CN102488837B - 治疗慢性疲劳综合症的无糖颗粒剂的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗慢性疲劳综合症的无糖颗粒剂及其制备方法和检测方法，按照重量份计算，它是由人参75份、麦冬250份、五味子150份、当归150份、黄芪250份、龙眼肉200份、肉桂50份、灵芝150份、鸡血藤150份、茯苓125份、山楂250份、丹参150份、枣仁150份、阿胶100份和甜菊素5份、糊精767份制成的。本发明无糖制剂具有溶解快，生物利用度高，稳定性好的优点，解决了糖尿病患者与老年患者用药的局限性问题，扩大了适用人群；另外本发明检测方法精密度高，重现性好，测量结果准确，可有效确保该制剂的临床疗效。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗慢性疲劳综合症的无糖颗粒剂及其制备方法和检测方法，属于中药技术领域。
背景技术
随着经济的发展，生活节奏的加快，社会竞争的加剧，人们不得不处于紧张和繁忙之中，身心长期处于满负荷或超负荷运转状态，得不到适当的松弛和休息，最终积劳成疾，不知不觉中成了慢性疲劳综合症者。慢性疲劳综合症是一种以慢性或反复发作的极度疲劳、低热、咽喉痛、肌肉痛、关节痛、头痛以及神经精神症状等临床表现为主的症候群。据流行病学调查，人群中14％的成年男性、29％的妇女表现有明显疲劳症状，其中40％以上的患者不能正常工作与学习，据美国疾病控制中心(CDC)预测：慢性疲劳已成为21世纪影响人类健康的主要疾病之一，我国该病的发病率也正逐年上升，危害着国人的健康。
消疲灵颗粒是治疗慢性疲劳综合症的纯中药良方，但该颗粒的传统湿法制粒工艺存在浸膏粘度大，浸膏量偏大，制粒难度大，含糖量高的缺点，老年人及禁糖患者用药有局限性。另消疲灵颗粒尚无完善的质量检测标准，其药品质量的稳定性和临床疗效的确切性急待提高。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种治疗慢性疲劳综合症的无糖颗粒剂及其制备方法和检测方法。本发明针对现有技术的不足，对辅料和成型工艺进行改进，制成无糖颗粒剂，扩大了适用人群，同时还研制了科学合理的检测方法，以有效地控制和提高产品质量。
本发明的技术方案：一种治疗慢性疲劳综合症的无糖颗粒剂，按照重量份计算，它是由人参75份、麦冬250份、五味子150份、当归150份、黄芪250份、龙眼肉200份、肉桂50份、灵芝150份、鸡血藤150份、茯苓125份、山楂250份、丹参150份、枣仁150份、阿胶100份和甜菊素5份、糊精767份制成的。
前述治疗慢性疲劳综合症的无糖颗粒剂的制备方法为：取阿胶粉碎成细粉，备用；按比例称取人参、麦冬、五味子、当归、黄芪、龙眼肉、肉桂、灵芝、鸡血藤、茯苓、山楂、丹参、枣仁十三味药，分别加8倍量水、6倍量水煎煮二次，每次2小时，合并 煎液，滤过，滤液浓缩成60℃相对密度为1.25～1.30的稠膏，加5.5～6.0倍量乙醇，搅匀，静置，分取上清液，残渣加2倍量85％乙醇，搅匀，静置，合并两次上清液，滤过，滤液回收乙醇，浓缩成60℃相对密度为1.25～1.30的清膏，加入阿胶细粉和甜菊素、糊精，制成颗粒，干燥，即得。
前述治疗慢性疲劳综合症的无糖颗粒剂的检测方法包括性状、检查、鉴别和含量测定项目；其中鉴别是对五味子、麦冬、当归、丹参的薄层色谱鉴别；含量测定是对制剂中五味子醇甲的含量测定。
五味子的鉴别方法是以五味子醇甲对照品为对照，以环己烷∶醋酸乙酯＝5∶5为展开剂的薄层色谱鉴别法；麦冬的鉴别方法是以麦冬对照药材为对照，以氯仿∶甲醇＝20∶1为展开剂的薄层色谱鉴别法；当归的鉴别方法是以阿魏酸对照品为对照，以苯∶醋酸乙酯∶甲酸＝5∶2∶1为展开剂的薄层色谱鉴别法；丹参的鉴别方法是以原儿茶醛对照品为对照，以苯∶醋酸乙酯∶甲酸＝10∶5∶0.5为展开剂的薄层色谱鉴别法；五味子醇甲的含量测定方法是以五味子醇甲对照品为对照，以乙腈∶0.1％磷酸溶液＝42∶58为流动相的高效液相色谱法。
具体的鉴别方法包括以下项目：
(1)麦冬 取本颗粒剂12g，研细，加乙醇40ml，加热回流提取1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，加水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇层，用0.1％氢氧化钠溶液洗涤两次，每次30ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取麦冬对照药材1g，加乙醇20ml，超声处理40分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液5ul、对照药材溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶甲醇＝20∶1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％磷钼酸乙醇溶液，置100℃烘至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
(2)五味子 取五味子醇甲对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述鉴别(1)项下的供试品溶液和前述对照品溶液各10ul，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环己烷∶醋酸乙酯＝5∶5为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
