼠海马神经元HT22细胞I/R损伤的保护作用的研究报道。
蒋伟、袁丹华等人(蒋伟,屈海琪,袁丹华,杨国栋,安芳,王书华.金莲花中荭草苷和牡荆苷对D-半乳糖致衰老小鼠脑损伤的保护作用[J].中草药,2012,43(7):1376-1380)发现金莲花中黄酮单体荭草苷对D-半乳糖致衰老小鼠脑损伤具有一定的保护作用，能够提高衰老小鼠组织中抗氧化酶系的活性、降低组织中MDA，改善海马区神经细胞结构功能。
袁丹华通过H2O2诱导红细胞建立脂质过氧化损伤模型，发现荭草苷通过降低MDA含量、提高抗氧化酶活性、提高跨膜离子转运酶活力对红细胞氧化损伤具有一定的保护作用。上述研究皆集中于利用细胞模型和动物模型研究荭草苷对心肌缺血作用及机理，但尚未见荭草苷对缺血性脑中风干预作用的研究报道。
油莎草(Cyperus esculentus L.Var.sativus)，它又被称为油莎豆，是莎草科(Cyperaceae)莎草属(Cyperus)多年生草本，新疆很多地方光热条件与莎豆的原产地(北非尼罗河油流域)相似，沙性土壤能满足油莎豆的生长发育。
瞿萍梅等人(瞿萍梅,程治英,龙春林,苏明华,杨德.油莎豆资源的综合开发利用[J].中国油脂,2009,(9):61-63)文献研究报道，油莎草具有天然药物的一些功能。《新华本草纲要》记载，油莎豆块茎性辛、甘、温，有疏肝行气、健脾和健胃功效，主治肝郁气滞所致的胁痛、胸闷；脾胃气滞所致的脘腹胀满、胃痛纳呆、脾虚食少、食积停滞、消化不良等症。《名医别录》里记载，油莎草的茎叶有主治行气开郁、祛风止痒、宽胞利痰、主胸闷不舒、风疹瘙痒；痈伴随肿毒等功能。
综上所述，油莎草既是很好的食用资源，又具有潜在的药用价值。
发明内容
本发明提供了一种油莎草总黄酮提取物、活性单体荭草苷及其提取方法和应用，本发明首次公开油莎草总黄酮提取物在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用、活性单体荭草苷在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用和活性单体荭草苷在制备治疗缺血再灌注24小时引起的缺血性脑中风药物中的应用。
本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种油莎草总黄酮提取物，按下述方法得到：第一步，将烘干后的油莎草地上茎叶采用50％至95％的乙醇溶液回流提取2次至3次，合并提取液，将合并后的提取液减压浓缩至得到浸膏；第二步，将第二步得到的浸膏采用预处理后的大孔树脂柱层析进行分离，在分离过程中，依次采用水和30％的乙醇溶液洗脱后得到30％乙醇洗脱部位；第三步，将30％乙醇洗脱部位依序经过减压浓缩和冷冻干燥后得到油莎草总黄酮提取物。
下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：
上述油莎草总黄酮提取物中，总黄酮的含量为176.69mg/g至180.00mg/g；总黄酮中，7-羟基-6-甲氧基-香豆素的含量为1.6mg/g，异荭草苷的含量为3.67mg/g，荭草苷的含量为9.96mg/g。
上述第一步中，每次提取的时间为1.5h；或/和，大孔树脂采用D101大孔树脂，D101大孔树脂的预处理按下述方法进行：将大孔树脂用无水乙醇回流提取直至大孔树脂充分的溶胀，然后再用不同浓度的无水乙醇梯度洗脱，直至洗脱液加水后无白色浑浊溶出，再用蒸馏水进行洗脱，直至洗脱下来的溶液没有醇味为止。
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种油莎草总黄酮提取物的提取方法，按下述方法进行：第一步，将烘干后的油莎草地上茎叶采用50％至95％的乙醇溶液回流提取2次至3次，合并提取液，将合并后的提取液减压浓缩至得到浸膏；第二步，将第二步得到的浸膏采用预处理后的大孔树脂柱层析进行分离，在分离过程中，依次采用水和30％的乙醇溶液洗脱后得到30％乙醇洗脱部位；第三步，将30％乙醇洗脱部位依序经过减压浓缩和冷冻干燥后得到油莎草总黄酮提取物。
下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：
上述油莎草总黄酮提取物中，总黄酮的含量为176.69mg/g至180.00mg/g；总黄酮中，7-羟基-6-甲氧基-香豆素的含量为1.6mg/g，异荭草苷的含量为3.67mg/g，荭草苷的含量为9.96mg/g。
上述第一步中，每次提取的时间为1.5h；或/和，大孔树脂采用D101大孔树脂，D101大孔树脂的预处理按下述方法进行：将大孔树脂用无水乙醇回流提取直至大孔树脂充分的溶胀，然后再用不同浓度的无水乙醇梯度洗脱，直至洗脱液加水后无白色浑浊溶出，再用蒸馏水进行洗脱，直至洗脱下来的溶液没有醇味为止。
本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种油莎草总黄酮提取物在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用。
本发明的技术方案之四是通过以下措施来实现的：一种使用油莎草总黄酮提取物提取的活性单体荭草苷，按下述方法得到：第一步，将油莎草总黄酮提取物用聚酰胺拌样后，在反相硅胶柱中采用不同浓度的甲醇溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，每瓶100mL，共收集77瓶，将分别得到的77瓶洗脱液采用薄层层析检测，薄层层析检测结果以蓝黑色斑或者黄绿色斑为判断标准，根据显色定性结果合并斑点颜色相似的洗脱液，将斑点颜色相似的第56瓶至61瓶洗脱液合并得到洗脱液一；第二步，将洗脱液一在葡聚糖凝胶柱利用甲醇进行洗脱，收集洗脱液，每瓶10mL，共收集90瓶，前第1瓶至第30瓶用A依次编号，第1瓶编号为A1，以此类推，第30瓶编号为A30，第31瓶至第60瓶用B依次编号，第31瓶编号为B1，以此类推，第60瓶编号为B30，第61瓶至第90瓶用C依次编号，第61瓶编号为C1，以此类推，第90瓶编号为C30，合并A23至A28、B21至B27和C23至C27得到合并流分，将合并流分经过减压浓缩和冷冻后得到活性单体荭草苷。
下面是对上述发明技术方案之四的进一步优化或/和改进：
上述第一步中，在反相硅胶柱中采用浓度为10％、20％、30％、40％、50％、70％和100％的甲醇溶液进行梯度洗脱；或/和，反相硅胶柱采用ODS RP-18反相硅胶柱；或/和，葡聚糖凝胶柱采用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱。
本发明的技术方案之五是通过以下措施来实现的：一种活性单体荭草苷的提取方法，按下述方法进行：第一步，将油莎草总黄酮提取物用聚酰胺拌样后，在反相硅胶柱中采用不同浓度的甲醇溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，每瓶100mL，共收集77瓶，将分别得到的77瓶洗脱液采用薄层层析检测，薄层层析检测结果以蓝黑色斑或者黄绿色斑为判断标准，根据显色定性结果合并斑点颜色相似的洗脱液，将斑点颜色相似的第56瓶至61瓶洗脱液合并得到洗脱液一；第二步，将洗脱液一在葡聚糖凝胶柱利用甲醇进行洗脱，收集洗脱液，每瓶10mL，共收集90瓶，前第1瓶至第30瓶用A依次编号，第1瓶编号为A1，以此类推，第30瓶编号为A30，第31瓶至第60瓶用B依次编号，第31瓶编号为B1，以此类推，第60瓶编号为B30，第61瓶至第90瓶用C依次编号，第61瓶编号为C1，以此类推，第90瓶编号为C30，合并A23至A28、B21至B27和C23至C27得到合并流分，将合并流分经过减压浓缩和冷冻后得到活性单体荭草苷。
下面是对上述发明技术方案之五的进一步优化或/和改进：
上述第一步中，在反相硅胶柱中采用浓度为10％、20％、30％、40％、50％、70％和100％的甲醇溶液进行梯度洗脱；或/和，反相硅胶柱采用ODS RP-18反相硅胶柱；或/和，葡聚糖凝胶柱采用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱。