(3)当归 取本颗粒剂18g，研细，加乙醇50ml溶解，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水30ml使溶解，用稀盐酸调节pH值至2～3，用醋酸乙酯振摇提取3 次，每次20ml，合并醋酸乙酯提取液，以2％碳酸钠振摇提取3次，每次20ml，合并碳酸钠提取液，用乙醚20ml洗涤，弃去乙醚液；用稀盐酸调节pH值至2～3，再用乙醚提取3次，每次15ml，合并乙醚提取液，挥干，残渣加无水乙醇1ml溶解，作为供试品溶液；另取阿魏酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯∶醋酸乙酯∶甲酸＝5∶2∶1的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
(4)丹参 取原儿茶醛对照品，加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述鉴别(3)项下的供试品溶液和前述对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯∶醋酸乙酯∶甲酸＝10∶5∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液，热风吹至斑点清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置显相同颜色的斑点。
具体的含量测定方法为：
照中国药典2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定：
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈∶0.1％磷酸溶液＝42∶58为流动相；检测波长为217nm；理论板数按五味子醇甲峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备 精密称取经五氧化二磷减压干燥24小时后的五味子醇甲对照品，加甲醇制成每1ml含6μg的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备 取本颗粒剂6g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，置水浴上加热回流2小时，取出，放冷，称重，用甲醇补足损失的重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；
测定法 分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本制剂每袋含五味子以五味子醇甲C24H32O7计，不得少于0.06mg。
具体地说，所述检测方法包括以下项目：
性状：本制剂为浅棕色至棕褐色的颗粒；气微，味甜、微苦；
检查：应符合中国药典2010年版一部附录I C颗粒剂项下有关的各项规定；
鉴别：(1)麦冬 取本颗粒剂12g，研细，加乙醇40ml，加热回流提取1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，加水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇层，用0.1％氢氧化钠溶液洗涤两次，每次30ml，分取正丁醇液，蒸干，残 渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取麦冬对照药材1g，加乙醇20ml，超声处理40分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液5ul、对照药材溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶甲醇＝20∶1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％磷钼酸乙醇溶液，置100℃烘至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
(2)五味子 取五味子醇甲对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述鉴别(1)项下的供试品溶液和前述对照品溶液各10ul，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环己烷∶醋酸乙酯＝5∶5为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
(3)当归 取本颗粒剂18g，研细，加乙醇50ml溶解，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水30ml使溶解，用稀盐酸调节pH值至2～3，用醋酸乙酯振摇提取3次，每次20ml，合并醋酸乙酯提取液，以2％碳酸钠振摇提取3次，每次20ml，合并碳酸钠提取液，用乙醚20ml洗涤，弃去乙醚液；用稀盐酸调节pH值至2～3，再用乙醚提取3次，每次15ml，合并乙醚提取液，挥干，残渣加无水乙醇1ml溶解，作为供试品溶液；另取阿魏酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯∶醋酸乙酯∶甲酸＝5∶2∶1的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
(4)丹参 取原儿茶醛对照品，加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述鉴别(3)项下的供试品溶液和前述对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯∶醋酸乙酯∶甲酸＝10∶5∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液，热风吹至斑点清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置显相同颜色的斑点；