本发明的技术方案之六是通过以下措施来实现的：一种活性单体荭草苷在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用。
本发明的技术方案之七是通过以下措施来实现的：一种活性单体荭草苷在制备治疗缺血再灌注24小时引起的缺血性脑中风药物中的应用。
本发明首次公开油莎草总黄酮提取物和活性单体荭草苷在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用，药理实验说明，油莎草总黄酮提取物和活性单体荭草苷两者对I/R损伤均具有保护作用，并且本发明中的活性单体荭草苷对I/R损伤的保护作用要高于油莎草总黄酮提取物；尤其是在I/R损伤24h时，本发明中的活性单体荭草苷对其仍然具有保护作用，而现有技术中的荭草苷并无相应的保护作用，提示本发明中的活性单体荭草苷在缺血性脑中风治疗中的应用前景；另外，本发明首次推测活性单体荭草苷可能通过降低MDA、H2O2含量、下调caspase-3水平及减少蛋白质氧化损伤而对CoCl2诱导的HT22细胞具有保护作用，为进一步研究油莎草总黄酮干预缺血性脑中风作用的分子机制奠定研究基础。
附图说明
附图1为CLTF对CoCl2诱导的HT22细胞缺血再灌注4h的干预作用。
附图2为CLTF对CoCl2诱导的HT22细胞缺血再灌注8h的干预作用。
附图3为CLTF对CoCl2诱导的HT22细胞缺血再灌注12h的干预作用。
附图4为CLTF对CoCl2诱导的HT22细胞缺血再灌注24h的干预作用。
附图5为CLO对细胞的保护作用CoCl2诱导的HT22细胞缺血再灌注4h的干预作用。
附图6为CLO对对细胞的保护作用CoCl2诱导的HT22细胞缺血再灌注8h的干预作用。
附图7为CLO对对细胞的保护作用CoCl2诱导的HT22细胞缺血再灌注12h的干预作用。
附图8为CLO对对细胞的保护作用CoCl2诱导的HT22细胞缺血再灌注24的干预作用。
附图9为不同浓度处理对CoCl2诱导的HT22细胞上清液中LDH的影响。
附图10为不同浓度处理对CoCl2诱导的HT22细胞中SOD酶活性的影响。
附图11为不同浓度处理对CoCl2诱导的HT22细胞中H2O2含量的影响。
附图12为不同浓度处理对CoCl2诱导的HT22细胞中MDA含量的影响。
附图13为不同浓度处理对CoCl2诱导的HT22细胞中caspase-3活性的影响。
附图14为不同浓度处理对CoCl2诱导的HT22细胞中蛋白质氧化损伤的影响。
附图1至附图14中，*P＜0.05,**P＜0.01，***P＜0.001versus blank。#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001versus model。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现有技术中公知公用的化学试剂和化学用品；本发明中的百分数如没有特殊说明，均为质量百分数；本发明中的溶液若没有特殊说明，均为溶剂为水的水溶液，例如，盐酸溶液即为盐酸水溶液；本发明中的常温、室温一般指15℃到25℃的温度，一般定义为25℃。
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例1：该油莎草总黄酮提取物，按下述制备方法得到：第一步，将烘干后的油莎草地上茎叶采用50％至95％的乙醇溶液回流提取2次至3次，合并提取液，将合并后的提取液减压浓缩至得到浸膏；第二步，将第二步得到的浸膏采用预处理后的大孔树脂柱层析进行分离，在分离过程中，依次采用水和30％的乙醇溶液洗脱后得到30％乙醇洗脱部位；第三步，将30％乙醇洗脱部位依序经过减压浓缩和冷冻干燥后得到油莎草总黄酮提取物。
根据本实施例所述的方法，100g油莎草可以得到0.82g油莎草总黄酮提取物。
本实施例得到的油莎草总黄酮提取物中，含有黄酮和多酚类化合物，总黄酮的含量为176.69mg/g至180.00mg/g；总黄酮中，7-羟基-6-甲氧基-香豆素的含量为1.6mg/g，异荭草苷的含量为3.67mg/g，荭草苷的含量为9.96mg/g。
总黄酮含量测定按现有公知方法(王赛赛,杨飞飞,聂正兴,李倩,马秀芳,敬思群.不同提取方法对油莎草总黄酮体外抗氧化活性影响.中国食品添加剂,2015,(4):148-153.)进行测定。
实施例2：该油莎草总黄酮提取物，按下述制备方法得到：第一步，将烘干后的油莎草地上茎叶采用50％或95％的乙醇溶液回流提取2次或3次，合并提取液，将合并后的提取液减压浓缩至得到浸膏；第二步，将第二步得到的浸膏采用预处理后的大孔树脂柱层析进行分离，在分离过程中，依次采用水和30％的乙醇溶液洗脱后得到30％乙醇洗脱部位；第三步，将30％乙醇洗脱部位依序经过减压浓缩和冷冻干燥后得到油莎草总黄酮提取物。
实施例3：作为上述实施例的优化，第一步中，每次提取的时间为1.5h；或/和，大孔树脂采用D101大孔树脂，D101大孔树脂的预处理按下述方法进行：将大孔树脂用无水乙醇回流提取直至大孔树脂充分的溶胀，然后再用不同浓度的无水乙醇梯度洗脱，直至洗脱液加水后无白色浑浊溶出，再用蒸馏水进行洗脱，直至洗脱下来的溶液没有醇味为止。
实施例4：上述实施例所述的油莎草总黄酮提取物在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用。
实施例5：使用上述实施例所述的油莎草总黄酮提取物提取的活性单体荭草苷，按下述制备方法得到：第一步，将油莎草总黄酮提取物用聚酰胺拌样后，在反相硅胶柱中采用不同浓度的甲醇溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，每瓶100mL，共收集77瓶，将分别得到的77瓶洗脱液采用薄层层析检测，薄层层析检测结果以蓝黑色斑或者黄绿色斑为判断标准，根据显色定性结果合并斑点颜色相似的洗脱液，将斑点颜色相似的第56瓶至61瓶洗脱液合并得到洗脱液一；第二步，将洗脱液一在葡聚糖凝胶柱利用甲醇进行洗脱，收集洗脱液，每瓶10mL，共收集90瓶，前第1瓶至第30瓶用A依次编号，第1瓶编号为A1，以此类推，第30瓶编号为A30，第31瓶至第60瓶用B依次编号，第31瓶编号为B1，以此类推，第60瓶编号为B30，第61瓶至第90瓶用C依次编号，第61瓶编号为C1，以此类推，第90瓶编号为C30，合并A23至A28、B21至B27和C23至C27得到合并流分，将合并流分经过减压浓缩和冷冻后得到活性单体荭草苷。
根据本实施例所述的方法，1000g油莎草可以得到139.33mg活性单体荭草苷。
本实施例得到的活性单体荭草苷的化学结构式如文献(王赛赛，张孟凡，齐蕊，敬思群，涂亦娴，王为兰.油莎草醇提物成分分离鉴定及抗氧化活性分析.食品工业,2017年6期)所示。
实施例6：作为实施例5的优化，在反相硅胶柱中采用浓度为10％、20％、30％、40％、50％、70％和100％的甲醇溶液进行梯度洗脱；或/和，反相硅胶柱采用ODS RP-18反相硅胶柱；或/和，葡聚糖凝胶柱采用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱。
实施例7：上述实施例所述的活性单体荭草苷在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用。
实施例8：上述实施例所述的活性单体荭草苷在制备治疗缺血再灌注24小时引起的缺血性脑中风药物中的应用。
本发明中，英文缩略词如表1所示。
一.本发明的油莎草总黄酮提取物在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用的药理实验
1.油莎草总黄酮提取物(油莎草总黄酮)对CoCl2诱导的小鼠海马神经元HT22细胞缺血再灌注(I/R)损伤的保护作用
目前常用过氧化氢和叔丁基过氧化氢来模拟脑缺血和缺血再灌注产生的活性氧引起的氧化应激损伤，还未见采用氯化钴(CoCl2)诱导HT22细胞缺血再灌注损伤细胞模型来探究油莎草总黄酮的保护作用。因此，本研究中以细胞存活率为指标，使用不同浓度的CoCl2作用于HT22细胞，建立I/R损伤模型，筛选出合适的作用浓度及再灌注时间。将不同浓度的油莎草总黄酮单独作用HT22细胞和分别作用于I/R损伤模型的HT22细胞，筛选对HT22细胞的无毒剂量范围。以此剂量范围将细胞分为6组：正常对照组(Control)、模型组(Model)、油莎草总黄酮(100、200、400、800μg/mL)，采用造模前预孵育及造模后干预两种加样方式，通过WST-8法筛选出对CoCl2诱导的HT22细胞I/R损伤具有保护作用的油莎草总黄酮剂量范围。
1.1实验材料
1.1.1细胞株
小鼠海马神经元细胞株HT22：由美国北德克萨斯大学健康科学中心(UNTHSC)的李文军博士后赠予
1.1.2药品及试剂
本发明所述的油莎草总黄酮
不同浓度的目标组分(油莎草总黄酮)溶液配制：用DMEM培养基溶解，溶解度约为99％，然后用0.45μm注射器过滤器过滤除菌，配制母液浓度为3200μg/mL。根据需要，稀释成不同浓度使用。
DMEM培养基、胎牛血清(FBS)和青链霉素(P/S)购自于Gibco公司(Grand Island,NY,USA)；台酚蓝(Trypan blue)、Trypsin-EDTA(0.25％)、DMSO、PBS购自于Sigma-Aldrich公司(St Louis,MO,USA)；CoCl2购自于Ricca化学试剂公司(Arlington,TX,USA)；WST-8细胞增殖分析试剂盒购自于Cayman化学公司(Ann Arbor,MI,USA)。
1.2实验方法
1.2.1细胞培养与观察
实验使用小鼠海马神经元HT22细胞株，细胞代数为10-30代。HT22于含有10％FBS(v/v)和1％青链霉素的DMEM液体培养基中培养，培养箱中的参数控制在37℃，5％CO2+95％空气，每2-3天换一次液。用倒置显微镜观察细胞的生长条件和形态学改变。
1.2.2 CoCl2剂量及再灌注时间筛选
方法参考Tao Yang等人的文献(Yang T,Li D,Liu F,et al.Regulation onBeclin-1expression by mTOR in CoCl2-induced HT22cell ischemia-reperfusioninjury[J].Brain research,2015,1614:60-66)略有修改。以每孔1×104个细胞的密度接种HT22细胞于96孔板上，每组6个复孔，放入37℃，5％CO2的培养箱培养过夜，细胞达到80％汇合时进行实验。弃去培养基，加入用培养基稀释不同浓度的CoCl2处理HT22细胞，设置对照组，对照组加入相同体积的培养基，将96孔细胞培养板放入37℃，5％CO2的培养箱培养16h，造成细胞缺血，用显微镜观察细胞形态。缺血16h后，吸出培养液，加入新鲜的培养基100μL继续培养不同的时间(0、4、8、12、24h)，造成缺血再灌注模型。在到达规定的再灌注时间后，每孔加入10μL WST-8试剂，轻微震荡使之混匀。然后置于37℃，5％CO2的培养箱中孵育2h，在450nm处用多功能酶标仪测定各孔的吸光度值。
1.2.3油莎草总黄酮的细胞毒性检验
以每孔1×104个细胞的密度接种HT22细胞于96孔板上，放入37℃，5％CO2的培养箱培养，细胞达到80％汇合时进行实验。实验分为空白对照组与油莎草总黄酮组(100、200、400、800、1600μg/mL)，每组6复孔，每孔加入100μL培养基，各组分别预孵育18、24、32、48、72h，采用WST-8法测细胞存活率。
1.2.4油莎草总黄酮对CoCl2诱导的HT22细胞I/R损伤的干预作用
实验分为空白对照组、模型组、不同浓度油莎草总黄酮组(100、200、400、800μg/mL)。以每孔1×104个细胞的密度接种HT22细胞于96孔板上，每组6个复孔，放入37℃，5％CO2的培养箱培养过夜，细胞达到80％汇合时进行实验，每孔加入20μL母液浓度为2500μM的CoCl2使得终浓度为500μM，将96孔细胞培养板放入37℃，5％CO2的培养箱培养16h，造成细胞缺血，用显微镜观察细胞形态。然后加入不同浓度的油莎草总黄酮4、8、12、24h，空白组与模型组加入相同体积的培养基。再灌注不同时间后，每孔加入10μL WST-8试剂，轻微震荡使之混匀。然后置于37℃，5％CO2的培养箱中孵育2h，在450nm处用多功能酶标仪测定各孔的吸光度值。
1.3统计学分析
采用GraphPad Prism 5.01统计软件(GraphPad Software Inc.,San Diego,USA)分析实验数据，数据以均数±标准差(x±s)表示。组间比较采用单因素方差分析。
1.4.1 CoCl2剂量及再灌注时间筛选
WST-8法分析不同浓度的CoCl2不同再灌注时间下HT22细胞存活率的变化，结果发现HT22细胞活力随着CoCl2浓度的增加及作用时间的延长而降低，当500μM CoCl2作用，缺血16h，再灌注时间为4、8、12、24h时，细胞存活率分别为62.89％、67.08％、69.74％、66.24％，平均存活率为69.17％，此时细胞受损但不至于大量死亡，综合考虑确定造模条件为浓度500μM，缺血16h，再灌注时间为4h。
WST-8法分析不同浓度油莎草总黄酮不同预孵育时间下HT22细胞存活率的变化，结果发现预孵育12h，800μg/mL油莎草总黄酮对HT22细胞I/R损伤具有显著保护作用(P＜0.01)，细胞存活率提高了21.60％。
1.4.2油莎草总黄酮不同孵育时间对HT22细胞的毒性作用
WST-8法分析不同浓度的油莎草总黄酮不同孵育时间下HT22细胞存活率的变化，确定无毒剂量范围，结果表明，在浓度100～800μg/mL，作用时间18～48h时，油莎草总黄酮对HT22细胞无显著毒性作用(P＞0.05)。
1.4.3油莎草总黄酮对CoCl2诱导的HT22细胞I/R的干预作用
1.4.3.1油莎草总黄酮对CoCl2诱导的HT22细胞I/R4h的干预作用
图1显示，使用油莎草总黄酮对CoCl2诱导的HT22细胞I/R干预4h时，不同浓度的CLTF对细胞的存活率均有不同程度的提升作用。与正常对照组相比，模型组HT22细胞存活率下降至62.89±5.236％，二者之间差异有统计学意义P＜0.001)。与模型组相比，100～400μg/mL的细胞存活率分别为：68.02±7.936％，74.91±5.963％，72.42±5.734％。800μg/mL的细胞存活率仅为57.15±3.200％，与模型组相比，下降了9.13％。然而，100～800μg/mL浓度的油莎草总黄酮干预下，细胞存活率的提高与模型组并无统计学差异(P＞0.05)。
1.4.3.2油莎草总黄酮对CoCl2诱导的HT22细胞I/R 8h的干预作用
图2显示，使用油莎草总黄酮对CoCl2诱导的HT22细胞缺血再灌注干预8h时，不同浓度的油莎草总黄酮对细胞的存活率均有不同程度的提升作用。与正常对照组相比，模型组HT22细胞存活率下降至67.08±4.806％，二者之间差异有统计学意义(P＜0.001)。与模型组相比，100～800μg/mL的细胞存活率均有所提高，分别为：78.85±16.08％，86.48±18.89％，84.77±12.20％，71.27±7.654％。然而，在此浓度范围内，细胞的存活率提高与模型组之间并无统计学差异(P＞0.05)。
1.4.3.3油莎草总黄酮对CoCl2诱导的HT22细胞I/R 12h的干预作用
图3显示，使用油莎草总黄酮对CoCl2诱导的HT22细胞缺血再灌注干预12h时，不同浓度的油莎草总黄酮对细胞的存活率均有不同程度的提升作用。与正常对照组相比，模型组HT22细胞存活率下降至69.74±8.203％，二者之间比较差异有统计学意义(P＜0.001)。与模型组相比，100～400μg/mL的细胞存活率均有所提高，分别为：72.71±4.427％，75.59±18.31％，72.10±10.46％，800μg/mL的细胞存活率仅为67.42±13.23％，与模型组相比，下降了3.33％。然而，在此浓度范围内，细胞的存活率提高与模型组之间并无统计学差异(P＞0.05)。