含量测定：照中国药典2010年版一部附录VI D高效液相色谱法测定：
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈∶0.1％磷酸溶液＝42∶58为流动相；检测波长为217nm；理论板数按五味子醇甲峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备 精密称取经五氧化二磷减压干燥24小时后的五味子醇甲对照品，加甲醇制成每1ml含6μg的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备 取本颗粒剂6g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，置水浴上加热回流2小时，取出，放冷，称重，用甲醇补足损失的重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；
测定法 分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本制剂每袋含五味子以五味子醇甲C24H32O7计，不得少于0.06mg。
本发明组方中人参、黄芪补气，当归、丹参、阿胶补血，枣仁、茯苓、麦冬、五味子具有安神之功效，肉桂、龙眼肉、山楂、鸡血藤、灵芝的主要功效亦为补益心脾、养血安神、活血、消食健胃，十四味药均是针对慢性疲劳综合症的中医学病因而配伍的，符合其治疗原则，疗效确切。
申请人进行了一系列实验来选择本发明制剂的辅料、工艺和检测方法，以保证其科学、合理、可行，并具有良好的疗效。
一、制备工艺研究
1、制备工艺参数的确定
1.1 提取加水量确定
试验目的：结合一般提取过程中，第一次提取加水量多于第二次提取加水量的原则，考察提取工序加水量的多少对出膏率及浸膏中有效成分含量的影响(一个处方量的生药材)，试验结果见下表：
以上结果表明，①、②号提取比较完全，出膏率及浸膏中五味子醇甲总含量均较高，③号则偏低，且处方中生药材多为根茎类药材，结合常规提取加水量，故选择加水量为第一次加8倍量水，第二次加6倍量水。
1.2 辅料-糊精用量的确定
试验目的：本品由含糖型颗粒变更为无糖型颗粒，拟定无糖型颗粒的常用辅料-糊精作为蔗糖的替代辅料，糊精与蔗糖这两种辅料对中药浸膏的吸收性能不同，因此辅料用量也会发生相应的变化，试验分别采用不同的辅料量与浸膏混合，观察所制得软材的干湿程度及制粒可行性，试验结果见下表：
根据上述试验结果，选定每100袋成品所用糊精量为460g，制得颗粒共600g，确定无糖型消疲灵颗粒规格为6g/袋。
1.3 甜菊素用量的确定
试验目的：采用糊精替代蔗糖作为辅料后，口感欠佳，为改善本品口味，同时确保本品能适用于糖尿病、高血糖患者，确定采用高甜度、低热量的矫味剂-甜菊素，通过试验确定最佳用量，试验结果如下：
以上试验结果表明，每100袋成品中添加3g甜菊素能较好地改善本品口味，因此确定每100袋成品中添加的甜菊素为3g。
2、制备方法
处方中十四味，阿胶粉碎成细粉，其余人参等十三味，分别加8倍量和6倍量水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.25～1.30(60℃)稠膏，加乙醇5.5～6.0倍量，搅匀，静置，分取上清液，残渣加85％乙醇2倍量，搅匀，静置，合并两次上清液，滤过，回收乙醇，浓缩成相对密度为1.25～1.30(60℃)的清膏，加入糊精及甜菊素，制成颗粒，干燥，制成600g，分装，即得。
3、三批中试产品技术数据
二、五味子醇甲的含量测定研究
1、仪器与试药
高效液相色谱仪：Hp1100系列高效液相色谱仪。
乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余为分析纯。
五味子醇甲对照品批号：0857-9601，由中国药品生物制品检定所提供，供鉴别用，经按峰面积归一化法标化，结果其含量为99.02％。
2、色谱条件
2.1 色谱柱：DiscoveryC18柱(250×4.6mm，5μm)。
2.2 流动相：乙腈-0.1％磷酸溶液(42∶58)。
2.3 检测波长：217nm。根据五味子醇甲对照品在紫外分光光度计上测得的最大吸收波长为217.3nm，选择217nm作为本制剂的检测波长。
2.4 柱温：25℃。
2.5 流速：1.0ml/min。
2.6 进样量：10μl。
在此色谱条件下，供试品中的五味子醇甲峰与其他杂质峰能达到很好的分离。
3、提取方法的选择：①取本颗粒剂6g，研细，精密称定，置具塞三角烧瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，取出，放冷，称重，用甲醇补足损失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液。②取本颗粒剂6g，研细，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，置水浴上加热回流2小时，取出，放冷，称重，用甲醇补足损失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液。③取本颗粒剂12g，研细，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇80ml，置水浴上加热回流6小时，取出，回流液置100ml量瓶中，用少 量甲醇冲洗容器，并加入量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液。④取本颗粒剂2g，加水50ml使溶解，用醋酸乙酯振摇提取，结果乳化不分层。前三种方法结果如表一：