1.4.3.4油莎草总黄酮对CoCl2诱导的HT22细胞I/R 24h的干预作用
图4显示，使用油莎草总黄酮对CoCl2诱导的HT22细胞缺血再灌注干预24h时，不同浓度的油莎草总黄酮对细胞的存活率均有不同程度的提升作用。与正常对照组相比，模型组HT22细胞存活率下降至66.24±6.081％，二者之间差异有统计学意义(P＜0.001)。与模型组相比，100～400μg/mL的细胞存活率均有所提高，分别为：68.85±6.811％，67.23±10.74％，77.19±10.18％，800μg/mL的细胞存活率仅为60.33±9.668％，与模型组相比，下降了8.92％。然而，在此浓度范围内，细胞的存活率提高与模型组之间并无统计学差异(P＞0.05)。
WST-8法分析油莎草总黄酮对CoCl2诱导的HT22细胞I/R干预不同时间HT22细胞存活率的变化，结果发现干预4～24h，浓度为100～800μg/mL油莎草总黄酮对I/R损伤的HT22细胞均具有不同程度的保护作用，但无显著差异。
二、本发明的活性单体荭草苷(油莎草总黄酮活性单体荭草苷)在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用的药理实验
2油莎草总黄酮活性单体荭草苷(CLO)对CoCl2诱导的HT22细胞缺血再灌注(I/R)损伤的保护作用
2.1实验材料
2.1.1细胞株
同1.1.1。
2.1.2药品及试剂
本发明的油莎草总黄酮活性单体荭草苷(活性单体荭草苷)；标品荭草苷(STO)：购自于中国食品药品检定研究院，其含量为97.9％，来自于金莲花植物。
其他试剂同1.1.2.
2.2实验方法
2.2.1单体荭草苷的细胞毒性检验
以每孔1×104个细胞的密度接种HT22细胞于96孔板上，放入37℃，5％CO2的培养箱培养，细胞达到80％汇合时进行实验。实验分为空白对照组与单体荭草苷及标品荭草苷组(100、200、400、600μg/mL)，每组6复孔，每孔加入100μL培养基，各组分别预孵育6、12h，采用WST-8法测细胞存活率。
2.2.2单体荭草苷不同预孵育时间对CoCl2诱导的HT22I/R损伤的保护作用
以每孔1×104个细胞的密度接种HT22细胞于96孔板上，每组6个复孔，放入37℃，5％CO2的培养箱培养过夜，细胞达到80％汇合时进行实验。弃去培养基，加入用培养基稀释不同浓度的单体荭草苷与标品荭草苷放入37℃，5％CO2的培养箱培养进行预孵育，设置对照组及模型组，对照组与模型组加入相同体积的培养基。预孵育完成后，各孔加入20μL母液浓度为2500μM的CoCl2使得终浓度500μM，将96孔细胞培养板放入37℃，5％CO2的培养箱培养16h，造成细胞缺血，用显微镜观察细胞形态。缺血16h后，吸出培养液，加入新鲜的DMEM培养基100μL继续培养4h，造成缺血再灌注模型。4h后，每孔加入10μL WST-8试剂，轻微震荡使之混匀。然后置于37℃，5％CO2的培养箱中孵育2h，在450nm处用多功能酶标仪测定各孔的吸光度值。
2.2.3单体荭草苷对CoCl2诱导的HT22细胞I/R损伤的干预作用
实验分为空白对照组、模型组、单体荭草苷与标品荭草苷组(100、200、400、600μg/mL)。以每孔1×104个细胞的密度接种HT22细胞于96孔板上，每组6个复孔，放入37℃，5％CO2的培养箱培养过夜，细胞达到80％汇合时进行实验，每孔加入20μL母液浓度为2500μM的CoCl2使得终浓度为500μM，将96孔细胞培养板放入37℃，5％CO2的培养箱培养16h，造成细胞缺血，用显微镜观察细胞形态。然后加入不同浓度的单体荭草苷与标品荭草苷4、8、12、24h，空白组与模型组加入相同体积的培养基。再灌注不同时间后，每孔加入10μL WST-8试剂，轻微震荡使之混匀。然后置于37℃，5％CO2的培养箱中孵育2h，在450nm处用多功能酶标仪测定各孔的吸光度值。
2.3统计学分析
采用GraphPad Prism 5.01统计软件(GraphPad Software Inc.,San Diego,USA)分析实验数据，数据均以均数±标准差(x±s)表示。组间比较采用单因素方差分析。
2.4结果与分析
2.4.1单体荭草苷不同孵育时间对HT22细胞的毒性作用
WST-8法分析单体荭草苷与标品荭草苷不同孵育时间下HT22细胞存活率的变化，结果表明预孵育6、12h时，浓度在100～600μg/mL范围内，单体荭草苷与标品荭草苷均未对HT22细胞活力造成影响(P＞0.05)，说明其对HT22细胞无毒性作用。
2.4.2单体荭草苷不同孵育时间对CoCl2诱导的HT22细胞I/R损伤的保护作用
WST-8法分析单体荭草苷与标品荭草苷对CoCl2诱导的HT22细胞缺血再灌注干预不同时间HT22细胞存活率的变化，结果表明I/R 8h，单体荭草苷与标品荭草苷均能不同程度的改善I/R损伤作用，在缺血再灌注24h时，仅单体荭草苷能够改善I/R损伤作用。综合比较发现CLO与STO的作用效果相当。
2.4.3单体荭草苷对CoCl2诱导的HT22细胞I/R损伤的干预作用
2.4.3.1单体荭草苷对CoCl2诱导的HT22细胞I/R4h的干预作用
由图5可以看出，使用CLO与STO对CoCl2诱导的HT22细胞缺血再灌注干预4h时，不同浓度的CLO与STO对细胞的存活率均有不同程度的提升作用。与正常对照组相比，模型组HT22细胞存活率分别下降至58.83±2.672％、61.86±5.333％，CLO与STO的空白对照组与模型组之间比较差异均具有有统计学意义(P＜0.001)。与模型组相比，25～200μg/mL的细胞存活率均有提高，但与模型组并无统计学差异(P＞0.05)。
2.4.3.2单体荭草苷对CoCl2诱导的HT22细胞缺血再灌注8h的干预作用
由图6可以看出，使用CLO与STO对CoCl2诱导的HT22细胞I/R干预8h时，不同浓度的CLO与STO对细胞的存活率均有不同程度的提升作用。与正常对照组相比，模型组HT22细胞存活率分别下降至58.79±6.847％、54.45±6.257％，CLO与STO的空白对照组与模型组之间比较差异均具有统计学意义(P＜0.001)。与模型组相比，25～200μg/mL的细胞存活率均有提高，STO组浓度在175～200μg/mL范围内细胞存活率显著提高(P＜0.01，P＜0.05)，CLO组175μg/mL浓度下细胞存活率显著提高(P＜0.05)，说明预孵育8h时STO与CLO均能改善CoCl2诱导的HT22细胞I/R损伤。
2.4.3.4单体荭草苷对CoCl2诱导的HT22细胞I/R 12h的干预作用
由图7可以看出，使用CLO与STO对CoCl2诱导的HT22细胞I/R干预12h时，不同浓度的CLO与STO对细胞的存活率均有不同程度的提升作用。与正常对照组相比，模型组HT22细胞存活率分别下降至52.85±7.901％、48.04±2.420％，CLO与STO的空白对照组与模型组之间比较差异均具有统计学意义(P＜0.001)。与模型组相比，25～200μg/mL的细胞存活率均有提高，但与模型组并无统计学差异(P＞0.05)。
2.4.2.4单体荭草苷对CoCl2诱导的HT22细胞I/R 24h的干预作用
由图8可以看出，使用CLO与STO对CoCl2诱导的HT22细胞I/R干预24h时，不同浓度的CLO与STO对细胞的存活率均有不同程度的提升作用。与正常对照组相比，模型组HT22细胞存活率分别下降至39.77±3.124％、40.42±3.344％，CLO与STO的空白对照组与模型组之间比较差异均具有统计学意义(P＜0.001)。与模型组相比，STO组在25～200μg/mL的细胞存活率均有提高，但与模型组并无统计学差异(P＞0.05)，而CLO在浓度为125～200μg/mL范围内的细胞存活率均有提高，并与模型组有统计学差异(P＜0.01，P＜0.001)。
CLO与STO的作用效果比较：在预孵育6h时，STO在200～600μg/mL浓度范围内HT22细胞存活率均有显著地提高，而CLO在100～600μg/mL浓度范围内HT22细胞存活率也均有了明显的提高；而在干预8h时，CLO(175μg/mL)和STO(175和200μg/mL)对HT22细胞存活率有显著地提高；在干预24h时，CLO浓度为125μg/mL时对HT22细胞存活率有显著地提高，但STO并没有显著地提高细胞存活率，综合比较发现CLO与STO的作用效果相当。
2.4.3油莎草总黄酮目标组分与油莎草总黄酮活性单体荭草苷(CLO)对HT22细胞缺血再灌注(I/R)损伤的保护作用药效比较分析
油莎草总黄酮目标组分预孵育12h，浓度为800μg/mL时对I/R损伤具有显著地保护作用，而油莎草总黄酮活性单体荭草苷预孵育6h，浓度仅为200μg/mL就对I/R损伤具有保护作用；而在干预实验中，油莎草总黄酮虽能不同程度地改善I/R损伤，但并不具有统计学意义，而油莎草总黄酮活性单体荭草苷(本发明的活性单体荭草苷)在干预8h，浓度为175μg/mL和干预24h，浓度为125～200μg/mL时对I/R损伤具有显著地保护作用。
并且油莎草总黄酮活性单体荭草苷的药效要高于油莎草总黄酮。
三、油莎草总黄酮活性单体荭草苷(CLO)对CoCl2诱导的HT22细胞缺血再灌注(I/R)损伤的保护机制研究
本章节我们将通过乳酸脱氢酶(LDH)检测细胞毒性、Caspase-3试剂盒检测细胞凋亡率，SOD、H2O2、TBARS试剂盒测定细胞内SOD酶活、过氧化物及MDA水平，使用醛酮反应性探针(aldehyde/keto-reactive probe，ARP)结合Western-Blot分析检测HT22细胞中的羰基修饰的蛋白质氧化水平，来判断脑缺血损伤过程中引起的氧化应激、细胞凋亡以及激活的信号转导通路，初步探讨单体荭草苷对CoCl2诱导的HT22细胞保护作用的可能机制。
3.1材料与试剂
3.1.1主要试剂
LDH毒性评估试剂盒购自于G-Biosciences公司(St Louis,MO,USA)；
Caspase-3分析试剂盒、SOD试剂盒、H2O2分析试剂盒、TBARS分析试剂盒购自于BioAssay Systems公司(Hayward,CA,USA)；
BSA购自于Amresco LLC公司(Solon,OH,USA)；
30％Acrylamide/Bis Solution、1.5M Tris-Hcl(pH 8.8)、0.5M Tris-Hcl(pH6.8)、10×Tris/Glycine/SDS Buffer、10×Tris/Glycine Buffer、Bio-Rad蛋白分析试剂、ECL Western blotting试剂和Strep Tactin-HRP缀合物均购自于Bio-Rad实验室(Hercules,CA,USA)；
Aldehyde/keto-reactive探针购自于Cayman化学公司(Arbor,Michigan,USA)；
TEMED购自于Sigma-Aldrich公司(St Louis,MO,USA)；
其余同上。
3.2实验方法
3.2.1乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性评估
其原理是在LDH的作用下，NAD+被还原为NADH，NADH和INT被硫辛酰胺脱氢酶催化反应成NAD+和强生色物甲臜(Formazan)，在490nm处产生吸收峰，从而可通过比色来定量LDH的活性，吸光度与LDH活性成线性正相关。
LDH试剂准备(按试剂盒方法)：1μL LDH加到10mL PBS(含1％BSA)中；1瓶底物混合物用11.4mL去离子水溶解，将0.6mL Assay Buffer室温避光加热后，将其混匀至溶解好的底物混合物中(重构底物混合物)；10×LDH裂解缓冲液；LDH终止液；LDH阳性对照。
细胞培养步骤参考本文2.2.2方法，预孵育时间为12h。将细胞分为3组：实验组，即正常细胞孵育组；阳性组，即1:10000稀释组(1μL+10mL PBS)；阴性组，即培养基组。在细胞进行培养完成后，每组各加10μL，10×LDH裂解缓冲液裂解细胞，在5％，37℃条件下孵育45min，250×g下离心5min，每孔取50μL重构底物混合物于新的96孔板，锡箔纸覆盖室温下孵育30min或37℃下孵育20min后，每孔加50μL终止液，1h后测定OD值(490nm处)
％细胞毒性＝(实验组OD-阴性组OD)/阳性组OD×100％
3.2.2定量比色法测定SOD酶活性
原理是：WST能与O2 -形成水溶性染料。WST-1被O2 -还原的比率与XO的活性线性相关，并且会被SOD抑制，SOD清除O2 -，会减少O2 -用于与WST-1反应形成颜色物质，在OD440nm处测定SOD活性。
SOD酶活评估试剂准备。1、裂解缓冲液制备：50μM磷酸钾，0.1mM EDTA，0.5％Triton X-100混合12000g下离心5min，取上清；2、标品：8μL SOD酶与392μL Diluent混合得到3U/mL SOD标品；3、工作液：每孔加160μL Assay buffer，5μL Xanthine，5μL WST1；4、XO酶：Diluent＝1:20。
细胞培养步骤参考本文4.2.2方法，预孵育时间为12h。在细胞进行培养完成后，将96孔板放置于冰上，用冷PBS洗3次，加30μL裂解缓冲液放冰上10min，12000g离心5min，收集上清。将标品与样品各取20μL加至96孔板，然后每孔加工作液170μL，最后加XO酶20μL。快速加后，立即测OD值，即为OD0，黑暗处25℃室温下孵育60min，测OD值，即为OD60。
计算：△OD60＝OD60-OD0
△△OD＝ODstd8 60-△OD60
绘制△△OD VS SOD(U/mL)的标准曲线。
3.2.3定量比色法测定过氧化物(H2O2)
测定原理是利用Fe3+与二甲基苯酚的显色反应。在存在二甲基苯酚的环境下，Fe2+与H2O2络合，样品中的过氧化物从Fe2+被氧化成Fe3+，Fe3+与二甲基苯酚橙形成有色复合物，在540～610nm处测OD值。
过氧化物试剂准备。1、检测试剂：试剂A：试剂B＝1:100；2、premix试剂配制：(1)5μL 3％H2O2与495μL H2O混合即为mix；(2)将5μL mix与1465μL H2O混合即为premix。
细胞培养步骤参考本文4.2.2方法，预孵育时间为12h。在细胞进行培养完成后，将培养液吸出后，加裂解液裂解细胞，离心，收集上清液，样品与标品均取40μL加至96孔板，然后加200μL检测试剂，室温下孵育30min，585nm处测定光密度值。
3.2.4定量检测硫代巴比妥酸反应物(TBARS)
其原理是TBARS与TBA形成粉红色的产物，在535nm处有最大吸收。
TBARS评估试剂准备。1、TBA Reagen：25mL；2、Standard：6M MDA；3、10％TCA：25mL；4、标品制备：(1)先简单离心装有MDA试管，以免MDA粘在瓶盖或边缘；(2)取4μL 6M MDA于2396μL H2O中，获得终浓度为10mM MDA；(3)再取3μL 10mM MDA于997μL H2O中，得到30μMMDA。
细胞以3×105个细胞接种于6孔板，其中步骤中的量均为96孔板的30倍，其余步骤与2.2.2方法相同。细胞培养完成后，收获5×106个细胞，于200μL冰预冷的PBS中超声破碎细胞，取20μL用于蛋白分析后进行后续实验，取100μL细胞裂解物于1.5mLEP管中，加200μL冰预冷的10％TCA于每个100μL的样本中，冰上孵育5min，14000rpm离心5min，转移200μL清亮上清液至新的EP管中，同样也转移标品至新的EP管中，每支管中加200μLTBA试剂，混匀并置于100℃反应60min，冷却至室温，简单离心后，每支管中取100μL液体至新的96孔板，每样2孔，535nm处测定吸光度值。
计算：[TBARS]＝Rsample-Rblank/Slope(μM-1)×n
N为稀释倍数，n＝3
3.2.5定量荧光分析细胞凋亡(Caspase-3分析)