表一 提取方法比较结果表
上表结果表明采用回流提取效率最高。
然后对提取的溶剂进行了比较：按上述方法②所述方法，但溶剂分别改为甲醇、50％甲醇、乙醇、50％乙醇，结果用50％乙醇时所得的溶液粘度很大，过滤困难，其它几种溶剂比较的结果见表二。
表二 提取溶剂比较结果表
上表结果表明采用甲醇作溶剂时提取效率最高，故选用甲醇作为提取溶剂。
最后比较了提取时间对五味子醇甲含量的影响：按上述方法②所述方法，但回流时间分别为1小时、2小时和3小时，比较结果如表三。
表三 提取时间比较表
结果表明本颗粒剂回流提取2小时已经基本提取完全。故最后将提取方法定为上述方法②所述方法。
4、对照品溶液与供试品溶液的制备：精密称取减压干燥24小时后的五味子醇甲对照品适量，加甲醇制成每1ml含6.234μg的对照品溶液，进样10μl测定；供试品溶液的制备同本发明技术方案。
5、标准曲线的绘制精密量取对照品溶液(6.234μg/ml)1、3、5、7、10、15μl，对照品溶液(20.78μg/ml)10、15μl，注入液相色谱仪，以色谱峰面积为纵坐标，以进样量(μg)为横坐标，结果如下表：
表四 线性关系考察表
得线性方程：Y＝6309.2X+2.464，r＝0.99998，线性范围为0.006234-0.3117μg。
6、精密度试验 取本颗粒剂，按本发明所述方法提取，重复进样6次，RSD为0.3％(n＝6)，结果见下表：
表五 精密度试验(一)
取五味子醇甲对照品溶液，重复进样5次，RSD为0.3％(n＝5)，结果如下表：
表六 精密度试验(二)
7、重现性试验 取本颗粒剂按本发明所述方法提取供试品6份，分别测定每份的含量，结果平均含量为27.405μg/ml，RSD为1.3％(n＝6)，结果如下表：
表七 重现性试验结果
8、回收率试验 采用加样回收法，精密称取本颗粒剂适量，精密加入五味子醇甲对照品溶液适量，共6份，按本发明所述方法测定供试品中五味子醇甲的量，计算回收率，结果平均回收率为101.67％，RSD＝0.9％(n＝6)，结果如下表：
表八 回收率试验结果
9、稳定性试验取供试品溶液1份，每隔一定时间测定，测得五味子醇甲峰面积如下表，结果表明，供试品溶液在室温下放置44小时内稳定。
表九 稳定性试验结果
10、缺五味子阴性对照试验：取缺五味子阴性试验样品，按本发明所述方法进样10μl，结果在与五味子醇甲相同位置无色谱峰出现，表明阴性对照对本制剂的测定无干扰。
11、样品测定结果 按本发明所述方法测定本颗粒剂中五味子醇甲的含量，结果如下表：
表十 样品含量测定结果
| 批号 | 含量(mg/袋) | 批号 | 含量(mg/袋) |
| 010401 | 0.19 | 010602 | 0.15 |
| 010402 | 0.16 | 010603 | 0.12 |
| 010403 | 0.07 | 010701 | 0.10 |
| 010501 | 0.09 | 010702 | 0.12 |
| 010601 | 0.10 | 010703 | 0.15 |
12、含量限度的制定：根据10批样品的含量测定结果，暂定本颗粒剂含量限度为每袋含五味子以五味子醇甲(C24H32O7)计，不得少于0.06mg。
三、麦冬鉴别方法确定
以麦冬对照药材为对照标出本制剂所含的麦冬。
1、供试品提取方法
2、展开剂的选择
| 展开剂 | 色谱效果 |
| 三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(9∶9∶3∶0.2) | 分离效果差，有拖尾现象 |
| 氯仿-甲醇(20∶1) | 分离效果好，斑点清晰 |
| 甲苯-甲醇-冰醋酸(80∶5∶0.1) | 分离效果差 |
3、点样量的选择
| 点样量 | 色谱效果 |
| 供试品5ul，对照药材10ul | 斑点清晰 |
| 各2ul | 斑点颜色过深 |
| 各10ul | 供试品斑点略有拖尾现象 |
四、当归鉴别方法确定
当归药材中含阿魏酸成分，选定以阿魏酸对照品为对照，检出本制剂中所含的当归药材。
1、供试品制备方法的选择
2、展开剂的选择
| 展开剂 | 色谱效果 |
| 苯-氯仿-冰醋酸(6∶5∶1) | 分离效果差 |
| 苯-醋酸乙酯-甲酸(5∶2∶1) | Rf值适宜，分离清晰 |
| 环己烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶1∶0.1) | 略有拖尾现象 |
3、点样量的选择
| 点样量 | 色谱效果 |
| 5μl | 分离效果好，斑点清晰 |
| 3μl | 斑点颜色略浅 |
| 10μl | 斑点过大 |
五、五味子鉴别方法确定
五味子中含五味子醇甲，选定以五味子醇甲为对照，检出本制剂所含的五味子药材。
1、供试品溶液制备方法
2、展开剂的选择
| 展开剂 | 色谱效果 |
| 环己烷-醋酸乙酯(5∶5) | Rf值适宜，分离效果好 |
| 石油醚(30～60℃)-乙酸乙酯-冰醋酸(15∶7∶5) | 分离效果差、拖尾。 |
| 环己烷-乙酸乙酯-甲醇(6∶2.5∶1) | 主斑点不清晰、拖尾。 |
3、点样量的选择
| 点样量 | 色谱效果 |
| 2ul | 主斑点颜色极浅 |
| 5ul | 主斑点颜色较浅 |
| 10ul | 主斑点清晰 |
六、丹参鉴别方法确定
丹参中主要含丹酚酸、丹参酮、原儿茶醛等，本发明选用原儿茶醛对照品，采用TLC法检定样品中所含的丹参。
1、供试品溶液制备方法
2、展开剂的选择
| 展开剂 | 色谱效果 |
| 苯-醋酸乙酯-甲酸(10∶5∶0.5) | Rf值适宜 |
| 氯仿-丙酮-甲酸(8∶1∶1) | 分离效果差 |
| 三氯甲烷-甲醇-水(30∶10∶3) | 分离效果差 |
3、点样量的选择
| 点样量 | 色谱效果 |
| 5μl | 斑点颜色较浅 |
| 10μl | 斑点清晰 |
| 15μl | 斑点过大，略有拖尾 |
与现有技术相比，本发明无糖制剂具有溶解快，生物利用度高，稳定性好的优点，解决了糖尿病患者与老年患者用药的局限性问题，扩大了适用人群；另外本发明检测方法精密度高，重现性好，测量结果准确，可有效确保该制剂的临床疗效。
具体实施方式
本发明的实施例1：治疗慢性疲劳综合症的无糖颗粒剂的制备：
取人参75g、麦冬250g、五味子150g、当归150g、黄芪250g、龙眼肉200g、肉桂50g、灵芝150g、鸡血藤150g、茯苓125g、山楂250g、丹参150g、枣仁150g、阿胶100g和甜菊素5g、糊精767g；阿胶粉碎成细粉，备用；其余人参、麦冬、五味子、当归、黄芪、龙眼肉、肉桂、灵芝、鸡血藤、茯苓、山楂、丹参、枣仁十三味药，分别加8倍量水、6倍量水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成稠膏(相对密度1.25～1.30，60℃)，加乙醇5.5～6.0倍量，搅匀，静置，分取上清液，残渣加85％乙醇2倍量，搅匀，静置，合并两次上清液，滤过，滤液回收乙醇，浓缩成清膏(相对密度1.25～1.30，60℃)，加入阿胶细粉和糊精、甜菊素，制成颗粒，干燥，制成1000g，即得。本制剂开水冲服，一次6～12g，每日1～3次，6天为一疗程。
本发明的实施例2：治疗慢性疲劳综合症的无糖颗粒剂的检测方法包括以下项目：
性状：本制剂为浅棕色至棕褐色的颗粒；气微，味甜、微苦。
鉴别：(1)麦冬 取本颗粒剂12g，研细，加乙醇40ml，加热回流提取1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，加水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇层，用0.1％氢氧化钠溶液洗涤两次，每次30ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取麦冬对照药材1g，加乙醇20ml，超声处理40分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述供试品溶液5ul、对照药材溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇(20∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％磷钼酸乙醇溶液，置100℃烘至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(2)五味子 取五味子醇甲对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取鉴别(1)项下的供试品溶液和前述对照品溶液各10ul，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环己烷-醋酸乙酯(5∶5)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(3)当归 取本颗粒剂18g，研细，加乙醇50ml溶解，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水30ml使溶解，用稀盐酸调节pH值至2～3，用醋酸乙酯振摇提取3次，每次20ml，合并醋酸乙酯提取液，以2％碳酸钠振摇提取3次，每次20ml，合并碳酸钠提取液，用乙醚20ml洗涤，弃去乙醚液；用稀盐酸调节pH值至2～3，再用乙醚提取3次，每次15ml，合并乙醚提取液，挥干，残渣加无水乙醇1ml溶解，作为供试品溶液；另取阿魏酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯-甲酸(5∶2∶1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(4)丹参 取原儿茶醛对照品，加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取鉴别(3)项下的供试品溶液和前述对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯-甲酸(10∶5∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液，热风吹至斑点清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置显相同颜色的斑点。
检查：应符合颗粒剂项下有关的各项规定(中国药典2010年版一部附录I C)。
含量测定：照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)测定：
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈∶0.1％磷酸溶液＝42∶58为流动相；检测波长为217nm；理论板数按五味子醇甲峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备 精密称取经五氧化二磷减压干燥24小时后的五味子醇甲对照品，加甲醇制成每1ml含6μg的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备 取本颗粒剂6g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，置水浴上加热回流2小时，取出，放冷，称重，用甲醇补足损失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液；