Caspase-3分析试剂准备。工作液：每孔加100μL Assay buffer，2μL Substrate，2μL DTT。
细胞培养步骤参考本文4.2.2方法，预孵育时间为12h。在细胞进行培养完成后，吸出培养基，立即向每孔加100μL工作液，在摇床上以100～200rpm摇动60s，暗处37℃下孵育60min，在λ＝400/490nm处测定荧光强度。
计算:△F＝样品-Control[相对Caspase-3活性]。
3.2.6醛酮反应性探针(aldehyde/keto-reactive probe，ARP)结合Western-Blot分析蛋白质氧化水平
本研究利用生物素-酰肼探针与蛋白羰基相连，再用链霉素亲和素检测，以此来观察单体荭草苷对CoCl2诱导的HT22细胞蛋白质氧化损伤的保护作用。
细胞以3×105个细胞接种于6孔板，其中步骤中的量均为96孔板的30倍，其余步骤与2.2.2方法相同。细胞培养完成后，收获细胞，用PBS洗涤3次，加200μL PBS冰浴，超声破碎细胞至清亮，将细胞裂解液进行蛋白质定量。取适量，加入E3buffer(20mM K3PO4，pH7.4，1％TritonX-100，0.5M EGTA(K+)，0.5M EDTA(Na+))和醛酮反应性探针(aldehyde/keto-reactive probe，ARP)，混合均匀，室温反应1h，加SDS-Loading buffer，95℃变性，5min。按总蛋白质20μg的量进行SDS-PAGE电泳(10％)，150v稳压电泳40min，转硝酸纤维素膜，100v1h。5％脱脂乳(用1×TBST缓冲液配制，TBS中含有0.01％Tween20)封闭1h，期间置于摇床上。用1×TBST buffer摇床上洗涤3次，每次10min。以1:10000比例用1×TBST buffer配制二抗结合液(strep tactin-HRP conjugate)，置于摇床上过夜，用1×TBST buffer摇床上洗涤3次，每次10min。显色，使用新鲜配制增强的ECL，照相。
3.2.6.1溶剂的配制
(1)SDS-PAGE
SDS(20％)：称2g SDS溶于10mL DW中；
APS(10％)：称1g APS溶于10mL DW中(4℃保存)；
Running Buffer：10×Tris/Glycine/SDS Buffer 100mL+DW 900mL；
Transfer Buffer：10×Tris/Glycine Buffer 100mL+DW 700mL+ME(甲醇)200mL；
5％牛奶封闭液：5g牛奶+100mL 1×TBST；
1×TBST配制：100mL 10×TBST+900mL DW+1mL Tween 20；
10×TBST配制：200mL 10×TBS+2000mL DW+2mL Tween 20；
10×TBS配制：1000mL DW+60.57g Tris+87.66g Nacl；
E3(Extraction buffer)配制：500mL 20mM K3PO4pH 7.4+1％Triton X-100+
200μL 0.5M EGTA(K+)+200μL 0.5M EDTA(Na+)。
(2)探针配制：
探针包装为5mg/瓶，因此用0.5mL DW溶解1瓶，将其吸出放入另1瓶，即10mg—0.5mL，浓度计算如下：10/445.4＝22.45×10-3mmol，22.45×10-3mmol/0.5mL＝44.9mM(贮存浓度，分装100L/管，-20℃备用)。
(3)蛋白质定量所需试剂配制：
BSA：25mg BSA溶于25mL ddH2O中；
4×SDS sample buffer：20mL 0.5M Tris-Hcl+20mL glycerol+4g SDS+3.5mLBromphenol blue+50mL DW(室温保存)；
3.2.6.2Bradford法蛋白定量
(1)准备BSA样本：取6个小EP管，标上0，2，4，6，8，10，在冰盒上进行；
(2)每管先加800μL DW，然后向每管加0，2，4，6，8，10μL BSA，再加200μLProteinAssay；
(3)在595nm处测吸光度值，得到标准曲线；
(4)根据要测的样品的数量，取小EP管，作上标记，在冰盒上进行；
(5)每管先加800μL DW，然后加样品液，再加200μLProtein Assay；
(6)在595nm处测吸光度值，最后得出样品浓度，根据样品浓度做样本后，因为是做Western-Blot用，则将样本混匀后95℃加热5min，待凉后保存以备后续使用。
3.2.6.3SDS-PAGE胶的制备及电泳
(1)将电泳盒和玻璃胶板洗至洁净，用DW反复冲洗，然后用干净的纱布将水分擦干。
(2)把擦干的玻璃板放入调整好的制胶架，装好玻璃板，加入DW验证玻璃板是否漏水。
(3)取两个新的的试管，先配置10％的分离胶，用移液器灌胶后立即用DW封液面等待25min，待分离胶聚合后倒出DW，吸水纸把多余的水吸干净。
(4)再将配好的4％浓缩胶灌注在凝好下层胶上面，插入齿梳，等待约25min。
(5)待胶凝固制好后，拔下齿梳，放上助跑的齿梳，倒入Running Buffer，进行点样，注意保持孔内的洁净。
(6)样品用微量进样器接近加样孔点样，上样品量为20μL，Maker加3μL。
(7)电泳(Running)：参数为：150V，40min或者250V，30min。以上操作均在4℃的条件下进行。
(8)转膜(Transfer)：准备2个黑白夹，滤纸4片，硝酸纤维素膜2片，冰盒1个。将黑白夹摊开，上下各放1片滤纸，将膜浸泡在Transfer buffer中。将跑完电泳的胶借助刮板45度角将胶与玻璃分开，刮掉多余的胶后，将胶放到滤纸上，滤纸与胶之间不可有气泡。再将膜放在胶上，最后将黑白夹扣紧放在盛有Transfer buffer的转膜装置里，装置中加上蓝色冰盒后，进行转膜，转膜参数：100V，60min。
(9)封闭：5％脱脂牛奶封闭，置于摇床封闭1h。
(10)适量的1×TBST buffer洗涤3次，每次置于摇床10min，配制二抗结合液(strep tactin-HRP conjugate；1:10000)，摇床过夜后，洗涤(3次，10min/次)。(11)显色：配制化学发光试剂(ECL；1:1)，ChemiDocTM MP Imaging System扫描拍照。
3.2.7数据处理与分析
采用GraphPad Prism 5.01统计软件(GraphPad Software Inc.,San Diego,USA)分析实验数据，数据均以均数±标准差(x±s)表示。组间比较采用单因素方差分析。
3.3结果与分析
3.3.1乳酸脱氢酶(LDH)释放量检测结果分析
如图9所示，LDH释放量结果显示：预孵育12h，CLO(浓度为100和600μg/mL)和STO(浓度为100、200和400μg/mL)均显著增加LDH释放量。
3.3.2 SOD酶活测定结果分析
如图10所示，SOD活性检测结果显示：CLO、STO在100～600μg/mL的浓度范围内对SOD酶活性无统计学意义。
3.3.3过氧化物(H2O2)含量检测结果分析
如图11所示，与对照组相比，模型组中HT22细胞的H2O2含量显著增加(P<0.001)，说明CoCl2造模成功。而在预孵12h，CLO(浓度为400和600μg/mL)和STO(浓度为200、400和600μg/mL)均能够显著降低H2O2含量，提示CLO通过减少细胞活性氧(H2O2)对CoCl2诱导的HT22细胞具有保护作用。
3.3.4 TBARS结果分析
如图12所示，与对照组相比，模型组中HT22细胞中的MDA含量显著增加(P<0.01)，说明CoCl2造模成功。使用CLO与STO预孵12h后，STO在浓度为400μg/mL时，CLO在浓度为400和600μg/mL时，其MDA含量显著降低。
3.3.5 Caspase-3检测细胞凋亡结果分析
由图13可以看出，与对照组相比，模型组中HT22细胞的caspase-3水平显著增加(P<0.01)，说明CoCl2能够促进HT22细胞凋亡的产生，造模成功。而在预孵12h，浓度为400和600μg/mL时，CLO和STO均能够显著降低caspase-3水平(P<0.05，P<0.05，P<0.01，P<0.01)，提示提示CLO通过减少细胞凋亡对CoCl2诱导的HT22细胞具有保护作用。