测定法 分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本制剂每袋含五味子以五味子醇甲(C24H32O7)计，不得少于0.06mg。
Claims (4)
1.一种治疗慢性疲劳综合症的无糖颗粒剂的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括性状、检查、鉴别和含量测定项目；其中鉴别是对五味子、麦冬、当归、丹参的薄层色谱鉴别；含量测定是对制剂中五味子醇甲的含量测定；五味子的鉴别方法是以五味子醇甲对照品为对照，以环己烷∶醋酸乙酯=5∶5为展开剂的薄层色谱鉴别法；麦冬的鉴别方法是以麦冬对照药材为对照，以氯仿∶甲醇=20∶1为展开剂的薄层色谱鉴别法；当归的鉴别方法是以阿魏酸对照品为对照，以苯∶醋酸乙酯∶甲酸=5∶2∶1为展开剂的薄层色谱鉴别法；丹参的鉴别方法是以原儿茶醛对照品为对照，以苯∶醋酸乙酯∶甲酸=10∶5∶0.5为展开剂的薄层色谱鉴别法；五味子醇甲的含量测定方法是以五味子醇甲对照品为对照，以乙腈∶0.1%磷酸溶液=42∶58为流动相的高效液相色谱法。
2.根据权利要求1所述治疗慢性疲劳综合症的无糖颗粒剂的检测方法，其特征在于：具体的鉴别方法包括以下项目：
（1）麦冬取本颗粒剂12g，研细，加乙醇40ml，加热回流提取1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，加水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇层，用0.1%氢氧化钠溶液洗涤两次，每次30ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取麦冬对照药材1g，加乙醇20ml，超声处理40分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液5ul、对照药材溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶甲醇=20∶1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%磷钼酸乙醇溶液，置100℃烘至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（2）五味子取五味子醇甲对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述鉴别（1）项下的供试品溶液和前述对照品溶液各10ul，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环己烷∶醋酸乙酯=5∶5为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（3）当归取本颗粒剂18g，研细，加乙醇50ml溶解，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水30ml使溶解，用稀盐酸调节pH值至2～3，用醋酸乙酯振摇提取3次，每次20ml，合并醋酸乙酯提取液，以2%碳酸钠振摇提取3次，每次20ml，合并碳酸钠提取液，用乙醚20ml洗涤，弃去乙醚液；用稀盐酸调节pH值至2～3，再用乙醚提取3次，每次15ml，合并乙醚提取液，挥干，残渣加无水乙醇1ml溶解，作为供试品溶液；另取阿魏酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯∶醋酸乙酯∶甲酸=5∶2∶1的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（4）丹参取原儿茶醛对照品，加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述鉴别（3）项下的供试品溶液和前述对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯∶醋酸乙酯∶甲酸=10∶5∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁乙醇溶液，热风吹至斑点清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置显相同颜色的斑点。
3.根据权利要求1所述治疗慢性疲劳综合症的无糖颗粒剂的检测方法，其特征在于：具体的含量测定方法为：
照中国药典2010年版一部附录ⅥD高效液相色谱法测定：
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈∶0.1%磷酸溶液=42∶58为流动相；检测波长为217nm；理论板数按五味子醇甲峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷减压干燥24小时后的五味子醇甲对照品，加甲醇制成每1ml含6μg的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备取本颗粒剂6g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，置水浴上加热回流2小时，取出，放冷，称重，用甲醇补足损失的重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；
测定法分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本制剂每袋含五味子以五味子醇甲C24H32O7计，不得少于0.06mg。
4.根据权利要求1-3中任一项所述治疗慢性疲劳综合症的无糖颗粒剂的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下项目：
性状：本制剂为浅棕色至棕褐色的颗粒；气微，味甜、微苦；
检查：应符合中国药典2010年版一部附录ⅠC颗粒剂项下有关的各项规定；
鉴别：（1）麦冬取本颗粒剂12g，研细，加乙醇40ml，加热回流提取1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，加水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇层，用0.1%氢氧化钠溶液洗涤两次，每次30ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取麦冬对照药材1g，加乙醇20ml，超声处理40分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液5ul、对照药材溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶甲醇=20∶1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%磷钼酸乙醇溶液，置100℃烘至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（2）五味子取五味子醇甲对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述鉴别（1）项下的供试品溶液和前述对照品溶液各10ul，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环己烷∶醋酸乙酯=5∶5为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（3）当归取本颗粒剂18g，研细，加乙醇50ml溶解，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水30ml使溶解，用稀盐酸调节pH值至2～3，用醋酸乙酯振摇提取3次，每次20ml，合并醋酸乙酯提取液，以2%碳酸钠振摇提取3次，每次20ml，合并碳酸钠提取液，用乙醚20ml洗涤，弃去乙醚液；用稀盐酸调节pH值至2～3，再用乙醚提取3次，每次15ml，合并乙醚提取液，挥干，残渣加无水乙醇1ml溶解，作为供试品溶液；另取阿魏酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯∶醋酸乙酯∶甲酸=5∶2∶1的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
（4）丹参取原儿茶醛对照品，加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述鉴别（3）项下的供试品溶液和前述对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯∶醋酸乙酯∶甲酸=10∶5∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁乙醇溶液，热风吹至斑点清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置显相同颜色的斑点；
含量测定：照中国药典2010年版一部附录ⅥD高效液相色谱法测定：
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈∶0.1%磷酸溶液=42∶58为流动相；检测波长为217nm；理论板数按五味子醇甲峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷减压干燥24小时后的五味子醇甲对照品，加甲醇制成每1ml含6μg的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备取本颗粒剂6g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，置水浴上加热回流2小时，取出，放冷，称重，用甲醇补足损失的重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；
测定法分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本制剂每袋含五味子以五味子醇甲C24H32O7计，不得少于0.06mg。
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Denomination of invention: Detection method of sugar free granules for treating chronic fatigue syndrome Effective date of registration: 20220110 Granted publication date: 20140101 Pledgee: Zhejiang Yiwu Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: ZHEJIANG DADE PHARMACEUTICAL GROUP Co.,Ltd. Registration number: Y2022330000037 |
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