3.3.6 ARP结合Western-Blot分析蛋白质氧化水平结果分析
如图14所示，与对照组相比，模型组的条带明显加深，其蛋白质氧化程度明显升高，说明CoCl2造成了HT22细胞蛋白质氧化损伤。使用丽春红染料染色后发现，不同处理组的条带颜色深浅一致，说明蛋白加样量相同。使用100～600μg/mL的CLO预孵12h后均能够不同程度的降低蛋白氧化损伤，提示CLO通过减少细胞蛋白质氧化对CoCl2诱导的HT22细胞具有保护作用。
由本章节实验结果可知：
(1)LDH释放量结果显示：预孵育12h，CLO(浓度为100和600μg/mL)和STO(浓度为100、200和400μg/mL)均显著增加LDH释放量。
(2)Caspase-3细胞凋亡率结果显示：与对照组相比，模型组中HT22细胞的caspase-3水平显著增加(P<0.01)，说明CoCl2造模成功。预孵12h，浓度为400和600μg/mL时，CLO和STO均能够显著降低caspase-3水平。
(3)SOD活性检测结果显示：CLO、STO在100～600μg/mL的浓度范围内对SOD酶活性无统计学意义。
(4)H2O2分析结果显示：与对照组相比，模型组中HT22细胞的H2O2含量显著增加(P<0.001)，说明CoCl2造模成功。预孵育12h，CLO(浓度为400和600μg/mL)和STO(浓度为200、400和600μg/mL)均能够显著降低H2O2含量。
(5)TBARS分析结果显示：与对照组相比，模型组中HT22细胞中的MDA含量显著增加(P<0.01)，说明CoCl2造模成功。CLO与STO预孵12h后，STO在浓度为400μg/mL时，CLO在浓度为400和600μg/mL时，其MDA含量显著降低。
(6)Western-Blots(ARP blots)结果显示：与对照组相比，模型组的蛋白质氧化程度明显升高，说明CoCl2造成HT22细胞蛋白质氧化损伤。而使用100～600μg/mL的CLO预孵12h后能够不同程度的降低蛋白氧化损伤。
由上所述，推测CLO可能通过降低MDA、H2O2含量、下调caspase-3水平及减少蛋白质氧化损伤而对CoCl2诱导的HT22细胞具有保护作用。
综上所述，本发明首次公开油莎草总黄酮提取物和活性单体荭草苷在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用，药理实验说明，油莎草总黄酮提取物和活性单体荭草苷两者对I/R损伤均具有保护作用，并且本发明中的活性单体荭草苷对I/R损伤的保护作用要高于油莎草总黄酮提取物；尤其是在I/R损伤24h时，本发明中的活性单体荭草苷对其仍然具有保护作用，而现有技术中的荭草苷并无相应的保护作用，提示本发明中的活性单体荭草苷在缺血性脑中风治疗中的应用前景；另外，本发明首次推测活性单体荭草苷可能通过降低MDA、H2O2含量、下调caspase-3水平及减少蛋白质氧化损伤而对CoCl2诱导的HT22细胞具有保护作用，为进一步研究油莎草总黄酮干预缺血性脑中风作用的分子机制奠定研究基础。
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
表1

Claims (9)

1.一种油莎草总黄酮提取物，其特征在于按下述方法得到：第一步，将烘干后的油莎草地上茎叶采用50％至95％的乙醇溶液回流提取2次至3次，合并提取液，将合并后的提取液减压浓缩至得到浸膏；第二步，将第二步得到的浸膏采用预处理后的大孔树脂柱层析进行分离，在分离过程中，依次采用水和30％的乙醇溶液洗脱后得到30％乙醇洗脱部位；第三步，将30％乙醇洗脱部位依序经过减压浓缩和冷冻干燥后得到油莎草总黄酮提取物。
2.根据权利要求1所述的油莎草总黄酮提取物，其特征在于第一步中，每次提取的时间为1.5h；或/和，大孔树脂采用D101大孔树脂，D101大孔树脂的预处理按下述方法进行：将大孔树脂用无水乙醇回流提取直至大孔树脂充分的溶胀，然后再用不同浓度的无水乙醇梯度洗脱，直至洗脱液加水后无白色浑浊溶出，再用蒸馏水进行洗脱，直至洗脱下来的溶液没有醇味为止。
3.一种根据权利要求1或2所述的油莎草总黄酮提取物的提取方法，其特征在于按下述方法进行：第一步，将烘干后的油莎草地上茎叶采用50％至95％的乙醇溶液回流提取2次至3次，合并提取液，将合并后的提取液减压浓缩至得到浸膏；第二步，将第二步得到的浸膏采用预处理后的大孔树脂柱层析进行分离，在分离过程中，依次采用水和30％的乙醇溶液洗脱后得到30％乙醇洗脱部位；第三步，将30％乙醇洗脱部位依序经过减压浓缩和冷冻干燥后得到油莎草总黄酮提取物。
4.一种根据权利要求1或2所述的油莎草总黄酮提取物在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用。
5.一种使用权利要求1或2所述的油莎草总黄酮提取物提取的活性单体荭草苷，其特征在于按下述方法得到：第一步，将油莎草总黄酮提取物用聚酰胺拌样后，在反相硅胶柱中采用不同浓度的甲醇溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，每瓶100mL，共收集77瓶，将分别得到的77瓶洗脱液采用薄层层析检测，薄层层析检测结果以蓝黑色斑或者黄绿色斑为判断标准，根据显色定性结果合并斑点颜色相似的洗脱液，将斑点颜色相似的第56瓶至61瓶洗脱液合并得到洗脱液一；第二步，将洗脱液一在葡聚糖凝胶柱利用甲醇进行洗脱，收集洗脱液，每瓶10mL，共收集90瓶，前第1瓶至第30瓶用A依次编号，第1瓶编号为A1，以此类推，第30瓶编号为A30，第31瓶至第60瓶用B依次编号，第31瓶编号为B1，以此类推，第60瓶编号为B30，第61瓶至第90瓶用C依次编号，第61瓶编号为C1，以此类推，第90瓶编号为C30，合并A23至A28、B21至B27和C23至C27得到合并流分，将合并流分经过减压浓缩和冷冻后得到活性单体荭草苷。
6.根据权利要求5所述的活性单体荭草苷，其特征在于第一步中，在反相硅胶柱中采用浓度为10％、20％、30％、40％、50％、70％和100％的甲醇溶液进行梯度洗脱；或/和，反相硅胶柱采用ODS RP-18反相硅胶柱；或/和，葡聚糖凝胶柱采用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱。
7.一种根据权利要求5或6所述的活性单体荭草苷的提取方法，其特征在于按下述方法进行：第一步，将油莎草总黄酮提取物用聚酰胺拌样后，在反相硅胶柱中采用不同浓度的甲醇溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，每瓶100mL，共收集77瓶，将分别得到的77瓶洗脱液采用薄层层析检测，薄层层析检测结果以蓝黑色斑或者黄绿色斑为判断标准，根据显色定性结果合并斑点颜色相似的洗脱液，将斑点颜色相似的第56瓶至61瓶洗脱液合并得到洗脱液一；第二步，将洗脱液一在葡聚糖凝胶柱利用甲醇进行洗脱，收集洗脱液，每瓶10mL，共收集90瓶，前第1瓶至第30瓶用A依次编号，第1瓶编号为A1，以此类推，第30瓶编号为A30，第31瓶至第60瓶用B依次编号，第31瓶编号为B1，以此类推，第60瓶编号为B30，第61瓶至第90瓶用C依次编号，第61瓶编号为C1，以此类推，第90瓶编号为C30，合并A23至A28、B21至B27和C23至C27得到合并流分，将合并流分经过减压浓缩和冷冻后得到活性单体荭草苷。
8.一种根据权利要求5或6所述的活性单体荭草苷在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用。
9.一种根据权利要求5或6所述的活性单体荭草苷在制备治疗缺血再灌注24小时引起的缺血性脑中风药物中的应用。
CN201711327107.7A 2017-12-13 2017-12-13 油莎草总黄酮提取物、活性单体荭草苷及其提取方法和应用 Pending CN108159223A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711327107.7A CN108159223A (zh) 2017-12-13 2017-12-13 油莎草总黄酮提取物、活性单体荭草苷及其提取方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711327107.7A CN108159223A (zh) 2017-12-13 2017-12-13 油莎草总黄酮提取物、活性单体荭草苷及其提取方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108159223A true CN108159223A (zh) 2018-06-15

Family

ID=62525759

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711327107.7A Pending CN108159223A (zh) 2017-12-13 2017-12-13 油莎草总黄酮提取物、活性单体荭草苷及其提取方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108159223A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109797129A (zh) * 2019-01-29 2019-05-24 兰州大学第一医院 Nrf2/ARE在低氧时表达及与黄芪多糖保护作用测定方法
CN113341050A (zh) * 2021-04-28 2021-09-03 内蒙古大学 一种油莎草地上部分多种成分的液质定量方法及其应用
CN114848738A (zh) * 2022-05-09 2022-08-05 内蒙古大学 油莎草地上部分提取物及其对农药所致肝毒性的保护作用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104083571A (zh) * 2014-07-29 2014-10-08 新疆大学 一种有增强微循环作用的油莎草总黄酮的提取方法及应用
ES2527556B1 (es) * 2013-07-26 2015-11-19 Francisco Javier CUENCA VALIENTE Uso del residuo de la chufa para la obtención de flavonoides

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2527556B1 (es) * 2013-07-26 2015-11-19 Francisco Javier CUENCA VALIENTE Uso del residuo de la chufa para la obtención de flavonoides
CN104083571A (zh) * 2014-07-29 2014-10-08 新疆大学 一种有增强微循环作用的油莎草总黄酮的提取方法及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XIAORU WANG等: "Orientin Attenuates Cerebral Ischemia/Reperfusion Injury in Rat Model through the AQP-4 and TLR4/NF-κB/TNF-α Signaling Pathway", 《JOURNAL OF STROKE AND CEREBROVASCULAR DISEASES》 *
王赛赛等: "油莎草醇提物成分分离鉴定及抗氧化活性分析", 《食品工业》 *
苏乐萍等: "油莎草醇提物对微循环和抗凝血活性作用初探", 《食品工业》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109797129A (zh) * 2019-01-29 2019-05-24 兰州大学第一医院 Nrf2/ARE在低氧时表达及与黄芪多糖保护作用测定方法
CN113341050A (zh) * 2021-04-28 2021-09-03 内蒙古大学 一种油莎草地上部分多种成分的液质定量方法及其应用
CN114848738A (zh) * 2022-05-09 2022-08-05 内蒙古大学 油莎草地上部分提取物及其对农药所致肝毒性的保护作用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Shoemaker et al. Reduction of MTT by aqueous herbal extracts in the absence of cells
CN103919712B (zh) 北虫草提取物及其制备方法和应用
CN102590433B (zh) 一种肝畅制剂的质量检测方法
Li et al. Spectrum-effect relationship of antioxidant and tyrosinase activity with Malus pumila flowers by UPLC-MS/MS and component knock-out method
CN104173401B (zh) 一种昆仑雪菊原花青素的提取方法及在延缓衰老中的应用
CN100533140C (zh) 一种解郁安神制剂的检测方法
CN104957512B (zh) 一种去淀粉高抗氧化红曲燕麦及其制备方法与应用
CN106573024A (zh) 用于改善肝功能的、含有黄漆木的提取物的组合物
CN108159223A (zh) 油莎草总黄酮提取物、活性单体荭草苷及其提取方法和应用
Vogel et al. Antioxidant properties and TLC characterization of four Chilean Haplopappus-species known as bailahuén
CN106483215B (zh) 木瓜药材中天然抗氧化剂在线发现及综合抗氧化活性评价方法
CN102749401B (zh) 一种中药组合物二十五味肺病制剂的检测方法
CN105147564B (zh) 一种马齿苋发酵原浆化妆品及其制备方法与应用
CN102488837B (zh) 治疗慢性疲劳综合症的无糖颗粒剂的检测方法
CN103110674B (zh) 一种唐古特白刺总酚提取物及其提取方法和应用
CN105738519A (zh) 一种基于量效色卡的气滞胃痛颗粒抗溃疡质量控制方法
CN107041924A (zh) 一种防治糖尿病肾病的朝药复方提取物及其制备方法
CN103860706B (zh) 一种具有保护酒精性肝损伤功能的纯中药养生制剂
CN107202856B (zh) 一种治疗感冒的中药制剂的检测方法
CN106706766A (zh) 一种治疗艾滋病的中药唐草片新增检测成分的测定方法
CN105255986B (zh) 一种黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性甾醇类化合物的制备方法
CN101411836A (zh) 一种治疗感冒后咳嗽的中药制剂质量标准及其检验方法
CN108635391A (zh) 一种返魂草酚酸成分及其制备方法与应用
CN103463163B (zh) 意大利牛舌草活性部位在制备抗氧化药物、化妆品和保健品中的应用
CN102988552A (zh) 一种治疗鸡大肠杆菌病的中药复方白头翁颗粒及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180615

RJ01 Rejection of invention patent application after publication